CN110042138A - 一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗氧化肽组分的制备方法及其在口服液体制剂方面的应用。胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备林蛙油抗氧化肽组分的工艺条件为：胃蛋白酶量2.0％、胃蛋白酶酶解时间3.5h、胰蛋白酶量2.0％、胰蛋白酶酶解时间3.0h。该条件下，林蛙油抗氧化肽组分对羟基自由基的清除率为75.57％，得率为63.45％。经超滤***，截留分子量1kDa～3kDa的肽组分，即得活性最高的林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ。该肽组分在乙醇诱导氧化损伤模型鼠体内具有显著的抗氧化作用，可降低丙二醛和蛋白质羰基含量，升高总超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽含量；可用于林蛙油抗氧化肽组分口服液的制备。

Description

一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途
技术领域
本发明属于天然产物制备和应用领域，具体涉及一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及其分离方法与用途。
背景技术
对机体而言，自由基是一把“双刃剑”，生理浓度时广泛参与细胞信号转导和生命过程；过量时又能引起线粒体氧化应激，导致衰老及相关疾病的发生。因此，保持细胞内的氧化与抗氧化平衡(氧化还原平衡)对维持健康极为重要。机体自由基以活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)为主，还包括部分活性氮自由基(Reactive nitrogenspecies,RNS)。ROS主要包括过氧化氢、羟基自由基、超氧阴离子、氢过氧化物等；RNS包括一氧化氮、过硝酸盐、二氧化氮等。机体自身具备清除多余自由基的能力，这主要依赖于内源性自由基清除***，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶等抗氧化酶和维生素C、维生素E、还原性谷胱甘肽等抗氧化剂。但由于生理水平较低，当受外界干扰致使机体自由基大量过剩时，内源性抗氧酶与抗氧化剂的作用就显得微乎其微。大量自由基直接损伤机体DNA、蛋白质、细胞膜磷脂等，导致细胞老化、免疫力下降、炎症、中枢神经***、心血管***等诸多疾病的发生。例如，免疫细胞膜富含多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatedfatty acids,PUFAs)，由于共轭双键的存在，PUFAs对自由基非常敏感，极易被还原为饱和脂肪酸，进而破坏免疫细胞结构与功能。因此，外源性补充抗氧化剂可以辅助机体清除多余自由基，减少ROS对正常细胞DNA与免疫细胞膜的直接损伤和/或炎性细胞因子的释放，进而增强机体免疫应答，是治疗多种疾病及延缓衰老的基础。
常用的外源性抗氧化剂多为化学合成物，如丁基羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，虽抗氧化效果良好，但因其毒副作用，各国政府纷纷强制规定了每日允许摄入量(Acceptabledaily intake,ADI)，目光也逐渐转向天然抗氧化剂，如抗坏血酸、α-生育酚、β-胡萝卜素、黄酮、儿茶素等。研究发现，蕴藏于蛋白质多肽链中的肽类物质同样具有较强抗氧化活性，且活性往往高于母体蛋白质，抗氧化肽作为一类非酶类自由基清除剂的研究正在兴起(Marine Drugs,2017,15(2):1-26；Antioxidants,2016,5(3):1-16)。获取生物活性肽的方法主要包括：(1)从天然生物体提取；(2)胃肠道消化蛋白质过程中产生或体外酶解蛋白质产生；(3)化学合成、酶法合成或重组DNA技术合成等。由于含量低、提取困难，从生物体中提取的活性肽不大可能满足大规模需求。基因组合和化学组合肽库虽给肽类药物及制药工业带来了革命性进展，但目前肽库的构建、筛选及应用尚处起步阶段。酶法制备生物活性肽因其具有生产条件温和、安全性高、价廉且可得到特定活性肽等优点，已成为生产活性肽的主流方法。Díaz等(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(8):2365-2370)将利用酪蛋白制备的磷酸肽加入到油/水乳化体系中，发现酪蛋白磷酸肽能延缓油脂氧化腐败过程；Sakanaka等(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(2):464-468)采用微生物酶水解法制备酪蛋白酸钙肽，其在β-胡萝卜素漂白实验中显示很强的抗氧化活性，清除超氧阴离子、DPPH自由基、羟基自由基的能力呈良好量效关系；Saiga等(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(12):3661-3667)采用木瓜蛋白酶和Actinase E水解猪肉肌原纤维蛋白，其产物在Fe2+诱导的亚油酸氧化体系中显示出强抗氧化性，且两种酶水解产物在pH 7.1比pH 5.4显示出更高的抗氧化活性，木瓜蛋白酶水解产物在pH 7.0与维生素E的抗氧化能力几乎相同，这些水解产物都能清除DPPH，螯合金属离子；Leng等(FEBS Letters,2005,579(5):1187-1190)研究发现:蛤肽可以激活SOD，通过清除参与肿瘤细胞恶化的ROS抑制人胃腺癌细胞BGC-823的生长和转移；鹰嘴豆多肽CPe通过提高机体抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用(食品工业科技,2015,36(2):368-372)。因此，不同酶的组合有望从蛋白链中释放结构与活性各异的生物活性肽。
林蛙油(Oviductus ranae)，又称哈蟆油、哈士蟆油，雌性成体林蛙输卵管的干制品，是珍贵的传统补益类中药材。《中药大词典》记载：林蛙油具有“补肾益精、润肺养阴”等功效，用于治疗“虚弱、肺痨、咳嗽、吐血、盗汗”等症；《中国药物学》记载：哈蟆油是“润肺、生津、补虚的身体增强剂，是身体衰弱的滋补佳品”；《中国药典》记载：哈蟆油“补肾益精，养阴润肺”。用于病后体弱，神疲乏力，心悸失眠，盗汗，痨嗽咳血。基于传统应用，国家食品药品监督管理总局批准上市的林蛙油保健食品多以增强机体免疫力、抗疲劳、延缓衰老为保健功能。林蛙油富含多种对人体有益的活性成分，如蛋白质、不饱和脂肪酸、磷脂、多糖、维生素、核酸、激素及铁、锰、硒等人体必需的微量元素。林蛙油中蛋白质含量高达50％以上，是主要的活性成分。在前期工作中，我们***研究了林蛙油蛋白的抗氧化作用，发现：林蛙油蛋白体内抗氧化活性强，而体外弱，推测实际发挥抗氧化作用的物质形式是某些重要的蛋白消化产物(Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2018,2018:9021371)。因此，模拟蛋白体内消化过程与程序，并结合活性跟踪是发现林蛙油抗氧化肽的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法及产品应用。相比林蛙油母体蛋白，本发明制备的林蛙油抗氧化肽组分分子量小，利于机体吸收；活性高于母体蛋白；去除无活性蛋白成分，减少蛋白滞留肠道所致的腐败，降低有害腐败产物对机体的危害。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法，以林蛙油脱脂粉为原料，首先采用胃蛋白酶在酸性条件酶解，然后采用胰蛋白酶在碱性条件下酶解，酶解液经灭菌、离心、冷冻干燥得林蛙油抗氧化肽组分。
所述林蛙油抗氧化肽组分的制备方法具体包括如下步骤：
称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于蒸馏水中静止过夜；用盐酸调pH至1.0～1.5后置于水浴锅孵育5min；加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于37℃震荡一定时间；胃蛋白酶酶解结束后，用NaOH溶液调节pH至8.0～8.5后置于37℃水浴5min，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间；胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于95℃～100℃水浴中灭酶10min～15min，冷却后13000r/min离心30min，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分；
优选的，所述胃蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，进一步优选2.0％；
优选的，所述胃蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，进一步优选3.5h；
优选的，所述胰蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，进一步优选2.0％；
优选的，所述胰蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3h；
优选的，所述胃蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％、胃蛋白酶酶解时间3.5h、胰蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％、胰蛋白酶酶解时间3.0h。该条件下，林蛙油抗氧化肽组分对羟基自由基的清除率为75.57％，得率为63.45％。
本发明所述的林蛙油抗氧化肽组分的制备方法中，还包括对制备出的林蛙油抗氧化肽组分利用超滤***对林蛙油抗氧化肽组分进行分离的工序；具体方法为：采用超滤***，分别采用截留分子量分别为10kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜对林蛙油抗氧化肽组分溶液进行分级分离，分别收集不同分子量的组分抗氧化肽组分I(>10kDa)、抗氧化肽组分II(5kDa～10kDa)、抗氧化肽组分III(3kDa～5kDa)、抗氧化肽组分IV(1kDa～3kDa)、抗氧化肽组分V(<1kDa)，冷冻干燥。在相同浓度下，抗氧化肽组分IV，即分子量分布于1kDa～3kDa的肽组分对羟基自由基的清除率最高，为93.21％，而林蛙油蛋白仅为10.12％，活性提高9倍。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种林蛙油抗氧化肽组分IV的用途，用于制备口服液体制剂；所述服液液体制剂包括林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ、矫味剂、防腐剂和水；
优选的，按重量比计算，林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ：矫味剂：防腐剂＝200～50:10～30:1～5；
矫味剂可以掩盖口服液腥味，优选的，所述矫味剂为三氯蔗糖、蔗糖、木糖醇、橙皮糖浆、樱桃糖浆、枸橼糖浆、桂皮糖浆、甘草糖浆或甜菊苷其中一种；或重量比为木糖醇：甘草糖浆＝1～2:3～5、甘草糖浆：樱桃糖浆＝3～4:1～2、木糖醇：甘草糖浆：樱桃糖浆＝1～2:2～5:2～3两种或两种以上复配的复配。
防腐剂可抑制细菌滋生，提高产品稳定性；优选的，所述防腐剂为丙酸杆菌素、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯其中一种或两种复配；
所述防腐剂进一步优选为丙酸杆菌素，按照重量比计算林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ：丙酸杆菌素＝50～200:1，优选100:1；丙酸杆菌素是丙酸杆菌发酵代谢产物，是一种新型的天然防腐剂，抑菌效果好，故添加量远低于普通化学防腐剂，同时安全性高于化学防腐剂；口感微酸，也能起到一定矫味作用。
本发明具有如下有益效果：
①本发明提供的林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ的分子量低于母体蛋白，利于机体吸收；去除无活性蛋白成分，减少蛋白滞留肠道所致的腐败，降低腐败产物对机体的危害。
②基于活性跟踪，制备、分离林蛙油抗氧化肽组分，所得肽组分Ⅳ活性显著高于母体蛋白。
③在体外，本发明提供的林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ对羟基自由基的清除率比母体蛋白提高9倍；在乙醇诱导氧化损伤模型小鼠体内，本发明提供的林蛙油抗氧化肽组分能显著降低脂质氧化产物丙二醛(MDA)和蛋白质羰基(PCO)的含量；升高抗氧化酶总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)含量，显示高于母体蛋白的抗氧化作用。
④本发明提供的林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ水溶性良好，利于口服液稳定性的提高；同时，以丙酸杆菌发酵产物丙酸杆菌素代替化学防腐剂，提高抑菌效果与口服安全性；上述特点使得林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ口服液具有便于加工制造、储存、运输的优势，具有产业化开发价值。
附图说明
图1.胃蛋白酶的用量对酶解肽抗氧化能力的影响；
图2.胃蛋白酶的酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响；
图3.胰蛋白酶的用量对酶解肽抗氧化能力的影响；
图4.胰蛋白酶的酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响。
具体实施方式
林蛙油脱脂粉购于吉林黄栀花药业有限公司；胃蛋白酶(1：3000)和胰蛋白酶(1：250)购于上海麦克林生化科技有限公司。
实施例1林蛙油抗氧化肽组分的制备
称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于30mL蒸馏水中静止过夜。用1mol/L盐酸水溶液调pH至1.0～1.5后置于37℃水浴锅孵育5min。加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于37℃震荡一定时间。胃蛋白酶酶解结束后，用0.1mol/mLNaOH水溶液调节pH至8.0～8.5后置于37℃水浴5min，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间。胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于95℃～100℃水浴中灭酶10min～15min，冷却后13000r/min离心30min，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分。
1.1单因素试验
1.1.1胃蛋白酶用量对酶解肽抗氧化能力的影响
在考察胃蛋白酶用量对酶解肽抗氧化能力的影响时，通过改变胃蛋白酶用量，而其他三个因素包括胃蛋白酶酶解时间、胰蛋白酶用量、胰蛋白酶酶解时间固定不变。胃蛋白酶的用量分别为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％。采用水杨酸法清除羟自由基清除率来测定酶解肽抗氧化的能力(酶解结束后，离心，取上清冷冻干燥即得抗氧化肽组分，抗氧化肽组分配制成浓度为5mg/mL的溶液测试，下同)，结果如图1所示。
由图1可知胃蛋白酶的用量在1.0％～2.0％时，随胃蛋白酶用量的增加，酶解肽抗氧化的能力也随着增加。但超过2.0％后，随着胃蛋白酶酶用量的增加酶解肽抗氧化的能力减小，所以胃蛋白酶的用量取2.0％最宜。
1.1.2胃蛋白酶酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响
在考察胃蛋白酶酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响时，通过改变胃蛋白酶酶解时间，固定胃蛋白酶的用量、胰蛋白酶的用量、胰蛋白酶酶解时间三个因素不变。胃蛋白酶酶解时间分别为1.5h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h；结果如图2所示。
由图2可知胃蛋白酶的酶解时间在1.5h～3.5h时，随酶解时间增加，酶解肽抗氧化能力也随之增大。但超过3.5h后，随着酶解时间增加，酶解肽抗氧化能力随之减小。因此，胃蛋白酶酶解时间取3.5h最佳。
1.1.3胰蛋白酶用量对酶解肽抗氧化能力的影响
在考察胰蛋白酶的用量对酶解肽抗氧化能力的影响时，通过改变胰蛋白酶的用量，其他三个因素，即胃蛋白酶的用量、胃蛋白酶的用量、胰蛋白酶酶解时间固定。胰蛋白酶用量分别为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％，结果如图3所示。
由图3可知胰蛋白酶的用量在1.0％～2.0％时，随胰蛋白酶用量的增加，酶解肽抗氧化能力随之增加，超过2.0％后，随胰蛋白酶用量的增加酶解肽抗氧化的能力减小，所以胰蛋白酶的用量以2.0％最宜。
1.1.4胰蛋白酶酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响
在考察胰蛋白酶酶解时间对酶解肽抗氧化能力的影响时，固定胃蛋白酶的用量、胃蛋白酶酶解时间、胰蛋白酶的用量不变。胰蛋白酶酶解时间分别为1.5h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h，结果如图4所示。
由图4可知胰蛋白酶的酶解时间在1.5h～3.0h时，随酶解时间增加，酶解肽抗氧化能力也随之增大。但超过3.0h后，随着酶解时间增加，酶解肽抗氧化能力随之减小。因此，胰蛋白酶酶解时间取3.0h最佳。
1.2响应面法试验
根据单因素试验结果确定：胃蛋白酶的用量为2.0％、胃蛋白酶酶解时间为3.5h、胰蛋白酶的用量为2.0％、胰蛋白酶的酶解时间为3.0h。响应面试验中选取胃蛋白酶的用量A、胃蛋白酶酶解时间B、胰蛋白酶的用量C、胰蛋白酶的用量D四个因素作为自变量，以林蛙油酶解肽羟基自由基清除力为响应值，实验因素及水平如表1所示。
表1.响应面分析因素与水平设计
利用实验设计软件Design-Expert，根据Box-Behnken Design(BBD)，设计得到的四因素三水平的响应面分析实验方案及结果如表2所示。
表2.响应面分析实验方案及结果
本实验中，1、8、9、22、27组为中心实验，其余均为析因实验，29个试验点总共分为析因点和零点，其中析因点是与自变量A、B、C、D所对应的三维顶点，零点实验重复5次，用以估计实验误差。
使用Design-Expert软件BBD，定义羟基自由基清除力为Y，经多元回归拟合，得出Y的预测值对A、B、C、D编码值的二次回归模型方程：
Y＝76.48+1.25A+1.32B-0.50C-0.53D-0.72AB+1.83AC-3.04AD-3.61BC-6.44BD+4.20CD-8.64A2-14.21B2-9.54C2-14.46D2
回归模型方差分析结果如表3所示。
表3.回归模型方差分析结果
“-”表示无。
由表3可知此模型的P<0.0001，说明选用的模型极显著、；失拟项P＝0.3499不显著，说明模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果干扰很小；方程决定系数R2＝0.8669，说明响应值的变化有86.69％来源于所选变量；R2 adj＝0.7337，意味着该模型能解释73.37％试验数据的变异性。从模型的失拟项方差分析可以看出，失拟项不显著(P>0.05)，表明该模型是稳定的，能较好预测实际林蛙油酶解肽对羟基自由基清除能力的变化。
通过软件分析，得到林蛙油酶解肽的清除率羟基自由基的最佳条件为：胃蛋白酶用量2.04％、胃蛋白酶酶解时间3.53h、胰蛋白酶用量1.98％、胰蛋白酶酶解时间2.98h，在此条件下，林蛙油酶解物抗氧化肽的清除率理论值为76.59％。采用上述优化提取条件进行林蛙油抗氧化肽组分的制备，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：胃蛋白酶用量2.0％、胃蛋白酶酶解时间3.5h、胰蛋白酶用量2.0％、胰蛋白酶酶解时间3.0h。在此条件下，林蛙油酶解肽对羟基自由基的清除率为75.57％，与理论预测相比，相对误差约为1.3％，与模型预测基本接近。该工艺条件下，林蛙油抗氧化肽组分的重量得率为63.45％。
林蛙油抗氧化肽组分的重量得率是按照如下方法计算的：酶解结束后，离心，上清液冷冻干燥得抗氧化肽组分，重量为m(g)，林蛙油脱脂粉的重量M(g)，m/M(w/w,％)即为得率。
对比例
在实施例1得出的最优工艺的基础上，为了表明本发明胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法较单酶(胃蛋白酶或胰蛋白酶)制备出的林蛙油抗氧化肽组分抗氧化性能优异，本发明做了如下对比试验：
方案A：胃蛋白酶水解工艺：
称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于30mL蒸馏水中静止过夜。用1mol/L盐酸调pH至1.0～1.5后置于37℃水浴锅孵育5min。加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于37℃震荡一定时间；将酶解液置于95℃～100℃水浴中灭酶10min～15min，冷却后13000r/min离心30min，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分；测试林蛙油抗氧化肽组分的羟基自由基清除率。
胃蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胃蛋白酶酶解时间6.5h时，对羟基自由基清除率为28.6％；
方案B：胰蛋白酶水解工艺：
称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于30mL蒸馏水中静止过夜。用0.1mol/mL NaOH水溶液调节pH至8.0～8.5后置于37℃水浴5min，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间。胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于95℃～100℃水浴中灭酶10min～15min，冷却后13000r/min离心30min，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分。
胰蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胰蛋白酶酶解时间6.5h，对羟基自由基清除率为19.78％。
所以本发明采用胃蛋白酶/胰蛋白酶分步水解法制备出的林蛙油抗氧化肽组分的抗氧化性显著高于单酶水解的抗氧化性。
实施例2林蛙油抗氧化肽组分的分离
采用PALL Minimate TM切向流超滤***，分别采用截留分子量分别为10kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜对林蛙油抗氧化肽组分溶液进行分级分离，分别收集不同分子量的组分I(>10kDa)、II(5kDa～10kDa)、III(3kDa～5kDa)、IV(1kDa～3kDa)、V(<1kDa)，冷冻干燥后，配制浓度均为5mg/mL的溶液。采用水杨酸法，比较对羟基自由基的清除能力，确定活性最高的组分并与林蛙油蛋白进行比较。
如表4可知，在相同浓度下，组分IV，即分子量分布于1kDa～3kDa的肽组分对羟基自由基的清除率最高，为93.21％，而林蛙油蛋白仅为10.12％，活性提高9倍。因此，选择林蛙油抗氧化肽组分IV做进一步的体内抗氧化活性验证。
表4.超滤后不同分子量肽组分对羟基自由基的清除能力
实施例3林蛙油抗氧化肽组分IV的体内抗氧化作用
实验动物选取雄性昆明小鼠60只，随机分成6组，每组10只，即林蛙油抗氧化肽组分IV低剂量组(100mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、高剂量组(400mg/kg)、空白对照组(蒸馏水)、阳性对照组(林蛙油蛋白200mg/kg)、模型对照组(蒸馏水)。连续喂养30天，每天灌胃一次。最后一天，除空白对照组，其他受试组一次性灌胃给予50℅乙醇(12mL/kg)造成氧化损伤模型。造模6小时后，取血1mL，离心后测定丙二醛(MDA)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平。断颈处死实验动物，取出肝脏，清洗、匀浆、离心后，测定谷胱甘肽(GSH)和蛋白质羰基(PCO)的含量。
由表5可知，当模型对照组与空白组对照组相比，MDA(P＜0.01)与PCO(P＜0.01)显著升高，GSH(P＜0.01)与T-SOD(P＜0.01)显著降低，这表明乙醇诱导氧化损伤模型造模成功。当低、中、高林蛙油抗氧化肽组分IV组分别与模型对照组相比，MDA(P＜0.01)与PCO(P＜0.01)均显著降低，T-SOD(P＜0.01)与GSH(P＜0.01)均显著升高，这说明林蛙油抗氧化肽组分IV具有显著的体内抗氧化作用，其机制与降低MDA和PCO含量；升高T-SOD和GSH有关。当低、中、高林蛙油抗氧化肽组分IV组分别与林蛙油蛋白组相比，中、高剂量组的MDA与PCO均显著降低；中、高剂量组的T-SOD显著升高；高剂量组的GSH显著升高，这表明相同剂量下的抗氧化肽组分IV的体内抗氧化活性同样高于林蛙油蛋白，且呈现剂量依赖性。
表5 林蛙油水溶性蛋白口服液对MDA、T-SOD、GSH和PC的影响
注：^表示与空白组对比P＜0.05；^^表示与空白组对比P＜0.01；*表示与模型组对比P＜0.05；**表示与模型组对比P＜0.01；#表示与林蛙油蛋白组对比P＜0.05；##表示与林蛙油蛋白组对比P＜0.05。
实施例4林蛙油水溶性蛋白口服液的制备
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入木糖醇2g,丙酸杆菌素0.1g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入三氯蔗糖0.5g,丙酸杆菌素0.1g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入甘草糖浆2g,丙酸杆菌素0.1g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入甘草糖浆2g,丙酸杆菌素0.1g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入甘草糖浆1g,樱桃糖浆1g，丙酸杆菌素0.1g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入木糖醇2g,山梨酸钾0.4g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
取上述林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ10g加入到200mL纯化水中,室温搅拌至溶解，加入甘草糖浆3g,尼泊金乙酯0.4g，搅拌均匀后，罐装瞬时灭菌，装瓶、封口。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种林蛙油抗氧化肽组分的制备方法，其特征在于：以林蛙油脱脂粉为原料，首先采用胃蛋白酶在酸性条件酶解，然后采用胰蛋白酶在碱性条件下酶解，酶解液经灭菌、离心、冷冻干燥得林蛙油抗氧化肽组分。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
称取一定量林蛙油脱脂粉末，置于蒸馏水中静止过夜；用盐酸调pH至1.0～1.5后置于水浴锅孵育；加入一定量胃蛋白酶，搅拌使其分散均匀，置于恒温振荡器中于30-40℃震荡一定时间；胃蛋白酶酶解结束后，用NaOH溶液调节pH至8.0～8.5后置于30-40℃水浴处理，加入一定量的胰蛋白酶，搅拌使其分散均匀，放入恒温振荡器中振荡酶解一定时间；胰蛋白酶酶解结束后，将酶解液置于90℃～100℃水浴中灭酶，冷却后离心，上清液冷冻干燥后即得林蛙油抗氧化肽组分。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，优选2.0％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3.5h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的加入量为林蛙油脱脂粉末重量的1.0％～3.0％，优选2.0％。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的酶解时间为1.5h～4h，优选3h。
7.根据权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于：所述胃蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胃蛋白酶酶解时间3.5h；胰蛋白酶用量为林蛙油脱脂粉末重量的2.0％，胰蛋白酶酶解时间3.0h。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：还包括对制备出的林蛙油抗氧化肽组分利用超滤***对林蛙油抗氧化肽组分进行分离的工序；具体方法为：采用超滤***，分别采用截留分子量分别为10kDa、5kDa、3kDa和1kDa的超滤膜对林蛙油抗氧化肽组分溶液进行分级分离，分别收集不同分子量的组分林蛙油抗氧化肽组分I、林蛙油抗氧化肽组分II、林蛙油抗氧化肽组分III、林蛙油抗氧化肽组分IV、林蛙油抗氧化肽组分V，冷冻干燥；
所述林蛙油抗氧化肽组分I的分子量>10kDa，所述林蛙油抗氧化肽组分II的分子量为5kDa～10kDa，所述林蛙油抗氧化肽组分III的分子量为3kDa～5kDa，所述林蛙油抗氧化肽组分IV的分子量为1kDa～3kDa，所述林蛙油抗氧化肽组分V的分子量<1kDa。
9.一种权利要求8所述制备方法制备出的林蛙油抗氧化肽组分IV的用途，其特征在于：用于制备口服液体制剂；所述口服液体制剂包括林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ、矫味剂、防腐剂和水；
按重量比计算，林蛙油抗氧化肽组分Ⅳ：矫味剂：防腐剂＝200～50:10～30:1～5。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述矫味剂为三氯蔗糖、蔗糖、木糖醇、橙皮糖浆、樱桃糖浆、枸橼糖浆、桂皮糖浆、甘草糖浆或甜菊苷其中一种；或重量比为木糖醇：甘草糖浆＝1～2:3～5、甘草糖浆：樱桃糖浆＝3～4:1～2、木糖醇：甘草糖浆：樱桃糖浆＝1～2:2～5:2～3的复配；
所述防腐剂为丙酸杆菌素、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯其中一种或两种复配。
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