CN110031423A - 基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法，在构建的太赫兹超材料芯片表面接种细胞，培养至细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层，然后采用太赫兹时域光谱仪测定等渗缓冲液中细胞层的谐振峰情况；更换低渗缓冲液，大量水分子通过水通道蛋白进入细胞内部，使得初始细胞体积增大，形成溶胀后的细胞，采用太赫兹时域光谱仪实时获取贴壁细胞层在渗透压变化时的谐振峰变化情况，有效反映细胞溶胀程度，即水分子通过细胞层的渗透状况，并根据实时响应曲线求得达到最大响应值所需时间的倒数，实现细胞水通道蛋白功能情况的无标记评估，可用于相关靶向AQP药物的高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于太赫兹测量技术领域，涉及一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法。
背景技术
水是生命之源。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是位于细胞膜上的跨膜蛋白，选择性高效转运水分子的通道。自1991年首次报道第一个水通道蛋白(AQP1)以来，研究者相继发现广泛分布于不同器官的13种水通道蛋白，对于维持器官正常生理功能发挥至关重要的作用。AQP表达量和功能状态与肿瘤、脑血管疾病、肾脏疾病等多种疾病密切相关。特别是AQP在肿瘤组织中表达上调，通过快速转运水分子进入肿瘤细胞介导其迁移、增殖和侵袭，并参与肿瘤新生血管的形成。因此准确评估细胞AQP功能状态、用于研发靶向AQP的阻断剂、抑制剂乃至激动剂是当前肿瘤靶向治疗和成像的热点所在。
细胞AQP功能评估主要通过测量水分子在胞外渗透压变化情况下透过胞膜的转运情况，宏观表现为细胞的体积和水含量改变。基于此目前评估细胞AQP功能方法有光散射法、显微图像测量法、光干涉法、离子浓度敏感型荧光标记等方法。光散射法受限于伪影信号产生，已较少应用；显微图像测量仅应用于表达AQP的非洲蟾蜍***在细胞溶胀过程体积改变的分析，数据变异性较大、可靠度较低；激光干涉对仪器的光束对准及振动要求较高，实用性不强。来自AQP功能研究领域领军人Verkman的研究揭示：传统基于体积测量的AQP功能评估方法可靠性较低，因而难以有效筛选真正抑制AQP功能的药物。荧光标记法则成为可靠的评估方法，其通过对生长在固体支持物上的细胞层进行胞质钙黄绿素染色或转染绿色荧光蛋白，可利用全内反射荧光平台测定渗透梯度改变时荧光信号的变化获得细胞容量动力学改变参数，具有伪影误差小、光漂白效应低及结果稳定性高的显著优势。但其仍是有标记检测，会损伤细胞活性；且由于倏逝波穿透深度限制，仅能获得亚微米尺度的细胞层部分信息。综上，目前尚缺乏一种无标记、可靠的细胞AQP功能评估方法。
太赫兹(Terahertz，THz)波技术是一种新型无标记检测技术。它是频率在0.1～10THz(对应波长范围为30μm-3mm)的电磁波，处于微波向红外过渡的波段，具备无标记检测的频谱优势：1THz振荡频率对应0.16皮秒转动，相较磁共振、准弹性中子散射和非相干中子散射等传统方法，THz技术无需氢氘置换或低温冷却，可将检测胞内水分子运动尺度从飞秒水平提升至皮秒及亚皮秒水平，从而实现精确、实时分析细胞内自由水和结合水的水化动力学，具备应用于细胞AQP功能实时评估的潜能。但是，THz波应用于活细胞检测仍面临THz波长(1THz～300μm)与细胞层厚度(约5～10μm)间存在的尺度失匹配问题，以及液相环境中对水强烈吸收干扰(1THz处水吸收系数约为230cm-1)等问题。目前尚无将太赫兹波技术应用于细胞AQP功能无标记评估领域的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法，具体步骤如下：
(1)构建太赫兹超材料芯片；
(2)在步骤(1)所构建的超材料芯片表面接种细胞，培养至细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层，然后采用太赫兹时域光谱仪测定等渗缓冲液中细胞层的谐振峰情况；
(3)更换低渗缓冲液，大量水分子通过水通道蛋白进入细胞内部，使得初始细胞体积增大，形成溶胀后的细胞，采用太赫兹时域光谱仪获取贴壁细胞层在渗透压变化时的谐振峰变化情况，有效反映细胞溶胀程度，即水分子通过细胞层的渗透状况，并根据实时响应曲线求得达到最大响应值所需时间的倒数，实现细胞水通道蛋白功能情况的无标记评估。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：以双面抛光的高阻硅为基底，在其表面依次溅镀上两层金属膜，然后在金属膜上刻蚀出对太赫兹波极化方向不敏感的狭缝结构，使得狭缝的底部为高阻硅。
作为进一步优选的技术方案之一，所述金属膜的材质选自金、钛、银、铜、铝或镍中的任一种。
作为进一步优选的技术方案之一，所述狭缝结构选自圆环形、方形或十字交叉形中的任一种。
作为进一步优选的技术方案之一，以双面抛光的高阻硅为基底，在其表面依次溅镀上20nm钛膜和200nm金膜，然后利用紫外光刻技术在金膜上刻蚀出圆环形狭缝周期结构，使得狭缝的底部为高阻硅，其中，高阻硅的厚度为500μm，电阻率大于10000Ω·cm，圆环的外直径为80μm，内直径为72μm，环宽(缝隙)为4μm，周期为120μm。此处狭缝尺寸与细胞尺寸相匹配，也可进行调整。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，在接种细胞前先对超材料芯片进行清洗处理，具体方法是：先使用无水乙醇清洗超材料芯片，再使用美国Harrick等离子清洗机处理3分钟，接着在超纯水中浸泡10分钟后，最后使用氮气吹干超材料芯片；其中，所述等离子清洗机的功率为100W，真空度为0.3mBar。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，接种细胞的具体方法是：将配置好的细胞悬液滴加在超材料芯片表面，并加入相应的培养基后，放置于细胞培养箱中生长，待细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层后，从培养箱中取出超材料芯片即可。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，接种细胞后的超材料芯片利用AQP阻断剂处理，进一步优选为使用对氯汞苯磺酸盐(p-chloromercuribenzene sulphonate,pCMBS)溶液处理20分钟。pCMBS是已报道的可靠AQP功能阻断剂，可以抑制细胞膜表面AQP的功能。相对应的THz超材料芯片测量结果：经过pCMBS处理后MCF-7细胞在低渗透压环境下，谐振峰实时信号变化程度远低于未经过任何处理的对照组信号，且pCMBS处理组细胞的1/t值显著低于对照组。经与FDTD模拟分析细胞水含量变化时超材料芯片谐振响应趋势相对比，充分说明经过pCMBS处理后MCF-7细胞的溶胀程度减弱，溶胀速度降低，所需时间延长，经由AQP的水分子转运功能被抑制。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)在超材料芯片表面滴加PBS溶液，采集并保存初始细胞的太赫兹光谱信号；步骤(3)向超材料芯片表面滴加超纯水并混匀形成低渗环境，进行太赫兹光谱测量。
作为进一步优选的技术方案之一，低渗环境下的太赫兹光谱测量结束后，消化解离超材料芯片表面细胞，清洗超材料芯片表面，吹干，放置于太赫兹检测光路中并滴加PBS溶液，获取PBS溶液的谐振峰响应。
作为进一步优选的技术方案之一，提取细胞不同反应时相点的时域光谱信号中来自超材料芯片表面反射的第二个峰信息，进行快速傅里叶变换分析，计算不同时相点的超材料芯片的反射率并求得Log(1/R)值，用于反映细胞内水含量的实时变化，将不同时相点的反射Log(1/R)值与初始值相减，可获得细胞溶胀过程的芯片实时响应变化图，计算出达到最大变化值时所需时间倒数(1/t)，用于表示细胞的水通道蛋白功能抑制情况，即细胞膜相对水通透能力。
作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，太赫兹时域光谱仪的检测方法为：选用THz时域光谱仪的反射模块进行检测，提前1小时开机并充入干燥空气，维持光路中湿度在3％以下，首先测量无任何狭缝结构的镀金膜硅片的反射光谱信号，光谱平均128次，作为参考信号；而后将超材料芯片水平放置于THz检测光路，使THz光斑对准中央检测区域，在芯片表面滴加PBS溶液，平均128次采集并保存初始细胞的THz光谱信号。
作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：向超材料芯片表面滴加同等体积超纯水并混匀以形成渗透压为150mOsm/L的低渗环境，立即开始THz光谱测量，平均128次，时间间隔1秒，连续采集50次反射时域光谱信号；测量结束后，使用胰酶-EDTA消化解离芯片表面细胞，依次用无水乙醇、超纯水清洗超材料芯片表面，氮气吹干后，放置于THz检测光路中并滴加PBS溶液，平均128次获取PBS溶液的谐振峰响应。
本发明的工作原理：
图1右侧为经FDTD(时域有限差分法)模拟分析上述结构参数下圆环狭缝形超材料芯片的电场分布图；入射THz波可激发圆环狭缝处的共振电场，增强的共振电场从狭缝底部沿Z轴方向快速衰减，趋肤深度为1.5μm，垂直分布高度接近10μm。同时，申请人使用FDTD分析建模，在THz反射模式下的超材料芯片表面添加10μm厚的细胞层和500μm厚的液体层作为液相细胞检测模型，并单纯使用510μm厚的液体层作为背景信号检测模型。细胞层和液体层复折射率参数根据已发表文献中数据(Shiraga K,Ogawa Y,Suzuki T,et al.AppliedPhysics Letters,2013,102(5):053702.Zhao X,Zhang M,Wei D,et al.[J].BiomedicalOptics Express,2017,8(10):4427-4437.)。细胞和PBS溶液的复折射率差异主要集中于复折射率虚部即消光系数，主要影响超材料芯片谐振峰强度差异，如图2模拟结果所示，液相细胞层的谐振峰强度明显高于PBS溶液层的谐振峰强度，而无明显共振频率位移改变。
申请人假定细胞溶胀过程进入水分子均为自由水，且进入胞内的自由水体积(ΔV流入水)即为细胞溶胀过程增加的体积，采用基于等效介质理论的二元模型可得此溶胀过程中的细胞层复折射率虚部值，即公式1。采用FDTD分析细胞AQP功能评估过程中胞内水含量变化时超材料芯片的响应变化。结果如图4所示，细胞层在水含量变化百分比增加时，超材料芯片的反射谐振峰强度逐渐降低，并逐渐靠近PBS溶液背景的信号。进一步对谐振峰强度变化情况与水含量变化百分比进行线性拟合，结果如图5所示，线性方程为线性相关性较好(R2为0.99874)。因而，本发明所采用THz超材料反射光谱实时获取贴壁细胞层在渗透压变化时的谐振峰变化情况，可有效反映细胞溶胀程度，即水分子通过细胞层的渗透状况，并可根据实时响应曲线求得达到最大响应值所需时间的倒数(1/t)，实现细胞AQP功能情况的无标记评估。
其中，κ溶胀细胞为溶胀过程中细胞的复折射率虚部，κ细胞为初始细胞的复折射率虚部，κ自由水为自由水的复折射率虚部，ΔV流入水为实时进入胞内的自由水总体积，V初始细胞为细胞的初始体积。
本发明的有益效果在于：
本发明所构建的太赫兹超材料芯片，其传感原理基于超强光透射现象：即太赫兹波与狭缝结构达到波矢完全匹配时的谐振峰频率与狭缝附近等效折射率变化相关。THz波与超材料芯片相互作用，特别是与具有周期性亚波长金属结构的超材料芯片相互作用，将产生数微米尺度的局域增强电场，可有效解决THz波细胞检测面临尺度失匹配问题。同时，结合THz反射光谱的超材料芯片可克服细胞培养基等液体强吸收干扰，有效获取液相环境中细胞层的介电响应信息。
本申请首次公布一种基于THz超材料反射光谱技术测量液相环境下细胞层水含量变化的方法，巧妙利用THz波对水强烈吸收特性，用于对微米级别细胞层水含量变化的敏感响应，并根据THz波段内细胞和水在复折射率虚部的差异特点选择超材料谐振峰幅值参数，作为反映胞外渗透压变化过程中细胞内水含量的变化程度的指标，可用于对细胞AQP功能的无标记、实时评估。具备以下突出优势：
1.无需标记，不需借助任何荧光染色或荧光蛋白转染的方法，简便快捷且对细胞不产生任何损伤，可有效评估细胞AQP的功能状态；
2.全细胞尺度检测，超材料的局域增强电场在垂直方向分布近10μm，可获取整个细胞层的介电响应变化；
3.灵敏度高，THz波对水含量变化十分敏感，可实时获取细胞层微弱的水含量变化。
综上，本专利提出的基于太赫兹超材料反射光谱技术可无标记、实时评估细胞AQP功能状态，可用于相关靶向AQP药物的高通量筛选。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为圆环狭缝形超材料芯片的示意图及电场分布图；
图2为FDTD模拟分析细胞层和PBS溶液在超材料芯片上的响应；
图3为超材料芯片无标记检测细胞AQP功能(低渗环境下溶胀过程)示意图；
图4为FDTD模拟分析超材料芯片上细胞层水含量百分比变化过程响应图；
图5为FDTD模拟分析超材料芯片响应变化与对应细胞层水含量百分比变化的线性拟合图；
图6为低渗环境下pCMBS处理组和对照组的MCF-7细胞在超材料芯片上实时响应变化；
图7为低渗环境下pCMBS处理组和对照组的MCF-7细胞达到最大响应值所需时间的倒数(1/t)对比图；
其中，1为金膜，2为硅基底，3为细胞(接种初始状态)，4为等渗缓冲液，5为溶胀后的细胞，6为低渗缓冲液。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
以下人乳腺癌细胞(MCF-7)的AQP功能检测为例说明本发明的评估方法，需要说明的是，本发明并不局限于该种特定细胞。
1、细胞培养：在高糖型DMEM培养基中加入体积百分数为10％胎牛血清、并加入体积百分数为1％的青霉素链霉素双抗工作液(Gibco，货号15140163)形成完全培养基，细胞培养箱温度设定为37℃、二氧化碳体积分数为5％，待培养瓶中MCF-7细胞(上海生工生物工程股份有限公司，货号D611026-0001)融合度达到85％左右时，以胰蛋白酶-EDTA消化液(其中胰酶质量浓度为0.25％，EDTA质量浓度为0.02％)在培养箱中消化2分钟，待细胞逐渐脱落(培养瓶呈毛玻璃样)时，加入以上所使用的完全培养基终止消化，并反复吹打获取细胞悬液，离心重悬后配置成浓度为1×106个细胞/mL悬液备用。
2、接种细胞：使用无水乙醇清洗六块同批次制作的超材料芯片，并使用美国Harrick等离子清洗机处理3分钟(功率为100W、真空度为0.3mBar)，在超纯水中浸泡10分钟后，使用氮气吹干超材料芯片。将配置好的MCF-7细胞悬液滴加在超材料表面，并向细胞培养皿中加入3mL完全培养基后，放置于细胞培养箱中生长。待细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层后，从培养箱中取出超材料芯片，将其均分为处理组和对照组。处理组使用1mM AQP阻断剂-对氯汞苯磺酸盐(p-chloromercuribenzene sulphonate,pCMBS)溶液处理20分钟后取出，而对照组不采取任何处理，全部芯片使用PBS缓冲液(其中NaCl 136.89mM,KCl2.67mM,Na2HPO4 8.1mM,KH2PO4 1.76mM；PH为7.4)清洗两次后备用。如图3所示，在加工完成的超材料芯片(包括：金膜1、硅基底2)表面接种细胞3，然后按照后续步骤测定等渗缓冲液4中细胞层的谐振峰情况。
3、THz检测：选用THz时域光谱仪的反射模块进行检测，提前1小时开机并充入干燥空气，维持光路中湿度在3％以下，首先测量无任何狭缝结构的镀金膜硅片的反射光谱信号，光谱平均128次，作为参考信号。而后将超材料芯片水平放置于THz检测光路，使THz光斑对准中央检测区域，在芯片表面滴加PBS溶液，平均128次采集并保存初始细胞的THz光谱信号。如图3所示，更换低渗缓冲液6，大量水分子通过AQP进入细胞内部，使初始细胞体积增大，形成溶胀后的细胞5，具体方法是：向超材料芯片表面滴加同等体积超纯水并混匀以形成渗透压为150mOsm/L的低渗环境，立即开始THz光谱测量，平均128次，时间间隔1秒，连续采集50次反射时域光谱信号。测量结束后，使用以上所使用的胰酶-EDTA消化液解离芯片表面细胞，依次用无水乙醇、超纯水清洗超材料芯片表面，氮气吹干后，放置于THz检测光路中并滴加PBS溶液，平均128次获取PBS溶液的谐振峰响应。使用同样方法获取全部芯片的测量结果。
4、结果分析：提取两组细胞不同反应时相点的时域光谱信号中来自超材料芯片表面反射的第二个峰信息，进行快速傅里叶变换分析，以镀金膜硅片信号为参考，计算不同时相点的超材料芯片的反射率R并求得Log(1/R)值。将不同时相点的反射Log(1/R)值与初始值相减，可获得细胞溶胀过程的芯片实时响应变化图，如图6所示。超材料芯片的反射Log(1/R)值可反映MCF-7细胞内水含量的实时变化，计算出达到最大变化值时所需时间倒数(1/t)用于表示MCF-7的AQP功能抑制情况，即细胞膜相对水通透能力，如图7所示。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.基于太赫兹波技术的无标记评估水通道蛋白功能的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建太赫兹超材料芯片；
(2)在步骤(1)所构建的超材料芯片表面接种细胞，培养至细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层，然后采用太赫兹时域光谱仪测定等渗缓冲液中细胞层的谐振峰情况；
(3)更换低渗缓冲液，大量水分子通过水通道蛋白进入细胞内部，使得初始细胞体积增大，形成溶胀后的细胞，采用太赫兹时域光谱仪实时获取贴壁细胞层在渗透压变化时的谐振峰变化情况，有效反映细胞溶胀程度，即水分子通过细胞层的渗透状况，并根据实时响应曲线求得达到最大响应值所需时间的倒数，实现细胞水通道蛋白功能情况的无标记评估。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：以双面抛光的高阻硅为基底，在其表面依次溅镀上两层金属膜，然后在金属膜上刻蚀出对太赫兹波极化方向不敏感的狭缝结构，使得狭缝的底部为高阻硅。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，在接种细胞前先对超材料芯片进行清洗处理，具体方法是：先使用无水乙醇清洗超材料芯片，再使用美国Harrick等离子清洗机处理3分钟，接着在超纯水中浸泡10分钟后，最后使用氮气吹干超材料芯片；其中，所述等离子清洗机的功率为100W，真空度为0.3mBar。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，接种细胞的具体方法是：将配置好的细胞悬液滴加在超材料芯片表面，并加入相应的培养基后，放置于细胞培养箱中生长，待细胞贴壁生长并完全融合成单细胞层后，从培养箱中取出超材料芯片即可。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，接种细胞后的超材料芯片利用AQP阻断剂处理。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)在超材料芯片表面滴加PBS溶液，采集并保存初始细胞的太赫兹光谱信号；步骤(3)向超材料芯片表面滴加超纯水并混匀形成低渗环境，进行太赫兹光谱实时测量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，低渗环境下的太赫兹光谱实时测量结束后，消化解离超材料芯片表面细胞，清洗超材料芯片表面，吹干，放置于太赫兹检测光路中并滴加PBS溶液，获取PBS溶液的谐振峰响应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，提取细胞不同反应时相点的时域光谱信号中来自超材料芯片表面反射的第二个峰信息，进行快速傅里叶变换分析，计算不同时相点的超材料芯片的反射率并求得Log(1/R)值，用于反映细胞内水含量的实时变化，将不同时相点的反射Log(1/R)值与初始值相减，可获得细胞溶胀过程的芯片实时响应变化图，计算出达到最大变化值时所需时间倒数(1/t)，用于表示细胞的水通道蛋白功能抑制情况，即细胞膜相对水通透能力。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，太赫兹时域光谱仪的检测方法为：选用THz时域光谱仪的反射模块进行检测，提前1小时开机并充入干燥空气，维持光路中湿度在3％以下，首先测量无任何狭缝结构的纯镀金膜硅片的反射光谱信号，光谱平均128次，作为参考信号；而后将超材料芯片水平放置于THz检测光路，使THz光斑对准中央检测区域，在芯片表面滴加PBS溶液，平均128次采集并保存初始细胞的THz光谱信号。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：向超材料芯片表面滴加同等体积超纯水并混匀以形成渗透压为150mOsm/L的低渗环境，立即开始THz光谱测量，平均128次，时间间隔1秒，连续采集50次反射时域光谱信号；测量结束后，使用胰酶-EDTA消化解离芯片表面细胞，依次用无水乙醇、超纯水清洗超材料芯片表面，氮气吹干后，放置于THz检测光路中并滴加PBS溶液，平均128次获取PBS溶液的谐振峰响应。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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