CN110079502B

CN110079502B - Pd-l1 car-nk细胞及其制备和应用

Info

Publication number: CN110079502B
Application number: CN201810124500.4A
Authority: CN
Inventors: 韩昆昆; 王保垒; 李华顺; 任宝永
Original assignee: Asclepius Suzhou Technology Company Group Co Ltd
Current assignee: Sichuan Asikeli Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2038-02-07
Also published as: CN110079502A

Abstract

本发明提供一种PD‑L1 CAR‑NK细胞，所述PD‑L1 CAR‑NK细胞能够表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原PD‑L1配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。本发明提供的PD‑L1 CAR‑NK细胞至少具有如下优势之一：本发明通过将PD‑L1受体用于CAR‑NK细胞的构建，其以PD‑L1分子为靶抗原，利用PD‑L1 CAR‑NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞。其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于PD‑L1分子高表达的肿瘤的治疗，为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法。

Description

PD-L1 CAR-NK细胞及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及PD-L1 CAR-NK及其制备和应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。CAR基因主要包括细胞外识别域和细胞内信号转导结构域：前者用于识别肿瘤表面特异性分子和后者用于启动识别肿瘤表面分子后的免疫细胞应答，发挥细胞毒作用。这是一个出现了很多年，但是近几年才被改良使用到临床上的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。但是CAR-T存在本身的缺陷，一方面临床使用中存在细胞因子风暴的风险，难以控制，严重时会造成患者死亡。另一面，CAR-T属于个性化治疗，不能异体回输限制了其大规模的制备。

自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫***的重要组成部分，先天免疫***反应的关键性介质细胞。NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且不需要提前致敏或HLA配型，即可展示强大的溶解异常细胞的活性。使用免疫细胞(包括NK细胞)来治疗癌症是近年来新趋势，这种新疗法有望为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治愈希望。

程序性死亡受体1(PD-1,programmed cell death-1)是一种重要的免疫抑制分子。为CD28超家族成员，其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11 克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。由日本京都大学本庶佑教授于1992年发现。

程序性死亡配体1(PD-L1,programmed cell death-Ligand 1)是大小为 40kDa的第一型跨膜蛋白，PD-L1(B7-H1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用；正常情形下免疫***会对聚集在***或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞 (CD8+Tcell)增生。而细胞程序化死亡受体-1(PD-1)与细胞程序性死亡 -配体1(PD-L1)结合，可以传导抑制性的信号，降低***CD8+T细胞的增生，而且PD-1还可以借由调节Bcl-2基因，控制***中抗原特异性T 细胞的聚积。该分子具有广泛的组织表达谱，在一些肿瘤细胞系上有较高的表达，许多研究均表明其与肿瘤的免疫逃逸机制相关。肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，且表达广泛，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种PD-L1 CAR-NK细胞及其制备和应用，该细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，具有更高效的肿瘤杀伤活性。

本发明提供一种PD-L1 CAR-NK细胞，所述PD-L1 CAR-NK细胞能够表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原PD-L1配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。

示例性地，所述的跨膜结构域选自：CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、 CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154 中的一种或多种的跨膜结构域；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域。

示例性地，所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、 CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、 4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含 4-1BB和CD3ζ胞内结构域。

示例性地，PD-L1 CAR-NK细胞能够表达ScFV-CD8 α hinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，该融合蛋白能够特异性识别肿瘤特异性的PD-L1配体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述ScFV-CD8 α hinge-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：1 所示或其同源序列等。

示例性地，所述同源序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、 82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

示例性地，所述ScFV-CD8 α hinge-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示或其简并序列等。

示例性地，所述简并序列与原序列的同源性约60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、 82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述PD-L1CAR-NK细胞能够有效地杀伤和/或杀死肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MDMB-231、结肠癌细胞 SW480、乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞H1299等。

本发明另一方面还提供了上述PD-L1CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：

(1)合成和扩增ScFV-CD8 α hinge-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述ScFV-CD8 α hinge-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；

(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染 293T细胞，包装和制备慢病毒；

(3)利用步骤(2)得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到CAR-NK细胞。

本发明还提供上述PD-L1 CAR-NK细胞在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。

示例性地，PD-L1 CAR-NK细胞在制备治疗高表达PD-L1配体的癌症的药物中的应用。

示例性地，所述癌症为乳腺癌、结肠癌或肺癌等。

本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述PD-L1 CAR-NK细胞，以及任选地，药学上可接受的辅料。

本发明提供的PD-L1 CAR-NK细胞至少具有如下优势之一：本发明通过将PD-L1配体用于CAR-NK细胞的构建，其以PD-L1配体为靶抗原，利用PD-L1 CAR-NK细胞特异性地杀伤肿瘤细胞。其可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于PD-L1配体高表达的肿瘤的治疗，为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法。

附图说明

图1所示为本发明实施例提供的慢病毒质粒载体PRRLSIN-PD-L1的结构示意图。

图2a-2b所示为本发明实施例提供的PD-L1 CAR-NK流式检测CAR细胞阳性率的结果图，其中，图2a为对照组；图2b为实验组。

图3a-3e所示为本发明实施例提供的利用常规流式方法检测不同肿瘤细胞中PD-L1配体的表达的结果图。

其中，图3a为肺癌细胞A549的实验结果；图3b为肺癌细胞H1299的实验结果；图3c为乳腺癌细胞MCF-7的实验结果；图3d为乳腺癌细胞 MDMB-231的实验结果；图3e为结肠癌细胞SW480的实验结果。

图4a-4e所示为本发明实施例提供的PD-L1 CAR-NK细胞杀伤不同肿瘤细胞的实验结果图。

其中，图4a为肺癌细胞A549的实验结果；图4b为肺癌细胞H1299的实验结果；图4c为乳腺癌细胞MCF-7的实验结果；图4d为乳腺癌细胞 MDMB-231的实验结果；图4e为结肠癌细胞SW480的实验结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

具体而言，本发明所述的编码ScFV-CD8 α hinge-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列是任何能够编码该融合蛋白的任何DNA序列，优选地，该序列为SEQ ID NO：2或其互补序列。另一方面，本发明所述的编码ScFV-CD8 α hinge-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸的序列可为在严紧条件下与由SEQ ID NO：2的核苷酸序列进行杂交、且编码该融合蛋白的多核苷酸或其互补序列；

本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为40℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50℃、5×SSC、 5×Denhardt液、0.5％SDS、52％甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的严紧度。

除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用***设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约 60％或以上、约70％或以上、71％或以上、72％或以上、73％或以上、74％或以上、75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、 99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸。

核苷酸序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的算法规则BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268,1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873,1993)来确定。基于BLAST算法规则的程序BLASTN、BLASTX已被开发(Altschul SF,et al:J MolBiol 215:403,1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，如使参数为score＝100、wordlength＝12；此外使用BLASTX分析氨基酸序列时，如使参数为score＝50、wordlength＝3；使用BLAST和Gapped BLAST程序时，采用各程序的***可设定默认参数值。

除非另有规定，“编码核苷酸”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列可包括内含子。

术语“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属，其能够有效感染非周期性和有丝***后的细胞；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因传递载体的最有效的方法之一。

术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需要的，由细胞的合成机器识别或引导合成机器的DNA序列。

术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子。

术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。

术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴***蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌结肠直肠癌、肝癌、肺癌等等。

如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

本文中出现的英文名称不区分大小写；PD-L1CAR-NK、PD-L1-CAR NK 表示的含义相同；PD-L1CAR-NK与PD-L1-CAR NK表示相同的含义，均表示抗PD-L1分子的CAR-NK细胞；NK-92、NK92均表示NK92细胞；CD8^TM表示跨膜结构域。

本发明所述的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞，NK-YS细胞，KHYG-1 细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK-92细胞为例进行说明。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例1慢病毒载体的制备

基因合成ScFV(Anti PD-L1)-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示)，通过酶切，将ScFV-CD8^TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到PRRSLIN载体中，基因上游为EP-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PRRLSIN-PD-L1慢病毒转染载体(如图1所示)。

实施例2慢病毒的制备

(1)转染前24小时，以每皿约8×10⁶将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。

(2)准备溶液A和溶液B

溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液(5个大皿一起包装的量，效果最好)。

溶液B：分别加入以下质粒的混合物：112.5μg PRRLSIN-PD-L1(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol， tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液A总体积：6.25ml。

充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置5-15 分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在 48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜(0.45μm)过滤。以70％乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28centrifuge tubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖(每8ml上清液加1ml蔗糖)。以PBS平衡离心管，25000rpm(82，700g)，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl PBS，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。冰上冷却后，置于-80℃保存。

实施例3PD-L1CAR-NK细胞的制备

将NK-92细胞密度调整至2-3×10⁵/ml，按体积比(V/V)病毒载体：细胞培养基＝1:5～10比例添加病毒载体，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×10⁵/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2-3×10⁵/ml。72h后进行CAR抗体染色，同时流式分选 PD-L1CAR NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。

利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图2a和图2b 所示。图2a为对照组，为未转CAR分子的NK92细胞；图2b为实验组，为转CAR分子的NK-92细胞。图2a和图2b中，纵坐标SSC-H表示流式侧向散射数值，FSC-H表示流式前向散射数值，这两个参数主要用于圈定出两组用于分析的活细胞，如图上椭圆圈定处；APC-H表示用抗体染色后荧光强度，该荧光强度越强，表示与对照组相比PD-L1CAR NK-92细胞阳性比率越大。从图2a和图2b中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达出CAR分子，CAR-NK92阳性率为98.25％。

实施例4PD-L1 CAR-NK细胞对体外肿瘤杀伤效果的评估

为了确定用于PD-L1CAR NK-92检测的肿瘤细胞，利用常规流式分析方法对常见的肿瘤细胞进行PD-L1分子的表达检测。其中，选取的肿瘤细胞分别为肺癌细胞A549、乳腺癌MDMB-231细胞、结肠癌细胞SW480、乳腺癌MCF-7细胞和肺癌细胞H1299，其实验结果如图3a-e所示。

图3a为肺癌细胞A549的实验结果；图3b为肺癌细胞H1299的实验结果；图3c为乳腺癌细胞MCF-7的实验结果；图3d为乳腺癌细胞MDMB-231 的实验结果；图3e为结肠癌细胞SW480的实验结果。

从图3a-3e中可以看出，肺癌细胞A549、肺癌细胞H1299和结肠癌细胞SW480低表达，表达率分别为0.48％、32.28％和30.64％；乳腺癌MCF-7 细胞中度表达，表达率为61.4％；乳腺癌MDA-MB-231细胞高表达，表达率为95.49％。

检测PD-L1CAR-NK细胞对上述不同肿瘤细胞系的杀伤效果。实验操作方法如下：

1)提前一天将上述五种不同的实体瘤细胞(40000个)均匀的铺于24 孔中，待细胞贴壁；

2)第二天按照0.5:1和1:1的效靶比例，将PD-L1-CARNK92铺在24 孔中(分别为20000个和40000个细胞)，总体系为1ml，37度孵育4小时；

3)作用4小时后，将培养基舍去，加PBS轻轻地漂洗两次，加入CCK8 试剂200ul，37℃作用1-4小时；

4)450nm处读板计算细胞杀伤率。

PD-L1CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如下表1及图 4a-4e所示。

表1PD-L1CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤效果

图4a-4e中，纵坐标表示杀伤效率，横坐标表示效靶比。其中图4a为肺癌细胞A549的实验结果；图4b为肺癌细胞H1299的实验结果；图4c为乳腺癌细胞MCF-7的实验结果；图4d为乳腺癌细胞MDMB-231的实验结果；图4e为结肠癌细胞SW480的实验结果。

如表1及图4a-4e所示，针对高表达PD-L1配体的MDMB-231细胞，在效靶比为0.5:1和1:1的条件下，PD-L1CAR-NK杀伤效果优于普通NK-92 细胞，在1:1效靶比条件下杀伤效果可达到80％。针对中度表达PD-L1配体的MCF-7细胞，PD-L1CAR-NK杀伤效果优于普通NK-92，1:1效靶比条件下杀伤效果可达到65％。针对其它低表达PD-L1配体的肿瘤细胞，PD-L1CAR-NK杀伤效果也优于普通NK-92细胞。即PD-L1CAR-NK的杀伤效果均优于普通的NK-92细胞，但对于低表达PD-L1配体的细胞的杀伤效果不如高表达该配体的肿瘤细胞效果明显。

本实施例成功构建了PD-L1CAR-NK细胞，该细胞能够有效杀伤和/或杀死表达PD-L1配体的肿瘤细胞，对PD-L1表达高的肿瘤细胞杀伤效果尤其显著。PDL-1CAR-NK细胞以PDL-1为靶点，不仅具备良好的肿瘤杀伤活性，同时该细胞可以异体回输，成为真正的“货架”细胞药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李华顺

<120> PD-L1 CAR-NK细胞及其制备和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ScFV-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

130 135 140

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr

165 170 175

Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro

210 215 220

Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

245 250 255

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

260 265 270

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

275 280 285

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

290 295 300

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

325 330 335

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

370 375 380

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

385 390 395 400

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

420 425 430

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

435 440 445

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455 460

<210> 2

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ScFV-CD8αhinge-CD8-4-1BB-CD3ζ

<400> 2

gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggaga tagagtgacc 60

atcacctgca gggcctctca ggacgtgtct acagccgtgg cttggtacca gcagaagcca 120

ggaaaggccc ccaagctgct gatctacagc gcctctttcc tgtacagcgg cgtgcctagc 180

agattcagcg gcagcggaag cggcaccgat ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacctgtacc acccagccac attcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa gggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggaggagga 360

ggatcggagg tgcagctggt ggaatcagga ggaggactgg tgcagccagg aggatctctg 420

agactgtctt gcgccgccag cggctttaca ttcagcgact cttggattca ctgggtgcgc 480

caggctccag gaaaaggact cgagtgggtg gcttggatca gcccttacgg cggcagcacc 540

tactacgccg atagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg ccgataccag caagaacacc 600

gcctacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggataccg ccgtgtacta ttgcgccagg 660

aggcattggc caggcggatt tgactattgg ggccagggaa cactggtgac agtgtctagc 720

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 780

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 840

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 900

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 960

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1020

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1260

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1320

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1380

ccccctcgct aa 1392

Claims

1.PD-L1 CAR-NK细胞，所述PD-L1 CAR-NK细胞能够表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原PD-L1配体，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞；

所述嵌合抗原受体是结构为ScFV-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，其中所述的ScFV能够特异性结合肿瘤特异性的PD-L1配体；

所述ScFV-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸的序列如SEQ ID NO：1所示；

所述NK细胞为NK-92细胞。

2.根据权利要求1所述的PD-L1 CAR-NK细胞，其特征在于，所述ScFV-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示或其简并序列。

3.如权利要求1或2所述的PD-L1 CAR-NK细胞，其能够有效地杀伤和/或杀死肺癌细胞A549、乳腺癌MDMB-231细胞、结肠癌细胞SW480、乳腺癌MCF-7细胞和肺癌细胞H1299。

4.权利要求1-3中任一项所述PD-L1 CAR-NK细胞的制备方法，其包括如下步骤：

（1）合成和扩增编码权利要求1-3中任一项所述的ScFV-CD8αhinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸，并将所述核苷酸克隆到慢病毒表达载体上；

（2）利用慢病毒包装质粒和步骤（1）得到的慢病毒表达载体质粒感染细胞，包装和制备慢病毒；

（3）利用步骤（2）得到的慢病毒感染NK-92细胞，得到CAR-NK细胞。

5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-3中任一项所述的PD-L1 CAR-NK细胞和/或权利要求4所制备的PD-L1 CAR-NK细胞。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其还包括药学可接受的辅料。

7.权利要求1-3中任一项所述的PD-L1 CAR-NK细胞和/或权利要求4所制备的PD-L1CAR-NK细胞在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；所述癌症为肺癌、乳腺癌和/或结肠癌。