CN110079489B

CN110079489B - 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法

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Publication number: CN110079489B
Application number: CN201810074387.3A
Authority: CN
Inventors: 叶健文; 陈国强; 尹进; 相瑞娟
Original assignee: Bluepha Co ltd; Tsinghua University
Current assignee: Bluepha Co ltd; Tsinghua University
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN110079489A

Abstract

本发明公开了一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB‑co‑4HB)的方法。所述重组盐单胞菌通过将编码4‑羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、编码2‑酮戊二酸脱羧酶的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和编码4‑羟基丁酸脱氢酶的基因引入出发菌盐单胞菌中而得到。本发明的重组盐单胞菌能够利用4HB结构非相关碳源(如葡萄糖、甘油、脂肪酸等)合成P(3HB‑co‑4HB)，从而无需添加相关碳源，降低P(3HB‑co‑4HB)的生产成本。

Description

一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法

技术领域

本发明涉及一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法，更具体而言，涉及一种能够实现非相关碳源生产P(3HB-co-4HB)的重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHAs)是一种可以由多种微生物菌株生产和积累的可降解聚合物，根据其组成单体的数目可分为均聚物和共聚物。PHA是一种环境友好型材料，有着广泛的应用前景，可以作为传统石油基塑料替代品。聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxybutyrate,P3HB)是目前PHAs家族成员中研究的最为清楚的，但它的应用却受到自身性能的限制，如结晶度高、弹性低、柔韧度差等。

3-羟基丁酸-4-羟基丁酸共聚物(P(3HB-co-4HB))是由3-羟基丁酸(3HB)和4-羟基丁酸(4HB)两种单体随机排列组成，具有良好的生物降解性和生物相容性。P(3HB-co-4HB)还可以通过改变其4HB的摩尔分数来调整其物理、化学性能和医学特点，从而获得硬质结晶塑料或者柔软弹性橡胶聚合材料。因而，P(3HB-co-4HB)作为化学塑料的替代品之一备受关注。目前，P(3HB-co-4HB)有多种应用，例如气体过滤薄膜，药物载体，细胞支架等，而P(3HB-co-4HB)的生物合成和工业化生产对其广泛应用至关重要。

据研究报道，多种细菌可以利用结构相关碳源或者非相关碳源来合成P(3HB-co-4HB)，其中，富养产碱菌(Ralstonia eutropha)，贪铜菌属(Cupriavidus)和大肠杆菌(Escherichia coli)是目前研究的最为清楚的P(3HB-co-4HB)生产菌株，但在生产过程中需要加入4HB结构相关碳源4-羟基丁酸，γ-丁内酯等。1997年，经过代谢工程改造的大肠杆菌(Escherichia coli)第一次可以利用葡萄糖生产P(3HB-co-2.8mol％4HB)。

在大肠杆菌(Escherichia coli)中，可以通过敲除两种编码琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的基因sad和gabD来优化4HB的合成通路，从而获得能够利用葡萄糖生产4HB摩尔分数含量较高的P(3HB-co-4HB)；CRISPRi基因编辑工具可以直接在基因组上进行基因编辑，从而避免在生产时额外加入抗生素；加长的微生物细胞可以有更大的空间来积累PHA；这些技术的应用都可以获得较高的P(3HB-co-4HB)产量。然而，底物成本高、污染风险高、发酵过程复杂、4HB摩尔分数含量低等依然是P(3HB-co-4HB)产业化的瓶颈问题。因此，降低P(3HB-co-4HB)的生产成本，提高4HB摩尔分数是目前生产应用的两大关键因素。

CN102120973A公开的从新疆艾丁湖筛选出的嗜盐微生物盐单胞菌HalomonasTD01(保藏号为CGMCC No.4353)，是一种PHA超级生产菌。它可以在高盐、高pH的条件下生长并积累PHA，从而实现在不灭菌的条件下进行连续发酵并持续高效地生产PHA。HalomonasTD01作为低成本生产PHAs的潜力菌株，可以作为许多产品的底盘菌株，如P3HB，PHBV，PhaR蛋白等。因此，用Halomonas TD01作为底盘菌株来进行P(3HB-co-4HB)的生产开发是非常有竞争力和必要的。

Halomonas TD01经基因改造可加添加相关碳源(如γ-丁内酯)的情况下合成P(3HB-co-4HB)(Chen,X.,Yin,J.,Ye,J.,Zhang,H.,Che,X.,Ma,Y.,Li,M.,Wu,L.P.,Chen,G.Q.,2017.Engineering Halomonas bluephagenesis TD01for non-sterile productionof poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Bioresour.Technol.,244,534-541)，但是相关碳源的添加会给P(3HB-co-4HB)的生产带来额外成本。因此，目前重组盐单胞菌合成P(3HB-co-4HB)，需要额外加入4HB结构相关碳源，带来额外的成本，且加入的4HB结构相关碳源对细胞生长有毒性，会影响细胞生长和PHA产量。因此，虽然盐单胞菌Halomonas TD01有潜力作为PHA的工业生产菌，但是野生型菌株无法合成更具有应用前景的P(3HB-co-4HB)。目前基因改造的盐单胞菌能够合成P(3HB-co-4HB)，但均需通过额外添加相关碳源(如γ-丁内酯)来实现。因此，需要将Halomonas TD01改造为利用结构非相关碳源(如葡萄糖、甘油、脂肪酸等)直接生产P(3HB-co-4HB)，而无需额外添加结构相关碳源。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终完成本发明。

本发明的一个目的是提供一种重组盐单胞菌，其能够利用4HB结构非相关碳源(如葡萄糖、甘油、脂肪酸等)合成P(3HB-co-4HB)，从而无需添加相关碳源，降低P(3HB-co-4HB)的生产成本。

本发明的另一个目的是提供一种生产P(3HB-co-4HB)的方法。

根据一个方面，本发明提供了一种重组盐单胞菌，其通过将编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因(例如，orfZ基因)、编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因(例如，ogdA基因)、编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因(例如，sucD基因)和编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因(例如，4hbd基因)引入出发菌盐单胞菌中而得到。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述出发菌盐单胞菌可为Halomonas TD01。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因可以是能够将4-羟基丁酸催化为4-羟基丁酰辅酶A的酶的基因，其实例可包括来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridium kluyveri)的orfZ基因。优选地，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因可以如SEQ ID NO:20所述，或者是将SEQ ID NO:20经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:20衍生的DNA分子。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶可以如SEQ IDNO:21所述，或者是将SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:21衍生的蛋白质。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因可以是能够将2-酮戊二酸催化为琥珀酸半醛的酶的基因，其实例可包括来自聚球蓝细菌(Synechococcussp.)的ogdA基因。优选地，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因可以如SEQ ID NO:22所述，或者是将SEQ ID NO:22经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:22衍生的DNA分子。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述2-酮戊二酸脱羧酶可以如SEQ ID NO:23所述，或者是将SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:23衍生的蛋白质。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因可以是能够将琥珀酰辅酶A催化为琥珀酸半醛的酶的基因，其实例可包括来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridium kluyveri)的sucD基因。优选地，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因可以如SEQ ID NO:24所述，或者是将SEQ ID NO:24经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:24衍生的DNA分子。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述琥珀酸半醛脱氢酶可以如SEQ ID NO:25所述，或者是将SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:25衍生的蛋白质。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因可以是能够将琥珀酸半醛催化为4-羟基丁酸的酶的基因，其实例可包括来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridiumkluyveri)的4hbd基因。优选地，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因可以如SEQ ID NO:26所述，或者是将SEQ ID NO:26经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:26衍生的DNA分子。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述4-羟基丁酸脱氢酶可以如SEQ ID NO:27所述，或者是将SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由SEQ ID NO:27衍生的蛋白质。

优选地，本发明的重组盐单胞菌可以是通过将包含编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因的质粒载体和包含编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因的质粒载体引入出发菌盐单胞菌中而得到。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述质粒载体可以是能够在盐单胞菌中复制，用于表达基因的载体，其实例可包括但不限于pSEVA321，pSEVA331，pSEVA341，pBBR1MCS-1等。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，可以敲除盐单胞菌基因组上的编码的琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的基因(例如，gabD基因)，从而可以提高P(3HB-co-4HB)中4HB的比例。本发明经实验验证，将盐单胞菌基因组上的gabD基因敲除后，重组盐单胞菌在结构非相关碳源(例如，葡萄糖)为底物合成的P(3HB-co-4HB)中4HB的比例上升。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因被整合到盐单胞菌基因组上，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因在质粒载体上。

本发明的重组盐单胞菌中，优选地，以基因组为载体包含所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因可以由诱导型启动子或组成型启动子控制。优选地，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因可以由如下启动子序列来控制：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因可以由诱导型启动子或组成型启动子控制。优选地，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因可以由如下启动子序列来控制：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因可以由诱导型启动子或组成型启动子控制。优选地，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因由如下启动子序列来控制：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73。

本发明的重组盐单胞菌中，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因可以由诱导型启动子或组成型启动子控制。优选地，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因可以由如下启动子序列来控制：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73。

优选地，本发明的重组盐单胞菌可以选自Halomonas TDWT-D2、Halomonas TDG-D2、Halomonas TD68/LP4so、Halomonas TD68-LP4so、Halomonas TD68-4so68、HalomonasTD68-4so194、Halomonas TD50-4so68和Halomonas TD50-4so194中。

本发明中，Halomonas TDWT-D2、Halomonas TDG-D2、Halomonas TD68/LP4so、Halomonas TD68-LP4so、Halomonas TD68-4so68、Halomonas TD68-4so194、HalomonasTD50-4so68和Halomonas TD50-4so194均是实施例中制备的重组盐单胞菌。

根据另一个方面，本发明提供了一种生产P(3HB-co-4HB)的方法，其特征在于，利用本发明的重组盐单胞菌生产P(3HB-co-4HB)。

本发明的生产P(3HB-co-4HB)的方法中，可以利用4HB结构非相关碳源(如葡萄糖)进行P(3HB-co-4HB)生产，无需额外添加相关碳源(如γ-丁内酯)。

本发明中，术语“相关碳源”是指4-羟基丁酸及化学结构与4-羟基丁酸相似的化合物，其实例包括1,4-丁二醇、γ-丁内酯等；“非相关碳源”是指相关碳源以外的，作为微生物培养的一般碳源，其实例包括葡萄糖、甘油、脂肪酸等。

本发明经实验验证，出发菌盐单胞菌Halomonas TD01在非相关碳源(葡萄糖)为底物时，所积累的PHA当中不含有4HB组分，而本发明的重组菌所积累的PHA当中检测到了4HB组分，说明4个基因能够在盐单胞菌中实现非相关碳源为底物合成P(3HB-co-4HB)。因此，本发明构建的重组盐单胞菌，实现了利用4HB结构非相关碳源(如葡萄糖)进行P(3HB-co-4HB)生产，无需额外添加相关碳源(如γ-丁内酯)，在工业生产上能够降低成本，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为显示利用非相关碳源生产P(3HB-co-4HB)的代谢通路的示意图。

图2为两个质粒载体的示意图。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

所用酶试剂采购自ThermoFisher公司和New England Biolabs(NEB)公司，质粒构建方法为Gibson Assembly，质粒提取试剂盒购自Qiangen(Shanghai,China)。引物和DNA片段的合成由Life Technologies(Carlsbad,USA)完成。基因片段的合成由无锡青兰生物科技有限公司完成。相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)大肠杆菌培养基

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

2)嗜盐菌培养基

60LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，60g/L NaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

60MMG培养基：60g/L NaCl，30g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，2g/L NH₄Cl，0.2g/LMgSO₄，9.65g/L Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g/L KH₂PO₄，10ml/L微量元素溶液I和1ml/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl₂，用1M HCl配制。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO₄·7H₂O，30mg/L MnCl₂·4H₂O，300mg/L H₃BO₃，200mg/LCoCl₂·6H₂O，10mg/L CuSO₄·5H₂O，20mg/L NiCl₂·6H₂O，30mg/L NaMoO₄·2H₂O，用1M HCl配制。培养基的最终pH用5M NaOH溶液调至8.5。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。

在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素或25μg/mL的氯霉素。

接合转化：

接合转化是一种将质粒转入Halomonas TD01的有效方法。本研究中，通过接合转化将质粒由E.coli S17-1pir中转入Halomonas TD01菌株。

1)60LB液体培养基培养受体菌Halomonas TD01(可由清华大学提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4353)，LB液体培养基中加入对应的抗生素培养带质粒的供体菌E.coli S17-1pir(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，培养至对数期前期，OD600在0.6-0.8之间。

2)分别取1ml菌体于1.5ml EP管中，4℃，5,000g，离心10min，收集菌体，用LB培养基(或60LB培养基)洗涤菌体。

3)以1:1的比例混合供体菌和受体菌，并将混合菌液滴于含有相应抗生素的60LB平板中央，平板保持正置，置于37℃培养6-8h。

4)向平板上加入200-300μl 60LB，将平板中央的菌苔重悬并涂布到整个平板。

5)平板倒置于37℃培养箱中直到长出克隆。

摇瓶实验48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，方法如下：

用量筒量取30ml菌液放入50ml离心管，10000rpm离心10min收集菌体。用去离子水重悬细胞洗涤一次，10000rpm离心10min，弃掉上清。将菌体在-80℃冷冻1h后，进行真空冷冻干燥12h以上至完全去除水分。称量取样前后离心管重量，其差值为细胞干重CDW。

酯化液的配制：取485ml无水甲醇，加入1g/L苯甲酸，缓慢加入15ml浓硫酸，即制成约500ml的酯化液。

样品制备：称取30至60mg冷冻干燥后的菌体，精确称重后置于酯化管中，加入2ml酯化液和2ml氯仿。称取10mg左右的PHA样品，同样方式处理作为标准样品。酯化管加盖密封后100度反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1ml去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(GC)分析。

GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，丙酮为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240度，检测器温度250度，柱温起始温度为80度，维持1.5分钟；以30度/分钟的速率升至140度并维持0分钟；以40度/分钟的速率升至240度并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHA组成及含量。

实施例1：盐单胞菌TD01中以非相关碳源为底物合成P(3HB-co-4HB)的质粒载体

本发明在盐单胞菌TD01中引入了两个不同的酶(琥珀酸半醛脱氢酶sucD和2-酮戊二酸脱羧酶ogdA)合成4HB前体----琥珀酸半醛(SSA)的代谢途径，这两条途径在下游利用共同的酶(4-羟基丁酸脱氢酶4hbd，4-羟基丁酰辅酶A转移酶orfZ)将SSA转化生成4HB-CoA，然后和TD01自身代谢生产的3HB-CoA在PHA合酶(phaC)的作用下实现P(3HB-co-4HB)的合成，相关原理见附图1。

以质粒pSEVA321(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The StandardEuropean Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis anddeployment of complex prokaryotic phenotypes.Nucleic Acids Res.41,666–675.)为模板，用引物扩增得到质粒骨架；以质粒pRE112-pMB1(Fu XZ,Tan D,Ai***la G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Development of Halomonas TD01as a host for openproduction of chemicals.Metab Eng23:78–91)为模板，用引物扩增得到启动子片段；以合成的ogdA片段(由无锡青兰生物科技有限公司合成)为模板，用引物扩增得到ogdA基因片段。上述3片段通过Gibson Assembly方法连接，得到质粒pSEVA321-porin-ogdA。所用的引物信息如下：

以质粒pSEVA321-porin-ogdA为模板，用引物扩增得到含有质粒骨架和ogdA的片段；以质粒pMCSH5(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production ofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources bymetabolically engineered Escherichia coli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板，用引物扩增得到含有sucD和4hbd的片段；上述两个片段通过Gibson Assembly方法连接，得到质粒pSEVA321-porin-os4-Cm。所用引物信息如下：

以质粒pSEVA341(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The StandardEuropean Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis anddeployment of complex prokaryotic phenotypes.Nucleic Acids Res.41,666–675.)为模板，用引物扩增得到质粒骨架；以质粒p68orfZ(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)fromunrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichiacoli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板扩增得到含有orfZ基因的片段；以质粒pSEVA434(Silva-Rocha,R.,de Lorenzo,V.,2013.The Standard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for the analysis and deployment of complexprokaryotic phenotypes.Nucleic Acids Res.41,666–675.)为模板，用引物扩增得到含有壮观霉素抗性基因的片段；将上述3片段用Gibson Assembly方法连接，得到质粒pSEVA341-orfZ-spe。所用引物信息如下：

以质粒pSEVA341-orfZ-spe为模板，用引物扩增得到含有质粒骨架和orfZ基因的片段；以质粒p68orfZ为模板，用引物扩增得到含有氨苄霉素抗性基因的片段；将2个片段通过Gibson Assembly的方法连接，得到质粒pSEVA341-orfZ-Am-Spe。所用引物信息如下：

两个质粒pSEVA341-orfZ-Am-Spe和pSEVA321-porin-os4-Cm即为在盐单胞菌中实现非相关碳源合成P(3HB-co-4HB)的载体。其中pSEVA341-orfZ-Am-Spe包含编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的orfZ基因；pSEVA321-porin-os4-Cm包含编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因ogdA，编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因sucD，编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因4hbd。载体结构示意图见附图2。

所述orfZ基因序列为：

ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAGAAACTGGTAACTGCAGAAAAAGCTGTTTCAAAAATAGAAAACCATAGCAGGGTAGTTTTTGCACATGCAGTAGGAGAACCCGTAGATTTAGTAAATGCACTAGTTAAAAATAAGGATAATTATATAGGACTAGAAATAGTTCACATGGTAGCTATGGGCAAAGGTGAATATACAAAAGAGGGTATGCAAAGACATTTTAGACATAATGCTTTATTTGTAGGCGGATGTACTAGAGATGCAGTAAATTCAGGAAGAGCAGATTATACACCTTGTTTTTTCTATGAAGTGCCAAGTTTGTTTAAAGAAAAACGTTTGCCTGTAGATGTAGCACTTATTCAGGTAAGTGAGCCAGATAAATATGGCTACTGCAGTTTTGGAGTTTCCAATGACTATACCAAGCCAGCAGCAGAAAGTGCTAAGCTTGTAATTGCAGAAGTGAATAAAAACATGCCAAGAACTCTTGGAGATTCTTTTATACATGTATCAGATATTGATTATATAGTGGAAGCTTCACACCCATTGTTAGAATTGCAGCCTCCTAAATTGGGAGATGTAGAAAAAGCCATAGGAGAAAACTGTGCATCTTTAATTGAAGATGGAGCTACTCTTCAGCTTGGAATAGGTGCTATACCAGATGCGGTACTTTTATTCTTAAAGAACAAAAAGAATTTAGGAATACATTCTGAGATGATATCAGATGGTGTGATGGAACTGGTGAAGGCAGGGGTTATCAATAACAAGAAAAAGACCCTCCATCCAGGCAAAATAGTTGTAACATTTTTAATGGGAACAAAAAAATTATATGATTTTGTAAACAATAATCCAATGGTAGAAACTTATTCTGTAGATTATGTAAATAATCCACTGGTAATTATGAAAAATGACAATATGGTTTCAATAAATTCTTGTGTTCAAGTAGACTTAATGGGACAAGTATGTTCTGAAAGTATAGGATTGAAACAGATAAGTGGAGTGGGAGGCCAGGTAGATTTTATTAGAGGAGCTAATCTATCAAAGGGTGGAAAGGCTATTATAGCTATACCTTCCACAGCTGGAAAAGGAAAAGTTTCAAGAATAACTCCACTTCTAGATACTGGTGCTGCAGTTACAACTTCTAGAAATGAAGTAGATTATGTAGTTACTGAATATGGTGTTGCTCATCTTAAGGGCAAAACTTTAAGAAATAGGGCAAGAGCTCTAATAAATATCGCTCATCCAAAATTCAGAGAATCATTAATGAATGAATTTAAAAAGAGATTTTAG(SEQ ID NO:20)

所述orfZ基因所编码的4-羟基丁酰辅酶A转移酶的氨基酸序列为：

MEWEEIYKEKLVTAEKAVSKIENHSRVVFAHAVGEPVDLVNALVKNKDNYIGLEIVHMVAMGKGEYTKEGMQRHFRHNALFVGGCTRDAVNSGRADYTPCFFYEVPSLFKEKRLPVDVALIQVSEPDKYGYCSFGVSNDYTKPAAESAKLVIAEVNKNMPRTLGDSFIHVSDIDYIVEASHPLLELQPPKLGDVEKAIGENCASLIEDGATLQLGIGAIPDAVLLFLKNKKNLGIHSEMISDGVMELVKAGVINNKKKTLHPGKIVVTFLMGTKKLYDFVNNNPMVETYSVDYVNNPLVIMKNDNMVSINSCVQVDLMGQVCSESIGLKQISGVGGQVDFIRGANLSKGGKAIIAIPSTAGKGKVSRITPLLDTGAAVTTSRNEVDYVVTEYGVAHLKGKTLRNRARALINIAHPKFRESLMNEFKKRF*(*代表蛋白质的终止密码子)(SEQ ID NO:21)

所述ogdA基因序列为：

ATGAATACTGCAGAATTATTGATCCGATGTCTAGAAAATGAAGGGGTGGAGTATATTTTTGGGCTGCCGGGGGAAGAAAATCTCCATATCCTCGAAGCCCTTAAGGAGTCTCCCATCCGCTTTATCACCGTCCGCCATGAACAGGGTGCCGCTTTTATGGCCGATGTGTATGGTCGTTTAACCGGGAAAGCAGGGGTTTGTCTGTCTACCCTGGGGCCTGGGGCTACCAATCTAATGACTGGGGTTGCCGATGCGAACCTCGATGGGGCGCCCCTGATTGCGATTACAGGGCAGGTGGGTACCGACCGCATGCACATTGAATCCCACCAATATCTTGATCTGGTGGCGATGTTTGCCCCCGTCACCAAGTGGAATAAACAAATTGTCCGACCGAACACGACCCCGGAGGTGGTACGTCGTGCCTTTAAAATTGCCCAGCAGGAAAAACCAGGGGCAGTACACATCGATCTCCCTGAAAATATTGCGGCGATGCCCGTAGAAGGTCAGCCCCTCCAGCGGGATGGTCGTGAAAAAATCTATGCTTCAAGCCGGAGTTTAAACCGGGCTGCCGAGGCGATCGCCCATGCCAAGAGTCCTTTAATTCTGGTGGGTAATGGCATTATTCGCGCCGATGCCGCCGAAGCCCTCACCGATTTTGCCACCCAGTTGAATATTCCCGTAGTCAACACCTTTATGGGCAAAGGGGCAATTCCCTACACCCATCCCCTGTCCCTGTGGACGGTAGGACTCCAACAGCGGGATTTTGTCACCTGTGCCTTTGAACAGAGCGATTTGGTGATTGCAGTGGGCTACGATCTGATCGAATATTCCCCCAAACGCTGGAACCCAGAGGGAACGACCCCAATTATCCACATTGGTGAAGTGGCCGCCGAAATTGATAGTAGTTATATTCCCCTCACAGAAGTTGTCGGCGACATTGGCGATGCCTTAAATGAAATTCGTAAACGCACAGACCGTGAGGGCAAAACCGCGCCAAAATTTCTCAATGTCCGGGCTGAGATTCGGGAGGACTATGAACGCCACGGCACCGACGCTAGTTTTCCGGTCAAACCCCAAAAAATCATCTACGATCTCCGCCAAGTGATGGCCCCAGAGGACATCGTCATTTCTGATGTGGGGGCCCACAAAATGTGGATGGCCCGCCATTACCATTGCGATCGCCCCAATACTTGCCTGATTTCCAATGGATTTGCGGCGATGGGCATTGCGATTCCCGGTGCTGTAGCAGCCAAATTAGTCTACCCAGAAAAAAATGTCGTGGCTGTCACAGGGGACGGGGGATTTATGATGAACTGCCAGGAGCTCGAAACGGCCCTGCGCATTGGGGCGAACTTTGTCACCCTAATTTTCAATGATGGTGGCTATGGTTTGATCGGTTGGAAACAGATTAACCAGTTCGGTGCACCAGCCTTTGTGGAGTTTGGCAATCCCGATTTTGTGCAGTTTGCCGAAAGTATGGGCCTCAAGGGTTATCGGATTACCGCCGCCGCCGACCTTGTGCCGACCTTAAAAGAAGCCCTAGCCCAGGATGTACCAGCGGTGATCGATTGCCCCGTGGACTACAGTGAGAATGTGAAATTCTCCCAAAAATCAGGGGATTTAATCTGCCGTATGTAA(SEQ IDNO:22)

所述ogdA基因编码的2-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列为：

MNTAELLIRCLENEGVEYIFGLPGEENLHILEALKESPIRFITVRHEQGAAFMADVYGRLTGKAGVCLSTLGPGATNLMTGVADANLDGAPLIAITGQVGTDRMHIESHQYLDLVAMFAPVTKWNKQIVRPNTTPEVVRRAFKIAQQEKPGAVHIDLPENIAAMPVEGQPLQRDGREKIYASSRSLNRAAEAIAHAKSPLILVGNGIIRADAAEALTDFATQLNIPVVNTFMGKGAIPYTHPLSLWTVGLQQRDFVTCAFEQSDLVIAVGYDLIEYSPKRWNPEGTTPIIHIGEVAAEIDSSYIPLTEVVGDIGDALNEIRKRTDREGKTAPKFLNVRAEIREDYERHGTDASFPVKPQKIIYDLRQVMAPEDIVISDVGAHKMWMARHYHCDRPNTCLISNGFAAMGIAIPGAVAAKLVYPEKNVVAVTGDGGFMMNCQELETALRIGANFVTLIFNDGGYGLIGWKQINQFGAPAFVEFGNPDFVQFAESMGLKGYRITAAADLVPTLKEALAQDVPAVIDCPVDYSENVKFSQKSGDLICRM*(*代表蛋白质的终止密码子)(SEQ ID NO:23)

所述sucD基因序列为：

ATGAGTAATGAAGTATCTATAAAAGAATTAATTGAAAAGGCAAAGGTGGCACAAAAAAAATTGGAAGCCTATAGTCAAGAACAAGTTGATGTACTAGTAAAAGCACTAGGAAAAGTGGTTTATGATAATGCAGAAATGTTTGCAAAAGAAGCAGTTGAAGAAACAGAAATGGGTGTTTATGAAGATAAAGTAGCTAAATGTCATTTGAAATCAGGAGCTATTTGGAATCATATAAAAGACAAGAAAACTGTAGGCATAATAAAAGAAGAACCTGAAAGGGCACTTGTTTATGTTGCTAAGCCAAAGGGAGTTGTGGCAGCTACTACGCCTATAACTAATCCAGTGGTAACTCCTATGTGTAATGCAATGGCTGCTATAAAGGGCAGAAATACAATAATAGTAGCACCACATCCTAAAGCAAAGAAAGTTTCAGCTCATACTGTAGAACTTATGAATGCTGAGCTTAAAAAATTGGGAGCACCAGAAAATATCATACAGATAGTAGAAGCACCATCAAGAGAAGCTGCTAAGGAACTTATGGAAAGTGCTGATGTAGTTATTGCTACAGGCGGTGCTGGAAGAGTTAAAGCTGCTTACTCCAGTGGAAGACCAGCTTATGGCGTTGGACCTGGAAATTCACAGGTAATAGTTGATAAGGGATACGATTATAACAAAGCTGCACAGGATATAATAACAGGAAGAAAATATGACAATGGAATTATATGTTCTTCAGAGCAATCAGTTATAGCTCCTGCTGAAGATTATGATAAGGTAATAGCAGCTTTTGTAGAAAATGGGGCATTCTATGTAGAAGATGAGGAAACAGTAGAAAAGTTTAGATCAACTTTATTTAAAGATGGAAAAATAAACAGCAAGATTATAGGTAAATCCGTCCAAATTATTGCGGATCTTGCAGGAGTAAAAGTACCAGAAGGTACTAAGGTTATAGTACTTAAGGGTAAAGGTGCAGGAGAAAAAGATGTACTTTGTAAAGAAAAAATGTGTCCAGTTTTAGTAGCATTGAAATATGATACTTTTGAAGAAGCAGTTGAAATAGCTATGGCTAATTATATGTATGAAGGAGCTGGTCATACAGCAGGCATACATTCTGACAATGACGAGAACATAAGATATGCAGGAACTGTATTACCTATAAGCAGATTAGTTGTAAATCAGCCTGCAACTACTGCTGGAGGAAGTTTCAATAATGGATTTAACCCTACTACTACACTAGGCTGCGGATCATGGGGCAGAAACAGTATTTCAGAAAATCTTACTTACGAGCATCTTATAAATGTTTCAAGAATAGGGTATTTCAATAAAGAAGCAAAAGTTCCTAGCTATGAGGAAATATGGGGATAA(SEQ ID NO:24)

所述sucD基因编码的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列为：

MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKVVYDNAEMFAKEAVEETEMGVYEDKVAKCHLKSGAIWNHIKDKKTVGIIKEEPERALVYVAKPKGVVAATTPITNPVVTPMCNAMAAIKGRNTIIVAPHPKAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESADVVIATGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDIITGRKYDNGIICSSEQSVIAPAEDYDKVIAAFVENGAFYVEDEETVEKFRSTLFKDGKINSKIIGKSVQIIADLAGVKVPEGTKVIVLKGKGAGEKDVLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMANYMYEGAGHTAGIHSDNDENIRYAGTVLPISRLVVNQPATTAGGSFNNGFNPTTTLGCGSWGRNSISENLTYEHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG*(*代表蛋白质的终止密码子)(SEQ ID NO:25)

所述4hbd基因序列为：

ATGAAGTTATTAAAATTGGCACCTGATGTTTATAAATTTGATACTGCAGAGGAGTTTATGAAATACTTTAAGGTTGGAAAAGGTGACTTTATACTTACTAATGAATTTTTATATAAACCTTTCCTTGAGAAATTCAATGATGGTGCAGATGCTGTATTTCAGGAGAAATATGGACTCGGTGAACCTTCTGATGAAATGATAAACAATATAATTAAGGATATTGGAGATAAACAATATAATAGAATTATTGCTGTAGGGGGAGGATCTGTAATAGATATAGCCAAAATCCTCAGTCTTAAGTATACTGATGATTCATTGGATTTGTTTGAGGGAAAAGTACCTCTTGTAAAAAACAAAGAATTAATTATAGTTCCAACTACATGTGGAACAGGTTCAGAAGTTACAAATGTATCAGTTGCAGAATTAAAGAGAAGACATACTAAAAAAGGAATTGCTTCAGACGAATTATATGCAACTTATGCAGTACTTGTACCAGAATTTATAAAAGGACTTCCATATAAGTTTTTTGTAACCAGCTCCGTAGATGCCTTAATACATGCAACAGAAGCTTATGTATCTCCAAATGCAAATCCTTATACTGATATGTTTAGTGTAAAAGCTATGGAGTTAATTTTAAATGGATACATGCAAATGGTAGAGAAAGGAAATGATTACAGAGTTGAAATAATTGAGGATTTTGTTATAGGCAGCAATTATGCAGGTATAGCTTTTGGAAATGCAGGAGTGGGAGCGGTTCACGCACTCTCATATCCAATAGGCGGAAATTATCATGTGCCTCATGGAGAAGCAAATTATCTGTTTTTTACAGAAATATTTAAAACTTATTATGAGAAAAATCCAAATGGCAAGATTAAAGATGTAAATAAACTATTAGCAGGCATACTAAAATGTGATGAAAGTGAAGCTTATGACAGTTTATCACAACTTTTAGATAAATTATTGTCAAGAAAACCATTAAGAGAATATGGAATGAAAGAGGAAGAAATTGAAACTTTTGCTGATTCAGTAATAGAAGGACAGCAGAGACTGTTGGTAAACAATTATGAACCTTTTTCAAGAGAAGACATAGTAAACACATATAAAAAGTTATATTAA(SEQ ID NO:26)

所述4hbd基因编码的4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列为：

MKLLKLAPDVYKFDTAEEFMKYFKVGKGDFILTNEFLYKPFLEKFNDGADAVFQEKYGLGEPSDEMINNIIKDIGDKQYNRIIAVGGGSVIDIAKILSLKYTDDSLDLFEGKVPLVKNKELIIVPTTCGTGSEVTNVSVAELKRRHTKKGIASDELYATYAVLVPEFIKGLPYKFFVTSSVDALIHATEAYVSPNANPYTDMFSVKAMELILNGYMQMVEKGNDYRVEIIEDFVIGSNYAGIAFGNAGVGAVHALSYPIGGNYHVPHGEANYLFFTEIFKTYYEKNPNGKIKDVNKLLAGILKCDESEAYDSLSQLLDKLLSRKPLREYGMKEEEIETFADSVIEGQQRLLVNNYEPFSREDIVNTYKKLY*(*代表蛋白质的终止密码子)(SEQ ID NO:27)

将质粒pSEVA341-orfZ-Am-Spe和pSEVA321-porin-os4-Cm分别转入大肠杆菌S17-1(ATCC编号:47055，可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection)，再通过接合转化方法(Fu XZ,Tan D,Ai***la G,Wu Q,Chen JC,Chen GQ(2014)Developmentof Halomonas TD01as a host for open production of chemicals.Metab Eng 23:78–91)将两个质粒载体都转入盐单胞菌Halomonas TD01(可由清华大学提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4353)，得到重组菌盐单胞菌Halomonas TD01/(pSEVA341-orfZ-Am-Spe,pSEVA321-porin-os4-Cm)，命名为HalomonasTDWT-D2。

上述重组菌与出发菌Halomonas TD01均在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，200rmp，37℃，培养48小时。48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，结果如下表所示：

出发菌Halomonas TD01在非相关碳源(葡萄糖)为底物时，所积累的PHA当中不含有4HB组分，而重组菌Halomonas TDWT-D2所积累的PHA当中检测到了4HB组分，说明两个质粒载体所包含的4个基因能够在盐单胞菌中实现非相关碳源为底物合成P(3HB-co-4HB)。

实施例2：敲除盐单胞菌中的gabD基因，提高P(3HB-co-4HB)中4HB的比例

盐单胞菌Halomonas TD01基因组上的gabD基因所编码的琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)可以把琥珀酸半醛转化成琥珀酸，会与4HB的合成产生竞争。本实施例通过敲除盐单胞菌基因组上的gabD基因来提高4HB的比例。

以质粒pRE112-6IsceI(Fu,X.Z.,Tan,D.,Ai***la,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as a host for open production ofchemicals.Metab.Eng.,23,2,78-91.)为模板，用引物扩增得到质粒骨架；以HalomonasTD01的基因组为模板，用引物分别扩增得到gabD2基因的上下游同源臂片段，与质粒骨架通过Gibson Assembly的方法连接，得到质粒pRE112-6IsceI-gabD2。所用的引物信息如下：

将质粒转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法转入盐单胞菌Halomonas TD01，在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆，阳性克隆在无抗培养基中每24h转接一次，传代培养7次，最后稀释涂布于平板，筛选丢失氯霉素抗性标签的菌株，并用引物gabD2-up-F和gabD2-down-R进行PCR验证，野生型得到的条带大小为2.0kb，敲除型得到的条带大小为1.0kb。最终得到敲除gabD2基因的重组菌Halomonas TD01ΔgabD2。

以质粒pRE112-6IsceI为模板，用引物扩增得到质粒骨架；以Halomonas TD01的基因组为模板，用引物分别扩增得到gabD3基因的上下游同源臂片段，与质粒骨架通过GibsonAssembly的方法连接，得到质粒pRE112-6IsceI-gabD3。所用的引物信息如下：

将质粒转入大肠杆菌S17-1，再通过接合转化方法转入盐单胞菌Halomonas TD01ΔgabD2，在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆，阳性克隆在无抗培养基中每24h转接一次，传代培养7次，最后稀释涂布于平板，筛选丢失氯霉素抗性标签的菌株，并用引物gabD3-up-F和gabD3-down-R进行PCR验证，野生型得到的条带大小为2.0kb，敲除型得到的条带大小为1.1kb。最终得到敲除gabD2和gabD3基因的重组菌Halomonas TD01ΔgabD2ΔgabD3，命名为Halomonas TDG。

将实施例1中的质粒pSEVA341-orfZ-Am-Spe和pSEVA321-porin-os4-Cm一起转入Halomonas TDG，方法同实施例1，得到重组菌Halomonas TDG/(pSEVA341-orfZ-Am-Spe,pSEVA321-porin-os4-Cm)，命名为Halomonas TDG-D2。

上述重组菌与实施例1中的Halomonas TDWT-D2均在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，200rmp，37℃，培养48小时。48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，结果如下表所示：

将盐单胞菌基因组上的gabD基因敲除后，重组盐单胞菌在非相关碳源(葡萄糖)为底物合成的P(3HB-co-4HB)中4HB的比例上升。

比较例：ogdA基因表达与否对P(3HB-co-4HB)中4HB的比例的影响

以实施例1中的质粒pSEVA321-porin-os4-Cm为模板，用引物attttctagacatcggatcaataattctgc(SEQ ID NO:40)和taaggggtggagtatatttttgggc(SEQID NO:41)扩增得到片段，用T4连接酶将片段自连的方法得到质粒pSEVA321-porin-o*s4，该质粒中ogdA基因的第14个氨基酸突变为了终止密码子(由gaa变为taa)，因此ogdA基因无法正常表达。

将质粒pSEVA321-porin-o*s4和实施例1中的质粒pSEVA341-orfZ-Am-Spe一起转入实施例2中的Halomonas TDG，方法同实施例1，得到重组菌Halomonas TDG/(pSEVA341-orfZ-Am-Spe,pSEVA321-porin-o*s4)，命名为Halomonas TDG-D1。

将上述重组菌与实施例2中的Halomonas TDG-D2均在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，200rmp，37℃，培养48小时。48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，结果如下表所示：

在接种之后的几个小时之内，发酵液的pH迅速降到的4-5，可能是因为琥珀酸半醛(SSA)的快速积累。为了稳定发酵过程中的pH，进行了1L的发酵实验，将发酵液的pH值稳定在pH8.5，结果如下：

有ogdA基因表达的重组菌Halomonas TDG-D2与ogdA基因无法表达的重组菌Halomonas TDG-D1相比，细胞干重、PHA含量及4HB比例均更高，说明ogdA基因的表达更有利于盐单胞菌以非相关碳源(葡萄糖)为底物合成P(3HB-co-4HB)。

实施例3：重组盐单胞菌在批式补料发酵中生产P(3HB-co-4HB)

以实施例2中的重组盐单胞菌Halomonas TDG-D2在7L发酵罐中进行批式补料发酵生产P(3HB-co-4HB)，具体方法如下：

7升发酵罐中装液量为3升；种子液在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后接种至发酵培养基中，接种量为300mL；发酵培养基为60MMG，其中酵母提取物替换为2g/L，另外添加1.5g/L的尿素；发酵温度控制在37度，pH通过5M NaOH溶液控制在8.5；初始搅拌速度为200rpm，最高为800rpm；采用溶氧控制策略，保持溶氧在30％以上；空气通气量为3L/min；补料溶液包括葡萄糖、尿素和酵母提取物(120g葡萄糖、3g酵母提取物和1g尿素溶于100mL自来水中)，在12h到24h之间进行补料；24h之后再进行一次补料，补料液只包含800g/L的葡萄糖。48小时结束发酵过程，在发酵过程中对葡萄糖浓度进行离线监测。发酵结束后，检测发酵液中的细胞干重CDW和PHA含量及4HB比例，检测方法同实施例1所述。结果如下：

通过对残糖含量的控制，进行了三个不同批次补料发酵，结果如下：

重组盐单胞菌Halomonas TDG-D2在批式补料发酵中以非相关碳源(葡萄糖)为底物生产P(3HB-co-4HB)，其中4HB的组分可通过控制残量含量实现可控变化。

实施例4：诱导启动子控制基因表达调控P(3HB-co-4HB)中的4HB比例

以一种启动子库(专利申请号201710413338.3，可从北京蓝晶微生物科技有限公司获得)中的启动子为模板，用引物扩增得到启动子序列；以质粒p68orfZ(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineeredEscherichia coli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板，用引物扩增得到orfZ基因；用Halomonas TD01基因组为模板，引物分别扩增得到整合到基因组所需的上游同源臂H1和下游同源臂H2；以质粒pRE112-6IsceI为模板，用引物扩增得到质粒骨架。上述5片段通过Gibson Assembly的方法连接，得到质粒pRE112-68orfZ。所用的启动子序列为：

agcggataacaatttcacacaggaatgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagactagagtttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(SEQ ID NO:42)

所用的引物信息如下：

将质粒pRE112-68orfZ转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例2中的Halomonas TDG中，利用***质粒无法在宿主菌内复制的特性，用氯霉素抗性的60LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组上的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。

诱导质粒pBBR1MCS1-ISceI(Fu,X.Z.,Tan,D.,Ai***la,G.,Wu,Q.,Chen,J.C.,Chen,G.Q.,2014.Development of Halomonas TD01as a host for open production ofchemicals.Metab.Eng.,23,2,78-91.)表达一种归为内切酶I-SceI，将第一次同源重组菌的基因组上的6个I-SceI位点进行切割，产生双链DNA缺口，从而诱发第二次同源重组的发生，产生突变型或者野生型，然后通过特异的PCR引物将突变株筛选出来。将诱导质粒pBBR1MCS1-ISceI通过接合转化方法导入上述第一次同源重组菌，壮观霉素的60LB平板上筛选得到阳性克隆。该阳性克隆为Halomonas TDG的基因组上整合了启动子和orfZ，得到的重组菌为Halomonas TDG-68orfZ。

以质粒p321-Ptac-GFP(Zhao,H.,Zhang,H.M.,Chen,X.,Li,T.,Wu,Q.,Ouyang,Q.,Chen,G.Q.,2016.Novel T7-like expression systems used forHalomonas.Metab.Eng.,39,128-140.)为模板，用引物扩增得到质粒骨架；以实施例1中的合成片段为模板，用引物扩增得到ogdA基因；以质粒pMCSH5(Li,Z.J.,Shi,Z.J.,Guo,Y.Y.,Wu,Q.,Chen,G.Q.,2010.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineeredEscherichia coli.Metab.Eng.,12,4,352-359.)为模板，用引物分别扩增sucD基因和4hbd基因；上述4片段通过Gibson Assembly的方法连接，得到质粒p321-Ptac-4so。质粒中所用的诱导型启动子Ptac序列为：

tgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcgctcacaattagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(SEQ ID NO:73)

所用的引物信息如下：

将质粒p321-Ptac-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入上述重组菌Halomonas TDG-68orfZ，得到重组菌Halomonas TDG-68orfZ/p321-Ptac-4so，命名为Halomonas TD68/LP4so。

上述重组菌Halomonas TD68/LP4so包含编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因orfZ，编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因ogdA，编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因sucD，编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因4hbd。其中orfZ基因在基因组载体上，ogdA、sucD与4hbd在质粒载体上。

所述orfZ基因序列同实施例1，所述orfZ基因编码的4-羟基丁酰辅酶A转移酶的氨基酸序列同实施例1。

所述ogdA基因序列同实施例1，所述ogdA基因编码的2-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列同实施例1。

所述sucD基因序列同实施例1，所述sucD基因编码的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列同实施例1。

所述4hbd基因序列同实施例1，所述4hbd基因编码的4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列同实施例1。

将上述重组菌Halomonas TD68/LP4so在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml 60MMG培养基，并添加不同浓度的诱导剂IPTG，在200rmp，37℃培养48小时。48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，结果如下表所示：

用诱导启动子控制ogdA、sucD与4hbd的表达，能够根据诱导剂IPTG的添加量控制重组菌所合成的P(3HB-co-4HB)中4HB的比例。4HB的比例不同，P(3HB-co-4HB)的材料性能也会不同。因此，所述重组菌实现了根据产物中4HB的目标比例调整发酵条件，达到了一株菌生产不同P(3HB-co-4HB)产物的效果。

实施例5：以盐单胞菌基因组为载体表达P(3HB-co-4HB)合成所需的基因

以实施例4中的质粒p321-Ptac-4so为模板，用引物扩增得到含有Ptac启动子和ogdA、sucD与4hbd基因的片段；以Halomonas TD01基因组为模板，用引物分别扩增得到整合到基因组所需的上游同源臂H1和下游同源臂H2；以质粒pRE112-6IsceI为模板，用引物扩增得到质粒骨架。上述4片段通过Gibson Assembly的方法连接，得到质粒pRE112-Ptac-4so。所用引物信息如下：

将质粒pRE112-Ptac-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例4中的重组菌Halomonas TDG-68orfZ，用与实施例4相同的方法得到Ptac启动子和ogdA、sucD与4hbd基因整合到基因组上的重组菌，重组菌命名为Halomonas TD68-LP4so。

在实施例4中所述启动库中选取两个启动子，用引物扩增分别得到启动子序列；以质粒p321-Ptac-4so为模板，用引物扩增得到含有ogdA、sucD与4hbd基因的片段；其余整合到基因组所需的上游同源臂H1和下游同源臂H2，以及pRE112-6IsceI质粒骨架用本实施例中上文所述同样方法获得。上述片段通过Gibson Assembly的方法连接，分别得到质粒pRE112-68-4so和pRE112-194-4so。其中一个启动子序列与实施例4中的相同，另一个启动子序列为：

agcggataacaatttcacacaggaatgcctccacaccgctcgtcacatcctgttgcgttcactggaatcccagtatctaatttgacctgcgagcaagctgtcaccggatgtgctttccggtctgatgagtccgtgaggacgaaacagcctctacaaataattttgtttaa(SEQ ID NO:69)

所用引物信息如下：

将质粒pRE112-68-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例4中的重组菌Halomonas TDG-68orfZ，用与实施例4相同的方法得到ogdA、sucD与4hbd基因整合到基因组上的重组菌，重组菌命名为Halomonas TD68-4so68。

将质粒pRE112-194-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例4中的重组菌Halomonas TDG-68orfZ，用与实施例4相同的方法得到ogdA、sucD与4hbd基因整合到基因组上的重组菌，重组菌命名为Halomonas TD68-4so194。

将质粒pRE112-6ISceI-orfZ(Chen,X.,Yin,J.,Ye,J.,Zhang,H.,Che,X.,Ma,Y.,Li,M.,Wu,L.P.,Chen,G.Q.,2017.Engineering Halomonas bluephagenesis TD01fornon-sterile production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate).Bioresour.Technol.,244,534-541)转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入实施例2中的Halomonas TDG中，用与实施例4相同的方法得到orfZ基因整合到基因组上的重组菌，该重组菌命名为Halomonas TD50。

将质粒pRE112-68-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入重组菌Halomonas TD50，用与实施例4相同的方法得到ogdA、sucD与4hbd基因整合到基因组上的重组菌，重组菌命名为Halomonas TD50-4so68。

将质粒pRE112-194-4so转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入重组菌Halomonas TD50，用与实施例4相同的方法得到ogdA、sucD与4hbd基因整合到基因组上的重组菌，重组菌命名为Halomonas TD50-4so194。

本实施例所述得到的5株重组菌Halomonas TD68-LP4so，Halomonas TD68-4so68，Halomonas TD68-4so194，Halomonas TD50-4so68，Halomonas TD50-4so194均为以基因组为载体，包含编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因orfZ，编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因ogdA，编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因sucD，编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因4hbd，区别在于表达这几个基因的启动子不同。

将上述5株重组菌在60LB培养基中200rpm，37℃培养12小时后按5％接种至50ml60MMG培养基，其中Halomonas TD68-LP4so添加200mg/L的诱导剂IPTG，在200rmp，37℃培养48小时。48小时后收集菌体，检测细胞干重和PHA含量，结果如下表所示：

以基因组为载体表达4个基因，同样能够实现重组盐单胞菌以非相关碳源(葡萄糖)为底物合成P(3HB-co-4HB)，不同的启动子表达4个基因，实现不同比例4HB的P(3HB-co-4HB)的合成。

实施例6：基因组为载体的重组盐单胞菌在批式补料发酵中生产P(3HB-co-4HB)

以实施例5中的重组盐单胞菌Halomonas TD50-4so194在7L发酵罐中进行批式补料发酵生产P(3HB-co-4HB)，具体方法如下：

以实施例5中的重组盐单胞菌Halomonas TD68-4so194在7L发酵罐中进行批式补料发酵生产P(3HB-co-4HB)，具体方法同上。发酵结束后，检测发酵液中的细胞干重CDW和PHA含量及4HB比例，检测方法同实施例1所述。结果如下：

基因组为载体的重组菌在发酵罐中生产P(3HB-co-4HB)，细胞干重超过50克/升，P(3HB-co-4HB)达到70％左右，具备放大生产应用于工业化生产的潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京蓝晶微生物科技有限公司

清华大学

<120> 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法

<130> DI18-0003-XC37

<160> 73

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-321-F

<400> 1

gcgcatgcat aaaaagtcga cctgcaggca tgcaa 35

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-321-R

<400> 2

cataggctcc ttaattaaag gcatcaaata aaacgaaagg ctc 43

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-F

<400> 3

ctttaattaa ggagcctatg gaaaaacgcc 30

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-R

<400> 4

ctagtatttc tcctctttct ctagtagatg taggttcctt aactagctta ctgtttcg 58

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-syn-F

<400> 5

tactagagaa agaggagaaa tactagatga atactgcaga attattgatc cgatg 55

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-syn-R

<400> 6

tcgacttttt atgcatgcgc ttacatacgg cagattaaat cccctgattt 50

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-syn-s4-B-R

<400> 7

atattcaaaa cactattaca tacggcagat taaatcccct gattt 45

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-porin-syn-s4-F-F

<400> 8

atctgccgta tgtaatagtg ttttgaatat aggatccaag gagatatacc a 51

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-321-porin-syn-s4-F-R

<400> 9

tgcctgcagg tcgacttttt atgcatgcgc ccaatacgca 40

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-F

<400> 10

aattattggg gaccctacaa tcattaaata tcccagggat cctc 44

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-R

<400> 11

taggcggcct cctgtgtgaa attgttatcc 30

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-F

<400> 12

atttcacaca ggaggccgcc tagctgcagg cgcacaaggc 40

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-R

<400> 13

gacccttgtc cttttcaaac tctatacaaa taaatgtttt gacgcaa 47

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Spe-F

<400> 14

tttgtataga gtttgaaaag gacaagggtc ttatttgccg 40

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Spe-R

<400> 15

tatttaatga ttgtagggtc cccaataatt acgatttacg t 41

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-orfZ-spe-Am-B-F

<400> 16

agaccaagtt tactctttga cttttgtcct tttccgctgc 40

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-orfZ-spe-Am-B-R

<400> 17

ataggggttc cgcgcacgtc tcattttcgc caatttaaat cg 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-orfZ-spe-Am-F-F

<400> 18

gcgaaaatga gacgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt tt 42

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-341-orfZ-spe-Am-F-R

<400> 19

aggacaaaag tcaaagagta aacttggtct gacagttacc aatg 44

<210> 20

<211> 1290

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ基因序列

<400> 20

atggagtggg aagagatata taaagagaaa ctggtaactg cagaaaaagc tgtttcaaaa 60

atagaaaacc atagcagggt agtttttgca catgcagtag gagaacccgt agatttagta 120

aatgcactag ttaaaaataa ggataattat ataggactag aaatagttca catggtagct 180

atgggcaaag gtgaatatac aaaagagggt atgcaaagac attttagaca taatgcttta 240

tttgtaggcg gatgtactag agatgcagta aattcaggaa gagcagatta tacaccttgt 300

tttttctatg aagtgccaag tttgtttaaa gaaaaacgtt tgcctgtaga tgtagcactt 360

attcaggtaa gtgagccaga taaatatggc tactgcagtt ttggagtttc caatgactat 420

accaagccag cagcagaaag tgctaagctt gtaattgcag aagtgaataa aaacatgcca 480

agaactcttg gagattcttt tatacatgta tcagatattg attatatagt ggaagcttca 540

cacccattgt tagaattgca gcctcctaaa ttgggagatg tagaaaaagc cataggagaa 600

aactgtgcat ctttaattga agatggagct actcttcagc ttggaatagg tgctatacca 660

gatgcggtac ttttattctt aaagaacaaa aagaatttag gaatacattc tgagatgata 720

tcagatggtg tgatggaact ggtgaaggca ggggttatca ataacaagaa aaagaccctc 780

catccaggca aaatagttgt aacattttta atgggaacaa aaaaattata tgattttgta 840

aacaataatc caatggtaga aacttattct gtagattatg taaataatcc actggtaatt 900

atgaaaaatg acaatatggt ttcaataaat tcttgtgttc aagtagactt aatgggacaa 960

gtatgttctg aaagtatagg attgaaacag ataagtggag tgggaggcca ggtagatttt 1020

attagaggag ctaatctatc aaagggtgga aaggctatta tagctatacc ttccacagct 1080

ggaaaaggaa aagtttcaag aataactcca cttctagata ctggtgctgc agttacaact 1140

tctagaaatg aagtagatta tgtagttact gaatatggtg ttgctcatct taagggcaaa 1200

actttaagaa atagggcaag agctctaata aatatcgctc atccaaaatt cagagaatca 1260

ttaatgaatg aatttaaaaa gagattttag 1290

<210> 21

<211> 429

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ基因所编码的4-羟基丁酰辅酶A转移酶的氨基酸序列

<400> 21

Met Glu Trp Glu Glu Ile Tyr Lys Glu Lys Leu Val Thr Ala Glu Lys

1 5 10 15

Ala Val Ser Lys Ile Glu Asn His Ser Arg Val Val Phe Ala His Ala

20 25 30

Val Gly Glu Pro Val Asp Leu Val Asn Ala Leu Val Lys Asn Lys Asp

35 40 45

Asn Tyr Ile Gly Leu Glu Ile Val His Met Val Ala Met Gly Lys Gly

50 55 60

Glu Tyr Thr Lys Glu Gly Met Gln Arg His Phe Arg His Asn Ala Leu

65 70 75 80

Phe Val Gly Gly Cys Thr Arg Asp Ala Val Asn Ser Gly Arg Ala Asp

85 90 95

Tyr Thr Pro Cys Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Leu Phe Lys Glu Lys

100 105 110

Arg Leu Pro Val Asp Val Ala Leu Ile Gln Val Ser Glu Pro Asp Lys

115 120 125

Tyr Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Asn Asp Tyr Thr Lys Pro Ala

130 135 140

Ala Glu Ser Ala Lys Leu Val Ile Ala Glu Val Asn Lys Asn Met Pro

145 150 155 160

Arg Thr Leu Gly Asp Ser Phe Ile His Val Ser Asp Ile Asp Tyr Ile

165 170 175

Val Glu Ala Ser His Pro Leu Leu Glu Leu Gln Pro Pro Lys Leu Gly

180 185 190

Asp Val Glu Lys Ala Ile Gly Glu Asn Cys Ala Ser Leu Ile Glu Asp

195 200 205

Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Val Leu

210 215 220

Leu Phe Leu Lys Asn Lys Lys Asn Leu Gly Ile His Ser Glu Met Ile

225 230 235 240

Ser Asp Gly Val Met Glu Leu Val Lys Ala Gly Val Ile Asn Asn Lys

245 250 255

Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Ile Val Val Thr Phe Leu Met Gly

260 265 270

Thr Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Val Asn Asn Asn Pro Met Val Glu Thr

275 280 285

Tyr Ser Val Asp Tyr Val Asn Asn Pro Leu Val Ile Met Lys Asn Asp

290 295 300

Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Val Gln Val Asp Leu Met Gly Gln

305 310 315 320

Val Cys Ser Glu Ser Ile Gly Leu Lys Gln Ile Ser Gly Val Gly Gly

325 330 335

Gln Val Asp Phe Ile Arg Gly Ala Asn Leu Ser Lys Gly Gly Lys Ala

340 345 350

Ile Ile Ala Ile Pro Ser Thr Ala Gly Lys Gly Lys Val Ser Arg Ile

355 360 365

Thr Pro Leu Leu Asp Thr Gly Ala Ala Val Thr Thr Ser Arg Asn Glu

370 375 380

Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Val Ala His Leu Lys Gly Lys

385 390 395 400

Thr Leu Arg Asn Arg Ala Arg Ala Leu Ile Asn Ile Ala His Pro Lys

405 410 415

Phe Arg Glu Ser Leu Met Asn Glu Phe Lys Lys Arg Phe

420 425

<210> 22

<211> 1638

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ogdA基因序列

<400> 22

atgaatactg cagaattatt gatccgatgt ctagaaaatg aaggggtgga gtatattttt 60

gggctgccgg gggaagaaaa tctccatatc ctcgaagccc ttaaggagtc tcccatccgc 120

tttatcaccg tccgccatga acagggtgcc gcttttatgg ccgatgtgta tggtcgttta 180

accgggaaag caggggtttg tctgtctacc ctggggcctg gggctaccaa tctaatgact 240

ggggttgccg atgcgaacct cgatggggcg cccctgattg cgattacagg gcaggtgggt 300

accgaccgca tgcacattga atcccaccaa tatcttgatc tggtggcgat gtttgccccc 360

gtcaccaagt ggaataaaca aattgtccga ccgaacacga ccccggaggt ggtacgtcgt 420

gcctttaaaa ttgcccagca ggaaaaacca ggggcagtac acatcgatct ccctgaaaat 480

attgcggcga tgcccgtaga aggtcagccc ctccagcggg atggtcgtga aaaaatctat 540

gcttcaagcc ggagtttaaa ccgggctgcc gaggcgatcg cccatgccaa gagtccttta 600

attctggtgg gtaatggcat tattcgcgcc gatgccgccg aagccctcac cgattttgcc 660

acccagttga atattcccgt agtcaacacc tttatgggca aaggggcaat tccctacacc 720

catcccctgt ccctgtggac ggtaggactc caacagcggg attttgtcac ctgtgccttt 780

gaacagagcg atttggtgat tgcagtgggc tacgatctga tcgaatattc ccccaaacgc 840

tggaacccag agggaacgac cccaattatc cacattggtg aagtggccgc cgaaattgat 900

agtagttata ttcccctcac agaagttgtc ggcgacattg gcgatgcctt aaatgaaatt 960

cgtaaacgca cagaccgtga gggcaaaacc gcgccaaaat ttctcaatgt ccgggctgag 1020

attcgggagg actatgaacg ccacggcacc gacgctagtt ttccggtcaa accccaaaaa 1080

atcatctacg atctccgcca agtgatggcc ccagaggaca tcgtcatttc tgatgtgggg 1140

gcccacaaaa tgtggatggc ccgccattac cattgcgatc gccccaatac ttgcctgatt 1200

tccaatggat ttgcggcgat gggcattgcg attcccggtg ctgtagcagc caaattagtc 1260

tacccagaaa aaaatgtcgt ggctgtcaca ggggacgggg gatttatgat gaactgccag 1320

gagctcgaaa cggccctgcg cattggggcg aactttgtca ccctaatttt caatgatggt 1380

ggctatggtt tgatcggttg gaaacagatt aaccagttcg gtgcaccagc ctttgtggag 1440

tttggcaatc ccgattttgt gcagtttgcc gaaagtatgg gcctcaaggg ttatcggatt 1500

accgccgccg ccgaccttgt gccgacctta aaagaagccc tagcccagga tgtaccagcg 1560

gtgatcgatt gccccgtgga ctacagtgag aatgtgaaat tctcccaaaa atcaggggat 1620

ttaatctgcc gtatgtaa 1638

<210> 23

<211> 545

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> ogdA基因编码的2-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列

<400> 23

Met Asn Thr Ala Glu Leu Leu Ile Arg Cys Leu Glu Asn Glu Gly Val

1 5 10 15

Glu Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Gly Glu Glu Asn Leu His Ile Leu Glu

20 25 30

Ala Leu Lys Glu Ser Pro Ile Arg Phe Ile Thr Val Arg His Glu Gln

35 40 45

Gly Ala Ala Phe Met Ala Asp Val Tyr Gly Arg Leu Thr Gly Lys Ala

50 55 60

Gly Val Cys Leu Ser Thr Leu Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Met Thr

65 70 75 80

Gly Val Ala Asp Ala Asn Leu Asp Gly Ala Pro Leu Ile Ala Ile Thr

85 90 95

Gly Gln Val Gly Thr Asp Arg Met His Ile Glu Ser His Gln Tyr Leu

100 105 110

Asp Leu Val Ala Met Phe Ala Pro Val Thr Lys Trp Asn Lys Gln Ile

115 120 125

Val Arg Pro Asn Thr Thr Pro Glu Val Val Arg Arg Ala Phe Lys Ile

130 135 140

Ala Gln Gln Glu Lys Pro Gly Ala Val His Ile Asp Leu Pro Glu Asn

145 150 155 160

Ile Ala Ala Met Pro Val Glu Gly Gln Pro Leu Gln Arg Asp Gly Arg

165 170 175

Glu Lys Ile Tyr Ala Ser Ser Arg Ser Leu Asn Arg Ala Ala Glu Ala

180 185 190

Ile Ala His Ala Lys Ser Pro Leu Ile Leu Val Gly Asn Gly Ile Ile

195 200 205

Arg Ala Asp Ala Ala Glu Ala Leu Thr Asp Phe Ala Thr Gln Leu Asn

210 215 220

Ile Pro Val Val Asn Thr Phe Met Gly Lys Gly Ala Ile Pro Tyr Thr

225 230 235 240

His Pro Leu Ser Leu Trp Thr Val Gly Leu Gln Gln Arg Asp Phe Val

245 250 255

Thr Cys Ala Phe Glu Gln Ser Asp Leu Val Ile Ala Val Gly Tyr Asp

260 265 270

Leu Ile Glu Tyr Ser Pro Lys Arg Trp Asn Pro Glu Gly Thr Thr Pro

275 280 285

Ile Ile His Ile Gly Glu Val Ala Ala Glu Ile Asp Ser Ser Tyr Ile

290 295 300

Pro Leu Thr Glu Val Val Gly Asp Ile Gly Asp Ala Leu Asn Glu Ile

305 310 315 320

Arg Lys Arg Thr Asp Arg Glu Gly Lys Thr Ala Pro Lys Phe Leu Asn

325 330 335

Val Arg Ala Glu Ile Arg Glu Asp Tyr Glu Arg His Gly Thr Asp Ala

340 345 350

Ser Phe Pro Val Lys Pro Gln Lys Ile Ile Tyr Asp Leu Arg Gln Val

355 360 365

Met Ala Pro Glu Asp Ile Val Ile Ser Asp Val Gly Ala His Lys Met

370 375 380

Trp Met Ala Arg His Tyr His Cys Asp Arg Pro Asn Thr Cys Leu Ile

385 390 395 400

Ser Asn Gly Phe Ala Ala Met Gly Ile Ala Ile Pro Gly Ala Val Ala

405 410 415

Ala Lys Leu Val Tyr Pro Glu Lys Asn Val Val Ala Val Thr Gly Asp

420 425 430

Gly Gly Phe Met Met Asn Cys Gln Glu Leu Glu Thr Ala Leu Arg Ile

435 440 445

Gly Ala Asn Phe Val Thr Leu Ile Phe Asn Asp Gly Gly Tyr Gly Leu

450 455 460

Ile Gly Trp Lys Gln Ile Asn Gln Phe Gly Ala Pro Ala Phe Val Glu

465 470 475 480

Phe Gly Asn Pro Asp Phe Val Gln Phe Ala Glu Ser Met Gly Leu Lys

485 490 495

Gly Tyr Arg Ile Thr Ala Ala Ala Asp Leu Val Pro Thr Leu Lys Glu

500 505 510

Ala Leu Ala Gln Asp Val Pro Ala Val Ile Asp Cys Pro Val Asp Tyr

515 520 525

Ser Glu Asn Val Lys Phe Ser Gln Lys Ser Gly Asp Leu Ile Cys Arg

530 535 540

Met

545

<210> 24

<211> 1362

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> sucD基因序列

<400> 24

atgagtaatg aagtatctat aaaagaatta attgaaaagg caaaggtggc acaaaaaaaa 60

ttggaagcct atagtcaaga acaagttgat gtactagtaa aagcactagg aaaagtggtt 120

tatgataatg cagaaatgtt tgcaaaagaa gcagttgaag aaacagaaat gggtgtttat 180

gaagataaag tagctaaatg tcatttgaaa tcaggagcta tttggaatca tataaaagac 240

aagaaaactg taggcataat aaaagaagaa cctgaaaggg cacttgttta tgttgctaag 300

ccaaagggag ttgtggcagc tactacgcct ataactaatc cagtggtaac tcctatgtgt 360

aatgcaatgg ctgctataaa gggcagaaat acaataatag tagcaccaca tcctaaagca 420

aagaaagttt cagctcatac tgtagaactt atgaatgctg agcttaaaaa attgggagca 480

ccagaaaata tcatacagat agtagaagca ccatcaagag aagctgctaa ggaacttatg 540

gaaagtgctg atgtagttat tgctacaggc ggtgctggaa gagttaaagc tgcttactcc 600

agtggaagac cagcttatgg cgttggacct ggaaattcac aggtaatagt tgataaggga 660

tacgattata acaaagctgc acaggatata ataacaggaa gaaaatatga caatggaatt 720

atatgttctt cagagcaatc agttatagct cctgctgaag attatgataa ggtaatagca 780

gcttttgtag aaaatggggc attctatgta gaagatgagg aaacagtaga aaagtttaga 840

tcaactttat ttaaagatgg aaaaataaac agcaagatta taggtaaatc cgtccaaatt 900

attgcggatc ttgcaggagt aaaagtacca gaaggtacta aggttatagt acttaagggt 960

aaaggtgcag gagaaaaaga tgtactttgt aaagaaaaaa tgtgtccagt tttagtagca 1020

ttgaaatatg atacttttga agaagcagtt gaaatagcta tggctaatta tatgtatgaa 1080

ggagctggtc atacagcagg catacattct gacaatgacg agaacataag atatgcagga 1140

actgtattac ctataagcag attagttgta aatcagcctg caactactgc tggaggaagt 1200

ttcaataatg gatttaaccc tactactaca ctaggctgcg gatcatgggg cagaaacagt 1260

atttcagaaa atcttactta cgagcatctt ataaatgttt caagaatagg gtatttcaat 1320

aaagaagcaa aagttcctag ctatgaggaa atatggggat aa 1362

<210> 25

<211> 453

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sucD基因编码的琥珀酸半醛脱氢酶的氨基酸序列

<400> 25

Met Ser Asn Glu Val Ser Ile Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ala Lys Val

1 5 10 15

Ala Gln Lys Lys Leu Glu Ala Tyr Ser Gln Glu Gln Val Asp Val Leu

20 25 30

Val Lys Ala Leu Gly Lys Val Val Tyr Asp Asn Ala Glu Met Phe Ala

35 40 45

Lys Glu Ala Val Glu Glu Thr Glu Met Gly Val Tyr Glu Asp Lys Val

50 55 60

Ala Lys Cys His Leu Lys Ser Gly Ala Ile Trp Asn His Ile Lys Asp

65 70 75 80

Lys Lys Thr Val Gly Ile Ile Lys Glu Glu Pro Glu Arg Ala Leu Val

85 90 95

Tyr Val Ala Lys Pro Lys Gly Val Val Ala Ala Thr Thr Pro Ile Thr

100 105 110

Asn Pro Val Val Thr Pro Met Cys Asn Ala Met Ala Ala Ile Lys Gly

115 120 125

Arg Asn Thr Ile Ile Val Ala Pro His Pro Lys Ala Lys Lys Val Ser

130 135 140

Ala His Thr Val Glu Leu Met Asn Ala Glu Leu Lys Lys Leu Gly Ala

145 150 155 160

Pro Glu Asn Ile Ile Gln Ile Val Glu Ala Pro Ser Arg Glu Ala Ala

165 170 175

Lys Glu Leu Met Glu Ser Ala Asp Val Val Ile Ala Thr Gly Gly Ala

180 185 190

Gly Arg Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Arg Pro Ala Tyr Gly Val

195 200 205

Gly Pro Gly Asn Ser Gln Val Ile Val Asp Lys Gly Tyr Asp Tyr Asn

210 215 220

Lys Ala Ala Gln Asp Ile Ile Thr Gly Arg Lys Tyr Asp Asn Gly Ile

225 230 235 240

Ile Cys Ser Ser Glu Gln Ser Val Ile Ala Pro Ala Glu Asp Tyr Asp

245 250 255

Lys Val Ile Ala Ala Phe Val Glu Asn Gly Ala Phe Tyr Val Glu Asp

260 265 270

Glu Glu Thr Val Glu Lys Phe Arg Ser Thr Leu Phe Lys Asp Gly Lys

275 280 285

Ile Asn Ser Lys Ile Ile Gly Lys Ser Val Gln Ile Ile Ala Asp Leu

290 295 300

Ala Gly Val Lys Val Pro Glu Gly Thr Lys Val Ile Val Leu Lys Gly

305 310 315 320

Lys Gly Ala Gly Glu Lys Asp Val Leu Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro

325 330 335

Val Leu Val Ala Leu Lys Tyr Asp Thr Phe Glu Glu Ala Val Glu Ile

340 345 350

Ala Met Ala Asn Tyr Met Tyr Glu Gly Ala Gly His Thr Ala Gly Ile

355 360 365

His Ser Asp Asn Asp Glu Asn Ile Arg Tyr Ala Gly Thr Val Leu Pro

370 375 380

Ile Ser Arg Leu Val Val Asn Gln Pro Ala Thr Thr Ala Gly Gly Ser

385 390 395 400

Phe Asn Asn Gly Phe Asn Pro Thr Thr Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp

405 410 415

Gly Arg Asn Ser Ile Ser Glu Asn Leu Thr Tyr Glu His Leu Ile Asn

420 425 430

Val Ser Arg Ile Gly Tyr Phe Asn Lys Glu Ala Lys Val Pro Ser Tyr

435 440 445

Glu Glu Ile Trp Gly

450

<210> 26

<211> 1116

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 4hbd基因序列

<400> 26

atgaagttat taaaattggc acctgatgtt tataaatttg atactgcaga ggagtttatg 60

aaatacttta aggttggaaa aggtgacttt atacttacta atgaattttt atataaacct 120

ttccttgaga aattcaatga tggtgcagat gctgtatttc aggagaaata tggactcggt 180

gaaccttctg atgaaatgat aaacaatata attaaggata ttggagataa acaatataat 240

agaattattg ctgtaggggg aggatctgta atagatatag ccaaaatcct cagtcttaag 300

tatactgatg attcattgga tttgtttgag ggaaaagtac ctcttgtaaa aaacaaagaa 360

ttaattatag ttccaactac atgtggaaca ggttcagaag ttacaaatgt atcagttgca 420

gaattaaaga gaagacatac taaaaaagga attgcttcag acgaattata tgcaacttat 480

gcagtacttg taccagaatt tataaaagga cttccatata agttttttgt aaccagctcc 540

gtagatgcct taatacatgc aacagaagct tatgtatctc caaatgcaaa tccttatact 600

gatatgttta gtgtaaaagc tatggagtta attttaaatg gatacatgca aatggtagag 660

aaaggaaatg attacagagt tgaaataatt gaggattttg ttataggcag caattatgca 720

ggtatagctt ttggaaatgc aggagtggga gcggttcacg cactctcata tccaataggc 780

ggaaattatc atgtgcctca tggagaagca aattatctgt tttttacaga aatatttaaa 840

acttattatg agaaaaatcc aaatggcaag attaaagatg taaataaact attagcaggc 900

atactaaaat gtgatgaaag tgaagcttat gacagtttat cacaactttt agataaatta 960

ttgtcaagaa aaccattaag agaatatgga atgaaagagg aagaaattga aacttttgct 1020

gattcagtaa tagaaggaca gcagagactg ttggtaaaca attatgaacc tttttcaaga 1080

gaagacatag taaacacata taaaaagtta tattaa 1116

<210> 27

<211> 371

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 4hbd基因编码的4-羟基丁酸脱氢酶的氨基酸序列

<400> 27

Met Lys Leu Leu Lys Leu Ala Pro Asp Val Tyr Lys Phe Asp Thr Ala

1 5 10 15

Glu Glu Phe Met Lys Tyr Phe Lys Val Gly Lys Gly Asp Phe Ile Leu

20 25 30

Thr Asn Glu Phe Leu Tyr Lys Pro Phe Leu Glu Lys Phe Asn Asp Gly

35 40 45

Ala Asp Ala Val Phe Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Gly Glu Pro Ser Asp

50 55 60

Glu Met Ile Asn Asn Ile Ile Lys Asp Ile Gly Asp Lys Gln Tyr Asn

65 70 75 80

Arg Ile Ile Ala Val Gly Gly Gly Ser Val Ile Asp Ile Ala Lys Ile

85 90 95

Leu Ser Leu Lys Tyr Thr Asp Asp Ser Leu Asp Leu Phe Glu Gly Lys

100 105 110

Val Pro Leu Val Lys Asn Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys

115 120 125

Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Lys Arg

130 135 140

Arg His Thr Lys Lys Gly Ile Ala Ser Asp Glu Leu Tyr Ala Thr Tyr

145 150 155 160

Ala Val Leu Val Pro Glu Phe Ile Lys Gly Leu Pro Tyr Lys Phe Phe

165 170 175

Val Thr Ser Ser Val Asp Ala Leu Ile His Ala Thr Glu Ala Tyr Val

180 185 190

Ser Pro Asn Ala Asn Pro Tyr Thr Asp Met Phe Ser Val Lys Ala Met

195 200 205

Glu Leu Ile Leu Asn Gly Tyr Met Gln Met Val Glu Lys Gly Asn Asp

210 215 220

Tyr Arg Val Glu Ile Ile Glu Asp Phe Val Ile Gly Ser Asn Tyr Ala

225 230 235 240

Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser

245 250 255

Tyr Pro Ile Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr

260 265 270

Leu Phe Phe Thr Glu Ile Phe Lys Thr Tyr Tyr Glu Lys Asn Pro Asn

275 280 285

Gly Lys Ile Lys Asp Val Asn Lys Leu Leu Ala Gly Ile Leu Lys Cys

290 295 300

Asp Glu Ser Glu Ala Tyr Asp Ser Leu Ser Gln Leu Leu Asp Lys Leu

305 310 315 320

Leu Ser Arg Lys Pro Leu Arg Glu Tyr Gly Met Lys Glu Glu Glu Ile

325 330 335

Glu Thr Phe Ala Asp Ser Val Ile Glu Gly Gln Gln Arg Leu Leu Val

340 345 350

Asn Asn Tyr Glu Pro Phe Ser Arg Glu Asp Ile Val Asn Thr Tyr Lys

355 360 365

Lys Leu Tyr

370

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-v-F

<400> 28

tcttgtcaac ctagaagaag cttgggatcg ggc 33

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-v-R

<400> 29

gctcagtcag cccgggaatt catgcagttc acttac 36

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-up-F

<400> 30

cttcttctag gttgacaaga atttatacca aagctgtct 39

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-up-R

<400> 31

gcataaaagt aggctcgctc tttcgctgta cgctttttc 39

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-down-F

<400> 32

tacagcgaaa gagcgagcct acttttatgc acgtgactac 40

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD2-down-R

<400> 33

gaattcccgg ctgactgagc ttctcagcca ctttaa 36

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-v-F

<400> 34

ctggttaata ctagaagaag cttgggatcg ggc 33

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-v-R

<400> 35

aagtgcggtt ccgggaattc atgcagttca cttac 35

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-up-F

<400> 36

cttcttctag tattaaccag cattgcttta cgctcg 36

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-up-R

<400> 37

aagaagccaa gcgtaggcgt taatgaaggg ctgatttcta 40

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-down-F

<400> 38

cccttcatta acgcctacgc ttggcttctt cagcgaaaaa 40

<210> 39

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> gabD3-down-R

<400> 39

gaattcccgg aaccgcactt gcttactcaa a 31

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 40

attttctaga catcggatca ataattctgc 30

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 41

taaggggtgg agtatatttt tgggc 25

<210> 42

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 启动子序列

<400> 42

agcggataac aatttcacac aggaatgcct ccacaccgct cgtcacatcc tgttgcgttc 60

actggaatcc cagactagag tttgacctgc gagcaagctg tcaccggatg tgctttccgg 120

tctgatgagt ccgtgaggac gaaacagcct ctacaaataa ttttgtttaa 170

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p68-F

<400> 43

cgagactatc atgcctccac accgctcg 28

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> p68-R

<400> 44

cttgttaaat ttaaacaaaa ttatttgtag aggctgtttc 40

<210> 45

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-F

<400> 45

aaataatttt gtttaaattt aacaagacag gatagggagg agataact 48

<210> 46

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> orfZ-R

<400> 46

ctatatcacc ctaaaatctc tttttaaatt cattcattaa tgattctctg aatttt 56

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-up-F

<400> 47

atcgacgaat ctggggtccg tgactgagga 30

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-up-R

<400> 48

gtggaggcat gatagtctcg aatcttccga ccaat 35

<210> 49

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-down-F

<400> 49

gagattttag ggtgatatag agtgtatcgc gcaaagtt 38

<210> 50

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-down-R

<400> 50

gaattcccgg gtcagcaccg gtttggtaaa tctg 34

<210> 51

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-v-F

<400> 51

cggaccccag ctagaagaag cttgggatcg ggc 33

<210> 52

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 68orfZ-v-R

<400> 52

cggtgctgac ccgggaattc atgcagttca cttac 35

<210> 53

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P321-Ptac-F

<400> 53

ttaataacag gacttaaaca aaattatttg tagaggctgt ttcgtc 46

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P321-Ptac-R

<400> 54

atgaactgta caaatgagtc gtgactggga aaaccctggc g 41

<210> 55

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-ogdA-F

<400> 55

tactagagaa agaggagaaa tactagtatg aatactgcag aattattgat ccgatgtct 59

<210> 56

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-ogdA-R

<400> 56

tcatttgtac agttcattta catacggcag attaaatccc ctgattttt 49

<210> 57

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4hbd-F

<400> 57

attttgttta agtcctgtta ttaaaaagta tataaggagg 40

<210> 58

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4hbd-R

<400> 58

attcaaaaca ctatgggata tttaatgatt gtaggttaca ta 42

<210> 59

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-sucD-F

<400> 59

aaatatccca tagtgttttg aatataggat ccaaggagat atacc 45

<210> 60

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-sucD-R

<400> 60

ctagtatttc tcctctttct ctagtattat ccccatattt cctcatag 48

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-F

<400> 61

agatgagaca ggcagctaat ccctcgagcc gtcaattgtc 40

<210> 62

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-R

<400> 62

ttttaatgat gatgcacatg ttacatacgg cagattaaat cc 42

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-up-F

<400> 63

atcgacgaat agtaggcgat 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-up-R

<400> 64

attagctgcc tgtctcatct 20

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-down-F

<400> 65

catgtgcatc atcattaaaa att 23

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-down-R

<400> 66

gctatcaatc aacggcccta 20

<210> 67

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-v-F

<400> 67

tagggccgtt gattgatagc ccgggaattc atgcagttca cttac 45

<210> 68

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ptac-4so-v-R

<400> 68

atcgcctact attcgtcgat ctagaagaag cttgggatcg ggc 43

<210> 69

<211> 170

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 启动子序列

<400> 69

agcggataac aatttcacac aggaatgcct ccacaccgct cgtcacatcc tgttgcgttc 60

actggaatcc cagtatctaa tttgacctgc gagcaagctg tcaccggatg tgctttccgg 120

tctgatgagt ccgtgaggac gaaacagcct ctacaaataa ttttgtttaa 170

<210> 70

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> P-4so-F

<400> 70

aattttgttt aagtcctgtt attaaaaagt atataaggag g 41

<210> 71

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Promoter-F

<400> 71

agatgagaca ggcagctaat atgcctccac accgctcgtc 40

<210> 72

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Promoter-R

<400> 72

aataacagga cttaaacaaa attatttgta gaggctg 37

<210> 73

<211> 131

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 诱导型启动子Ptac序列

<400> 73

tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcgctc acaattagct 60

gtcaccggat gtgctttccg gtctgatgag tccgtgagga cgaaacagcc tctacaaata 120

attttgttta a 131

Claims

1.一种重组盐单胞菌，其通过将编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因引入出发菌盐单胞菌中而得到，

其中，所述出发菌盐单胞菌为Halomonas TD01，

其中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因是来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridium kluyveri)的orfZ基因；

其中，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因是来自聚球蓝细菌(Synechococcus sp.)的ogdA基因；

其中，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因是来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridiumkluyveri)的sucD基因；

其中，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因是来自克氏梭状芽胞杆菌(Clostridiumkluyveri)的4hbd基因。

2.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因如SEQ ID NO:20所述；和/或，其中，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因如SEQ ID NO:22所述；和/或，其中，所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因如SEQ ID NO:24所述；和/或，其中，所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因如SEQ ID NO:26所述。

3.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，所述4-羟基丁酰辅酶A转移酶如SEQ IDNO:21所述；和/或，其中，所述2-酮戊二酸脱羧酶如SEQ ID NO:23所述；和/或，其中，所述琥珀酸半醛脱氢酶如SEQ ID NO:25所述；和/或，其中，所述4-羟基丁酸脱氢酶如SEQ ID NO:27所述。

4.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其是通过将包含编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因的质粒载体和包含编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因的质粒载体引入出发菌盐单胞菌中而得到。

5.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，敲除盐单胞菌基因组上的编码琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的基因。

6.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因被整合到盐单胞菌基因组上，所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因在质粒载体上；或者，其中，以基因组为载体包含所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因。

7.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和/或所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因由诱导型启动子或组成型启动子控制。

8.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其中，所述编码4-羟基丁酰辅酶A转移酶的基因、所述编码2-酮戊二酸脱羧酶的基因、所述编码琥珀酸半醛脱氢酶的基因和/或所述编码4-羟基丁酸脱氢酶的基因由如下启动子序列来控制：SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:73。

9.一种生产P(3HB-co-4HB)的方法，其特征在于，利用权利要求1-8中任一项所述的重组盐单胞菌生产P(3HB-co-4HB)。