CN110055268A - 水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用。本发明水解酶基因ameH全长为951bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物水解酶AmeH含316个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。AmeH能降解灭多威杀虫剂。水解酶AmeH可用于降解土壤、水体中灭多威的残留，具有非常重要的理论和应用价值。

Description

水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用，具体涉及降解肟类氨基甲酸酯类农药——灭多威的水解酶基因ameH和其应用。

背景技术

氨基甲酸酯类农药是与有机磷、拟除虫菊酯并驾齐驱的三大农药之一的一类新型广谱杀虫、杀螨和除草剂。因有机氯农药的禁用、限用，及抵抗有机磷农药的昆虫种类逐渐增加，氨基甲酸酯类农药的使用量也随之越来越大。灭多威是一种广泛用于农林业的氨基甲酸酯类农药，除了常见的灭多威剂型作为农药使用外，还可以与其他多种杀虫、杀螨剂结合配制成复配剂，如与毒死蜱、阿维菌素、哒螨灵、辛硫磷、氧乐果、吡虫啉、高效氯氰菊酯等。在棉花、桑茶、果蔬等作物中可以通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)而防治双鳞翅目、鳞翅目、丰翅目等120多种害虫，且是目前防治抗药性棉蚜良好的替换品种。我国是农药生产和使用大国，占杀虫剂生产总量20％的高毒农药仍有灭多威，且在市场上依旧活跃。灭多威作为农民常规当家农药，近年产量稳定。20世纪90年代中期全球销售额最大的44个农药品种中，灭多威为其中一员。因此从使用情况来看，灭多威是使用最广泛的杀虫剂之一。

灭多威在土壤中吸附能力较弱，迁移性强，水溶性高，因此很有可能会污染地表水或地下水。灭多威对人等哺乳动物具有高毒性，被美国EPA列为I类限制使用农药。其对环境的生物毒性表现为破坏动物间的捕食关系，威胁生态***平衡等。除了损坏机体的抗氧化***、各种器官和干扰内分泌危害外，灭多威还可能具有遗传毒性。由于灭多威在水中溶解性强、使用量大，加之工农业生产中的不合理排放，导致一些水体和食品中监测到灭多威残留。灭多威因在环境水体中检出率高和具有内分泌干扰作用等而被受到广泛关注。

获得灭多威降解菌株和降解基因在治理环境中的灭多威残留有以下作用：(1)用于土壤、水体中杀虫剂灭多威残留的消除；(2)通过基因研究构建基因工程菌株，进而研究酶学特性，对灭多威污染修复具有重要意义。因此降解基因在消除该杀虫剂残留具有非常重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种灭多威水解酶基因ameH；

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白；

本发明的又一目的是提供该基因的应用；

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一个水解酶基因ameH，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

通过多种蛋白纯化和菌株基因组测序相结合的方法来寻找目的基因。首先运用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱、Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱和Sephadex-200凝胶层析等逐步纯化菌株MDW-2粗酶液中的灭多威水解酶。Sephadex-200凝胶层析后仍具有灭多威降解活性的蛋白电泳图(见图1)，虽然未获得单一的目的蛋白，但经多条具有酶活性的蛋白条带分析，初步确定该菌株的灭多威水解酶蛋白大小在30kDa左右。将该条带送往上海博苑生物科技有限公司进行肽指纹图谱分析；然后采用高盐法提取菌株MDW-2基因组，DNA样品送于凌恩生物科技公司进行基因组测序。通过肽段序列与菌株MDW-2基因组中的氨基酸序列进行同源性比对分析，发现与基因组中scaffold 60的orf06623的氨基酸同源性达到51％，因此对orf06623进行分析，将对应的编码基因命名为ameH。

所述的水解酶基因ameH编码的蛋白AmeH，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

含有所述的水解酶基因ameH的重组表达载体。

所述的重组表达载体优选将所述的水解酶基因ameH连接pET24b的NdeI和XhoI位点之间所得。

含有所述的水解酶基因ameH的基因工程菌，所述的基因工程菌株优选以E.coliBL21(DE3)为出发菌株。

所述水解酶基因ameH在降解灭多威中的应用。

所述的含有水解酶基因ameH的重组表达载体在降解灭多威中的应用。

所述水解酶蛋白AmeH在降解灭多威中的应用。

所述水解酶蛋白AmeH在去除土壤、水体中灭多威中的应用。

灭多威降解菌株氨基杆菌属(Aminobacter sp.)MDW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏时间为2019年4月1号，保藏编号为：CCTCC NO:M2019221。

本发明所述的解菌株氨基杆菌属(Aminobacter sp.)MDW-2在降解灭多威中的应用。

本发明的有益效果如下：

1.本发明分离到一株Aminobacter sp.MDW-2，液质谱结果表明菌株MDW-2降解灭多威为灭多威肟。在此基础上，本发明用多种蛋白纯化和菌株基因组测序相结合的方法成功从菌株MDW-2中克隆出水解酶基因ameH。在NCBI(the UniProtKnowledge Base/SwissProt databases)中进行blastp在线氨基酸序列分析和同源性比较，发现该基因为一个新基因，全长(从起始密码子到终止密码子)全长951bp，可编码316个氨基酸。

2.本发明提供的水解酶基因AmeH能在1h内完全降解100mg/L的灭多威，此外AmeH还可用于构建降解灭多威的基因工程菌株，用于去除土壤、水体中的灭多威残留，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1菌株MDW-2催化的降解灭多威的HPLC图谱及代谢产物MS/MS图谱；

a：灭多威标准品；b：MDW-2降解灭多威8h取样检测的HPLC图谱；c：灭多威的MS/MS图谱；d：灭多威肟的MS/MS图谱。

图2水解酶基因ameH克隆的策略图。

图3从菌株MDW-2中纯化水解酶AmeH的不同步骤在SDS-PAGE检测图

泳道1：蛋白质marker；泳道2：菌株MDW-2破碎液；泳道3：通过硫酸铵沉淀纯化；泳道4：通过DEAE-Sepharose阴离子交换层析纯化；泳道5：通过Q-Sepharose阳离子交换层析纯化；泳道6：通过Superdex G-200色谱柱纯化。

图4水解酶基因ameH在BL21(pET24b)中表达策略图。

图5水解酶AmeH蛋白电泳图谱；

泳道1为蛋白质marker，泳道2为纯化的水解酶AmeH蛋白。

图6水解酶AmeH催化的降解灭多威的HPLC图谱及代谢产物MS/MS图谱；

A：催化反应体系的液相图；B：灭多威MS/MS图谱；C:灭多威肟的MS/MS图谱

生物材料保藏信息

MDW-2，分类命名为Aminobacter sp.MDW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏时间2019年4月1号，保藏编号为：CCTCC NO:M2019221。

具体实施方式

实施例1灭多威解菌株MDW-2的分离筛选

1.1灭多威降解菌株MDW-2的富集驯化分离

3份样品采源于山东省生产灭多威农药厂的废水处理池，经富集驯化来筛选灭多威降解菌株。每份样品均取5.0g污泥加到含50mg/L灭多威的100mL MSM培养基中，放置在30℃、160rpm的摇床中培养7天。然后将5mL的富集液转接至新鲜的含50mg/L灭多威的100mLMSM培养基中，经连续3次转接。

MSM培养基配方(MSM)：1.5g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g KH₂PO₄，1.0g NH₄NO₃，0.5g NaCl，0.2g MgSO₄·7H₂O，加去离子水定容至1L。固体培养基中每升加入15.0g琼脂。

1.2降解菌株的纯化、筛选和鉴定

利用紫外分光光度计和高效液相色谱仪检测第三次转接的富集培养液中灭多威的残留量以及是否有新的代谢产物的生成。对有降解效果的富集液进行梯度稀释，取10-4至10-7梯度稀释富集液各0.1ml，分别涂布于加有100mg/l灭多威的基础盐固体培养基上，30℃培养6天。挑取平板上的单菌落，进一步划线纯化，将得到的纯化单菌接种于加有100mg/l灭多威的MSM液体培养基中，30℃，150rpm/min培养3天，后验证各单菌落是否有灭多威降解功能。

通过富集驯化分离筛选得到一株灭多威降解菌，命名为MDW-2。菌株MDW-2在LB固体平板上生长4天后，菌落呈微黄、圆形、边缘整齐、表面凸起；菌株MDW-2为革兰氏阴性细菌，电镜图显示该菌株为杆状。菌株MDW-2无鞭毛，脲酶、淀粉和明胶水解等反应为阴性，过氧化氢酶酶和氧化酶为阳性。

16S rRNA基因序列***发育分析：以菌株的总DNA为模板，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-TACCTTGTTACGACT T-3′。50μL PCR反应体系为：模板1.0μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物((25μM)各1.0μL，10×Taq缓冲液5.0μL，Mg²⁺(25mM)4.0μL，Taq酶(5.0U/L)0.5μL，超纯水33.5μL。聚合酶链式反应条件：95℃预变性5min；94℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃延伸10min。3.0μL PCR产物于0.75％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，PCR产物用回收试剂盒(Axygen公司)进行割胶回收，TA克隆后送于南京金斯瑞生物技术有限公司进行测序。测序后获得的16S rRNA基因序列在EzTaxon-e server进行同源性比对，菌株MDW-2与Aminobacter aganoensis DSM 7051T(Genebank登录号为AJ011760)的序列相似性为99.72％。另外，结合菌株的形态学和生理生化特征将MDW-2鉴定为氨基杆菌属(Aminobacter sp.)该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为保藏编号为CCTCC NO:M2019221。

紫外分光光度计检测：取2mL降解培养液于12000rpm离心2min，将上清液在UV-2450型分光光度计的200～350nm区间内扫描，判断灭多威的降解情况和确定高效液相检测波长。

1.3降解菌株MDW-2的降解特性及降解产物分析

降解特性的研究：将MDW-2接种至LB液体培养基，30℃培养至对数中期，低速离心收集菌体，菌体用新鲜、无菌基础盐培养基洗涤2遍，重悬于基础盐培养基中，调节细胞浓度约为1.0×10⁹cfu/ml，按1％(v/v)接种量，接种到20ml，含100mg/l灭多威的基础盐培养基中，30℃培养60h。每隔12h定时取样测定菌株生长和降解曲线。

定时取样培养液2mL，12000rpm/s离心2min，上清液用0.22μm水相滤器过滤，处理好的样品用高效液相色谱(HPLC)进行检测。取2mL降解培养液，12000rpm/s离心2min，上清液用0.22μm水相滤器过滤，处理好的样品用液相色谱仪检测农药灭多威的含量。高效液相色谱条件：色谱分离柱为Kromasil100-5C18反相柱(4.6mm×250mm×5μm)；柱温40℃；乙腈/水(50:50,v/v)为流动相，流速为0.8mL/min；紫外检测波长为243nm；进样量20μL。

实验结果表明菌株MDW-2能够降解灭多威，培养30h能降解约99％的100mg/l灭多威。HPLC-MS/MS分析结果表明灭多威降解的第一步是水解灭多威生产灭多威肟(图1)。

实施例2灭多威水解酶基因的克隆及功能验证(策略图见图2)

2.1细菌基因组总DNA的测序分析

2.1.1细菌基因组总DNA的提取

菌株MDW-2基因组总DNA采用高盐结合CTAB法进行提取，基因组总DNA溶于TE缓冲液(pH 8.0)，-20℃保存。

2.1.2基因组草图测序及结果分析

细菌基因组测序要求样品OD值在1.8-2.0之间，浓度越高越好，浓度不低于30ng/μl。将准备好的足量的DNA样品于干冰保温下寄送至美吉生物科技公司测序。

样品检测采用：1.浓度检测，琼脂糖凝胶电泳定量；2.OD260:280和OD260:230检测方法：NanoDrop。

2.1.3基因组草图测序结果分析

基因组测序结果：菌株MDW-2基因组草图大小为6，557，908bp，106个scaffolds，G+C含量为63.18mol％。

2.2菌株MDW-2细胞破碎粗酶液的蛋白纯化

2.2.1菌株细胞破碎液的制备

菌株MDW-2接种于LB培养基或含二甲戊灵的基础盐培养中，30℃培养至OD₆₀₀约2.0，离心收集菌体，用pH 7.4的Tris-HCl缓冲液洗涤两遍后重悬。超声破碎(AutoScience,UH-650B超声破碎仪,40％intensity)10min后，高速离心收集上清液，然后将上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤得粗酶液，4℃保存待用。

2.2.2菌株粗酶液酶活的测定

酶活测活体系：1ml的测活体系中含20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，100μl过滤粗酶液，加入灭多威(终浓度100mg/l)起始酶活反应，30℃反应1h后，加入20μL 5M盐酸终止反应。反应液12000rpm离心2min，0.22μm的微孔滤膜过滤后，HPLC检测底物的残留量。一个酶活力单位定义为：在pH 7.4，30℃条件下1min内催化消耗1nmol底物所需要酶的量，以U表示。

酶活测定试验表明MDW-2粗酶液降解灭多威的比酶活可达到为18.76U/mg。

2.2.3硫酸铵分级沉淀

菌株在3mL LB液体中培养至对数期，然后以2％(v/v)接种量转接至100mL LB液体中，培养至对数后期，6000rpm离心5min收集菌体，无菌水重悬洗涤菌体两次后，再用无菌水重悬菌体至OD600≈1.0作为种子液。

将破碎好的粗酶液按0～20％、20～40％、40～60％、60～80％和80～100％组分进行硫酸铵饱和梯度沉淀。首先计算粗酶液体积，内置磁力搅拌器转子于冰浴烧杯中，打开磁力搅拌器至匀速；根据粗酶液的体积计算硫酸铵质量，缓慢均匀添加硫酸铵使其饱和度达到20％，4℃、13000rpm离心30min，沉淀以适量20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)重悬，测定蛋白含量和酶活；收集上清，根据体积继续缓慢均匀添加硫酸铵，使其饱和度达到40％，重复上述步骤，直至硫酸铵饱和度达到100％停止。将各组分沉淀重悬，在4℃20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中透析过夜，透析袋的截留分子量为10kDa。收集并计算各级沉淀的蛋白含量与酶活，选择比酶活较高的组分继续纯化。

2.2.4 DEAE-Sepharose fast flow离子柱层析

用20mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液平衡DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱，将粗酶液于4℃、13000rpm离心5min后，加入层析柱中，用20mM Tris-HCl(pH 7.4)洗脱后，再用含不同浓度NaCl(0.2M、0.25M、0.3M和0.35M)的20mM Tris-HCl(pH 7.4)进行梯度洗脱，每3mL收集一管，每管测定酶活性，将有活性的酶液于4℃20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中透析过夜，通过超滤管(截留分子量为10kDa)浓缩收集有活性的酶液。

2.2.5 Q-Sepharose fast flow离子柱层析

用20mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液平衡Q-Sepharose fast flow阴离子柱，将浓缩的酶液加入层析柱中，用20mM Tris-HCl(pH 7.4)洗脱后，再用含不同浓度NaCl(0.2M、0.4M、0.45M和0.5M)的20mM Tris-HCl(pH 7.4)进行梯度洗脱，每3mL收集一管，每管测定酶活性，将有活性的酶液于4℃20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中透析过夜，通过超滤管(截留分子量为10kDa)浓缩收集有活性的酶液。

2.2.6 Superdex-200凝胶层析

将超滤后的酶液加入Superdex-200凝胶层析柱，以含0.1M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液进行洗脱，AKTA purifier全自动层析仪(AKTA purifier10UPC)自动收集，流速为0.4mL/min，每0.5mL收集一管，每管测定酶活性。

2.2.7 SDS-PAGE胶蛋白测序结果分析及水解酶肽指纹图谱分析

用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱、Q-Sepharose FastFlow离子交换层析柱和Sephadex-200凝胶层析等方法逐步纯化菌株MDW-2粗酶液中的灭多威水解酶。通过SDS-PAGE检测将获得的蛋白(图3)委托上海博苑生物科技有限公司进行肽指纹图谱分析(MALDI-TOF mass spectrometry analysis)，通过肽段序列与菌株MDW-2基因组中的氨基酸序列进行同源性比对分析，查到一个注释为水解酶的orf，命名为AmeH，氨基酸个数为216，其编码核苷酸为951bp，编码基因ameH核苷酸序列见SEQ ID NO.1，PNR氨基酸序列见SEQ IDNO.2。

实施例3水解酶基因ameH的异源表达及验证(策略图见图4)

3.1灭多威水解酶基因ameH的特异性扩增

设计ameH基因的特异性同源重组引物ameH-F：5′-TAAGAAGGAGATATACATATGGCGCGTCAGACGACA-3′(SEQ ID NO.3，下划线碱基为NdeI酶切位点)，ameH-R：5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCGGCGAAGATGCTTCG-3′(SEQ ID NO.4，下划线碱基为XhoI酶切位点)，以菌株MDW-2的基因组DNA为模板进行特异性扩增。

特异性扩增反应体系(50μL)：

所用程序如下：

3.2质粒pET24b的双酶切

对质粒pET24b进行NdeI和XhoI双酶切，酶切体系如下：

于37℃水浴酶切过夜，3.0μL产物用0.75％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，剩余用Axygen公司的回收试剂盒进行割胶回收。

3.3表达菌株的构建及验证

于冰水域中配制如下反应体系(10μL)：

混匀后，在37℃水浴30min，但反应完成后立即置于冰水浴中冷却5min，将同源重组产物转入大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中。挑取转化子至50mg/L Km的3mL LB试管中37℃、180rpm摇床培养，提取质粒获得阳性转化子，分别进行PCR验证和送往金斯瑞生物科技有限公司进行测序，验证***质粒pET24b的DNA片段序列是否正确，将获得的阳性克隆含有pET24b-ameH的E.coli BL21(DE3)表达菌株命名为E.coli BL21(DE3)-ameH。

3.4表达载体的诱导表达、纯化

重组表达菌株E.coli BL21(DE3)-AmeH在100mL LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600为0.6～0.8时，加入0.15mM IPTG，16℃诱导培养8h；4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，超声破碎5min，离心，收集上清，用0.22μm的水相滤器过滤去除菌体与破碎残渣，即获得菌株E.coli BL21(DE3)-AmeH的粗酶液，可用Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，收集水解酶纯度最高的洗脱液，在4℃、20mMTris-HCl(pH 7.4)缓冲液中用透析袋(截留分子量10kDa)透析过夜。SDS-PAGE蛋白电泳检测纯化效果，条带大小和理论预测的大小(30kDa)相一致(图5)

3.5AmeH活力测定

酶活反应体系：20mM Tris-HCl(pH 7.4)，50mg/L灭多威，反应酶量50μL，30℃反应20min。每个反应以加入酶开始计时，反应结束后加入20μL 5M盐酸终止反应，用HPLC测灭多威的降解情况。酶活力单位(U)定义：本实验中1个酶活单位(U)定义为：每分钟减少1nmol灭多威所需的酶量(mg)。降解试验表明纯化后的AmeH能在3hr内降解50mg/L的灭多威，酶学试验表明AmeH对灭多威的比酶活为221.15U/mg。

3.6代谢产物的确定

酶促反应后的灭多威降解产物采用HPLC-MS/MS技术进行检测和鉴定分析。HPLC色谱条件：色谱分离柱为Kromasil 100-5C18反相柱(4.6mm×250mm×5μm)；柱温40℃；乙腈/水(50:50,v/v)为流动相，流速为0.8mL/min；紫外检测波长为243nm；进样量20μL。LTQOrbitrap XL质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific)MS/MS分析离子源为ESI，正离子检测模式。液质检测数据用Xcalibur软件处理分析。

HPLC-MS/MS检测结果分析指出AmeH能水解灭多威，HPLC图谱上显示有水解产物生产，MS/MS结果分析鉴定产物为灭多威肟(图6)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 水解酶基因ameH及其编码的蛋白和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> 氨基杆菌属(Aminobacter sp.)

<400> 1

atggcgcgtc agacgacaca ttacctgtca aagaaatccc accacagtaa gtgggacaac 60

agcctcgaac ctgccctgac aatcgactca ggcgacgtcg tcgtctttga gtgcgtcgaa 120

ggttcgggcg gccagctgac gcgagagtcc acggtcgaag acctcaaggt gcttgactgg 180

agcacggttc attgcctgac cgggccggtg gcagtccgcg gagccgatcc tggggacgtg 240

ctgaaggtag agatcctgga cttcgagcat gagggctggg cctggacgtg tatcgctccc 300

gggtacgggg tgctgcccga ggagttcggc gacacatatg cgctgagggt ctgggaggtc 360

ggggccgacg agcgggtgga gctgacgccg ggcatccgag ttccgatcgc tcccttcatg 420

ggggtgatgg gatgcgctct cgccgagccc ggagcacact cgaccatgcc gccgcgtagc 480

atgggcggga acttggacag ccgccacctc gtcaagggga gcacgctgct ccttccggtc 540

caagtgcctg gcgccttgtt ctcgaccggc gacgggcatc tcggtcaggg tgacggcgag 600

gtgtgtatca ccgcgctcga gggtccgctg acggtgacgc tgcgcatcag cgtcgtgaag 660

gggcgcagca tccgagctcc gcagtacatc acgtacgcac ccaccaccag caagttcgat 720

gggatgggct actacgtcac atccgctgcc ggactggatc tgcaggacgg cgtgagcagg 780

gcggtgcgcg acatgatcga gtacctgcag gcgcagtacg ggctcaatcg catcgacgcg 840

tacatgctct gtagcgtcgc ggctgacctg aagatcgcgg ttccggcgct cggtcccggg 900

cacgccagct tcgtgacctt ccacatgccg cgaagcatct tcgccggcta g 951

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> 氨基杆菌属(Aminobacter sp.)

<400> 2

Met Ala Arg Gln Thr Thr His Tyr Leu Ser Lys Lys Ser His His Ser

1 5 10 15

Lys Trp Asp Asn Ser Leu Glu Pro Ala Leu Thr Ile Asp Ser Gly Asp

20 25 30

Val Val Val Phe Glu Cys Val Glu Gly Ser Gly Gly Gln Leu Thr Arg

35 40 45

Glu Ser Thr Val Glu Asp Leu Lys Val Leu Asp Trp Ser Thr Val His

50 55 60

Cys Leu Thr Gly Pro Val Ala Val Arg Gly Ala Asp Pro Gly Asp Val

65 70 75 80

Leu Lys Val Glu Ile Leu Asp Phe Glu His Glu Gly Trp Ala Trp Thr

85 90 95

Cys Ile Ala Pro Gly Tyr Gly Val Leu Pro Glu Glu Phe Gly Asp Thr

100 105 110

Tyr Ala Leu Arg Val Trp Glu Val Gly Ala Asp Glu Arg Val Glu Leu

115 120 125

Thr Pro Gly Ile Arg Val Pro Ile Ala Pro Phe Met Gly Val Met Gly

130 135 140

Cys Ala Leu Ala Glu Pro Gly Ala His Ser Thr Met Pro Pro Arg Ser

145 150 155 160

Met Gly Gly Asn Leu Asp Ser Arg His Leu Val Lys Gly Ser Thr Leu

165 170 175

Leu Leu Pro Val Gln Val Pro Gly Ala Leu Phe Ser Thr Gly Asp Gly

180 185 190

His Leu Gly Gln Gly Asp Gly Glu Val Cys Ile Thr Ala Leu Glu Gly

195 200 205

Pro Leu Thr Val Thr Leu Arg Ile Ser Val Val Lys Gly Arg Ser Ile

210 215 220

Arg Ala Pro Gln Tyr Ile Thr Tyr Ala Pro Thr Thr Ser Lys Phe Asp

225 230 235 240

Gly Met Gly Tyr Tyr Val Thr Ser Ala Ala Gly Leu Asp Leu Gln Asp

245 250 255

Gly Val Ser Arg Ala Val Arg Asp Met Ile Glu Tyr Leu Gln Ala Gln

260 265 270

Tyr Gly Leu Asn Arg Ile Asp Ala Tyr Met Leu Cys Ser Val Ala Ala

275 280 285

Asp Leu Lys Ile Ala Val Pro Ala Leu Gly Pro Gly His Ala Ser Phe

290 295 300

Val Thr Phe His Met Pro Arg Ser Ile Phe Ala Gly

305 310 315

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagaaggag atatacatat ggcgcgtcag acgaca 36

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga ggccggcgaa gatgcttcg 39

Claims (10)

1.一种水解酶基因ameH，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述的水解酶基因ameH编码的蛋白质AmeH，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.含有权利要求1所述的水解酶基因ameH的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述的水解酶基因ameH的基因工程菌；所述的基因工程菌优选以E.coli BL21(DE3)为出发菌株。

5.权利要求1所述水解酶基因ameH在降解灭多威中的应用。

6.权利要求3所述的含有水解酶基因ameH的重组表达载体在降解灭多威中的应用。

7.权利要求2所述水解酶蛋白AmeH在降解灭多威中的应用。

8.权利要求2所述的水解酶蛋白AmeH在去除土壤、水体中灭多威中的应用。

9.灭多威降解菌株氨基杆菌属(Aminobacter sp.)MDW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏时间为2019年4月1号，保藏编号为：CCTCC NO:M2019221。

10.权利要求9所述的解菌株氨基杆菌属(Aminobacter sp.)MDW-2在降解灭多威中的应用。