CN110004149A - 一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种程序性死亡受体‑配体1(PD‑L1)的核酸适体及其应用，涉及一种核酸。提供能够高特异性识别、高亲和力结合PD‑L1的核酸适体。所述核酸适体可通过基于琼脂糖微珠分离‑流式细胞术分析的蛋白SELEX方法筛选制备。所述核酸适体具有富含G碱基、具有茎环结构、易合成和标记、成本低、稳定性好、非免疫原性等特点，并且利用该核酸适体实现了PD‑L1蛋白、表达PD‑L1蛋白的肿瘤细胞系及肿瘤细胞系分泌的表达PD‑L1蛋白外泌体的特异性识别，验证了其在生化分析检测领域中的应用，并有望作为检测PD‑L1表达水平的分子识别工具，而应用于临床医学肿瘤免疫研究领域PD‑1/PD‑L1抑制剂疗效的精准预测和动态监测。

Description

一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体及其应用
技术领域
本发明涉及能够高特异性识别、高亲和力结合程序性死亡受体-配体1的核酸适体及其在生化分析和临床医学，如肿瘤免疫研究领域中的应用，并有望作为检测PD-L1表达水平的分子识别工具。
背景技术
随着科学的进步及癌症相关学科的发展，肿瘤免疫研究和免疫治疗得到了迅猛的发展。目前认为，免疫逃逸是肿瘤发展的重要机制，而T细胞在免疫逃逸中起着重要的作用。程序性死亡受体(PD-1，Programmed Death 1)表达于T细胞表面，而在肿瘤细胞表面表达程序性死亡受体-配体1(PD-L1，Programmed Death-Ligand 1)，它与T细胞的PD-1蛋白相互作用，从而抑制T细胞的增殖、粘附，抑制T细胞的抗癌活性，从而发生免疫逃逸。针对肿瘤细胞的免疫逃逸，研究者用免疫检查点来解释，并开发了免疫检查点抑制剂药物。比如，包括PD-1和PD-L1抗体药物，它们旨在阻断PD-1与PD-L1的相互作用，重新激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而唤醒患者自身的抗肿瘤效应。PD-1和PD-L1抗体药物是目前临床研究与应用最广泛的免疫检查点抑制剂，且取得了良好的效果。
但是，PD-1/PD-L1抗体药物并不是对所有肿瘤病人都有效，仅在一部分肿瘤病人有效果。以Pembrolizumab为例，在黑色素瘤患者中有效率只有33％，在其它肿瘤患者中的有效率大多在10～30％之间。而对于对药物没有响应的患者，不但治疗无效，还要承受昂贵的治疗负担，所以知道哪些病人会有反应是很重要的。
有研究表明，PD-L1在肿瘤细胞表面高表达。那么，PD-L1的高表达则意味着当PD-1与PD-L1的结合被阻断时，使用PD抑制剂的疗效更好，患者获益几率更大。所以，用药之前检测患者的PD-L1水平可以指导是否需要用药治疗。PD-1抑制剂Opdivo应用于非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗研究时，使用诊断抗体对病人的组织样本进行免疫组织化学(IHC)染色诊断，伴随诊断抗体的IHC染色信号越强，所获得的总体生存率(OS)越高。另外，PD-1抑制剂pomalidomide及低剂量***的联合用药应用于多发性骨髓瘤(MM)的三联免疫治疗研究，同样的，伴随诊断抗体的IHC染色信号越强，则使用联合用药的反应效率越高。此外，在其它肿瘤中，PD-L1的表达水平与免疫检查点抑制剂的疗效亦存在相关性。所以，PD-1抑制剂的疗效与PD-L1的表达水平呈一定的正相关性，需要根据患者自身的情况来选择是否用药，那么就需要补充检测PD-L1的表达水平。
而目前PD-L1的检测方法主要是基于蛋白水平的免疫组织化学测定，所以在NSCLC治疗中，每个PD抑制剂都开发了相应的特异性PD-L1免疫组化检测抗体，以评估肿瘤的PD-L1表达水平。但是，目前PD-L1表达水平的检测仍然存在一些问题，如目前检测抗体不一，染色技术及条件的不统一，病理评价标准尚未统一，导致不能很好的对应答者和非应答者进行有效的识别。加上抗体存在不稳定、易失活、以及成本高的缺点。因此，需要更稳定，更有效，和更低成本的PDL1的结合配体进行PD-L1表达水平的检测。
核酸适体(aptamer)是具有功能性的单链寡核苷酸，即为核酸分子探针，从人工合成的单链DNA/RNA文库中基于指数富集配体***进化技术(SELEX)体外筛选获得，能够高特异性地和高亲和力地与靶标分子结合，具有稳定性高、化学合成便捷经济且无批次差异等诸多优点，被誉为“化学抗体”，在生化分析检测领域显示出巨大的应用前景，而且基于核酸适体的识别与检测方法已经成为一种普遍适用的技术。所以，如果获得高亲和力和高选择性的识别PDL1的核酸适体，就可以将其伴随抗体用于补充诊断检测PD-L1的表达水平，将给快速判断和指导是否需要免疫治疗带来新的希望和解决途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体，并提供其在生化分析和临床医学中的应用。针对当前检测PD-L1表达水平的免疫组化检测方法以及抗体存在的问题，本发明中提供的可高亲和力和高选择性地识别PD-L1的核酸适体，可协同抗体用于诊断和检测PD-L1的表达水平，将给快速判断和指导是否需要免疫治疗带来新的希望和解决途径。所述核酸适体是通过基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的蛋白SELEX方法筛选制备。所述核酸适体具有富含G碱基，具有茎环结构、易合成和标记，合成成本低、稳定性好、非免疫原性等特点。并且利用该核酸适体实现了PD-L1蛋白、表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系及肿瘤细胞系分泌的表达PD-L1蛋白外泌体的特异性识别，验证了其在生化分析检测领域的应用可行性，并有望作为检测PD-L1表达水平的分子识别工具，而应用于临床医学如肿瘤免疫研究领域，实现PD-1/PD-L1抑制剂疗效的精准预测和动态监测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体，所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体包括如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
具体为：
SEQ ID No.1，命名为mj1：
5'-AGCGTCGAATACCACTACAGTTGATCGGACGAAAACATTC
GACGTTTCTTTATTTCGGCGCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.2，命名为mj2-1：
5’-AGCGTCGAATACCACTACAGACCAGGTCATCGATGGGTTT
TTCGACGTGCGGCGCGAGGGCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.3，命名为mj2-2：
5'-AGCGTCGAATACCACTACAGTCGTAGTTATTCCACGTGCG
GCGCGAGGGACTAATTAGATCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.4，命名为mj3：
5'-AGCGTCGAATACCACTACAGTCTCCAGAGCCGTCTGAGG
GCATCTCGCTGCAAGCGAGACTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.5，命名为mj4：
5'-AGCGTCGAATACCACTACAGAATTGGCGGTTCACTGCGAA
GTACTACCTCGCCCTCAAGCCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.6，命名为mj5：
5'-AGCGTCGAATACCACTACAGGTTCTTGTGGGGGGTGGGTG
GGGAACCTGTTCTGACGTTAACTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'
SEQ ID No.7，命名为mj5C：
5'-TACAGGTTCTGGGGGGTGGGTGGGGAACCTGTT-3'
优选地，所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列mj5C。
一实施例中：还包括基于上述序列做截短或部分碱基替换的程序性死亡受体-配体1的核酸适体。
一实施例中：所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体具有茎环结构。
一实施例中：所述的程序性死亡受体-配体1的核酸适体为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列mj5C作为与表达PD-L1蛋白的细胞系结合的核酸适体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体的应用，但不用于疾病诊断和治疗。
一实施例中：所述应用为在生化分析检测领域、临床医学肿瘤免疫研究领域的应用。
一实施例中：所述应用包括：
1)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞的流式分析检测的应用；
2)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞成像的应用；
3)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞捕获的应用；
4)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在组织切片成像中的应用；
5)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在活体成像中的应用；
6)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤免疫治疗中的应用；
7)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在制备肿瘤靶向药物、肿瘤免疫治疗药物中的应用；
8)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在细胞外囊泡或外泌体的流式分析检测、ELISA检测中的应用；
9)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在细胞外囊泡或外泌体成像的应用；
10)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在捕获细胞外囊泡或外泌体的应用。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1)本发明筛选获得的核酸适体是通过基于琼脂糖微珠分离-流式细胞术分析的蛋白SELEX方法筛选得到，相比于抗体，更为简便快速。
2)相比于抗体，本发明筛选获得的核酸适体具有易合成和标记，合成成本低、稳定性好，不易失活、非免疫原性，无毒性等特点，应用前景更广阔。
3)本发明筛选获得的核酸适体实现了PD-L1蛋白、表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系及肿瘤细胞系分泌的表达PD-L1蛋白外泌体的特异性识别，有望作为检测PD-L1表达水平的分子识别工具，而应用于PD-1/PD-L1抑制剂疗效的精准预测和动态监测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为流式细胞术监测核酸适体筛选富集进程以及PD-L1靶蛋白琼脂糖微球与筛选文库的结合能力。在图1中，横坐标为荧光强度，0th为DNA初始文库，8th，12th，18th，20th，22th，24th，26th分别为第8，第12，第18，第20，第22，第24和第26轮DNA富集文库。
图2为流式细胞术监测核酸适体筛选富集进程以及对于Ni琼脂糖微球与筛选文库的结合能力。在图2中，横坐标为荧光强度，0th为DNA初始文库，8th，12th，18th，20th，22th，24th，26th分别为第8，第12，第18，第20，第22，第24和第26轮DNA富集文库。
图3为通过流式细胞术测定第26轮DNA富集文库对PD-L1靶蛋白的解离常数。在图3中，横坐标为DNA富集文库浓度(nmol/L)，纵坐标为平均荧光强度。
图4为通过流式细胞术考察测序分析得到的6条核酸适体mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5针对稳转高表达PD-L1蛋白的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的结合能力。在图4中，横坐标为荧光强度，rs为随机单链DNA，mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5分别为6条核酸适体。
图5为通过流式细胞术考察测序分析得到的6条核酸适体mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5针对表达PD-L1蛋白的结直肠癌细胞系HCT116的结合能力。在图5中，横坐标为荧光强度，rs为随机单链DNA，mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5分别为6条核酸适体。
图6为通过流式细胞术考察核酸适体mj5与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460，以及不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos，还有人的血细胞的结合能力。在图6中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数。曲线a为随机单链DNA，曲线b为mj5核酸适体。
图7为通过流式细胞术测定所得核酸适体mj5对稳转高表达PD-L1蛋白的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的解离常数。在图7中，横坐标为DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为归一化平均荧光强度。
图8为通过流式细胞术考察经截短优化得到的核酸适体mj5C与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460，以及不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos，还有人的血细胞的结合能力。在图8中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数。曲线a为随机单链DNA，曲线b为mj5核酸适体，线c为mj5C核酸适体。
图9为通过流式细胞仪测定经截短优化得到的核酸适体mj5C对稳转高表达PD-L1蛋白的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的解离常数。在图9中，横坐标为DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为归一化平均荧光强度。
图10为通过流式细胞术考察截短优化得到的核酸适体mj5C针对PD-L1蛋白的结合能力。在图10中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微球数。曲线a为随机单链DNA，曲线b为mj5核酸适体，曲线c为mj5C核酸适体。
图11为通过流式细胞术考察截短优化得到的核酸适体mj5C对Ni琼脂糖微球的结合能力。在图11中，横坐标为荧光强度，纵坐标为微球数。曲线a为随机单链DNA，曲线b为mj5核酸适体，曲线c为mj5C核酸适体。
图12为通过流式细胞术测定截短优化得到的核酸适体mj5C对PD-L1靶蛋白的解离常数。在图12中，横坐标为DNA浓度(nmol/L)，纵坐标为归一化平均荧光强度。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1程序性死亡受体-配体1的核酸适体的筛选
1)化学合成DNA初始文库，如SEQ ID No.8所示，其中每一条DNA链由80个碱基组成，包含两端各20各碱基的固定序列和中间40个碱基的随机序列，具体为：5'-AGC GTC GAATAC CAC TAC AG-40nt-CTA ATG GAG CTC GTG GTC AG-3'，库容量为1015以上。取3nmol DNA初始文库溶于结合缓冲液(12mmol/L PBS，pH 7.4，150mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，0.55mmol/L MgCl2)中，进行变性处理：95℃处理10min，后置于冰上5min，最后于室温下放置10min；
2)原核表达融合蛋白His-PD-L1，通过His与Ni的亲和相互作用，将PD-L1蛋白固定在Ni琼脂糖微球(beads)上，得到PD-L1蛋白琼脂糖微球PD-L1 beads；将步骤1)得到的预处理初始文库液体与PD-L1蛋白琼脂糖微球于37℃孵育40min；
3)在步骤2)中，进行到第三轮筛选时候，需要加入反筛的过程，具体操作为：将处理好的上一轮DNA文库与Ni琼脂糖微球于37℃孵育15min，进行反筛，然后收集未与Ni琼脂糖微球结合的液体，再将得到的液体与PD-L1蛋白琼脂糖微球于37℃下孵育，进行正筛；
4)去掉未与PD-L1蛋白琼脂糖微球结合的DNA序列，使用结合缓冲液洗涤孵育后的PD-L1蛋白琼脂糖微球，再将结合了DNA的PD-L1蛋白琼脂糖微球做PCR扩增反应(扩增程序为94℃预变性3min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，扩增10个循环，最后72℃延伸5min，正向引物如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3'；反向引物如SEQ IDNo.10所示：5'-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3'；)
5)PCR扩增反应结束后，产物为3’端带有生物素标记，5’端带有FAM标记的双链DNA，加入链酶亲和素琼脂糖微球，室温反应30min，然后用0.1mol/L NaOH进行碱变性单链化，经NAP-5柱脱盐过滤，纯化，即得到用于下一轮筛选的单链DNA文库，即次一级单链DNA文库；
6)使用200pmol的次一级单链DNA文库，重复进行步骤2)～5)的筛选，并在筛选过程中逐步降低文库以及PD-L1蛋白琼脂糖微球的投入量，并且逐步增加Ni琼脂糖微球的投入量以及洗涤次数以增强筛选强度。本实施例之中，共进行26轮筛选，而后通过流式细胞术监测核酸适体筛选富集进程，结果如图1和图2所示，显示从第8轮开始，富集文库与PD-L1蛋白有结合，而与Ni琼脂糖微球没有结合，最后对第26轮筛选得到的单链DNA富集文库进行测序表征，得到与程序性死亡受体-配体1特异结合的核酸适体序列，即如SEQ ID No.1至SEQID No.6所示的mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5。
实施例2通过流式细胞术考察单链DNA富集文库与PD-L1蛋白的结合能力
首先分别用PCR扩增带荧光标记的第0，8，12，18，20，22，24，26轮DNA富集文库，使用正向引物(SEQ ID No.9)：5'-FAM-AGC GTC GAA TAC CAC TAC AG-3'与反向引物(SEQ IDNo.10)：5'-Biotin-CTG ACC ACG AGC TCC ATT AG-3'，PCR产物为5’端带有FAM并且3’端带有生物素的双链DNA，加入链酶亲和素琼脂糖微球，室温反应20min，然后用0.1mol/L NaOH进行碱变性单链化，经NAP-5 column脱盐过滤，纯化，即得到第0，8，12，18，20，22，24，26轮单链DNA富集文库；
用200μl结合缓冲液配置浓度为200nmol/L的第0，8，12，18，20，22，24，26轮单链DNA富集文库溶液，分别加入约105个PD-L1蛋白琼脂糖微球，37℃下孵育40min，去掉未与PD-L1蛋白琼脂糖微球结合的单链DNA，使用结合缓冲液洗涤微球3次，而后把PD-L1蛋白琼脂糖微球结合重悬在200μL结合缓冲液中。使用流式细胞仪对PD-L1蛋白琼脂糖微球进行荧光测定。
结果如图1至图2所示，其中图1是第0，8，12，18，20，22，24，26轮DNA富集文库与PD-L1蛋白琼脂糖微球结合情况(第0轮文库为DNA初始文库)，图2是人血浆中第0，8，12，18，20，22，24，26轮DNA富集文库与Ni琼脂糖微球结合情况(Ni琼脂糖微球为反筛靶标)。结果表明第8，12，18，20，22，24，26轮DNA富集文库与PD-L1蛋白琼脂糖微球有结合，而Ni琼脂糖微球没有结合，说明筛选文库有富集。
实施例3通过流式细胞术测定所得第26轮单链DNA富集文库与PD-L1蛋白的解离常数
首先PCR扩增带荧光标记的第26轮DNA富集文库，使用正向引物5'-FAM-AGC GTCGAA TAC CAC TAC AG-3'(SEQ ID No.9)：与反向引物(SEQ ID No.10)：5'-Biotin-CTG ACCACG AGC TCC ATT AG-3'，PCR产物为5’端带有FAM并且3’端带有生物素的双链DNA，加入链酶亲和素琼脂糖微球，室温反应20min，然后用0.1mol/L NaOH进行碱变性单链化，经NAP-5column脱盐过滤，纯化，即得到第26轮单链DNA富集文库；
使用0，3，7.5，10，20，30，50，75，100，200nmol/L浓度梯度的26轮单链DNA富集文库与PD-L1蛋白琼脂糖微球来测定解离常数(Kd)。用200μl结合缓冲液配置上述各浓度的第26轮单链DNA富集文库溶液，加入约105个PD-L1蛋白琼脂糖微球，37℃下孵育40min，去掉未与PD-L1蛋白琼脂糖微球结合的单链DNA，使用结合缓冲液洗涤微球3次，而后把PD-L1蛋白琼脂糖微球重悬在200μL结合缓冲液中。使用流式细胞仪对PD-L1蛋白琼脂糖微球进行荧光测定，而后计算出所得核酸适体的解离常数。
结果如图3所示，第26轮DNA富集文库对PD-L1蛋白琼脂糖微球的解离常数为Kd＝98±19nM，而DNA初始文库作为对照文库，与PD-L1蛋白琼脂糖微球不结合，结果表明富集的第26轮DNA富集文库对PD-L1蛋白具有高亲和力，因此可以用于后续测序分析。
实施例4通过流式细胞术考察测序核酸适体表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系的结合能力
首先将合成好的带荧光标记的测序核酸适体，即如SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的mj1、mj2-1、mj2-2、mj3、mj4、与mj5，用200μl结合缓冲液配置浓度为200nmol/L的核酸适体溶液，加入约105个表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞，37℃下孵育40min，去掉未与肿瘤细胞结合的单链DNA，使用结合缓冲液洗涤肿瘤细胞3次，而后把肿瘤细胞结合重悬在200μL结合缓冲液中。使用流式细胞仪对肿瘤细胞进行荧光测定。
结果如图4、图5所示，其中图4是6条核酸适体与稳转高表达PD-L1蛋白的非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的结合情况，图5是6条核酸适体与表达PD-L1蛋白的结直肠癌细胞系HCT116的结合情况，结果表明如SEQ ID No.6所示的mj5C核酸适体与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系结合，至此结果表明经过26轮富集，获得1条与肿瘤细胞系表达的PD-L1蛋白结合力及特异性良好的核酸适体，将对其进行下一步的表征分析。
实施例5通过流式细胞术考察mj5核酸适体对表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系的特异性
首先将合成好的带荧光标记的核酸适体，即如SEQ ID No.6所示的mj5，用200μl结合缓冲液配置浓度为200nmol/L的核酸适体溶液，分别加入约105个表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460，以及不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos及人血细胞，37℃下孵育40min，去掉未与肿瘤细胞结合的单链DNA，使用结合缓冲液洗涤肿瘤细胞3次，后重悬在200μL结合缓冲液中。使用流式细胞仪对肿瘤细胞进行荧光测定。
结果如图6所示，结果表明如SEQ ID No.6所示的mj5核酸适体与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460结合，而不与不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos及人血细胞结合。说明mj5核酸适体对肿瘤细胞系表达的PD-L1蛋白具有高特异性。
实施例6通过流式细胞术测定mj5核酸适体与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞NCI-H1299的解离常数
首先将合成好的带荧光标记的核酸适体，即如SEQ ID No.6所示的mj5，用200μl结合缓冲液配置浓度为0，3，7.5，10，20，30，40，50，75，100，150，200，300nmol/L等浓度梯度的核酸适体溶液，再加入约105个表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞NCI-H1299，37℃下孵育40min，去掉未与肿瘤细胞结合的单链DNA，使用结合缓冲液洗涤肿瘤细胞3次，后重悬在200μL结合缓冲液中。使用流式细胞仪对肿瘤细胞进行荧光测定，并计算出所得核酸适体的解离常数。
结果如图7所示，为如SEQ ID No.6所示的mj5对表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299的解离常数，为Kd＝72±10nM，结果表明mj5核酸适体对肿瘤细胞系表达的PD-L1蛋白具有高亲和力，因此mj5核酸适体可以用于后续截断优化分析。
实施例7
综上所述，最终选择mj5核酸适体进行后续截短优化以及实验。具体操作是:先利用NUPACK对mj5核酸适体进行二级结构的模拟，对其碱基组成和空间结构进行分析，在保证mj5核酸适体原有的亲和力和选择性基本不变的前提下，去除不必要的碱基，主要去除序列两端的引物，得到最优核酸适体，如SEQ ID No.7所示的mj5C。接下来就是考察最优核酸适体mj5C与PD-L1蛋白以及表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系的结合能力、特异性以及亲和力。具体操作与实施例4、5类似。
结果如图8至图12所示，其中图8是mj5C核酸适体与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460，以及不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos及人血细胞的结合情况；图9是mj5C核酸适体对表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299的解离常数；图10是mj5与mj5C核酸适体与PD-L1蛋白琼脂糖微球的结合情况；图11是mj5与mj5C核酸适体与Ni琼脂糖微球的结合情况；图12是mj5C核酸适体PD-L1蛋白琼脂糖微球的解离常数。结果表明mj5C核酸适体与PD-L1蛋白琼脂糖微球以及表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299、HCT116、NCI-H460结合，而不与阴性对照Ni琼脂糖微球以及不表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系K562、Ramos及人血细胞结合。至此结果表明经过mj5截短优化后的mj5C核酸适体，与表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系保持良好结合能力以及特异性；另外，mj5C对表达PD-L1蛋白的肿瘤细胞系NCI-H1299的解离常数为Kd＝90±13nM，而对PD-L1蛋白琼脂糖微球的解离常数为Kd＝95±30nM，结果表明mj5C核酸适体对肿瘤细胞系表达的PD-L1蛋白以及PD-L1蛋白仍具有高亲和力。所以，最终获得了一条高亲和、高特异性的PD-L1的核酸适配体mj5C。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgtcgaat accactacag ttgatcggac gaaaacattc gacgtttctt tatttcggcg 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcgtcgaat accactacag accaggtcat cgatgggttt ttcgacgtgc ggcgcgaggg 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcgtcgaat accactacag tcgtagttat tccacgtgcg gcgcgaggga ctaattagat 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcgtcgaat accactacag tctccagagc cgtctgaggg catctcgctg caagcgagac 60
taatggagct cgtggtcag 79
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcgtcgaat accactacag aattggcggt tcactgcgaa gtactacctc gccctcaagc 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 6
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agcgtcgaat accactacag aattggcggt tcactgcgaa gtactacctc gccctcaagc 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacaggttct ggggggtggg tggggaacct gtt 33
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcgtcgaat accactacag nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
ctaatggagc tcgtggtcag 80
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcgtcgaat accactacag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgaccacga gctccattag 20

Claims (6)

1.一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体，其特征在于：所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体包括如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1的核酸适体，其特征在于：所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体为如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的程序性死亡受体-配体1的核酸适体，其特征在于：所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体具有茎环结构。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的程序性死亡受体-配体1的核酸适体的应用，但不用于疾病诊断和治疗。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为在生化分析检测研究领域、临床医学肿瘤免疫研究领域的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用包括：
1)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞的流式分析检测的应用；
2)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞成像的应用；
3)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤细胞捕获的应用；
4)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在组织切片成像中的应用；
5)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在活体成像中的应用；
6)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在肿瘤免疫治疗中的应用；
7)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在制备肿瘤靶向药物、肿瘤免疫治疗药物中的应用；
8)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在细胞外囊泡或外泌体的流式分析检测、ELISA检测中的应用；
9)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在细胞外囊泡或外泌体成像的应用；
10)所述程序性死亡受体-配体1的核酸适体在捕获细胞外囊泡或外泌体的应用。
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