CN110082446A - 一种姜黄质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种姜黄质量检测方法,它包括如下操作步骤:1)内标溶液的制备;2)供试品溶液的制备:挥发油供试品溶液和芳香水供试品溶液;3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱‑质谱联用仪;4)用内标法计算挥发油成分和芳香水中挥发性成分相对含量。本发明的姜黄质量检测方法,能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分,芳香水中62种挥发性成分,能反应出姜黄挥发油的整体面貌,结果可靠,为姜黄挥发油的质量控制提供了新方法,同时可用于区分来自不同产地的姜黄药材质量,具有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种姜黄质量检测方法。
背景技术
姜黄是姜科多年生草本植物姜黄的根茎,主要产自于福建、四川、广西、云南等地。具有特异的香气,味苦涩,辛温,行通经止痛、行气、破风活血之功效,现代临床医学研究得出,姜黄具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗原虫、降低血糖血脂等多种药理作用。挥发油是姜黄的主要有效成分,主要含有姜黄酮、芳姜黄酮、姜黄新酮、β-倍半水芹烯、α-姜黄烯等特征成分,且其药理活性显著。
《中国药典》仅对姜黄挥发油总量进行了控制,如“照挥发油测定法(附录X D)测定。本品含挥发油不得少于7.0%(ml/g)”,此种控制方法不利于不同产地姜黄质量的对比和区分。
目前也没有关于不同产地姜黄质量区分方法的研究。
发明内容
为解决上述问题,本发明一种姜黄质量检测方法,它包括如下操作步骤:
1)内标溶液的制备:取正二十二烷,加***溶解,混匀得标准品溶液;
2)供试品溶液的制备:
a)取姜黄药材,加水浸泡,提取,提取液静置分层,分离油相和水相;
b)取步骤a)油相,加无水***稀释50~75倍,再加无水硫酸钠脱水,过滤,滤液加入步骤1)内标液和***,摇匀,作为挥发油供试品溶液;
c)取步骤a)水相,加***萃取,取***层溶液,加无水硫酸钠脱水,过滤,滤液加入步骤1)内标液和***,摇匀,作为芳香水供试品溶液;
3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪;色谱条件如下:
色谱柱:HP-5毛细管;程序升温:初始温度50℃,保持3min,以5℃·min-1的速率升温至140℃,以10℃min-1的速率升温至280℃,保持2min;
质谱条件:离子源:EI离子源;扫描质量范围m/z 33~1000amu。
进一步地,步骤1)所述正二十二烷与***的质量体积比为(10-12)mg:10ml。
进一步地,步骤a所述姜黄药材与水的质量体积比为1g:8mL;所述浸泡30min;所述提取为水蒸汽蒸馏法提取,提取时间为7.5-8h。
进一步地,步骤b所述油相与无水***体积比为2:100;所述滤液与内标液和***体积比为5:2:8。
进一步地,步骤c所述水相与***的体积比为1:(3-5),优选1:3;所述提取为振摇提取;所述滤液与内标液和***体积比为5:2:8。
进一步地,步骤3)所述HP-5毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm,0.1μm,弱极性;所述色谱条件中进样口温度250℃,进样量1.5μL,载气为氦气,柱温130℃,分流比20:1。
进一步地,步骤3)所述质谱条件中离子源温度230℃,接口温度250℃,四极杆温度150℃,溶剂延迟3min。
进一步地,所述供试品溶液中挥发性成分相对含量用内标法计算。
更进一步地,所述挥发性成分中的特征性成分相对含量,与挥发油总量用PCA法分析,得到的两个主成分对姜黄药材进行产地和/或质量区分。
更进一步地,所述特征性成分为芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯。
用本发明方法检测来自四川宜宾、四川乐山、四川屏山、云南红河、云南文山、云南河口、云南曲靖、云南洱源、云南瑞丽、陕西汉中、福建泉州和浙江温州12批次样品,可区分出云南产区质量最好,四川产区质量最差,其余地方质量居中。
本发明的姜黄质量检测方法,能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分,芳香水中62种挥发性成分,能反应出姜黄挥发油的整体面貌,结果可靠,为姜黄挥发油的质量控制提供了新方法,同时可用于区分不同产地的姜黄药材,及其来自不同产地的姜黄药材质量,具有广泛应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1姜黄挥发油样品GC-MS总离子流图(450min收集所得)
图2姜黄芳香水样品GC-MS总离子流图(450min收集所得)
图3实验方案流程图
图4姜黄挥发性成分GC-MS总离子流图(30min收集所得挥发油)
图5挥发性成分总体特征图谱
图6主要特征成分含量-时间曲线图
图7不同分布成分含量-时间曲线图
图8水中特有成分对芳香水中主要成分溶出的影响散点矩阵图
图9不同产地姜黄挥发油总含量
图10不同产地姜黄PCA分析结果
具体实施方式
实施例1本发明姜黄质量检测
1)内标溶液的制备:精密称取11.77mg正二十二烷置于10mL棕色容量瓶中加入***定容,振摇均匀,得到浓度为1.177mg/mL的正二十二烷标准品溶液,4℃保存备用。
2)供试品溶液制备:
a、取姜黄200g,置于三口圆底烧瓶,加8倍量水,浸泡30min,电热套煮沸提取,打开挥发油收集装置下端活塞,连续收集冷凝液,共收集450min。冷凝液静置至室温,待油水分层后,分离挥发油部分和芳香水部分,备用。
b、挥发油供试品溶液的制备:取挥发油20μL,加入1mL无水***,另加适量无水硫酸钠脱水,过滤,准确量取0.5mL至2mL棕色样品瓶中,再加入200μL二十二烷标准品溶液,加***至1.5mL,摇匀,密封,4℃保存备用。
c、芳香水供试品溶液的制备:取芳香水溶液1mL,加3mL***振摇提取,分取***层溶液,加入无水硫酸钠适量脱水,过滤,准确量取0.5mL至样品瓶,另加入200μL二十二烷标准品溶液,加***至1.5mL,摇匀,密封。4℃保存备用。
3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪,得总离子流(图1~图2);色谱条件如下:
HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.1μm,弱极性),进样口温度250℃,进样量1.5μL,载气为氦气,柱温130℃,分流比20:1,程序升温为初始温度50℃,保持3min,以5℃·min-1的速率升温至140℃,以10℃min-1的速率升温至280℃,保持2min。EI离子源,离子源温度230℃,接口温度250℃,四极杆温度150℃,扫描质量范围m/z 33~1000amu,溶剂延迟3min。
4)用内标法计算挥发油和芳香水中挥发性成分相对含量,其中特征性成分:芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯相对含量,与挥发油总量用PCA法分析,得到的两个累计方差贡献率大于92%主成分,用于对姜黄药材进行产地和/或质量区分。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果:
1.1仪器与设备
100-1000μL移液器,Dragonlab公司;10-100μL移液枪,Sartorius公司;GC-MS,Agilent technologies公司;微孔滤膜,衫羽(天津)科技有限公司;粉碎机,浙江屹立工资有限公司;分析天平,天行者;BT25S型1/10万天平,sartorius公司。
1.2试验药材及对照品
姜黄(陕西省兴盛德药业有限公司,生产批号20170901),经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为姜科多年生草本植物姜黄(Curcumalonga L.)的根茎;正二十二烷(上海源叶生物有限公司,生产批号A11N8L47966)。***、无水硫酸钠均为分析纯;实验用水为纯净水。
2实验方法及过程
采用水蒸气蒸馏法提取姜黄,每30分钟收集一次提取液。分离提取液的挥发油部分和芳香水部分。GC-MS分析不同部分的挥发性成分,提取特征成分并进行特征分析,对其提取时间-含量进行模型拟合,探索姜黄挥发油提取动力学规律。本文采用的研究方案路线如下(流程图见图3):
2.1水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发油
取姜黄200g,置于三口圆底烧瓶,加8倍量水,浸泡30min,电热套煮沸提取,打开挥发油收集装置下端活塞,连续收集冷凝液,每30min更换一次收集器,记录该段时间下冷凝液体积,并及时补充等量沸水至三口圆底烧瓶中,共收集450min。冷凝液静置至室温,待油水分层后,分离挥发油部分和芳香水部分,分别按提取时间编号挥发油1-15、芳香水1-15,备用。
2.2溶液的制备
2.2.1内标溶液的制备
内标溶液的制备:精密称取11.77mg正二十二烷置于10mL棕色容量瓶中加入***定容,振摇均匀,得到浓度为1.177mg/mL的正二十二烷标准品溶液,4℃保存备用。
2.2.2供试品溶液的制备
挥发油供试品溶液的制备:取2.1项下制备的挥发油20μL,加入1mL无水***,另加适量无水硫酸钠脱水,过滤至2mL棕色样品瓶中,再加入200μL二十二烷标准品溶液,加***至1.5mL,摇匀,密封,分别编号1-15,4℃保存备用。
芳香水供试品溶液的制备:取2.1项下芳香水溶液1mL,加3mL***振摇提取,分取***层溶液,加入无水硫酸钠适量脱水,过滤,准确量取0.5mL至样品瓶,另加入200μL二十二烷标准品溶液,加***至1.5mL,摇匀,密封。分别编号1-15,4℃保存备用。
2.3姜黄挥发油的GC-MS分析
2.3.1GC-MS的测定条件
HP-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm,0.1μm,弱极性),进样口温度250℃,进样量1.5μL,载气为氦气,柱温130℃,分流比20:1,程序升温为初始温度50℃,保持3min,以5℃·min-1的速率升温至140℃,以10℃min-1的速率升温至280℃,保持2min。EI离子源,离子源温度230℃,接口温度250℃,四极杆温度150℃,扫描质量范围m/z33~1000amu,溶剂延迟3min。
3实验结果
3.1 GC-MS总离子流图谱
挥发性成分经GC-MS分析所得总离子流图见图4。表明该色谱条件下,各成分可得到基本分离,满足后续研究定性及相对定量的要求。
3.2化合物信息
调用NIST 14.L数据库,解析总离子流图,整理芳香水、挥发油在不同时间点下的分析结果,共得到姜黄芳香性成分71个,见表1。
表1水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发性成分化合物信息
3.3提取特征分析
3.3.1主要特征性成分的确定
通过内标法计算各成分在不同时间段的相对含量。绘制姜黄挥发油提取过程的特征图谱,从提取时间聚类结果可知,芳香水溶液挥发性成分大部分在前13个时间点(即提取时间6.5小时)溶出,挥发油部分挥发性成分大部分在7-13个时间段溶出(即提取时间3.5-6.5小时溶出)。从挥发性成分聚类结果看,特征成分可分为9类:①芳姜黄酮,(CAS号:532-65-0);②姜黄新酮(又名curlone,CAS号:87440-60-6);③Tumerone(CAS号:180315-67-7);④A-姜黄烯(CAS号:644-30-4);⑤β-倍半水芹烯(CAS号:20307-83-9);⑥吉马酮(CAS号:6902-91-6);⑦(+)-α-柏木萜烯(CAS号:50894-66-1);⑧2,6-二叔丁基对甲酚(CAS号:128-37-0);⑨其他类成分。前8类成分含量占总含量的86.33%,可作为特征成分反映提取动力学规律,见图5。进一步分析可知,间异丙基甲苯、正二十四烷、Succinic acid,2-fluorophenyl 1-phenylpropyl ester、2-epi-.alpha.-Funebrene、Benzene,(1,1-dimethyldecyl)-、Tetratriacontane等9种成分特异性地分布于挥发油中,记为油中特有成分(only in oil);桉叶油醇、N-乙基间甲苯胺、(E)-β-金合欢烯、3'-甲基苯乙酮、反式角鲨烯、1,3-二甲基-4-乙基苯等39种成分特异性32地分布于芳香水中,记为水中特有成分(only in water);尚有23种成分在挥发油、芳香水中均有分布,记为油水共有成分(inboth oil and water)。
.3.2特征成分提取行为
绘制特征成分含量-提取时间关系图,从图6可看出,芳姜黄酮(CAS:532-65-0)、姜黄新酮(CAS:87440-60-6)、Tumerone(CAS:180315-67-7)、β-倍半水芹烯(CAS:20302-83-9)以及A-姜黄烯(CAS:644-30-4)为水部分主要芳香类成分,油中主要挥发性成分为芳姜黄酮。
从提取初始到结束,特征成分在高温作用下主要溶解或分散于水中,而在油中含量远远少于在水中含量分布,见图7a、7b所示,可能是由于某些水中特有成分的“乳化”作用所致,结合图7c可以看出,提取时间至100-400分钟时,芳香水中挥发性成分的含量持续升高,而且远远大于油中挥发性成分的含量。比较特殊的是水中特有成分(S)-β-甜没药烯(棕黄色成分)与芳香水中特征成分芳姜黄酮的增长趋势基本相同。
综上所述,水中特有成分(S)-β-甜没药烯可能发挥了“乳化剂”的作用,增加了特征成分在水中的分布,但具体诱发“乳化”的机制有待后续更深入的研究。
3.3.3水中特有成分对芳香水中特征成分提取行为的影响
由图8可知,随着水中特有成分的增加,芳香水中主要特征成分芳姜黄酮的含量显著升高,且二者呈线性关系;水中特有成分对姜黄酮、姜黄新酮则呈现先升高后降低的作用趋势,可能与二者随着提取时间的增加,含量逐渐降低有关。
线性回归方程表明,水中特有成分与芳姜黄酮的线性关系如下:
M芳姜黄酮=2.69×M水中特有成分+8.81(R2=0.7653,P<0.05)。
4实用性
《中国药典》仅对姜黄挥发油总量进行了控制,如“照挥发油测定法(附录X D)测定。本品含挥发油不得少于7.0%(ml/g)”,此种控制方法不利于不同产地姜黄质量的对比和区分,经本实验提取的主要特征成分可便捷地区分不同姜黄的产地,是本研究的重要实用价值体现。
本实验采集了不同产地的姜黄药材12批次,分别来自四川宜宾、四川乐山、四川屏山、云南红河、云南文山、云南河口、云南曲靖、云南洱源、云南瑞丽、陕西汉中、福建泉州和浙江温州,分别测定不同批次姜黄挥发油总量以及芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯的含量。如图9所示,各批次产地姜黄挥发油总量无显著性差异,仅仅依靠挥发油总量无法评价不同产地的药材质量。将所有测定指标进行PCA主成分分析,可得到影响产地分布的两个主成分,累计方差贡献率可达92.69%。
PC1=0.97挥发油总含量-0.14芳姜黄酮+0.15姜黄新酮+0.08A.姜黄烯
0.09+β.倍半水芹烯(挥发油含量正相关,方差贡献率54.94%);
PC2=0.64A.姜黄烯-0.06挥发油总含量+0.54芳姜黄酮+0.53姜黄新酮
+0.04β.倍半水芹烯+0.02吉马酮-0.09柏木萜烯(姜黄烯、芳姜黄酮、姜黄新酮含量正相关,方差贡献率37.75%)。
如图10所示:实验所得主成分可成功的区分来自不同产地的姜黄药材质量。其中云南产区质量最好,四川产区质量最差,其余地方质量居中。
综上:本发明的姜黄质量检测方法,不仅能检测姜黄挥发油中32种挥发性成分,芳香水中62种挥发性成分,还可用于区分姜黄药材的产地和质量,具有广泛应用前景。
Claims (10)
1.一种姜黄质量检测方法,其特征在于:它包括如下操作步骤:
1)内标溶液的制备:取正二十二烷,加***溶解,混匀得标准品溶液;
2)供试品溶液的制备:
a)取姜黄药材,加水浸泡,提取,提取液静置分层,分离油相和水相;
b)取步骤a)油相,加无水***稀释50~75倍,再加无水硫酸钠脱水,过滤,滤液加入步骤1)内标液和***,摇匀,作为挥发油供试品溶液;
c)取步骤a)水相,加***萃取,取***层溶液,加无水硫酸钠脱水,过滤,滤液加入步骤1)内标液和***,摇匀,作为芳香水供试品溶液;
3)分别将挥发油和芳香水供试品溶液注入气相色谱-质谱联用仪;色谱条件如下:
色谱柱:HP-5毛细管;程序升温:初始温度50℃,保持3min,以5℃·min-1的速率升温至140℃,以10℃min-1的速率升温至280℃,保持2min;
质谱条件:离子源:EI离子源;扫描质量范围m/z33~1000amu。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤1)所述正二十二烷与***的质量体积比为10-12mg:10ml。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤a所述姜黄药材与水的质量体积比为1g:8mL;所述浸泡30min;所述提取为水蒸汽蒸馏法提取,提取时间为7.5-8h,优先7.5h。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤b所述油相与无水***体积比为2:100;所述滤液与内标液和***体积比为5:2:8。
5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤c所述水相与***的体积比为1:(3-5),优选1:3;所述提取为振摇提取;所述滤液与内标液和***体积比为5:2:8。
6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤3)所述HP-5毛细管色谱柱规格为30m×0.25mm,0.1μm,弱极性;所述色谱条件中进样口温度250℃,进样量1.5μL,载气为氦气,柱温130℃,分流比20:1。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤3)所述质谱条件中离子源温度230℃,接口温度250℃,四极杆温度150℃,溶剂延迟3min。
8.根据权利要求1~7任意一项所述的检测方法,其特征在于,所述供试品溶液中挥发性成分相对含量用内标法计算。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述挥发性成分中的特征性成分相对含量,与挥发油总量用PCA法分析,得到的两个主成分对姜黄药材进行产地和/或质量区分。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,所述特征性成分为芳姜黄酮、姜黄新酮、A-姜黄烯、β-倍半水芹烯、吉马酮和(+)-α-柏木萜烯。
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