CN110025630A - 黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用。本发明采用MTT法检测细胞活力；中性红法检测细胞吞噬能力；一氧化氮试剂盒测定NO的含量，ELISA试剂盒测定TNF‑α和IL‑6含量；qRT‑PCR法检测其对诱导型一氧化氮合酶、TNF‑α和IL‑6细胞因子mRNA表达的影响；Western blot法分析对MAPK和NF‑κB通路相关蛋白表达的影响。研究结果表明：本发明黑莓籽多糖BSP‑2能显著增强RAW264.7细胞的吞噬活性，并能浓度依赖性提高RAW264.7细胞释放NO的能力和细胞因子TNF‑α、IL‑6的水平，同时也能显著上调iNOS和TNF‑α、IL‑6 mRNA的表达，以及细胞核内p65、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平，说明其可用于免疫调节剂的制备，对免疫类新药具有一定的开发价值。

Description

黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用

技术领域：

本发明属于植物活性成分的药物医疗和保健品应用技术领域，具体涉及一种具有免疫调节作用的黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用。

背景技术：

蔷薇科悬钩子属黑莓 (Rubusspp. blackberry) 果实是果酱、糖果、葡萄酒、果汁饮料等产品的原料，富含大量的维生素和氨基酸等有益成分，具有清除自由基、延缓衰老、防治心脏病、抗癌等功效。黑莓籽是由黑莓果酒、黑莓汁等加工过程中产生，含有丰富的多酚类、多糖等天然活性成分，本申请课题组前期对其进行了生物活性试验，发现黑莓籽具有抑制α-葡萄糖苷酶活性、降血脂、抗肝损伤、抗氧化自由基、抗血栓等作用，如专利CN201510521971.5公开了一种促凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用；专利CN201510529023.6公开了一种抗凝血黑莓籽多糖及其提取分离方法、应用；专利申请CN201510995185.9公开了一种黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用。目前，与黑莓籽多糖有关的免疫活性研究还未曾报道。因此，探究黑莓籽多糖的免疫调节能力对进一步了解其生物活性具有重要意义。

发明内容：

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种具有免疫调节作用的黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用。

进一步的，上述黑莓籽多糖在制备免疫增强药物方面的应用，具体的，黑莓籽多糖用量为10-15 mg/kg每天。

上述黑莓籽多糖在制备免疫增强药物方面的应用，进一步的，黑莓籽多糖能提高细胞吞噬能力、提高细胞中NO含量、提高细胞分泌TNF-α和IL-6细胞因子含量、上调TNF-α和IL-6细胞因子mRNA表达水平，以及上调细胞核内p65、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平。

进一步优选的，上述黑莓籽多糖经下述步骤制备获得：

（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂，挥干石油醚后，药渣用乙醇提取，过滤，阴干残渣，再向残渣中加入蒸馏水提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置离心，得到的沉淀再加蒸馏水溶解透析以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

（2）取黑莓籽粗多糖溶于蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

（3）组分2溶于蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，浓缩，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-2，即为黑莓籽多糖。

BSP-2是本申请课题组前期对黑莓籽多糖纯化分离得到的纯组分之一，富集量较大，使用ToxinSensor^TMChromogenic LAL Endotoxin Asssay Kit检测其内毒素含量，结果显示未超标。

本发明进行了如下黑莓籽多糖的免疫调节应用的验证实验：

1）RAW264.7细胞毒活性检测；

2）采用一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞内NO含量；

3）采用酶联免疫法（ELISA）检测TNF-α和IL-6细胞因子含量；

4）实时定量PCR法检测iNOS、TNF-α和IL-6细胞因子mRNA表达水平；

5）Western blot法分析细胞核内p65、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平。

本发明经常规实验验证后，发现：黑莓籽多糖BSP-2可以刺激细胞分泌大量的促炎症介质，并且激活了MAPK和NF-κB信号通路，说明黑莓籽纯组分多糖具有免疫调节作用，可用于免疫调节剂或药物的制备，对免疫类新药具有一定的开发价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明通过大量研究和试验发现了黑莓籽多糖BSP-2的一种新用途。本发明研究结果表明：与空白对照组相比，黑莓籽多糖BSP-2能显著增强RAW264.7细胞的吞噬活性，并能浓度依赖性提高RAW264.7细胞释放NO的能力和细胞因子TNF-α、IL-6的水平。同时，BSP-2也能显著上调iNOS和TNF-α、IL-6 mRNA的表达，以及细胞核内p65、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平。说明本发明黑莓籽多糖能够激活MAPK和NF-κB信号通路，促进细胞大量分泌促炎因子，吞噬和消灭外来病原菌，激活细胞的免疫功能，起到免疫调节的功效。因此，本发明黑莓籽多糖可被用于制作免疫增强剂，对免疫类新药具有一定的开发价值。

附图说明：

图1为BSP-2对RAW264.7细胞的细胞活力及吞噬能力的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图2为 BSP-2对RAW264.7细胞分泌NO及iNOS mRNA表达的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图3为BSP-2对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；

图4为BSP-2对RAW264.7细胞内p65、p38、ERK和JNK蛋白表达的影响；注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001；与BSP-2比较，^# P<0.05，^## P<0.01，^### P < 0.001。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述应用试验中，所用黑莓籽多糖BSP-2可参照专利申请（CN201510995185.9一种黑莓籽多糖在制备抗血栓药物方面的应用）制备获得，具体描述如下：

1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂3次，挥干石油醚后，用70V%乙醇提取3次，过滤，阴干残渣，然后按料液比为20mL/g的比例加入蒸馏水，80℃下提取3次，每次3h。趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，用95V%乙醇调至乙醇的终浓度为70V%，4℃静置24h后离心（10000r/min，10min），得到的沉淀加蒸馏水溶解透析（48h，每4h换一次蒸馏水）以除去小分子杂质，减压浓缩、冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

2）取300mg的黑莓籽粗多糖溶于10mL蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱中(2.5×60cm)，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度。以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品。透析、浓缩后冷冻干燥。其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

3）称取70mg组分2溶于5mL蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱中(1.5×100cm)，用蒸馏水进行洗脱（洗脱流速为0.5mL/min，每管2mL）采用苯酚-硫酸法进行检测，检测490nm处的吸光度。以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得单一洗脱峰，浓缩，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-2；即为黑莓籽多糖。

应用实施例黑莓籽多糖BSP-2对RAW264.7细胞的免疫调节及机制研究

1.实验细胞

RAW264.7细胞（小鼠单核巨噬细胞），购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2.仪器与试剂

二氧化碳细胞培养箱（Thermo scientific）

96孔、24孔、6孔细胞培养板（corning）

倒置显微镜（Nikon ECLiPSE TS100）

离心机沉淀器（上海手术器械厂）

分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）

全波长酶标仪（Thermo Fisher）

梯度PCR仪（MyCyclerTMThermal Cycler）

7500 Real Time PCR System（实时荧光定量PCR）（Thermo Fisher）

多色荧光、化学发光和可见光成像仪（ProteinsiMpleFluorcheM Q）

微型台式冷冻离心机（D-37520 TherMo）

电泳仪（EPS600 Tanon）

MiNi-PROTEAN Tetra SysteM（BIO-RAD）

改良Eagle培养基（DMEM）（Solarbio）

青链霉素混合液（Solarbio）

澳洲胎牛血清（FBS）（gibco）

脂多糖(LPS)（Sigma）

PBS漂洗缓冲液（博士德）

噻唑蓝（MTT）（华蓝化学）

吐温20（华蓝化学）

二甲基亚砜(DMSO)（Sigma）

0.075 %中性红溶液 （Solarbio）

PMSF（苯甲基磺酰氟）（Solarbio）

一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所）

酶联免疫试剂盒（ELISA）（南京森贝伽生物科技有限公司）

Trizol Reagent（康为世纪生物科技有限公司）

DEPC处理水（Solarbio）

PCR引物（Thermo Fisher）

PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa）、

TB GreenTM Ex TaqTMⅡ(TliRNadeH Plus),Bulk试剂盒（TaKaRa）

ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Asssay Kit（GenScript）

BCA蛋白质定量试剂盒（Solarbio）

核蛋白提取试剂盒（Solarbio）

蛋白酶磷酸酶抑制剂（Solarbio）

5×蛋白上样缓冲液（Solarbio）

彩虹180广谱Marker（Solarbio）

脱脂奶粉（Amresco）

PVDF膜（Solarbio）

Goat Anti-Rabbit lgG,HRP conjugated（康为世纪生物科技有限公司）

ECL超敏发光液（Solarbio）

抗体NF-κB p65、phospho-NF-κB p65、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、SAPK/JNK、phospho-SAPK/JNK、p44/p22 MAPK（ERK1/2）、phospho-p44/p22 MAPK（ERK1/2）（Cellsignaling technology）

PDTC (NF-κB抑制剂)、PD98059 (ERK抑制剂)、

SP600125 (JNK抑制剂)、SB203580 (p38 抑制剂)（Sigma-Aldrich）。

3.实验方法

（1）细胞培养

将RAW264.7细胞在37 ℃、5% CO₂的培养箱中用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养，待细胞密度达到80%左右时进行传代。用吹打管小心吹打瓶壁上细胞，将细胞悬液转移至玻璃小瓶中，继续用移液枪充分吹散至单个细胞，最后转移至细胞培养瓶中。

（2）MTT法检测RAW264.7细胞的活力

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中（1×10⁴个/孔），在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，将BSP-2从600 µg/mL等梯度稀释5个浓度，空白对照组给予DMEM培养基，每个浓度组设6个复孔。然后在培养箱内孵育24小时后，每孔加入10 µL MTT溶液，继续孵育4小时，用移液枪吸弃上清，再加入DMSO进行溶解，避光反应数分钟后，设定酶标仪波长为490 nm，测定其吸光度值。

（3）中性红法检测RAW264.7细胞的吞噬能力

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中（1×10⁵个/孔），在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，加入37.5、75、150和300 µg/mL BSP-2溶液各100 µL，空白对照组给予DMEM培养基，阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设6个复孔。培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，用PBS溶液轻洗两次，每孔加入浓度为0.075 %的中性红溶液，继续孵育1小时后，从培养箱中拿出，小心弃去上清液，用PBS溶液轻洗两次，甩干，每孔加入冰醋酸-无水乙醇（1:1, V:V）细胞裂解液100 µL，设定酶标仪波长为540 nm，测定吸光度值。

（4）一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞释放的NO含量

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板中（1×10⁵个/孔），在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，加入37.5、75、150和300 µg/mL BSP-2溶液，空白对照组给予DMEM培养基，阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。培养箱内孵育24小时后，收集培养液上清，按照所购试剂盒说明书测定NO的含量。

（5）ELISA法检测RAW264.7细胞分泌TNF-α 和IL-6的含量

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中（2×10⁶个/孔），在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，加入37.5、75、150和300 µg/mL BSP-2溶液，空白对照组给予DMEM培养基，阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。37℃、5%CO₂培养箱内继续孵育1小时后，移液枪吸弃培养基上清，用PBS溶液轻洗两次，收集细胞到EP管中，2000 g离心5分钟，弃去PBS上清，每管重新加入100 µL PBS溶液，充分混匀，超声1小时，4 ℃ 12000 g离心10分钟，吸取上清，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α和IL-6的含量。

（6）实时定量PCR法检测iNOS、TNF-α 和IL-6 mRNA表达

将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中（2×10⁶个/孔），在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，加入37.5、75、150和300 µg/mL BSP-2溶液，空白对照组给予DMEM培养基，阳性对照组给予1 µg/mL LPS，每组设4个复孔。培养箱内继续孵育12小时后，用移液枪吸弃培养基上清，用PBS溶液轻洗2次。使用Trizol试剂提取总RNA，再通过实时荧光定量PCR测定各引物表达强度。

（7） Western blot 检测NF-κB和MAPK通路的影响

方法一：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板中（4×10⁶个/孔），培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，加入37.5、75、150和300 µg/mL BSP-2溶液，空白对照组给予DMEM培养基，阳性对照组给予1 µg/mL的LPS，每组设4个复孔。37℃，5%CO₂培养箱内继续孵育30分钟后，从培养箱中拿出，弃去培养基上清，用PBS溶液轻洗2次，收集至1.5 mL EP管中，-20℃保存。

方法二：使用PDTC（30 µM）、PD98059（30 µM）、SP600125（3 µM）、SB203580（10 µM）预处理30分钟后，加入ADPs-1a和ADPs-3a继续孵育30分钟，同上，收集细胞。

按照核蛋白提取试剂盒的说明书提取核蛋白，以裂解液：PMSF：蛋白酶抑制剂=100：1：1的比例配制浆蛋白裂解液，依据EP管中细胞量加入适量浆蛋白裂解液，充分涡旋，冰上裂解10 min，涡旋10 s，4 ℃12000g离心10分钟，取上清于干净的EP管中。同上，配制核蛋白裂解液，裂解管底沉淀后，收集上清即为核蛋白，-20℃保存。然后使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后通过孵育抗体，进行显影。

数据分析

以上实验均进行多次重复，实验结果进行统计学分析使用SPSS 19.0软件，数据表示为平均值±标准差，并使用t检验或单向ANOVA分析，P<0.05时有统计学意义。

试验结果

1.BSP-2对RAW264.7细胞活力及吞噬能力的影响

采用MTT法检测BSP-2对RAW264.7细胞活力的影响，图1给出了BSP-2对RAW264.7细胞的细胞活力及吞噬能力的影响。如图1A所示，BSP-2浓度低于300µg/mL时明显促进了RAW264.7细胞的增殖，浓度为600 µg/mL时产生了细胞毒性，抑制了细胞活力。因此，选择浓度37.5~300 µg/mL作为BSP-2的试验剂量范围。

采用中性红法检测BSP-2对RAW264.7细胞吞噬能力的影响，如图1B所示，与空白对照组（图中为control，下同）相比，LPS与各浓度BSP-2均能够提高RAW264.7细胞吞噬中性红的能力，具有统计学差异(P<0.001)。这表明BSP-2能够显著增加 RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性。

2.BSP-2对RAW264.7细胞分泌NO及iNOS mRNA表达的影响

图2给出了BSP-2对RAW264.7细胞分泌NO及iNOS mRNA表达的影响。如图2A所示，与空白对照组相比，阳性对照组LPS显著提高了RAW264.7细胞内NO含量，各浓度的BSP-2也明显提高了细胞释放NO的能力(P<0.001)。如图2B所示，BSP-2在300µg/mL和150 µg/mL浓度下能显著上调iNOS的基因表达(P<0.001)。由此可知，BSP-2刺激RAW264.7细胞大量释放NO可能与上调iNOS的基因表达有关。

3.BSP-2对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平的影响

图3给出了BSP-2对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6及mRNA表达水平的影响。如图3A所示， BSP-2在37.5~300 µg/mL浓度范围内明显增加了RAW264.7细胞内TNF-α含量，且在浓度75 µg/mL时达到高峰，具有极显著性差异(P<0.001)。如图3B所示，与空白对照组相比，各剂量的BSP-2均能显著增加细胞内IL-6含量(P<0.001)。qRT-PCR结果如图3C和3D所示，在37.5~300 µg/mL浓度范围内，TNF-α和IL-6的基因表达水平明显提高，且在浓度75 µg/mL时效果最显著。由此可知BSP-2能够提高RAW264.7细胞的TNF-α和IL-6 mRNA表达水平，使得细胞内TNF-α和IL-6的含量增加，从而发挥一定的免疫调节能力。

4. BSP-2对RAW264.7细胞内NF-κB和MAPK信号通路的影响

图4给出了BSP-2对RAW264.7细胞内p65、p38、ERK和JNK蛋白表达的影响。如图4所示，与空白对照组相比，阳性对照组LPS诱导后RAW264.7细胞中p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平显著升高 (P<0.001)。BSP-2不仅能显著上调RAW264.7细胞核内磷酸化p65表达水平，促进NF-κB由胞浆转至细胞核，也能明显增强p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平，尤其在75 µg/mL浓度下，表达水平更显著(P<0.001)。使用通路抑制剂之后，结果如图4B所示，抑制剂明显降低了BSP-2的磷酸化水平，具有极强的特异性。以上结果表明BSP-2的免疫调节反应可能与激活RAW264.7细胞内NF-κB和MAPKs信号通路有关。

本发明经试验证明了BSP-2对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用。说明BSP-2能增强RAW264.7细胞的吞噬能力以及促炎细胞因子、NO及其mRNA表达；此外又使用通路抑制剂双向证明了其能增强NF-κB和MAPK信号通路关键蛋白的表达，表明BSP-2的免疫调节能力是通过激活NF-κB和MAPK信号通路来实现的。

Claims (4)

1.黑莓籽多糖在制备免疫增强药物中的应用。

2.如权利要求1所述黑莓籽多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，黑莓籽多糖用量为10-15 mg/kg。

3.如权利要求2所述黑莓籽多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，黑莓籽多糖能提高细胞吞噬能力、提高细胞中NO含量、提高细胞分泌TNF-α和IL-6细胞因子含量、上调TNF-α和IL-6细胞因子mRNA表达水平，以及上调细胞核内p65、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平。

4.如权利要求1所述黑莓籽多糖在制备免疫增强药物方面的应用，其特征在于，所述黑莓籽多糖经下述步骤制备获得：

（1）将黑莓籽粉碎，室温下用石油醚脱脂，挥干石油醚后，药渣用乙醇提取，过滤，阴干残渣，再向残渣中加入蒸馏水提取，趁热抽滤，合并滤液后减压浓缩，再向浓缩液中加入乙醇，静置离心，得到的沉淀再加蒸馏水溶解透析以除去小分子杂质，减压浓缩，冷冻干燥即得黑莓籽粗多糖；

（2）取黑莓籽粗多糖溶于蒸馏水中，过滤，弃去杂质后加入到DEAE-52纤维素柱色谱，依次用蒸馏水、0.1mol/L氯化钠溶液和0.2mol/L氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液采用苯酚-硫酸法进行检测，测490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的多糖样品，透析、浓缩后冷冻干燥；其中，蒸馏水洗脱峰为组分1，0.1mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分2，0.2mol/L氯化钠溶液的洗脱峰为组分3；

（3）组分2溶于蒸馏水中、过滤弃去杂质，加入到SephadexG-100凝胶柱色谱，用蒸馏水进行洗脱，采用苯酚-硫酸法进行检测，测其在490nm处的吸光度，以洗脱管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线，得到单一洗脱峰，浓缩，冷冻干燥得到的多糖命名为BSP-2，即为黑莓籽多糖。