CN110073900B

CN110073900B - 一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110073900B
Application number: CN201910469707.XA
Authority: CN
Inventors: 陈智毅; 刘学铭; 王旭苹; 程镜蓉; 张友胜; 张业辉; 汪婧瑜
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110073900A

Abstract

本发明属于食用菌生产技术领域，公开了一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基及其制备方法和应用。旨在利用金针菇高效生物合成具有强抗氧化性能的麦角硫因。金针菇培养基包括以下组分：杂木屑28.5％‑51.5％、鸡毛降解物5％‑30％，棉籽壳10％‑20％、玉米芯10％‑20％、小麦4％‑8％、豆秸1％‑5％、米糠2％‑12％、石灰0.25％‑0.75％、石膏0.25％‑0.75％、大豆皮1％‑5％。鸡毛降解物的处理条件：鸡毛粉70％‑90％，5‑12h光照，反应时间5‑15d，反应pH5.0‑6.0，菌种量10％‑30％。菌种是芽孢杆菌的一种或多种。鸡毛通过蒸汽、弱碱、干燥、粉碎等加工处理获得鸡毛粉。

Description

一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于食用菌生产技术领域，特别涉及一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基及其制备方法和应用。

背景技术

金针菇：金针菇[Flammulina velutiper(Fr.)Sing.]在植物分类学上，隶属真菌门，担子菌纲，伞菌目，白蘑科，金针菇属。金针菇有很高的食用药用价值，金针菇中的朴菇素(也叫火菇素，Flammulin，一种碱性蛋白)，金针菇免疫调节蛋白即FIP-fve、金针菇多糖等具有很好的抗癌作用，金针菇中的核苷酸如5′-GMP，5′-AMP，5′-UMP等具有降胆固醇的作用，金针菇含有酚类、麦角硫因和多糖，具有很好的抗氧化活性，其中麦角硫因以其高效的抗氧化、清除自由基、螯合金属离子和抵抗紫外线辐射以及保鲜护色作用等功能而受到越来越多的关注，逐渐成为研究热点。麦角硫因分布于哺乳动物的某些组织、器官中，主要存在于红血球(约1-2mmol/L)和某些动物的***中。麦角硫因在绝大多数生物体中的含量均极少，而在某些蘑菇品种、黑豆、红豆、红肉、肝、肾和谷物中却含量丰富，在金针菇中含量尤为丰富。本发明人研究表明，金针菇子实体干物中麦角硫因的含量(3.213±0.624g/kg)，是目前发现含有麦角硫因最多的生物体。因此金针菇是目前最适合用于生物合成麦角硫因的材料。

2017年7月13日，欧盟委员会发布(EU)2017/1281号法规，根据欧洲议会和理事会(EC)第258/97号条例，授权将L-麦角硫因(L-ergothioneine)作为新食品成分投放市场，并命名为L-麦角硫杆菌素。麦角硫因是一种有效的天然抗氧化剂，其抗氧化能力可与常规抗氧化剂谷胱甘肽、维生素C等相当。麦角硫因在体外的抗氧化性主要体现在可以结合组织中羟自由基、次氯酸、单线态氧以及过氧亚硝酸盐等的自由电子；与谷胱甘肽、维生素C等抗氧化剂相比，麦角硫因能更有效预防酪氨酸的硝化和α-1-抗蛋白酶的钝化；麦角硫因还能保护DNA免受损伤以及防止由过氧化氢和过氧化氢亚铁血红素蛋白质混合物导致的花生四烯酸过氧化；麦角硫因能够阻止血红蛋白与过氧化氢的反应，肉的变色是肌红蛋白和脂类过氧化之间的反应所致，因而麦角硫因也被用来维持鱼肉和畜禽肉颜色的稳定性。麦角硫因的提取制备及合成方法主要有化学方法，如公开号为CN107848984A、CN107108520A、CN102686568A，这些合成方法都涉及化学反应的底物甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸等，相关的技术至今尚不成熟，合成所需的原料成本较高，目前市售的麦角硫因均没有来自化学合成的产品。从利用真菌生物合成麦角硫因的专利，如公开号为CN106831596A、CN106831597A、CN103734022A、CN102978121A，不仅需要添加甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸等底物，但其报道其麦角硫因的含量并没有突破性提高，与本发明人没有添加添加甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸等底物的液体深层发酵金针菇菌丝体提取麦角硫因的效率差异不大。此外还有专利使用体外酶促转化或代谢工程(CN104854245A)、转基因(CN107250347A)等方法生产麦角硫因，但目前只处于概念阶段未能产业化。由此说明，甜菜碱、组氨酸、半胱氨酸等底物对于化学合成或者生物合成麦角硫因具有重要意义。

含量较多胱氨酸主要有角蛋白(含胱氨酸14-15％)，角蛋白含有较多的氮含量(21-24.5％)。而禽类羽毛中的蛋白质主要由角质蛋白构成，其含量超过80％，鸡毛蛋白是一种不溶性的蛋白质，其氨基酸组成稳定，主要是由胱氨酸等20多种氨基酸以肽键作用结合在一起，羽毛蛋白中除赖氨酸、蛋氨酸的含量明显较低外，其它动物必需氨基酸含量较高。我国羽毛资源非常丰富，是羽毛产量第一大国，目前羽毛年产数百万吨，数量十分庞大。家禽中羽毛有部分用来生产羽绒制品，下脚料羽梗经过简单的加工后制成羽毛粉添加到饲料中，以提高饲料粗蛋白的含量，但因技术及成本原因，羽毛粉产量很低，绝大部分羽毛没有得到充分利用，这既浪费资源又污染环境。因此可以低成本利用鸡羽毛角蛋白为金针菇生物合成麦角硫因提供大量的组氨酸、半胱氨酸等底物。

但鸡羽毛角蛋白结构稳定，在一般条件下角蛋白不溶解，甚至动物来源的蛋白酶如酪蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等都不能降解角蛋白。自然界中很多微生物可利用自身分泌的角蛋白酶分解角蛋白利用，作为生长所需的碳源和氮源。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单，易于存活、定殖与繁殖，无致病性，并能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。因此枯草芽孢杆菌这些酶具备很好地降解鸡羽毛角蛋白的特性。有鉴于此，本发明利用微生物的特性，设计合适发酵工艺降解羽毛角蛋白，将降解的底物用于金针菇生物合成麦角硫因的成分，对我国需要进口大量大豆、饲料蛋白质资源极度缺乏的现状，充分利用角蛋白资源，具有极大的经济价值与社会价值。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基，该培养基能促进金针菇生物合成功能性成分麦角硫因。

本发明的另一目的在于提供一种上述含有鸡毛降解物的金针菇培养基的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种上述含有鸡毛降解物的金针菇培养基的应用。

本发明利用低成本的微生物枯草芽孢杆菌等，降解含有生物合成麦角硫因需要的组氨酸、半胱氨酸等底物的废弃物鸡羽毛，作为最合适生物合成麦角硫因的食用菌金针菇的培养基，培养出富含麦角硫因具有强抗氧化性的高品质的金针菇。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基，所述金针菇培养基的配方包含以下组分：杂木屑28.5％-51.5％、鸡毛降解物5％-30％，棉籽壳10％-20％、玉米芯10％-20％、小麦4％-8％、豆秸1％-5％、米糠2％-12％、石灰0.25％-0.75％、石膏0.25％-0.75％、大豆皮1％-5％。

所述鸡毛降解物按照以下方法制备得到：

(1)收集鸡毛，装罐密封，输入蒸汽，压力调节至1.0-3.0MPa，处理0.5-3.0min后排气，一边翻转一边均匀喷入质量百分浓度为0.05-0.5％氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，喷均匀后，离心脱水回收氢氧化钾或氢氧化钠，烘干，分拣，粉碎得鸡毛粉；

(2)将菌种在斜面培养基中活化，挑取活化后的菌种置入摇瓶中进行液体培养扩增，获得芽孢杆菌菌液；所述菌种为嗜热型地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中的一种以上；

所述斜面培养基的成分包括5.0-7.0g大豆蛋白胨、5.0-7.0g酵母提取物、8-10.0g葡萄糖、0.5-2.0g K₂HPO₄、0.01-0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5-7.0gNaCl、5-13.0g Na₂CO₃、10-18.0g琼脂和1.0L蒸馏水，上述成分混合后在121℃条件下15分钟灭菌；

所述液体培养采用的液体培养基的成分包括5.0-7.0g大豆蛋白胨、5.0-7.0g酵母提取物、8-10.0g葡萄糖、0.5-2.0g K₂HPO₄、0.01-0.5gMgSO₄·7H₂O、0.5-7.0g NaCl、5-13.0g Na₂CO₃和1.0L蒸馏水，上述成分混合后在121℃条件下15分钟灭菌。

(3)将鸡毛粉加入上述芽孢杆菌菌液中，调拌均匀，鸡毛粉和菌液中的菌种量的质量百分数分别为70％-90％和10％-30％，控制pH5.0-6.0，每天光照5-12h，反应5-15d后，得到鸡毛降解物。

上述的一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基的制备方法，包括以下操作步骤：将杂木屑、鸡毛降解物、棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏和大豆皮混合均匀，得到金针菇培养基。

上述的一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基在生产高含量麦角硫因金针菇中的应用。

该应用包括以下步骤：将含有鸡毛降解物的金针菇培养基装袋后灭菌，然后依次进行接种金针菇菌种、菌处理、搔菌、出菇管理、采收、养菌、搔菌和重复出菇管理。

所述高含量麦角硫因金针菇生产麦角硫因的产率大于质量分数0.6％。

本发明的原理是：

(1)本发明的实施方式利用了畜禽废弃物家禽羽毛高蛋白的特性，其中包括家禽羽毛蛋白含量超过80％，鸡毛蛋白资源非常丰富，鸡毛蛋白是一种不溶性的蛋白质，其氨基酸组成稳定，主要是由胱氨酸等20多种氨基酸以肽键作用结合在一起，其中的α-角蛋白的半胱氨酸残基含量较高，β-角蛋白富含丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸小侧链残基。

(2)本发明的实施方式采用蒸汽的高温高压方式将家禽羽毛蛋白进行部分降解，降解产物主要为半胱氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、组氨酸等氨基酸，并以半胱氨酸的含量作为参数优化的主要参数。

(3)本发明实施方式以提升金针菇生物合成功能性成分麦角硫因的特性为目的改良金针菇培养基配方。金针菇具有较强的生物合成麦角硫因的能力，是目前发现麦角硫因含量最高的生物。但本发明人研究发现普通的金针菇培养基主要由杂木屑，棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏、大豆皮等组成，其中蛋白质含量仅有9％，供给金针菇生物合成麦角硫因的主要底物蛋白质降解产物氨基酸等成分的含量远远不够，因此设法提高金针菇培养基中蛋白质含量，即提高金针菇生物合成麦角硫因底物原料的含量，有助于提高金针菇生物合成麦角硫因的能力。

(4)本发明实施方式利用了高温高压蒸汽处理结合微生物降解家禽废弃物羽毛蛋白。家禽羽毛资源丰富，而且蛋白含量超过80％，并且是富含生物合成麦角硫因需要的半胱氨酸等氨基酸，但鸡毛蛋白是一种不容易被其他生物利用的硬蛋白，本发明用高温高压裂解二硫键，破坏鸡毛蛋白牢固的分子空间结构，降解为容易被微生物等生物利用的多肽、寡肽以及游离的氨基酸等。

(5)本发明实施方式适度高温高压处理鸡毛既可以降低成本又可以提供最佳的食用菌金针菇生物合成麦角硫因利用的底物。目前，鸡毛蛋白降解技术均采用没有针对性的降解方式，而是完全降解了鸡毛蛋白，将鸡毛蛋白中的二硫键完全被破坏，合成麦角硫因需要的底物半胱氨酸等同时也被完全破坏。本发明以半胱氨酸为主要参数设计适度控制高温高压蒸汽降解鸡毛蛋白的技术提供食用菌金针菇发酵作用生物合成麦角硫因的最优化的条件。

(6)本发明实施方式利用微生物的变性作用等，破坏鸡毛角蛋白的立体化学结构非常牢固的二硫键，然后微生物的多肽酶将上述角蛋白逐步降解为多肽、寡肽以及游离的氨基酸，从而可以供给金针菇利用作为合成麦角硫因的原料。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明的实施是通过降解鸡毛蛋白被食用菌金针菇等生物利用。畜禽废弃物鸡毛每年产生数百万吨，鸡毛富含角蛋白，含量在80％以上，但鸡毛角蛋白的结构非常稳定，本发明提出采用物理、化学、微生物与真菌联合作用的方式降解鸡毛角蛋白，可以低成本地获得易被食用菌等生物利用的多肽、寡肽以及游离的氨基酸等，而这些成分可以作为金针菇生物合成麦角硫因的底物。

(2)本发明的实施是通过利用鸡毛降解产物改造金针菇培养基的配方实现的，提出促进金针菇生物合成功能成分麦角硫因的能力，以达到提升金针菇的食药用价值的效果。

工业实用性：

本发明提出了可以规模化干燥处理畜禽废弃物鸡毛生产鸡毛粉、芽孢杆菌等微生物降解处理鸡毛粉生产鸡毛降解物的工艺条件，适用于金针菇工业化生产的培养基配方，利用金针菇大量生物合成功能成分麦角硫因，提升金针菇的食药用价值，为规模化制备麦角硫因创造条件，本发明具有很好的应用前景和经济价值。

本发明工业实用性的优点在于：1)直接利用金针菇食用菌的转化作用生产麦角硫因，不需要化学试剂，既节省成本，又利于环境保护。2)金针菇食用菌转化的效率高，专一性强，生成的麦角硫因，产率大于质量分数0.6％；3)工艺简单，降低生产成本；4)畜禽鸡毛废弃物综合利用；5)提升金针菇的食药用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中用到的菌液是按照以下方法制备得到：将菌种在斜面培养基中活化，挑取活化后的菌种置入摇瓶中进行液体培养扩增，获得芽孢杆菌菌液；

所述菌种为芽孢杆菌，包括嗜热型地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中的一种以上。

实施例1

(1)鸡毛粉的制作：收集鸡毛，装罐密封，输入蒸汽，压力调节至1.0MPa，处理3.0min后排气，一边翻转一边均匀喷入质量百分浓度为0.05-0.5％氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，喷均匀后，离心脱水回收氢氧化钾或氢氧化钠，烘干，分拣，粉碎得鸡毛粉；

(2)鸡毛降解物的制作：将鸡毛粉加入芽孢杆菌菌液中，调拌均匀，鸡毛粉和菌液中的菌种量的质量百分数分别为80％和20％，控制pH5.0，每天光照12h，反应12d后，得到鸡毛降解物；

(3)金针菇培养基的制作：将杂木屑、鸡毛降解物、棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏和大豆皮混合均匀，得到金针菇培养基；原料配比按照质量百分比计为：杂木屑51.5％、鸡毛降解物20％，棉籽壳10％、玉米芯10％、小麦4％、豆秸1％％、米糠2％、石灰0.25％、石膏0.25％、大豆皮1％；

(4)将含有鸡毛降解物的金针菇培养基装袋后灭菌，然后依次进行接种金针菇菌种、菌处理、搔菌、出菇管理、采收、养菌、搔菌和重复出菇管理。对所得金针菇进行含量测定，其中麦角硫因的产率达到质量分数0.6％。

实施例2

(1)鸡毛粉的制作：收集鸡毛，装罐密封，输入蒸汽，压力调节至1.5MPa，处理1.0min后排气，一边翻转一边均匀喷入质量百分浓度为0.05-0.5％氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，喷均匀后，离心脱水回收氢氧化钾或氢氧化钠，烘干，分拣，粉碎得鸡毛粉；

(2)鸡毛降解物的制作：将鸡毛粉加入芽孢杆菌菌液中，调拌均匀，鸡毛粉和菌液中的菌种量的质量百分数分别为80％和20％，控制pH5.5，每天光照10h，反应15d后，得到鸡毛降解物；

(3)金针菇培养基的制作：将杂木屑、鸡毛降解物、棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏和大豆皮混合均匀，得到金针菇培养基；原料配比按照质量百分比计为：杂木屑41.3％、鸡毛降解物10％，棉籽壳15％、玉米芯15％、小麦7％、豆秸3％、米糠5％、石灰0.3％、石膏0.4％、大豆皮3％；

(4)将含有鸡毛降解物的金针菇培养基装袋后灭菌，然后依次进行接种金针菇菌种、菌处理、搔菌、出菇管理、采收、养菌、搔菌和重复出菇管理。对所得金针菇进行含量测定，其中麦角硫因的产率达到质量分数0.65％。

实施例3

(1)鸡毛粉的制作：收集鸡毛，装罐密封，输入蒸汽，压力调节至2.0MPa，处理1.5min后排气，一边翻转一边均匀喷入质量百分浓度为0.05-0.5％氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，喷均匀后，离心脱水回收氢氧化钾或氢氧化钠，烘干，分拣，粉碎得鸡毛粉；

(2)鸡毛降解物的制作：将鸡毛粉加入芽孢杆菌菌液中，调拌均匀，鸡毛粉和菌液中的菌种量的质量百分数分别为90％和10％，控制pH6.0，每天光照10h，反应13d后，得到鸡毛降解物；

(3)金针菇培养基的制作：将杂木屑、鸡毛降解物、棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏和大豆皮混合均匀，得到金针菇培养基；原料配比按照质量百分比计为：杂木屑25％、鸡毛降解物30％，棉籽壳10％、玉米芯10％、小麦5％、豆秸5％、米糠10％、石灰0.5％、石膏0.5％、大豆皮4％；

(4)将含有鸡毛降解物的金针菇培养基装袋后灭菌，然后依次进行接种金针菇菌种、菌处理、搔菌、出菇管理、采收、养菌、搔菌和重复出菇管理。对所得金针菇进行含量测定，其中麦角硫因的产率达到质量分数0.7％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基，其特征在于：所述金针菇培养基由以下按质量百分比计的组分组成：杂木屑28.5％-51.5％、鸡毛降解物5％-30％，棉籽壳10％-20％、玉米芯10％-20％、小麦4％-8％、豆秸1％-5％、米糠2％-12％、石灰0.25％-0.75％、石膏0.25％-0.75％、大豆皮1％-5％；

所述鸡毛降解物按照以下方法制备得到：

(2)将菌种在斜面培养基中活化，挑取活化后的菌种置入摇瓶中进行液体培养扩增，获得芽孢杆菌菌液；所述菌种为嗜热型地衣芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种以上；

所述斜面培养基的成分包括5.0-7.0g大豆蛋白胨、5.0-7.0g酵母提取物、8-10.0g葡萄糖、0.5-2.0g K₂HPO₄、0.01-0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5-7.0g NaCl、5-13.0g Na₂CO₃、10-18.0g琼脂和1.0L蒸馏水，上述成分混合后在121℃条件下15分钟灭菌；

所述液体培养采用的液体培养基的成分包括5.0-7.0g大豆蛋白胨、5.0-7.0g酵母提取物、8-10.0g葡萄糖、0.5-2.0g K₂HPO₄、0.01-0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5-7.0g NaCl、5-13.0gNa₂CO₃和1.0L蒸馏水，上述成分混合后在121℃条件下15分钟灭菌；

(3)将鸡毛粉加入芽孢杆菌菌液中，调拌均匀，鸡毛粉和菌液中的菌种量的质量百分数分别为70％-90％和10％-30％，控制pH5.0-6.0，每天光照5-12h，反应5-15d后，得到鸡毛降解物。

2.根据权利要求1所述的一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：将杂木屑、鸡毛降解物、棉籽壳、玉米芯、小麦、豆秸、米糠、石灰、石膏和大豆皮混合均匀，得到金针菇培养基。

3.根据权利要求1所述的一种含有鸡毛降解物的金针菇培养基在生产高含量麦角硫因金针菇中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：该应用包括以下步骤：将含有鸡毛降解物的金针菇培养基装袋后灭菌，然后依次进行接种金针菇菌种、菌处理、搔菌、出菇管理、采收、养菌、搔菌和重复出菇管理。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述高含量麦角硫因金针菇生产麦角硫因的产率大于质量分数0.6％。