CN110068529A - 一种外囊泡的表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪获取外囊泡的多参数，实现评估表征；本发明通过将蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料相结合，优化实验步骤和条件，应用于流式细胞仪检测生物样品中外囊泡，拓宽了荧光染料的新用途，基于蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料的双重染色在评估外囊泡中具有较好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，主要涉及一种外囊泡的表征方法，尤其涉及一种微囊泡或/和外泌体的表征方法。
背景技术
细胞外囊泡(extracellular vesicle，EVs)是指细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。细胞外囊泡主要由微囊泡(microvesicle)和外泌体(exosome)组成。微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm–1000nm。外泌体由细胞内的多泡小体(Multivesicular bodies)与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径约为30nm-100nm。几乎所有类型的细胞，包括癌细胞都会释放外泌体。作为细胞间通讯的重要介质，外泌体介导了蛋白质和遗传物质的转运和交换。
目前细胞外囊泡(EVs)的检测方法主要有扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射技术(DLS)、纳米微粒追踪分析术(NTA)、流式细胞仪和酶联免疫分析(ELISA)等，由于动态光散射技术和纳米微粒追踪分析术仅能表征生物样品的物理参数；而扫描电子显微镜、原子力显微镜的样品前处理步骤复杂且对操作人员的经验要求较高；由于通量高、用时短、操作简单，酶联免疫分析和流式细胞仪已成为目前较常用的方法。酶联免疫分析方法容易受其他可溶性抗原的干扰，而且无法知道囊泡的大小、数量等信息；流式细胞仪可以检测囊泡的大小、数量，因理论上是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。但纳米流式仪造价高昂，不利于在医院和疾病检测中心的应用和推广；到目前为止以上技术也未在医疗领域中得到广泛应用。
因此，研发一种简洁高效、适用于常规流式细胞仪，用于表征评估外泌体或/和微囊泡的检测方法，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种外囊泡的表征方法，通过将蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料相结合，应用于流式细胞仪检测生物样品中外泌体或/和微囊泡，拓宽了荧光染料的新用途，在评估外囊泡中具有较好的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种外囊泡的表征方法，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪检测并获取外囊泡的多参数，实现生物样品的评估表征。
现有技术中，鉴定微囊泡和外泌体的方法是纳米流式和扫描电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射技术、纳米微粒追踪分析术、流式细胞仪和酶联免疫分析，但纳米微粒追踪分析术和酶联免疫分析的方法只能表征样品的物理参数；而扫描电子显微镜、原子力显微镜虽然可以表征样品的生物结构，对样品和操作人员的要求较高；纳米流式仪是针对于外囊泡而专门研发的流式仪，目前仪器购置成本高；以上因素均严重限制了外囊泡表征方法的发展与推广。本方法采用胞内通用型酯酶的蛋白质荧光染料和通用型细胞膜荧光染料的双重染色，通过流式细胞仪来获取微囊泡和外泌体的多参数，用以其特征的评估。
优选地，所述外囊泡包括外泌体或/和微囊泡。
外囊泡主要由外泌体和微囊泡组成，本发明所述方法可用于外泌体的表征，也可用于微囊泡的表征，但因目前提取方法的局限，无法保证100％的分离纯化外泌体或微囊泡，在提取微囊泡的实验步骤中一般不会特意剔除外泌体，故一般提取出的微囊泡中可能混有外泌体。而因为外泌体的提取难度大，不可避免的造成提取物中仍混有一定比例的微囊泡。因此，实际操作中，外泌体和微囊泡以混合物的形式存在。现有技术中，通常要先对样品中的外囊泡进行计数，然后观察外囊泡的形态是否完整，最后通过Western Blot等手段对外囊泡的抗原性进行分析验证，三种方法结合才能评估外囊泡的物理和生物活性；而本发明的双重染色方法可以同时监测样品中外囊泡的数量、形态和生物活性，显著提高检测效率。此外，对外泌体的表征难度远大于对微囊泡的表征，外泌体粒径更小，普通操作方法很难在保持生物活性的条件下进行物理和生化两方面的表征，本发明的方法不仅可以对微囊泡进行表征，同时满足对外泌体样品的物理粒径分布和生物活性评估，获得样品多参数的统计学信息，以便对外泌体样品进行综合评价。
优选地，所述蛋白质荧光染料包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE。
优选地，所述细胞膜荧光染料包括亲脂性羰花青染料Dil或/和十八烷基罗丹明B氯盐，优选为亲脂性羰花青染料Dil。
单一染色方式对外泌体和微囊泡的检测灵敏度低，本发明通过组合使用两种荧光染料，提高对外囊泡的表征准确度，实现对外囊泡的活体检测，不破坏样品的完整性。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)分离提取体外囊泡；
(2)将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光孵育染色；
(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色；
(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。
羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE没有颜色、不显荧光，可通过被动扩散进入细胞，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定的荧光偶联物。
羰花青荧光染料有较长的亲脂性烃链，具有消光系数高、极性依赖性、着色稳定、激发态寿命短、细胞毒性小等特点，可用于细胞膜和其它脂溶性生物结构的活体染色。强光敏感性的荧光染料在进入细胞膜之前仅具有微弱的荧光，一旦结合细胞膜后，可在细胞膜上扩散，其荧光强度大大增强，荧光染料在最佳浓度时可以使生物样品的细胞膜均一着色。
本发明采用通用型酯酶的蛋白质荧光染料——羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE，和通用型细胞膜荧光染料——亲脂性羰花青染料Dil双重染色，通过流式细胞仪来获取微囊泡和外泌体的多参数，用以其特征的评估。普通检测方法只可对囊泡的个数和浓度进行物理上的计数，而对其样品的活性和杂质等只能通过观察的方式进行粗略评估。而相比于传统方法，本发明提供的表征方法可以提供更精准的信息，即绝对的生物活性的囊泡个数。
优选地，所述羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE的工作浓度为10-80nM，例如可以是10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM或80nM。
优选地，所述亲脂性羰花青染料Dil的工作浓度为0.5-2nM，例如可以是0.5nM、1nM、1.5nM或2nM。
本发明中，通过特异性选择两种不同的荧光染料，并配比其工作浓度，以实现对外囊泡的充分染色，但不产生过多的背景噪音，方便后续表征分析，若工作浓度超出本申请所述范围均会降低表征效果：染料浓度过高会引入假阳性结果，浓度过低则显著降低染色效率导致结果偏差或无结果。
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为35℃-37℃，例如可以是35℃、36℃、或37℃。
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为0.2-3h，例如可以是0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.25h、2.5h、2.75h或3h。
优选地，步骤(3)所述孵育的条件为23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min，优选为23℃-26℃孵育10-30min。
本发明中，亲脂性羰花青染料Dil的常用孵育条件为35℃-37℃孵育1-15min，但发明人在实践过程中发现，23℃-26℃孵育10-30min孵育条件下，亲脂性染料对样品质膜的染色效果更佳，且可搭配蛋白质荧光染料产生互不干扰的显色反应。
优选地，步骤(4)所述稀释的倍数为10-1000倍，例如可以是10倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍、800倍或1000倍。
本发明中，通过对染料种类的搭配，不同染料的染色条件进行组合，并配合本发明所述稀释倍数，以确保染色充分且均匀。其中，稀释倍数在10-1000倍范围内，操作人员可根据具体流式细胞仪上样要求进行调整。
作为优选技术方案，一种外囊泡的表征方法，具体包括如下步骤：
(1)分离提取外囊泡；
(2)将工作浓度为10-80nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光35℃-37℃孵育0.2-3h染色；
(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入工作浓度为0.5-2nM的亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色，23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min；
(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释10-1000倍后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。
本发明中，发明人在长期的科研实践过程中，为提升细胞外囊泡检测方法的高效性和简便性，研发了一种崭新的评估微囊泡和外泌体的双重荧光染色技术方法，优选两种特性不同的荧光染料，优化配比和实验步骤，各步骤各条件相互配合，协同增效，用于评估微囊泡和外泌体的浓度、样品完整性和生物活性、细胞外囊泡的粒径范围、样品中蛋白质和脂质类等杂质的含量等，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
第二方面，本发明提供一种包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE和亲脂性羰花青染料Dil的组合物用于外囊泡的双重荧光染色的应用。
优选地，所述外囊泡为外泌体或/和微囊泡。
优选地，所述应用包括评估外囊泡的浓度、外囊泡样品完整性和生物活性、细胞外囊泡的粒径范围或样品中杂质的含量中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述杂质包括蛋白质聚合物和脂类化合物。
细胞外囊泡样品制备过程中的离心、过滤和荧光染色等步骤均可造成外囊泡的破碎以及其他杂质的引入，产生的杂质包括蛋白质聚合物和脂类化合物，通过本发明所述双重染色方法可对所述杂质进行定性和定量。
优选地，所述应用包括表征生物样品中外泌体或/和微囊泡的有效浓度。
普通检测方法只可对囊泡的个数和浓度进行物理上的计数，而本发明通过双重染色的方式可以提供更精准的信息，即绝对的具有生物活性的囊泡个数。
优选地，所述应用包括表征生物样品中外泌体或/和微囊泡结构的完整率和/或破损率。
本发明能够提供外囊泡粒径分布范围的参数，用以评估外泌体或微囊泡分离效率、提取方法的有效性和样品纯度。
本发明所涉及的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯和亲脂性的羰花青荧光染料用于微囊泡和外泌体的磷脂双分子层细胞膜结构及胞内蛋白质染色，可用于其生物活性的检测及品质评估。本发明涉及的双重染色方案可用于分离提取后的微囊泡和外泌体的活体检测及品质评估，临床患者的长时间多参数监测和及疾病诊断；基于羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染料的双重染色可用于评估微囊泡和外泌体的有效浓度、样品完整性和生物活性、细胞外囊泡的粒径范围、样品中蛋白质和脂质类等杂质的含量等。
本发明是一种较新的评估微囊泡和外泌体的双重荧光染色技术方法。羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染料可以在胞内蛋白质的作用下显出荧光，亲脂性的羰花青荧光染料可以与细胞膜的磷脂双分子结构有效的结合显出荧光。流式细胞仪记录下荧光基团的信号，用以后续的数据分析和品质评估。本发明发现基于羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染料的双重染色在评估微囊泡和外泌体中具有较好的效果。
本发明所述的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯和亲脂性的羰花青荧光染料分别作为蛋白质和细胞膜的荧光染色剂，应用于微囊泡和外泌体生物结构的表征中，开拓了两种荧光染料组合的新用途，为微囊泡和外泌体体外提取后的活性评估提供了新选择。具体的说，双重染色在表征生物样品中微囊泡和外泌体的提取效率中的应用；双重染色在表征生物样品中微囊泡和外泌体结构的完整率/破损率中的应用；双重染色在表征生物样品中微囊泡和外泌体的含量中的应用；双重染色在表征生物样品中微囊泡和外泌体的粒径分布区间中的应用。传统方法并不能通过一次计数实验来反应囊泡的生物学活性，而要通过质膜上的抗原和电镜下的囊泡形貌才能对其生物活性进行粗略的评估。而本发明的表征方法，可以通过流式细胞术的方法，一方面实现囊泡的计数，一方面通过双染的方法实现对囊泡质膜和包裹其中的蛋白质的数据统计来评估囊泡的生物活性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯和亲脂性的羰花青荧光染料双重染色应用于外泌体或/和微囊泡的表征评估中，方法简洁高效，能够同时检测多项参数，实现精确计数并评估样品生物活性，具有用量小、低毒性、广谱性、价格低廉等诸多优点。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
无外泌体的血清培养1×106个Hela细胞，在37℃和5％CO2的条件下，6h后收集培养基上清，用于微囊泡和外泌体的分离提取。
4℃，100,000g超速离心2h，经过两次超高速离心，再复溶于PBS溶液即为提取的外泌体。
终浓度为25nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(eBioscienceTMCFSE，货号：65-0850-84，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃培养箱内避光共孵育1.5h；
然后，终浓度为1nM的亲脂性的羰花青荧光染料('DiI'；DiIC18(3)，货号：D282，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃中避光共孵育10min或常温(24℃)避光共孵育20min。
染色后的样品稀释100倍后进行后续的流式数据收集和分析。
基于本方法评估超滤技术分离的外泌体，发现提取得到的纳米级的颗粒浓度为3.2-7.6×108/mL；其中双重染色的细胞外囊泡的含量为53.1％-63.3％；溶液中蛋白质聚合物含量为10.5％-14.1％；细胞膜碎片的含量为10.2％-17.1％，其他杂质的含量为5.5-7.8％。
实施例2
无外泌体的血清培养1×106个Hela细胞，在37℃和5％CO2的条件下，6h后收集培养基上清，用于微囊泡和外泌体的分离提取。
4℃，100,000g超速离心2h，经过两次超高速离心，再复溶于PBS溶液即为提取的外泌体。
终浓度为80nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(eBioscienceTMCFSE，货号：65-0850-84，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃培养箱内避光共孵育0.2h；
然后，终浓度为2nM的亲脂性的羰花青荧光染料('DiI'；DiIC18(3)，货号：D282，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃中避光共孵育1min或常温(24℃)避光共孵育10min。
染色后的样品稀释1000倍后进行后续的流式数据收集和分析。
基于本方法评估超滤技术分离的外泌体，发现提取得到的纳米级的颗粒浓度为5.6-7.6×108/mL；其中双重染色的细胞外囊泡的含量为55.2％-61.9.3％；溶液中蛋白质聚合物含量为11.2％-15.1％；细胞膜碎片的含量为11.7％-16.3％，其他杂质的含量为4.9-8.6％。
实施例3
无外泌体的血清培养1×106个Hela细胞，在37℃和5％CO2的条件下，6h后收集培养基上清，用于微囊泡和外泌体的分离提取。
4℃，100,000g超速离心2h，经过两次超高速离心，再复溶于PBS溶液即为提取的外泌体。
终浓度为10nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(eBioscienceTMCFSE，货号：65-0850-84，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃培养箱内避光共孵育3h；
然后，终浓度为0.5nM的亲脂性的羰花青荧光染料('DiI'；DiIC18(3)，货号：D282，Thermo fisher)溶液和外泌体，在37℃中避光共孵育15min或常温(24℃)避光共孵育30min。
染色后的样品稀释10倍后进行后续的流式数据收集和分析。
基于本方法评估超滤技术分离的外泌体，发现提取得到的纳米级的颗粒浓度为1.2-8.6×108/mL；其中双重染色的细胞外囊泡的含量为48.1％-63.3％；溶液中蛋白质聚合物含量为10.8％-17.2％；细胞膜碎片的含量为9.3％-15.7％，其他杂质的含量为5.2-8.9％。
实施例4应用于Hela微囊泡和外泌体提取效率的表征
羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(eBioscienceTMCFSE，货号：65-0850-84，Thermo fisher)，用时以二甲基亚砜配制成所需浓度，过滤除菌，-20℃避光短期保存溶液(半年内)。
亲脂性的羰花青荧光染料('DiI'；DiIC18(3)，货号：D282，Thermo fisher)，用时以无水乙醇/二甲基甲酰胺/二甲基亚砜配制成所需浓度，-20℃避光短期保存溶液(半年内)。
终浓度为10nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)溶液和外泌体，在37℃培养箱内避光共孵育2h；
然后，终浓度为0.5nM的亲脂性的羰花青荧光染料溶液和上述经CFSE染色后的外泌体，在37℃中避光共孵育15min或常温(23℃-26℃)避光共孵育30min。
染色后的样品稀释100倍进行细胞流式数据收集和分析。
本实施例的空白对照为等体积的PBS溶液，其他处理包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯单一染色、亲脂性的羰花青染料单一染色和双重染色三个样品，其中“++”表示CFSE和Dil在双重染色时使用的浓度与单重染色相同，即，10nM的Dil+1nM的CFSE。
实验数据结果见表1：
表1细胞外囊泡样品的特征
由表1可知，PBS缓冲液对样品不会产生任何染色影响，Dil单重染色的结果中包括外囊泡的同时还存在杂质脂质，Dil染色样本中脂质的染色比例为a+b＝56.91％，但该方法无法区分外囊泡与杂质脂质，也无法检测杂质蛋白聚合物的存在及含量；CFSE单重染色的结果中包括外囊泡的同时还存在杂质蛋白质聚合物，CFSE染色样本中蛋白质的染色比例为82.16％，但该方法无法区分外囊泡和杂质蛋白质聚合物，也无法检测杂质脂质的存在及含量；而使用CFSE+Dil的双重染色可以对蛋白质和脂质进行染色，同时具备两种颜色的样品即为外囊泡，而仅具有单一染色的部分为相应的杂质脂质或杂质蛋白聚合物。使用本发明的双重染色方法配合普通流式细胞仪即可对外囊泡的物理和生物活性进行评估。根据表1的记载可知，样品溶液中细胞外囊泡的比例为63.28％，样品中也包含14.12％的胞外蛋白质聚合物、17.13％的脂质和5.57％的其他杂质。相比单一染色，双重染色方法能更准确的评估溶液中细胞外囊泡的含量和杂质组分及含量。
实施例5应用于肺癌细胞外囊泡的粒径分析
本实施例采用的100nm、200nm、300nm和500nm聚苯乙烯微球(FluoSpheresTMSizeKit#2，货号：F8888，Thermo Fisher)，使用PBS溶液稀释100,000倍后，用于流式分析。
终浓度为10nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯溶液和外泌体，在37℃培养箱内避光共孵育2h；然后，终浓度为1nM的亲脂性的羰花青荧光染料溶液和外泌体，在常温(23℃-26℃)避光共孵育30min。实验结果见表2。
表2肺癌细胞外囊泡的粒径及含量
Dil单染即为细胞脂质杂质，CFSE单染为杂质蛋白，而两种染料都未染色的区域为其他杂质。由表2可知，根据流式细胞仪的紫色(405nm)侧散射光(VSSC)的参数设置下的数据分析，肺癌细胞外囊泡的粒径更多的是分布在200-500nm，而在100nm区间的比例较少。此外样品中的胞外蛋白质极少，但脂质和其他杂质的含量则较高，尤其在100-300nm区间范围内其他杂质的比较更高。传统方法并不能通过一次计数实验来反应囊泡的生物学活性，而要通过质膜上的抗原和电镜下的囊泡形貌才能对其生物活性进行粗略的评估。而本方法，可以通过流式细胞术的方法，一方面实现囊泡的计数，另一方面通过双染的方法实现对囊泡质膜和包裹其中的蛋白质的数据统计来评估囊泡的生物活性。
综上所述，本发明提供了一种外泌体或/和微囊泡的表征方法，通过将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯和羰花青荧光染料相结合，优化实验步骤和条件，应用于流式细胞仪检测生物样品中外泌体或/和微囊泡，拓宽了荧光染料的新用途，基于羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯染料的双重染色在评估微囊泡和外泌体中具有较好的效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种外囊泡的表征方法，其特征在于，所述方法采用蛋白质荧光染料和细胞膜荧光染料进行双重荧光染色，通过流式细胞仪获取外囊泡的多参数，实现评估表征。
2.根据权利要求1所述的表征方法，其特征在于，所述外囊泡包括外泌体或/和微囊泡；
优选地，所述蛋白质荧光染料包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE；
优选地，所述细胞膜荧光染料包括亲脂性羰花青染料Dil或/和十八烷基罗丹明B氯盐，优选为亲脂性羰花青染料Dil。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)分离提取外囊泡；
(2)将羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光孵育染色；
(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色；
(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE的工作浓度为10-80nM；
优选地，所述亲脂性羰花青染料Dil的工作浓度为0.5-2nM。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述孵育的温度为35℃-37℃；
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为0.2-3h。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育的条件为23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min，优选为23℃-26℃孵育10-30min。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述稀释的倍数为10-1000倍。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)分离提取外囊泡；
(2)将工作浓度为10-80nM的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE与外囊泡混合后避光35℃-37℃孵育0.2-3h染色；
(3)将步骤(2)孵育染色后的产物加入工作浓度为0.5-2nM的亲脂性羰花青染料Dil，避光孵育染色，23℃-26℃孵育10-30min或35℃-37℃孵育1-15min；
(4)将步骤(3)孵育染色后的产物稀释10-1000倍后进行流式细胞仪检测，收集数据并分析。
9.一种包括羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE和亲脂性羰花青染料Dil的组合物用于外囊泡的双重荧光染色的应用；
优选地，所述外囊泡为外泌体或/和微囊泡。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括评估外囊泡的有效浓度、外囊泡样品完整性和生物活性、细胞外囊泡的粒径范围或样品中杂质含量中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述杂质包括蛋白质聚合物和脂类化合物；
优选地，所述应用包括表征生物样品中外泌体或/和微囊泡结构的完整率或/和破损率。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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