CN110029080A - 一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用 - Google Patents

一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用，本发明的基因工程菌能有效降解有机磷农药中的甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷，按照降解效率排序依次为甲基对硫磷＞杀螟松＞辛硫磷；在无机盐培养基中完全降解甲基对硫磷25mg/L、50mg/L、100mg/L所需时长分别为60h、68h、76h；且mpd基因的转入并未影响固氮施氏假单胞菌L38‑1的固氮酶活性。

Description

一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用。
背景技术
有机磷农药是一种产量大(占到农药总产量的80％)，应用广的酯类杀虫剂，广泛应用于农业生产、植物保护过程中。对水稻、棉花、玉米等农作物上的多种害虫杀灭效果显著，有效保障了农作物的产量。但它对人类和非目标有机体的危害巨大，我们施用的有机磷农药有约80％～90％进入到环境中造成了土壤、地表水和地下水的污染，同时粮食、蔬菜、水果中的有机磷农药残留也在威胁着人们的健康。
有机磷农药的降解方法主要有：化学降解，铁/炭微电解属电化学还原、氧化分解(电催化氧化处理、芬顿氧化法、湿式氧化法)等；物理降解，包括超声波技术、吸附和电离辐射等；生物降解包括微生物、植物降解等。相比于物理化学方法及植物降解，利用微生物分泌的有机磷降解酶，水解磷酸酯键降低有机磷农药的毒性，成本低，无二次污染，为消除有机磷农药造成的生态破坏提供了更好的途径。
目前用于降解有机磷农药菌株的获得主要途径还是通过筛选手段，筛选获得含有甲基对硫磷水解酶基因的野生菌。近年来也有利用基因工程手段克隆得到mpd基因，将其转入受体菌，使该菌获得水解有机磷农药的能力，但选用的受体菌都为大肠杆菌或酵母菌。这两种方法：筛选野生菌带有盲目性，工作量大；大肠杆菌和酵母菌都是模式菌株，作为受体菌技术成熟，成功率高，但是这两类菌都不是土壤中的优势菌，在野外存活率低，实际应用存在问题。
因此，提供一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及其构建方法，以及其在有机磷农药降解中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用，该固氮基因工程菌能有效降解有机磷农药。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌，所述固氮基因工程菌为L38-1/pME6032-mpd，所述固氮基因工程菌的保藏编号为CGMCC No.17303，保藏时间为2019年03月04日。
L38-1/pME6032-mpd为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.17303，保藏日期2019年03月04日。
进一步，一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)合成mpd基因，所述mpd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)构建表达载体：将合成的mpd基因与质粒pME6032酶切连接，构建重组载体pME6032-mpd；
(3)将重组载体pME6032-mpd热激转化至大肠杆菌DH5α中，经抗性筛选获得阳性菌落；
(4)提取重组质粒pME6032-mpd，将其电转化进固氮施氏假单胞菌L38-1中，经抗性筛选获得阳性菌株L38-1/pME6032-mpd。
进一步，所述抗性为四环素，所述四环素的浓度为5μg/ml。
进一步，所述电转化的条件为2.5kv，4ms。
进一步，一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌在降解有机磷农药中的应用。
进一步，所述有机磷农药为甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用，本发明的基因工程菌能有效降解有机磷农药中的甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷，按照降解效率排序依次为甲基对硫磷＞杀螟松＞辛硫磷；在无机盐培养基中完全降解甲基对硫磷25mg/L、50mg/L、100mg/L所需时长分别为60h、68h、76h。本发明中所用受体菌本身为水稻根际分离得到的共生固氮菌，固氮施氏假单胞菌L38-1，能适应较广的生长温度及pH值，因此具有较强的抗逆性，常用于污染环境的环境修复，该菌与mpd来源均是假单胞菌属，所以能更好的的保证甲基对硫磷水解酶异源表达的酶活，同时该菌具有较强的固氮活性，可促进农作物的生长；mpd基因的表达使该菌具有有机磷农药降解功能，降低土壤中有机磷农药的残留，进而提高该固氮菌对有机磷农药的耐受性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明重组质粒结果验证电泳图；
其中，1，为从工程菌中抽提出的重组质粒；2，为重组质粒经SmaI单酶切后电泳结果；3，为DNA Marker；
图2附图为本发明工程菌在无机盐培养基中降解甲基对硫磷产生对硝基苯酚的动力学曲线；
其中，甲基对硫磷的浓度梯度为25mg/L、50mg/L、100mg/L；阴性对照(negtive)为野生菌L38-1在含有50mg/L甲基对硫磷无机盐培养基中，其它条件完全一致；空白(blank)中以无菌水代替菌液，甲基对硫磷含量为50mg/L，其它条件完全一致；
图3附图为本发明工程菌在无机盐培养基中降解杀螟松产生3-甲基-4硝基苯酚的动力学曲线；
其中，杀螟松的浓度梯度为100mg/L、500mg/L、1000mg/L；阴性对照(negtive)为野生菌L38-1在含有100mg/L杀螟松无机盐培养基中，其它条件完全一致；空白(blank)中以无菌水代替菌液，杀螟松含量为100mg/L，其它条件完全一致；
图4附图为本发明工程菌在无机盐培养基中降解辛硫磷产生苯乙酮肟的动力学曲线；
其中，辛硫磷的浓度梯度为100mg/L、500mg/L、1000mg/L；阴性对照(negtive)为野生菌L38-1在含有100mg/L辛硫磷的无机盐培养基中，其它条件完全一致；空白(blank)中以无菌水代替菌液，辛硫磷含量为100mg/L，其它条件完全一致；
图5附图为本发明总蛋白含量测定时所使用的标准曲线，以1mg/ml的牛血清蛋白配制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调pH至7.0，去离子水定容到1000ml，121℃灭菌20分钟。
无机盐培养基(g/L)：K2HPO4 0.2g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·H2O0.1g，NaMoO4·2H2O 0.003g，FeSO4·7H2O 0.005g，(NH4)2SO4，1.0g，pH 7.2，去离子水定容到1000ml；固体培养基加入1.5％琼脂，121℃灭菌20分钟。
本发明所用到的阿斯毕无氮培养基(g/L):甘露醇(或蔗糖、葡萄糖)10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，CaCO3 5g，琼脂20g，去离子水定容到1000ml；121℃灭菌30分钟。
固氮施氏假单胞菌L38-1购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号ACCC06513。
L38-1/pME6032-mpd为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.17303，保藏日期2019年03月04日。
实施例1产甲基对硫磷水解酶的固氮施氏假单胞菌工程菌的构建
1)构建重组表达载体
(1)mpd基因获得
以NCBI上甲基对硫磷水解酶(Mevalonate Pyrophosphate Decarboxylase，MPD)基因的核苷酸序列为模板，合成得到mpd目的片段，序列如SEQ ID NO.1所示。
(2)连接、转化与筛选
将mpd基因和载体pME6032分别用内切酶EcoR I和Kpn I双酶切后，再按照目的基因：载体＝5:1(摩尔比)加样后，加入T4 DNA连接酶，16℃连接16h。向100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中加入10μL连接产物，采用热激法进行转化。利用四环素LB平板(5μg/mL)筛选抗性单菌落。随机选取10～20单菌落进行菌落PCR验证，提取阳性菌落的质粒，结果如图1所示；经SmaI单酶切再次验证后，送测序公司测序，序列正确的重组质粒命名为pME6032-mpd。
2)构建固氮施氏假单胞菌工程菌
制备固氮施氏假单胞菌L38-1感受态细胞，通过电激转化法将pME6032-mpd转入L38-1中，转化参数：2.5kv，4ms。阳性转化子采用含5μg/mL四环素的LB平板筛选获得，命名为L38-1/pME6032-mpd。
实施例2重组菌L38-1/pME6032-mpd与对照菌有机磷农药降解实验
1)待测样品准备
挑取L38-1/pME6032-mpd单菌落及L38-1单菌落(对照菌)接入LB液体培养基中，于35℃，180rpm/min过夜培养。取相同OD600＝1.8的上述种子液2ml，接种于22ml含有有机磷农药的无机盐培养基中，有机磷农药的种类和浓度如表1所示。180rpm/min，35℃培养，每隔4小时取样一次，置于冰箱-20℃保存，待测前10000rpm/min离心，取上清过0.45μm滤膜备用。
表1
2)制作标准曲线
3)HPLC检测条件及结果分析
色谱条件Agilent L260色谱柱：Agilent Eclipse C18柱(1.8μm，3.0mm×10cm)；流动相：30％水(A相)和70％甲醇(B相)；流速：1mL/min；柱温：30℃，进样量：5.0μL。
检测结果如图2所示，野生株L38-1没有降解甲基对硫磷的能力，培养96小时仍然未检测到对硝基苯酚；工程菌L38-1/pME6032-mpd，完全降解25mg/L、50mg/L、100mg/L甲基对硫磷所用时长分别为60h、68h、76h，可以确定转入施氏假单胞菌中的mpd基因已成功表达。
同时甲基对硫磷水解酶对杀螟松和辛硫磷也有一定的降解能力，结果如图3和图4中所示；野生株L38-1没有降解杀螟松和辛硫磷的能力，培养78小时仍未检测到。其中，0小时是指将发酵后的种子液与含有农药的无机盐培养基充分混合(手动摇匀)，种子液为OD600＝1.8的菌液2ml，加入22ml无机盐培养基，菌液初始浓度较大，而且种子液是在LB培养基(最适条件)中培养得到，所以酶活性较高，在短时间内已与农药反应。
4)基因工程菌固氮酶比活力检测
(1)1nmol乙烯的标定
准备120ml血清瓶两个，标为1#瓶，2#瓶，将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100ml水(用容量瓶量取)，换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100ml；向1#瓶中注射2.24ml(标况下为2.24ml，非标准状况下，根据PV＝nRT来计算注入量)乙烯，再从1#瓶中取出lml气体注入2#瓶中，从2#瓶中取出0.1ml气体打入气相色谱仪，所显示的峰高即为lnmol乙烯的量，据此可计算出待测样品中乙烯含量。
(2)待测样品准备
菌株固氮酶活性测定采用乙炔还原法(ARA)Agilent-7890B型气相色谱仪进行测定，气相柱：Agilent cp7584 poraPLAT U(25m0.53mm20μm)。工程菌和野生株同时接入LB培养基中活化，保持生长状态一致；将活化后的各菌株接入阿斯毕液体培养基，30℃振荡培养20h；测定各菌株的OD值。从每个试管中取出适量菌液，4,000g，4℃离心10min，收集菌体。用生理盐水洗涤菌体两次，充分悬浮于阿斯毕液体培养基中，使OD600＝1.0；每个西林瓶加入18ml无氮液体培养基，接入2ml菌液，使菌液终浓度为OD600＝0.1。将每个西林瓶抽出空气10ml空气。然后注入10ml的纯乙炔，35℃，200rpm/min,培养的条件下培养12小时后，每隔12小时用微量进样器取样0.2ml，连续取样三次，取平均值。每个西林瓶中气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。
(3)固氮酶活性测定
固氮酶活性＝记录仪上乙烯峰的面积x(试管气相体积/进样量)/(1nmol标准乙烯峰的面积x反应时间)
L38-1固氮酶活性＝2850.55664×(100ml/200μl)/(175.50330x12h)＝676.758(nmol·h-1)
L38-1/pME6032-mpd固氮酶活性＝2074.66620×(100ml/200μl)/(175.50330X12h)＝492.552(nmol·h-1)
(4)反应体系蛋白含量测定
以1mg/ml的牛血清白蛋白标准曲线，配制比例如下表所示，所得标准曲线如图5所示。
y＝6.1571x-0.0086，R2＝0.9953
吸光值L38-1＝0.396；L38-1/pME6032-mpd＝0.378
测得20ml反应体系中L38-1和L38-1/pME6032-mpd中的蛋白含量分别为18.71mg和12.86mg。
(5)固氮酶比活力计算
菌体比活力(nmol·mg-1·h-1)＝固氮酶活性/菌体蛋白量(mg)
L38-1菌体比活力＝676.758/18.71mg＝36.17nmol·mg-1·h-1
L38-1/pME6032-mpd菌体比活力＝492.552/12.86mg＝38.30nmol·mg-1·h-1
最终测得L38-1固氮酶比活力为36.17nmol·mg-1·h-1，工程菌L38-1/pME6032-mpd固氮酶比活力38.30nmol·mg-1·h-1；表明mpd基因的转入并未影响固氮施氏假单胞菌L38-1的固氮酶活性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 陕西省微生物研究所
<120> 一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌及构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgcccctga agaaccgctt gctggcccgc ctgtcctgtg ttgcggccgt ggtggccgcc 60
acggccgccg ttgcaccgtt gacgctggtg tccaccgccc acgccgccgc accgcaggtg 120
cgcacctcgg cccccggcta ctaccggatg ctgctgggcg acttcgaaat caccgcgctg 180
tcggacggca cggtggcgct gccggtcgac aagcggctga accagccggc cccgaagacg 240
cagagcgcgc tggccaagtc cttccagaaa gcgccgctcg aaacctcggt caccggttac 300
ctcgtcaaca ccggctccaa gctggtgctg gtggacaccg gcgcggccgg cctgttcggc 360
cccaccctgg gccggctggc ggccaacctc aaggccgcag gctatcagcc cgagcaggtc 420
gacgagatct acatcaccca catgcacccc gaccacgtgg gcggcttgat ggtgggtgag 480
caactggcgt tcccgaacgc ggtggtgcgt gcggaccaga aagaagccga tttctggctc 540
agccagacca acctcgacaa ggccccggac gacgagagca aaggcttctt caaaggcgcc 600
atggcctcgc tgaaccccta tgtgaaggcc ggcaagttca agcctttctc ggggaacacc 660
gacctggtgc ccggcatcaa agcgctggcc agccacggcc acaccccggg ccacaccacc 720
tacgtggtcg aaagccaggg gcaaaagctc gccctgctcg gcgacctgat actcgtcgcc 780
gcggtgcagt tcgacgaccc cagcgtcacg atccagctcg acagcgacag caagtccgcc 840
gcggtggagc gcaagaaggc cttcgcggat gccgccaagg gcggctacct gatcgcggcg 900
acccacctgt cgttccccgg catcggccac atccgcgccg aaggcaaggg ctaccgtttc 960
gtgccggtga actactcggt cgtcaacccc aagtga 996

Claims (6)

1.一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌，其特征在于，所述固氮基因工程菌为L38-1/pME6032-mpd，所述固氮基因工程菌的保藏编号为CGMCCNo.17303。
2.一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)合成mpd基因，所述mpd基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)构建表达载体：将合成的mpd基因与质粒pME6032酶切连接，构建重组载体pME6032-mpd；
(3)将重组载体pME6032-mpd热激转化至大肠杆菌DH5α中，经抗性筛选获得阳性菌落；
(4)提取重组质粒pME6032-mpd，将其电转化进固氮施氏假单胞菌L38-1中，经抗性筛选获得阳性菌株L38-1/pME6032-mpd。
3.根据权利要求2所述的一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述抗性为四环素，所述四环素的浓度为5μg/ml。
4.根据权利要求2或3所述的一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述电转化的条件为2.5kv，4ms。
5.一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌在降解有机磷农药中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种产甲基对硫磷水解酶的固氮基因工程菌在降解有机磷农药中的应用，其特征在于，所述有机磷农药为甲基对硫磷、杀螟松和辛硫磷。
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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1203945A (zh) * 1998-07-03 1999-01-06 中国农业科学院原子能利用研究所 固氮斯氏假单胞菌及其菌膜的培养方法
CN101096644A (zh) * 2006-06-26 2008-01-02 谢明 施氏假单胞菌jsd-008及其对有机磷农药的降解作用
WO2009155115A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Reactive Surfaces, Ltd. Coatings and surface treatments having active enzymes and peptides
CN103451130A (zh) * 2013-07-25 2013-12-18 中国农业大学 一种固氮基因簇及其应用
CN103614410A (zh) * 2013-11-20 2014-03-05 中国农业科学院生物技术研究所 rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用
CN104388352A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 中国农业科学院研究生院 一种可同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌
CN104673823A (zh) * 2015-03-11 2015-06-03 中国农业科学院生物技术研究所 多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法
CN109554317A (zh) * 2018-12-29 2019-04-02 陕西省微生物研究所 贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防病促生中的应用
CN109735462A (zh) * 2019-01-16 2019-05-10 淮海工学院 一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心elisa方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1203945A (zh) * 1998-07-03 1999-01-06 中国农业科学院原子能利用研究所 固氮斯氏假单胞菌及其菌膜的培养方法
CN101096644A (zh) * 2006-06-26 2008-01-02 谢明 施氏假单胞菌jsd-008及其对有机磷农药的降解作用
WO2009155115A2 (en) * 2008-05-30 2009-12-23 Reactive Surfaces, Ltd. Coatings and surface treatments having active enzymes and peptides
CN103451130A (zh) * 2013-07-25 2013-12-18 中国农业大学 一种固氮基因簇及其应用
CN103614410A (zh) * 2013-11-20 2014-03-05 中国农业科学院生物技术研究所 rsmA基因在植物根表定殖和促生方面的应用
CN104388352A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 中国农业科学院研究生院 一种可同时降解毒死蜱和萘的施氏假单胞菌
CN104673823A (zh) * 2015-03-11 2015-06-03 中国农业科学院生物技术研究所 多策略叠加提高甲基对硫磷水解酶在毕赤酵母中分泌表达量的方法
CN109554317A (zh) * 2018-12-29 2019-04-02 陕西省微生物研究所 贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防病促生中的应用
CN109735462A (zh) * 2019-01-16 2019-05-10 淮海工学院 一种快速检测人畜共患病原菌气单胞菌属的双抗体夹心elisa方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU D等: "Pseudomonas stutzeri strain HS-D36 Mpd(mpd) gene,complete cds", 《GENBANK DATABASE》 *
PATTEN CHERYL L等: "Draft genome sequence of a diazotrophic,plant growth-promoting rhizobacterium of the pseudomonas syringae complex", 《MICROBIOLOGY RESOURCE ANNOUNCEMENTS》 *
天津农药厂: "《农药工业知识》", 31 December 1972 *
樊慧俐等: "斯氏假单胞菌A1501固氮新基因PST1305的功能分析", 《微生物学报》 *
虞云龙等: "一硫代磷酸酯杀虫剂的酶促降解", 《环境科学》 *
许育新等: "甲基对硫磷降解菌PF32的分离鉴定及其降解特性研究", 《农药学学报》 *
郑永良: "有机磷农药甲基对硫磷降解菌的代谢途径及酶学性质研究", 《万方》 *

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