CN110066803A

CN110066803A - 一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法

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Publication number: CN110066803A
Application number: CN201910401105.0A
Authority: CN
Inventors: 黄国滨; 周红艳; 李爱群; 鲁浩; 龚春丽; 郑妍明; 周珊珊
Original assignee: Zhuhai Loy Regenerative Medical Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Zhuhai Loy Regenerative Medical Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-05-16
Also published as: CN110066803B

Abstract

本发明公开了一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法，涉及基因表达调控技术领域，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin‑i gRNA和引导转录激活子的nestin‑a gRNA中的任意一种。该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。

Description

一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法

技术领域

本发明涉及基因表达调控技术领域，具体而言，涉及一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法。

背景技术

nestin基因的蛋白编码产物为NESTIN。NESTIN是第6类中间丝蛋白，也被称为巢蛋白，其分子量大小为220KDa-250KDa，其位于1号染色体中。nestin基因在结构上由3个内含子和4个外显子组成。NESTIN蛋白在结构上主要分为N端(1-7aa)、α螺旋区(8-313aa) 以及C端(314-1621aa)，其中α螺旋区又细分为4个部分，分别是 1A，1B，2A和2B。

胚胎发育过程中nestin基因呈现广泛表达，其最早表达是在胚胎的单细胞神经外胚层上。此外，nestin还在多种细胞中表达，如新生血管内皮细胞、中肾***等，但在神经***中nestin的表达是最丰富的。中枢神经***发育在哺乳动物早期发育过程中是一个十分重要的事件，该过程表现为细胞的迁移以及细胞形态的变化，NESTIN 作为一种中间丝蛋白，被作为神经干细胞的标记分子，对于神经干细胞的自我更新起着十分重要的作用。尽管Nestin在神经***发育中起着重要的作用，但是其具体的影响以及作用机制尚不明确，因此阐明Nestin在神经***发育中的分子机理显得十分必要。

对于基因的研究常见于在细胞中过表达或者沉默靶基因，观察靶基因在细胞命运改变中发挥的作用，而实现基因的过表达或者沉默主要有瞬时表达和稳定表达两类。其中，瞬时表达中外源DNA不会整合到基因组中，但是瞬时表达只能维持短短的几天时间；稳定表达中外源基因与基因组整合，能够在细胞中持续表达。传统的建立稳定细胞株通常通过瞬时转染的方式以及结合基因载体上的抗性基因进行筛选最终获得稳定细胞株，这样的方式存在工作时间长、效率低的问题，此外由于Nestin基因序列比较长，运用传统的方式建立稳定过表达细胞株比较困难，因此有必要建立一种新型的Nestin基因过表达或沉默的gRNA靶点序列。

CRISPR/Cas9是一种操纵基因组的技术，在引导RNA的指导下， Cas9能够靶向基因组中特定区域并对DNA进行切割，从而造成DNA 双链断裂。CRISPR/Cas9常用于对基因组进行编辑。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，该方法简单，脱靶率低，且能在细胞株中稳定表达。克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，能够在短期获得稳定细胞株。这将更有利于研究Nestin基因在神经***发育中的生物学功能及其具体的作用机制，对于我们认识神经干细胞的生命规律具有重要的指导意义。

本发明的另一目的在于提供一种靶向细胞的方法，该方法能够精确靶向细胞，对细胞进行转录前的基因调控。

本发明是这样实现的：

一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，包括依次进行的如下步骤，先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的 nestin-i gRNA和引导转录激活子的nestin-a gRNA中的任意一种。

在本发明应用较佳的实施例中，上述nestin-i gRNA的序列如序列1-12所示，nestin-a gRNA的序列如序列13-24所示，nestin-i gRNA 的序列可以是如序列1-12所示的任意一种或多种的组合，nestin-a gRNA的序列可以是如序列13-24所示的任意一种或多种的组合。

在本发明应用较佳的实施例中，上述nestin-i gRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点下游1-112bp范围内，nestin-a gRNA 的靶定序列位于第一外显子转录起始位点上游1-450bp范围内。

在本发明应用较佳的实施例中，上述方法还包括使用293T细胞进行病毒包装，具体包括先对293T细胞进行均匀分散，将PEI混合液加入到质粒混合液中制得质粒-PEI混合液，再将质粒-PEI混合液加入含有239T细胞的培养基中共培养，浓缩收集病毒。

在本发明应用较佳的实施例中，上述使用293T细胞进行病毒包装后进行细胞的感染和筛选，具体包括如下步骤：先准备病毒混合液，再往生长状态良好的神经干细胞中加入制备好的病毒液混合液，共培养。

在本发明应用较佳的实施例中，上述细胞的感染后分别进行nes 基因的表达水平检测和NESTIN蛋白水平的检测，其中，nes基因的表达水平检测所用的检测nes基因的引物如序列26-27所示。

在本发明应用较佳的实施例中，上述方法包括过表达神经干细胞中nestin基因或沉默神经干细胞中nestin基因。

一种负载分子，包含有nestin基因的gRNA，nestin基因的gRNA 的序列如序列1-24所示的任意一种或者多种的组合。

一种靶向细胞的方法，包括使细胞与负载分子接触，负载分子包含有nestin基因的gRNA，负载分子包含无催化活性结构域的dCas9，dCas9的序列如序列25所示，nestin基因的gRNA的序列如序列1-24 所示，细胞是神经干细胞，新生血管内皮细胞和中肾***中的任意一种。

在本发明应用较佳的实施例中，上述负载分子还包含有抗生素，抗生素是嘌呤霉素，潮霉素，罗红霉素，螺旋霉素，阿奇霉素，克拉霉素，万古霉素，链霉素，庆大霉素，四环素，多西环素，米诺环素，卡那霉素，氨苄青霉素和氯霉素中的任意一种或多种的组合；优选的，抗生素为嘌呤霉素，潮霉素。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，该方法可以用于内源性过表达或沉默nestin基因的gRNA靶点序列，克服了运用传统方法构建稳定细胞株的弊端，且脱靶率低，能够在短期获得稳定细胞株。这将更有利于研究Nestin基因在神经***发育中的生物学功能及其具体的作用机制，对于我们认识神经干细胞的生命规律具有重要的指导意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为gRNA位置及nestin基因的结构图；

图2为gRNA-a组神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果图(Control组代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2细胞；gRNAa1代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa1细胞；gRNAa2代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa2细胞；gRNAa3代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa3细胞；gRNAa4代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa4细胞；gRNAa5代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa5细胞；gRNAa6代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAa6细胞；用Student’s t-test检验进行组间差异的比较，*p<0.05，**p<0.01)；

图3为gRNA-i组神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果(Control组代表稳定表达lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2细胞；gRNAi1代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi1细胞；gRNAi2代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi2细胞；gRNAi3代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi3细胞；gRNAi4代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi4细胞；gRNAi5代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi5细胞；gRNAi6代表稳定表达 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro以及 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNAi6细胞；用Student’s t-test检验进行组间差异的比较，*p<0.05，**p<0.01，#p<0.001，n.s为无显著差异)；

图4为nestin基因稳定过表达神经干细胞中NESTIN的免疫印迹检测结果图(图4中的图注与图2中的图注相同，均对应代表相同的物质)；

图5为nestin基因稳定抑制神经干细胞中NESTIN的免疫印迹检测结果图(图5中的图注与图3中的图注相同，均对应代表相同的物质)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，具体包括依次进行的如下步骤：

首先设计nestin基因的gRNA。

nestin基因的cDNA序列参照序列30所示，NESTIN蛋白的氨基酸序列参照序列31所示，针对nestin基因的序列，在nestin基因的转录起始附近设计了12对gRNA，包括6对引导转录抑制子的nestin-i gRNA和6对引导转录激活子的nestin-a gRNA，其中nestin-i gRNA的序列如序列1-12所示，nestin-a gRNA的序列如序列13-24所示。 nestin-i gRNA用于引导转录抑制子与nestin基因第一外显子转录起始位点下游的靶向位点结合。nestin-agRNA用于引导转录激活子与 nestin基因第一外显子转录起始位点上游的靶向位点结合。在nestin 基因的转录起始附近设计的12对gRNA以及nestin基因的结构图参照图1所示，图1中A1，A2，A3，A4，A5和A6位于5’UTR区上游，分别代表6对nestin-a gRNA；图1中I1，I2，I3，I4，I5和I6 位于5’UTR区下游，分别代表6对nestin-i gRNA。

构建载体。

构建载体具体包括如下步骤：

1.使用Addgene公司生产型号为99374的质粒： lentiGuide-Hygro-mTagBFP2质粒进行酶切，在37℃酶切30min，酶切体系如下所示：

2.将酶切好的lentiGuide-Hygro-mTagBFP2载体与退火的gRNA 序列进行连接，条件为4℃过夜连接反应。

3.将上述连接产物转化DH5α感受态细胞，具体操作步骤如下：

(1)从-80℃中取出感受态细胞DH5α，在冰上缓慢解冻；

(2)将连接产物加到感受态细胞DH5α中，并轻轻吹吸混匀，放于冰上30min；

(3)将步骤2中的混合物取出，迅速于42℃水浴锅中进行热激，热激90s；

(4)热激结束迅速放于冰上静置5min；

(5)加入900μl预热的LB培养基，于37℃摇床180g转速下培养1小时；

(6)室温下4000rpm离心3min，弃去上清余下100μl培养基重悬；

(7)将重悬的菌液均匀涂到含有潮霉素抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。

4.提取质粒

使用去内毒素质粒小提试剂盒进行质粒的提取，具体步骤如下：

1)挑选上述步骤3中LB平板上的单克隆接种到含有潮霉素抗性的LB培养基中，摇床培养过夜；

2)将菌液离心，收集菌体，离心条件为5000rpm离心10min；

3)往菌体中加入500μl已添加RNase A的Solution I，充分混匀重悬菌体；

4)往重悬的菌体中加入500μl Solution II，并轻轻地上下颠倒数次直到溶液变的透明，放于室温3min；

5)往管中加入250μl预冷的N3Buffer，并轻轻地上下颠倒数次，室温13000g条件下离心10min；

6)将上一步获得的上清液转移到另一离心管中，加入0.1个体积的ETR Solution，上下颠倒混匀，放于冰上静置10min；

7)静置结束后放于42℃水浴锅中孵育5min，室温12000g条件下离心3min；

8)将上清转移到新的离心管中，加入0.5个体积的无水乙醇，轻轻地颠倒混匀，室温静置2min；

9)往吸附柱中加入上一步骤获得的混合液，室温13000g条件下离心1min，弃掉离心液；

10)往吸附柱中加入500μl HBC Buffer，室温13000g条件下离心1min，弃掉离心液；

11)往吸附柱中加入700μl DNA Wash Buffer，室温13000g条件下离心1min，弃掉离心液；

12)将空吸附柱13000g条件下离心1min，并将上层空吸附柱转移到新的离心管中，往吸附柱中加入100μl ddH₂O，室温静置5min；

13)室温13000g离心1min，离心后的液体中即含有目的质粒，对目的质粒进行浓度的测定，放于-20℃保存。

5.重组质粒的鉴定

将重组质粒送到测序公司进行测序，确定质粒是否构建成功。

准备293T细胞

1)将培养皿中的培养基吸弃，其中培养皿中培养有293T细胞， 293T细胞为常规的工具细胞；

2)用1ml PBS清洗细胞表面，并弃去PBS，操作时不进行吹洗；

3)将每皿细胞加入1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA(1x)消化细胞，上下左右摇动，于显微镜下观察消化情况。待293T细胞变圆后就可以终止消化，此过程宜尽快，时间不宜过长；

4)每皿细胞加入1ml DMEM+10％FBS终止胰酶的消化，吹打混匀并转移至15ml离心管中；

5)吸取2ml PBS洗培养皿一遍，并转移到15ml离心管中；

6)将15ml离心管放入离心机中，1000rpm，5min离心，弃上清；

7)加入1ml DMEM+10％FBS重悬细胞，吹吸混匀；

8)取一个离心管，往离心管中加入10μl的台盼蓝和10μl的步骤(7)的细胞悬液，充分吹吸混匀后，每次取10μl并进行两次细胞计数；

9)准备好10cm的细胞培养皿，做好标记，各加入8ml的 DMEM+10％FBS；

10)每皿加入800万细胞，吹打混匀，并按“十字法”摇匀培养皿，使细胞分散于培养皿中；

11)待细胞沉下，缓缓平稳放入培养箱中备用。

病毒包装

(1)从细胞培养箱中取出细胞，于显微镜下观察生长情况。若细胞状况良好，则可进行细胞转染步骤。

(2)细胞转染前，准备如下混合液：

转染前制备质粒混合液，将步骤4提取的质粒，以及psPAX2和 VSV-G载体按照表1中的添加比例混合后，加入到Opti-MEM培养基中，轻轻吹吸2-3下混匀，室温静止5min。表1中Insert为步骤4 提取的质粒，Packing和Envelop分别表示psPAX2和VSV-G的添加量。psPAX2载体购买自Addgene公司，生产型号为质粒12260，VSV-G 载体购买自Addgene公司，生产型号为质粒8454。Opti-MEM培养基购买自Gibco公司，生产型号为31985-070。

表1中，lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro和 lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro载体均由Addgene公司购买得到，前者的生产型号为99373，后者的生产型号为99372。

PEI混合液：将PEI(聚醚酰亚胺)(1mg/ml)加入到Opti-MEM 培养基中，轻轻吹吸2-3下混匀，室温静止5min。

表1 10cm培养皿包装质粒用量

3)静止5min后将PEI混合液加入到质粒混合液中，逐滴加入，边加边混合晃动离心管，避免沉淀出现，室温静止15min。

4)静置15min后将质粒-PEI混合液逐滴均匀加入到不含抗生素的培养基中，在培养箱中培养6h后更换培养基(整个实验过程中所用的培养基均不含抗生素)。

5)质粒-PEI混合液与293T细胞混合转染48h，第一次收集病毒上清液，转染72h后第二次收集病毒上清液并将所有的病毒上清液用 0.45μm滤膜过滤；

6)将收集的病毒上清液进行离心浓缩，离心条件为4℃， 19400rpm离心2h，离心结束后将上清弃掉并加入DMEM基础培养基重悬，最终病毒上清液浓缩20倍，将浓缩好的病毒分装到1.5ml EP 管于-80℃保存。

细胞感染与筛选

1.细胞感染：

1)在进行病毒感染前一天，将生长状态良好的人源神经干细胞按照50K/孔的细胞密度接种在24孔板中，该人源神经干细胞为常规的神经干细胞；

2)准备病毒混合液，分别往离心管中加入 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro或lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro病毒上清液以及聚凝胺(Polybrene)，Polybrene使用的终浓度为5μg/ml，备用；

聚凝胺在细胞培养中主要用于提高逆转录病毒感染细胞的效率，通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现。

3)将24孔板中的培养基吸弃，往细胞中加入制备好的病毒混合液；

4)将孔板在25℃，2250rpm条件下离心30min；

5)离心后将细胞放回37℃培养箱培养，24h后更换新鲜培养基继续培养。

2.细胞筛选：

1)病毒感染细胞72h后，将培养基吸弃，往细胞中加入含有嘌呤霉素的培养基进行培养；

2)每隔两天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基；

3)使用含有嘌呤霉素的培养基培养细胞7天后，更换为含有减半药物浓度的培养基维持培养，此时获得分别稳定表达lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro、lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro的细胞株；

4)在稳定表达lenti-EF1a-dCas9-KRAB-Puro和 lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro的细胞株上分别进行 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-I和 lentiGuide-Hygro-mTagBFP2-gRNA-A病毒的感染，感染步骤按照上述细胞感染所描述的步骤进行；

5)病毒感染细胞72h后，将培养基吸弃，往细胞中加入含有潮霉素B的培养基进行培养；

6)每隔两天更换含有潮霉素B的新鲜培养基；

7)使用含有潮霉素B的培养基培养细胞7天后，更换为含有减半药物浓度的培养基维持培养，此时获得稳定沉默或过表达nes基因的细胞株；

8)对获得的细胞株进行nestin基因的表达检测。

实施例2

对nestin基因表达水平的检测。

1.提取细胞株的总RNA，具体包括如下步骤：

1)吸弃培养皿中的培养基并加入2ml PBS漂洗细胞，弃掉PBS 后加入1ml TRIZOL溶液，冰上孵育10min；

2)将步骤(1)中添加有TRIZOL的溶液转移到离心管中，加入 200μl的氯仿并涡旋震荡混匀，放于冰上孵育5min；

3)将离心管在4℃13000g条件下离心15min，离心后小心将上层水相转移到另一离心管中；

4)往离心管中加入等量体积的异丙醇，混匀后将离心管放于 -80℃中沉淀30min；

5)将离心管在4℃13000g条件下离心15min，在离心管底可见白色沉淀，此时要小心地将上清吸弃；

6)往离心管中加入1ml预冷的75％乙醇溶液，颠倒混匀并在4℃ 13000g条件下离心5min，吸弃上清；

7)重复步骤(6)一次；

8)将离心管管盖打开放于室温静置3～5min，让多余的乙醇挥发干净，此时离心管管底白色沉淀呈现无色透明；

9)往离心管中加入含有RNase抑制剂的DEPC水溶解RNA，并进行浓度和纯度的测定。

2.cDNA第一链的合成

1)基因组DNA的去除，在冰上配制以下反应体系：

2)在PCR仪中设定如下程序进行反应：37℃30min，75℃10 min，4℃短暂保存；

3)从步骤(2)中取出10μl RNA溶液到离心管中，配制以下反应体系：

4)将离心管放于65℃水浴中反应5min，反应结束迅速放于冰上冷却；

5)将离心管瞬时离心后，在冰上向离心管中加入以下组分：

6)将步骤(5)离心管在37℃水浴反应2min；

7)往离心管中加入1μl M-MLV逆转录酶；

8)在PCR仪中设定以下程序进行反应：25℃10min→37℃50 min→70℃15min→4℃短暂保存；

9)将步骤(8)的产物取出放于-20℃中保存。

3.qRT-PCR检测nes mRNA的表达水平。

1)将制备好的cDNA用ddH₂O稀释6倍后作为反应模板；

2)在冰上配制以下反应体系，其中nestin引物的序列参照序列 26-27所示，内参基因GAPDH的引物序列参照序列28-29所示：

3)将步骤(2)中的混合反应液转移到qRT-PCR板中并进行封板；

4)将qRT-PCR板放进Bio-Rad公司生产的qRT-PCR仪中，采用软件中的标准两步法和溶解曲线程序开始运行。

实施例3

NESTIN蛋白水平的检测

首先提取细胞的总蛋白，然后进行Western Blot。具体包括如下步骤：

1)将实施例1中收集的细胞株用PBS漂洗后，加入蛋白裂解液于冰上裂解15min；

2)使用超声仪将步骤(1)中的混合物进行超声破碎，充***解细胞；

3)将离心管在4℃13000g条件下离心15min，将上清蛋白转移到新的离心管中；

4)使用Solarbio公司生产的Bradford蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定，Bradford蛋白浓度测定试剂盒的产品型号为 PC0010；

5)取50μg总蛋白加入到20μl 2xSDS loading buffer中，补加 ddH₂O使总体积为40μl，于沸水中加热10min；

6)取步骤(5)中35μl变性好的样品进行SDS-PAGE电泳；

7)通过湿法转膜将凝胶中的蛋白转到PVDF膜上；

8)抗体孵育以及PDVF膜清洗；

9)往步骤(8)上的PDVF膜上滴加ECL进行显影。

实施例4

神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果参照表2及图2 所示。

参照表2和图2可得，以对照组细胞nestin mRNA的表达量为对照，对照组(control)***的质粒载体为lentiGuide-Hygro-mTagBFP2，其他实验组相对对照组NestinmRNA表达水平分别为：gRNAa1组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的5.2倍，gRNAa2组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的1.77倍，gRNAa3组细胞中NestinmRNA表达水平是对照组细胞的1.93倍，gRNAa4组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的1.86倍，gRNAa5组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的2.37倍，gRNAa6组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的1.18倍。其中，gRNAa1 对神经干细胞nestin基因的转录激活作用最强。

表2 gRNA-a组神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果

Control	gRNAa1	gRNAa2	gRNAa3	gRNAa4	gRNAa5	gRNAa6
							1.00	5.20	1.77	1.93	1.86	2.37	1.18

参照表3和图3可得，以对照组细胞Nestin mRNA表达量为对照，对照组(control)***的质粒载体为lentiGuide-Hygro-mTagBFP2，其他实验组相对对照组Nestin mRNA表达水平分别为：gRNAi1组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的0.87倍，gRNAi2组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的0.40倍，gRNAi3组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的0.27倍，gRNAi4组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的0.46倍，gRNAi5组细胞中Nestin mRNA表达水平是对照组细胞的0.91倍，gRNAi6组细胞中NestinmRNA表达水平是对照组细胞的0.95倍。其中，gRNAi3 对神经干细胞nestin基因的转录抑制作用最强。

表3 gRNA-i组神经干细胞nestin基因mRNA的qRT-PCR结果

Control	gRNAi1	gRNAi2	gRNAi3	gRNAi4	gRNAi5	gRNAi6
							1.00	0.87	0.40	0.27	0.46	0.91	0.95

实施例5

为进一步验证实施例4的nestin基因表达结果，分别对神经干细胞NESTIN的蛋白表达进行检测，结果参照图4和图5所示。结果显示gRNAa1-a6均能稳定过表达神经干细胞中NESTIN，其中gRNAa1 对神经干细胞nestin基因的转录激活作用最强，NESTIN蛋白表达量也最高。gRNAi1-i6均能稳定抑制神经干细胞中NESTIN，其中 gRNAi3对神经干细胞nestin基因的转录抑制作用最强。实施例5的试验结果与实施例4的实验结果拟合，因此，本发明所提供的一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法可以用于内源性过表达或沉默nestin基因的gRNA靶点序列。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海乐维再生医学科技有限公司

<120> 一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法及靶向细胞的方法

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccggcaga atgagctgct cagcg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaccgctga gcagctcatt ctgcc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccggaccg acggggacaa tgacg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaccgtcat tgtccccgtc ggtcc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caccggagac cgacggggac aatga 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaactcattg tccccgtcgg tctcc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caccgggagg agtcgtttca gatgt 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaacacatct gaaacgactc ctccc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caccggtggg agctcaatcg gcgcc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaacggcgcc gattgagctc ccacc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caccggacgg ggacaatgac ggggc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaacgccccg tcattgtccc cgtcc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caccgggttc cactctccag caccc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaacgggtgc tggagagtgg aaccc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

caccgccatg gtacagcttc ttctt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aaacaagaag aagctgtacc atggc 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caccgcccag gccttaaccc cttag 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaacctaagg ggttaaggcc tgggc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

caccggaagc tgtaccatgg agaat 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaacattctc catggtacag cttcc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caccggcaca gaactgagcc tgtgg 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aaacccacag gctcagttct gtgcc 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

caccggactg cactccctcc caggc 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aaacgcctgg gagggagtgc agtcc 25

<210> 25

<211> 4101

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gacaagaagt acagcatcgg cctggccatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc 60

accgacgagt acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac 120

agcatcaaga agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggctga agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat 240

ctgcaagaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg 300

gaagagtcct tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac 360

atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa 420

ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct atctggccct ggcccacatg 480

atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg 540

gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc 600

aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg 660

ctggaaaatc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggcaacctg 720

attgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat 780

gccaaactgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag 840

atcggcgacc agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg 900

ctgagcgaca tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg 960

atcaagagat acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag 1020

cagctgcctg agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc 1080

tacattgacg gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa 1140

aagatggacg gcaccgagga actgctcgtg aagctgaaca gagaggacct gctgcggaag 1200

cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc acctgggaga gctgcacgcc 1260

attctgcggc ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag 1320

aagatcctga ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga 1380

ttcgcctgga tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg 1440

gtggacaagg gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac 1500

ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat 1560

aacgagctga ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg 1680

aagcagctga aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc 1740

ggcgtggaag atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc 1800

aaggacaagg acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg 1860

accctgacac tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac 1920

ctgttcgacg acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg 1980

ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat 2040

ttcctgaagt ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc 2100

ctgaccttta aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac 2160

gagcacattg ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg 2220

aaggtggtgg acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc 2280

gaaatggcca gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg 2340

aagcggatcg aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg 2400

gaaaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat 2460

atgtacgtgg accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccacatc 2520

gtgcctcaga gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac 2580

aaggcccggg gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac 2640

tactggcggc agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc 2700

aaggccgaga gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg 2760

gtggaaaccc ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact 2820

aagtacgacg agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag 2880

ctggtgtccg atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac 2940

caccacgccc acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac 3000

cctaagctgg aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg 3060

atcgccaaga gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac 3120

atcatgaact ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct 3180

ctgatcgaga caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc 3240

accgtgcgga aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag 3300

acaggcggct tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc 3360

agaaagaagg actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat 3420

tctgtgctgg tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa 3480

gagctgctgg ggatcaccat catggaaaga agcagcttcg agaagaatcc catcgacttt 3540

ctggaagcca agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac 3600

tccctgttcg agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag 3660

aagggaaacg aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac 3720

tatgagaagc tgaagggctc ccccgaggat aatgagcaga aacagctgtt tgtggaacag 3780

cacaagcact acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc 3840

ctggccgacg ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc 3900

atcagagagc aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct 3960

gccgccttca agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag 4020

gtgctggacg ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac 4080

ctgtctcagc tgggaggcga c 4101

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ctggagcagg agaaacagg 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tgggagcaaa gatccaagac 20

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

acccactcct ccacctttg 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctcttgtgct cttgctggg 19

<210> 30

<211> 5568

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

agtcgctcag gctactccca ccccgccccg ccccgtcatt gtccccgtcg gtctcttttc 60

tcttccgtcc taaaagctct gcgagccgct cccttctccc ggtgccccgc gtctgtccat 120

cctcagtggg tcagacgagc aggatggagg gctgcatggg ggaggagtcg tttcagatgt 180

gggagctcaa tcggcgcctg gaggcctacc tggcccgggt caaggcgctg gaggagcaga 240

atgagctgct cagcgcggag ctcggggggc tccgggcaca atccgcggac acctcctggc 300

gggcgcatgc cgacgacgag ctggcggccc tgcgggccct cgttgaccaa cgctggcggg 360

agaagcacgc ggccgaggtg gcgcgcgaca acctggctga agagctggag ggcgtggcag 420

gccgatgcca gcagctgcgg ctggcccggg agcggacgac ggaggaggta gcccgcaacc 480

ggcgcgccgt cgaggcagag aaatgcgccc gggcctggct gagtagccag gtggcagagc 540

tggagcgcga gctagaggct ctacgcgtgg cgcacgagga ggagcgcgtc ggcctgaacg 600

cgcaggctgc ctgtgccccc cgctgccccg cgccgccccg cgggcctccc gcgccggccc 660

cggaggtaga ggagctggca aggcgactgg gcgaggcgtg gcgcggggca gtgcgcggct 720

accaggagcg cgtggcacac atggagacgt cgctgggcca ggcccgcgag cggctgggcc 780

gggcggtgca gggtgcccgc gagggccgcc tggagctgca gcagctccag gctgagcgcg 840

gaggcctcct ggagcgcagg gcagcgttgg aacagaggtt ggagggccgc tggcaggagc 900

ggctgcgggc tactgaaaag ttccagctgg ctgtggaggc cctggagcag gagaaacagg 960

gcctacagag ccagatcgct caggtcctgg aaggtcggca gcagctggcg cacctcaaga 1020

tgtccctcag cctggaggtg gccacgtaca ggaccctcct ggaggctgag aactcccggc 1080

tgcaaacacc tggcggtggc tccaagactt ccctcagctt tcaggacccc aagctggagc 1140

tgcaattccc taggacccca gagggccggc gtcttggatc tttgctccca gtcctgagcc 1200

caacttccct cccctcaccc ttgcctgcta cccttgagac acctgtgcca gcctttctta 1260

agaaccaaga attcctccag gcccgtaccc ctaccttggc cagcaccccc atccccccca 1320

cacctcaggc accctctcct gctgtagatg cagagatcag agcccaggat gctcctctct 1380

ctctgctcca gacacagggt gggaggaaac aggctccaga gcccctgcgg gctgaagcca 1440

gggtggccat tcctgccagc gtcctgcctg gaccagagga gcctgggggc cagcggcaag 1500

aggccagtac aggccagtcc ccagaggacc atgcctcctt ggcaccaccc ctcagccctg 1560

accactccag tttagaggct aaggatggag aatccggtgg gtctagagtg ttcagcatat 1620

gccgagggga aggtgaaggg caaatctggg ggttggtaga gaaagaaaca gccatagagg 1680

gcaaagtggt aagcagcttg cagcaggaaa tatgggaaga agaggatcta aacaggaagg 1740

aaatccagga ctcccaggtt cctttggaaa aagaaaccct gaagtctctg ggagaggaga 1800

ttcaagagtc actgaagact ctggaaaacc agagccatga gacactagaa agggagaatc 1860

aagaatgtcc gaggtcttta gaagaagact tagaaacact aaaaagtcta gaaaaggaaa 1920

ataaagagct attaaaggat gtggaggtag tgagacctct agaaaaagag gctgtaggcc 1980

aacttaagcc tacaggaaaa gaggacacac agacattgca atccctgcaa aaggagaatc 2040

aagaactaat gaaatctctt gaaggtaatc tagagacatt tttatttcca ggaacggaaa 2100

atcaagaatt agtaagttct ctgcaagaga acttagagtc attgacagct ctggaaaagg 2160

agaatcaaga gccactgaga tctccagaag taggggatga ggaggcactg agacctctga 2220

caaaggagaa tcaggaaccc ctgaggtctc ttgaagatga gaacaaagag gcctttagat 2280

ctctagaaaa agagaaccag gagccactga agactctaga agaagaggac cagagtattg 2340

tgagacctct agaaacagag aatcacaaat cactgaggtc tttagaagaa caggaccaag 2400

agacattgag aactcttgaa aaagagactc aacagcgacg gaggtctcta ggggaacagg 2460

atcagatgac attaagaccc ccagaaaaag tggatctaga accactgaag tctcttgacc 2520

aggagatagc tagacctctt gaaaatgaga atcaagagtt cttaaagtca ctcaaagaag 2580

agagcgtaga ggcagtaaaa tctttagaaa cagagatcct agaatcactg aagtctgcgg 2640

gacaagagaa cctggaaaca ctgaaatctc cagaaactca agcaccactg tggactccag 2700

aagaaataaa tcagggggca atgaatcctc tagaaaagga aattcaagaa ccactggagt 2760

ctgtggaagt gaaccaagag acattcagac tcctggaaga ggagaatcag gaatcattga 2820

gatctctggg agcatggaac ctggagaatt tgagatctcc agaggaggta gacaaggaaa 2880

gtcaaaggaa tctggaagag gaagagaacc tgggaaaggg agagtaccaa gagtcactga 2940

ggtctctgga ggaggaggga caggagctgc cgcagtctgc agatgtgcag aggtgggaag 3000

atacggtgga gaaggaccaa gaactggctc aggaaagccc tcctgggatg gctggagtgg 3060

aaaatgagga tgaggcagag ctgaatctga gggagcagga tggcttcact gggaaggagg 3120

aggtggtaga gcagggagag ctgaatgcca cagaggaggt ctggatccca ggcgaggggc 3180

acccagagag ccctgagccc aaagagcaga gaggcctggt tgagggagcc agtgtgaagg 3240

gaggggctga gggcctccag gaccctgaag ggcaatcaca acaggtgggg gccccaggcc 3300

tccaggctcc ccaggggctg ccagaggcga tagagcccct ggtggaagat gatgtggccc 3360

cagggggtga ccaagcctcc ccagaggtca tgttggggtc agagcctgcc atgggtgagt 3420

ctgctgcggg agctgagcca ggcccggggc agggggtggg agggctgggg gacccaggcc 3480

atctgaccag ggaagaggtg atggaaccac ccctggaaga ggagagtttg gaggcaaaga 3540

gggttcaggg cttggaaggg cctagaaagg acctagagga ggcaggtggt ctggggacag 3600

agttctccga gctgcctggg aagagcagag acccttggga gcctcccagg gagggtaggg 3660

aggagtcaga ggctgaggcc cccaggggag cagaggaggc gttccctgct gagaccctgg 3720

gccacactgg aagtgatgcc ccttcacctt ggcctctggg gtcagaggaa gctgaggagg 3780

atgtaccacc agtgctggtc tcccccagcc caacgtacac cccgatcctg gaagatgccc 3840

ctgggcctca gcctcaggct gaagggagtc aggaggctag ctggggggtg caggggaggg 3900

ctgaagccct ggggaaagta gagagcgagc aggaggagtt gggttctggg gagatccccg 3960

agggccccca ggaggaaggg gaggagagca gagaagagag cgaggaggat gagctcgggg 4020

agacccttcc agactccact cccctgggct tctacctcag gtcccccacc tcccccaggt 4080

gggaccccac tggagagcag aggccacccc ctcaagggga gactggaaag gagggctggg 4140

atcctgctgt cctggcttcc gagggccttg aggccccacc ctcagaaaag gaggaggggg 4200

aggagggaga agaggagtgt ggccgtgact ctgacctgtc agaagaattt gaggacctgg 4260

ggactgaggc accttttctt cctggggtcc ctggggaggt ggcagaacct ctgggccagg 4320

tgccccagct gctactggat cctgcagcct gggatcgaga tggggagtcc gatgggtttg 4380

cagatgagga agaaagtggg gaggagggag aggaggatca ggaggagggg agggagccag 4440

gggctgggcg gtgggggcca gggtcttctg ttggcagcct ccaggccctg agtagctccc 4500

agagagggga attcctggag tctgattctg tgagtgtcag tgtcccctgg gatgacagct 4560

tgaggggtgc agtggctggt gcccccaaga ctgccctgga aacggagtcc caggacagtg 4620

ctgagccttc tggctcagag gaagagtctg accctgtttc cttggagagg gaggacaaag 4680

tccctggccc tctagagatc cccagtggga tggaggatgc aggcccaggg gcagacatca 4740

ttggtgttaa tggccagggt cccaacttgg aggggaagtc acagcatgtg aatgggggag 4800

tgatgaacgg gctggagcag tctgaggaag tggggcaagg aatgccgcta gtctctgagg 4860

gagaccgagg gagccccttt caggaggagg aggggagtgc tctgaagacc tcttgggcag 4920

gggctcctgt tcacctgggc cagggtcagt tcctgaagtt cactcagagg gaaggagata 4980

gagagtcctg gtcctcaggg gaggactagg aaaagaccat ctgcccggca ctggggactt 5040

aggggtgcgg ggaggggaag gacgcctcca agcccgctcc ctgctcagga gcagcactct 5100

taacttacga tctcttgaca tatggtttct ggctgagagg cctggcccgc taaggtgaaa 5160

aggggtgtgg caaaggagcc tactccaaga atggaggctg taggaatata acctcccacc 5220

ctgcaaaggg aatctcttgc ctgctccatc tcataggcta agtcagctga atcccgatag 5280

tactaggtcc ccttccctcc gcatcccgtc agctggaaaa ggcctgtggc ccagaggctt 5340

ctccaaaggg agggtgacat gctggctttt gtgcccaagc tcaccagccc tgcgccacct 5400

cactgcagta gtgcaccatc tcactgcagt agcacgccct cctgggccgt ctggcctgtg 5460

gctaatggag gtgacggcac tcccatgtgc tgactccccc catccctgcc acgctgtggc 5520

cctgcctggc tagtccctgc ctgaataaag taatgcctcc gcttcaaa 5568

<210> 31

<211> 1621

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Met Glu Gly Cys Met Gly Glu Glu Ser Phe Gln Met Trp Glu Leu Asn

1 5 10 15

Arg Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Glu Gln

20 25 30

Asn Glu Leu Leu Ser Ala Glu Leu Gly Gly Leu Arg Ala Gln Ser Ala

35 40 45

Asp Thr Ser Trp Arg Ala His Ala Asp Asp Glu Leu Ala Ala Leu Arg

50 55 60

Ala Leu Val Asp Gln Arg Trp Arg Glu Lys His Ala Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Arg Asp Asn Leu Ala Glu Glu Leu Glu Gly Val Ala Gly Arg Cys Gln

85 90 95

Gln Leu Arg Leu Ala Arg Glu Arg Thr Thr Glu Glu Val Ala Arg Asn

100 105 110

Arg Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Cys Ala Arg Ala Trp Leu Ser Ser

115 120 125

Gln Val Ala Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Ala His

130 135 140

Glu Glu Glu Arg Val Gly Leu Asn Ala Gln Ala Ala Cys Ala Pro Arg

145 150 155 160

Cys Pro Ala Pro Pro Arg Gly Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Glu

165 170 175

Glu Leu Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Trp Arg Gly Ala Val Arg Gly

180 185 190

Tyr Gln Glu Arg Val Ala His Met Glu Thr Ser Leu Gly Gln Ala Arg

195 200 205

Glu Arg Leu Gly Arg Ala Val Gln Gly Ala Arg Glu Gly Arg Leu Glu

210 215 220

Leu Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Gly Gly Leu Leu Glu Arg Arg Ala

225 230 235 240

Ala Leu Glu Gln Arg Leu Glu Gly Arg Trp Gln Glu Arg Leu Arg Ala

245 250 255

Thr Glu Lys Phe Gln Leu Ala Val Glu Ala Leu Glu Gln Glu Lys Gln

260 265 270

Gly Leu Gln Ser Gln Ile Ala Gln Val Leu Glu Gly Arg Gln Gln Leu

275 280 285

Ala His Leu Lys Met Ser Leu Ser Leu Glu Val Ala Thr Tyr Arg Thr

290 295 300

Leu Leu Glu Ala Glu Asn Ser Arg Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Ser

305 310 315 320

Lys Thr Ser Leu Ser Phe Gln Asp Pro Lys Leu Glu Leu Gln Phe Pro

325 330 335

Arg Thr Pro Glu Gly Arg Arg Leu Gly Ser Leu Leu Pro Val Leu Ser

340 345 350

Pro Thr Ser Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Leu Glu Thr Pro Val

355 360 365

Pro Ala Phe Leu Lys Asn Gln Glu Phe Leu Gln Ala Arg Thr Pro Thr

370 375 380

Leu Ala Ser Thr Pro Ile Pro Pro Thr Pro Gln Ala Pro Ser Pro Ala

385 390 395 400

Val Asp Ala Glu Ile Arg Ala Gln Asp Ala Pro Leu Ser Leu Leu Gln

405 410 415

Thr Gln Gly Gly Arg Lys Gln Ala Pro Glu Pro Leu Arg Ala Glu Ala

420 425 430

Arg Val Ala Ile Pro Ala Ser Val Leu Pro Gly Pro Glu Glu Pro Gly

435 440 445

Gly Gln Arg Gln Glu Ala Ser Thr Gly Gln Ser Pro Glu Asp His Ala

450 455 460

Ser Leu Ala Pro Pro Leu Ser Pro Asp His Ser Ser Leu Glu Ala Lys

465 470 475 480

Asp Gly Glu Ser Gly Gly Ser Arg Val Phe Ser Ile Cys Arg Gly Glu

485 490 495

Gly Glu Gly Gln Ile Trp Gly Leu Val Glu Lys Glu Thr Ala Ile Glu

500 505 510

Gly Lys Val Val Ser Ser Leu Gln Gln Glu Ile Trp Glu Glu Glu Asp

515 520 525

Leu Asn Arg Lys Glu Ile Gln Asp Ser Gln Val Pro Leu Glu Lys Glu

530 535 540

Thr Leu Lys Ser Leu Gly Glu Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Leu

545 550 555 560

Glu Asn Gln Ser His Glu Thr Leu Glu Arg Glu Asn Gln Glu Cys Pro

565 570 575

Arg Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Thr Leu Lys Ser Leu Glu Lys Glu

580 585 590

Asn Lys Glu Leu Leu Lys Asp Val Glu Val Val Arg Pro Leu Glu Lys

595 600 605

Glu Ala Val Gly Gln Leu Lys Pro Thr Gly Lys Glu Asp Thr Gln Thr

610 615 620

Leu Gln Ser Leu Gln Lys Glu Asn Gln Glu Leu Met Lys Ser Leu Glu

625 630 635 640

Gly Asn Leu Glu Thr Phe Leu Phe Pro Gly Thr Glu Asn Gln Glu Leu

645 650 655

Val Ser Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Ser Leu Thr Ala Leu Glu Lys

660 665 670

Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Pro Glu Val Gly Asp Glu Glu Ala

675 680 685

Leu Arg Pro Leu Thr Lys Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Leu Glu

690 695 700

Asp Glu Asn Lys Glu Ala Phe Arg Ser Leu Glu Lys Glu Asn Gln Glu

705 710 715 720

Pro Leu Lys Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gln Ser Ile Val Arg Pro Leu

725 730 735

Glu Thr Glu Asn His Lys Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Gln Asp Gln

740 745 750

Glu Thr Leu Arg Thr Leu Glu Lys Glu Thr Gln Gln Arg Arg Arg Ser

755 760 765

Leu Gly Glu Gln Asp Gln Met Thr Leu Arg Pro Pro Glu Lys Val Asp

770 775 780

Leu Glu Pro Leu Lys Ser Leu Asp Gln Glu Ile Ala Arg Pro Leu Glu

785 790 795 800

Asn Glu Asn Gln Glu Phe Leu Lys Ser Leu Lys Glu Glu Ser Val Glu

805 810 815

Ala Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ala

820 825 830

Gly Gln Glu Asn Leu Glu Thr Leu Lys Ser Pro Glu Thr Gln Ala Pro

835 840 845

Leu Trp Thr Pro Glu Glu Ile Asn Gln Gly Ala Met Asn Pro Leu Glu

850 855 860

Lys Glu Ile Gln Glu Pro Leu Glu Ser Val Glu Val Asn Gln Glu Thr

865 870 875 880

Phe Arg Leu Leu Glu Glu Glu Asn Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gly

885 890 895

Ala Trp Asn Leu Glu Asn Leu Arg Ser Pro Glu Glu Val Asp Lys Glu

900 905 910

Ser Gln Arg Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asn Leu Gly Lys Gly Glu Tyr

915 920 925

Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Glu Gly Gln Glu Leu Pro Gln

930 935 940

Ser Ala Asp Val Gln Arg Trp Glu Asp Thr Val Glu Lys Asp Gln Glu

945 950 955 960

Leu Ala Gln Glu Ser Pro Pro Gly Met Ala Gly Val Glu Asn Glu Asp

965 970 975

Glu Ala Glu Leu Asn Leu Arg Glu Gln Asp Gly Phe Thr Gly Lys Glu

980 985 990

Glu Val Val Glu Gln Gly Glu Leu Asn Ala Thr Glu Glu Val Trp Ile

995 1000 1005

Pro Gly Glu Gly His Pro Glu Ser Pro Glu Pro Lys Glu Gln Arg

1010 1015 1020

Gly Leu Val Glu Gly Ala Ser Val Lys Gly Gly Ala Glu Gly Leu

1025 1030 1035

Gln Asp Pro Glu Gly Gln Ser Gln Gln Val Gly Ala Pro Gly Leu

1040 1045 1050

Gln Ala Pro Gln Gly Leu Pro Glu Ala Ile Glu Pro Leu Val Glu

1055 1060 1065

Asp Asp Val Ala Pro Gly Gly Asp Gln Ala Ser Pro Glu Val Met

1070 1075 1080

Leu Gly Ser Glu Pro Ala Met Gly Glu Ser Ala Ala Gly Ala Glu

1085 1090 1095

Pro Gly Pro Gly Gln Gly Val Gly Gly Leu Gly Asp Pro Gly His

1100 1105 1110

Leu Thr Arg Glu Glu Val Met Glu Pro Pro Leu Glu Glu Glu Ser

1115 1120 1125

Leu Glu Ala Lys Arg Val Gln Gly Leu Glu Gly Pro Arg Lys Asp

1130 1135 1140

Leu Glu Glu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Glu Phe Ser Glu Leu Pro

1145 1150 1155

Gly Lys Ser Arg Asp Pro Trp Glu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Glu

1160 1165 1170

Glu Ser Glu Ala Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu Glu Ala Phe Pro

1175 1180 1185

Ala Glu Thr Leu Gly His Thr Gly Ser Asp Ala Pro Ser Pro Trp

1190 1195 1200

Pro Leu Gly Ser Glu Glu Ala Glu Glu Asp Val Pro Pro Val Leu

1205 1210 1215

Val Ser Pro Ser Pro Thr Tyr Thr Pro Ile Leu Glu Asp Ala Pro

1220 1225 1230

Gly Pro Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Gln Glu Ala Ser Trp Gly

1235 1240 1245

Val Gln Gly Arg Ala Glu Ala Leu Gly Lys Val Glu Ser Glu Gln

1250 1255 1260

Glu Glu Leu Gly Ser Gly Glu Ile Pro Glu Gly Pro Gln Glu Glu

1265 1270 1275

Gly Glu Glu Ser Arg Glu Glu Ser Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu

1280 1285 1290

Thr Leu Pro Asp Ser Thr Pro Leu Gly Phe Tyr Leu Arg Ser Pro

1295 1300 1305

Thr Ser Pro Arg Trp Asp Pro Thr Gly Glu Gln Arg Pro Pro Pro

1310 1315 1320

Gln Gly Glu Thr Gly Lys Glu Gly Trp Asp Pro Ala Val Leu Ala

1325 1330 1335

Ser Glu Gly Leu Glu Ala Pro Pro Ser Glu Lys Glu Glu Gly Glu

1340 1345 1350

Glu Gly Glu Glu Glu Cys Gly Arg Asp Ser Asp Leu Ser Glu Glu

1355 1360 1365

Phe Glu Asp Leu Gly Thr Glu Ala Pro Phe Leu Pro Gly Val Pro

1370 1375 1380

Gly Glu Val Ala Glu Pro Leu Gly Gln Val Pro Gln Leu Leu Leu

1385 1390 1395

Asp Pro Ala Ala Trp Asp Arg Asp Gly Glu Ser Asp Gly Phe Ala

1400 1405 1410

Asp Glu Glu Glu Ser Gly Glu Glu Gly Glu Glu Asp Gln Glu Glu

1415 1420 1425

Gly Arg Glu Pro Gly Ala Gly Arg Trp Gly Pro Gly Ser Ser Val

1430 1435 1440

Gly Ser Leu Gln Ala Leu Ser Ser Ser Gln Arg Gly Glu Phe Leu

1445 1450 1455

Glu Ser Asp Ser Val Ser Val Ser Val Pro Trp Asp Asp Ser Leu

1460 1465 1470

Arg Gly Ala Val Ala Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Glu Thr Glu

1475 1480 1485

Ser Gln Asp Ser Ala Glu Pro Ser Gly Ser Glu Glu Glu Ser Asp

1490 1495 1500

Pro Val Ser Leu Glu Arg Glu Asp Lys Val Pro Gly Pro Leu Glu

1505 1510 1515

Ile Pro Ser Gly Met Glu Asp Ala Gly Pro Gly Ala Asp Ile Ile

1520 1525 1530

Gly Val Asn Gly Gln Gly Pro Asn Leu Glu Gly Lys Ser Gln His

1535 1540 1545

Val Asn Gly Gly Val Met Asn Gly Leu Glu Gln Ser Glu Glu Val

1550 1555 1560

Gly Gln Gly Met Pro Leu Val Ser Glu Gly Asp Arg Gly Ser Pro

1565 1570 1575

Phe Gln Glu Glu Glu Gly Ser Ala Leu Lys Thr Ser Trp Ala Gly

1580 1585 1590

Ala Pro Val His Leu Gly Gln Gly Gln Phe Leu Lys Phe Thr Gln

1595 1600 1605

Arg Glu Gly Asp Arg Glu Ser Trp Ser Ser Gly Glu Asp

1610 1615 1620

Claims

1.一种调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，包括依次进行的如下步骤：先在nestin基因的转录起始附近设计nestin基因的gRNA，再进行载体的构建，所述nestin基因的gRNA可以是引导转录抑制子的nestin-i gRNA和引导转录激活子的nestin-agRNA中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述nestin-i gRNA的序列如序列1-12所示，所述nestin-a gRNA的序列如序列13-24所示，所述nestin-i gRNA的序列可以是如序列1-12所示的任意一种或多种的组合，所述nestin-agRNA的序列可以是如序列13-24所示的任意一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述nestin-i gRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点下游1-112bp范围内，所述nestin-a gRNA的靶定序列位于第一外显子转录起始位点上游1-450bp范围内。

4.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，还包括使用293T细胞进行病毒包装，具体包括先对293T细胞进行均匀分散，将PEI混合液加入到质粒混合液中制得质粒-PEI混合液，再将质粒-PEI混合液加入含有239T细胞的培养基中共培养，浓缩收集病毒。

5.根据权利要求4所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，使用293T细胞进行病毒包装后进行细胞的感染和筛选，具体包括如下步骤：先准备病毒混合液，再往生长状态良好的神经干细胞中加入制备好的病毒液混合液，共培养。

6.根据权利要求5所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，细胞的感染后分别进行nes基因的表达水平检测和NESTIN蛋白水平的检测，其中，nes基因的表达水平检测所用的检测nes基因的引物如序列26-27所示。

7.根据权利要求1所述的调控神经干细胞中nestin基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括过表达神经干细胞中nestin基因或沉默神经干细胞中nestin基因。

8.一种负载分子，其特征在于，包含有nestin基因的gRNA，所述nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示的任意一种或者多种的组合。

9.一种靶向细胞的方法，其特征在于，包括使细胞与负载分子接触，所述负载分子包含有nestin基因的gRNA，所述负载分子包含无催化活性结构域的dCas9，所述dCas9的序列如序列25所示，所述nestin基因的gRNA的序列如序列1-24所示，所述细胞是神经干细胞，新生血管内皮细胞和中肾***中的任意一种。

10.根据权利要求9所述的靶向细胞的方法，所述负载分子还包含有抗生素，所述抗生素是嘌呤霉素，潮霉素，罗红霉素，螺旋霉素，阿奇霉素，克拉霉素，万古霉素，链霉素，庆大霉素，四环素，多西环素，米诺环素，卡那霉素，氨苄青霉素和氯霉素中的任意一种或多种的组合；优选的，所述抗生素为嘌呤霉素，潮霉素。