CN110004095B - 一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用。一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17424；本发明还涉及利用该菌株制备抗菌活性物质及相关的应用。本发明首次从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中提取出三种具有抗菌活性的脂肪醇类化合物，而现有短小芽孢杆菌中并未发现上述三种抗菌活性物质。

Description

一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用，属于微生物技术及应用技术领域。
背景技术
目前，畜禽养殖业抗生素的大量使用，导致耐药性产生及兽药残留，严重影响了畜产品品质，***残渣也导致土壤和水体污染。破坏了生态环境，直接危害人类健康。环境污染造成了人类生存环境的恶化，导致食品安全问题日益突出。
抗菌活性物质是近年来国内外的研究热点，可广泛应用于生物饲料、生防、医药、天然食品防腐剂、化妆品等方面。其中芽孢杆菌可产生多种抗菌物质，其抗菌机理独特，对革兰阴性菌、革兰阳性菌、霉菌及酵母菌均有抑制作用，具有广谱抗菌、高效、安全、不易产生耐药性、易降解等特点，自Johnson等报道枯草芽孢杆菌可以产生抑菌物质以来，国内外学者先后从不同芽孢杆菌中分离得到多种抑菌物质，包括多肽类、脂肽类及抑菌蛋白类等。
短小芽孢杆菌为芽孢杆菌属的一种，广泛存在于自然界中，显微镜下观察营养细胞为杆状，革兰氏反应阳性，能运动。菌落形态分为半透明状和不透明状两种。短小芽孢杆菌能够分泌活性很强的纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶和果胶裂解酶等，有利于降解大分子物质。还可以产生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗性物质，抑菌范围广，对多种病原菌都有抑制作用。
目前，国内已有关于生产短小芽孢杆菌类产品的相关技术，如:中国专利文献CN103563991A(申请号201210271396.4)公开了水稻稻瘟病生防菌短短小芽孢杆菌杀菌剂水分散粒剂剂型和制备方法。所述固体的水分散粒剂包含短短小芽孢杆菌TW菌株原粉(2×1012cfu/g)和助剂，助剂包括载体、分散剂、湿润剂、崩解剂、光保护剂和粘结剂；其加工方法是将有效成分和助剂探子一定比例混合，经气流粉碎、造粒、干燥获得。
中国专利文献CN105494441A(申请号200710021509.1)公开了一种含有芽孢萌发剂的短小芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法，该可湿性粉剂的原料由下列重量组份组成：短小芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：膨润土20-30份；润湿剂：聚乙二醇1-4份；分散剂：十二烷基硫酸钠0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；紫外保护剂：羧甲基纤维素0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，谷氨酸钠0.2-1份。
中国专利文献CN103205383A(申请号201310128271.0)公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)E14 CGMCC No.6682。本发明还公开了短小芽孢杆菌E14的培养方法，其步骤：将短小芽孢杆菌E14菌株接种到2216E液体培养基中，28℃、150rpm培养20h，即得菌液。本发明所述的短小芽孢杆菌E14或所述的方法培养得到的菌液具备抑制哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抑菌用途，可以用于虾蟹养殖药物的制备，或者用于作为抑菌药物添加到虾蟹养殖饲料中。
中国专利文献CN102965299A(申请号201210290374.2)公开了一株短小芽孢杆菌LD-b1的发酵工艺及其在防治黄瓜褐斑病，黄瓜灰霉病，黄瓜菌核病，苹果腐烂病，茄子枯萎病，小麦赤毒病,白菜黑斑病和番茄灰霉病上的应用。曲发斌等考察了短小芽孢杆菌发酵液对番茄种子萌发及幼苗生长的影响，结果表明:短小芽孢杆菌发酵液对番茄种子萌发,根芽生长及幼苗的株高和株重具有明显的促进作用，其中以50倍稀释液的效果最为显著,而在幼苗施用方式上叶面喷施的效果明显优于灌根和浸种。
中国专利文献CN105494441A(申请号201510951106.4)公开了一种含有芽孢萌发剂的短小芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法，该可湿性粉剂的原料由下列重量组份组成：短小芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：膨润土20-30份；润湿剂：聚乙二醇1-4份；分散剂：十二烷基硫酸钠0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，2，6-吡啶二羧酸钙0.1-0.5份；紫外保护剂：羧甲基纤维素0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，谷氨酸钠0.2-1份。
上述技术的关注点多放在防治植物病害和促进植物生长方向，并未对短小芽孢杆菌的活性物质进行进一步研究的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用。
本发明技术方案如下：
一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17424。
上述短小芽孢杆菌的培养方法，步骤如下：
(1)将上述短小芽孢杆菌接种于种子培养基中，在35～38℃、160～200转/分的条件下，培养14～16小时，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比3～5％的比例接种至发酵培养基中，在28～32℃，160～200转/分培养45～50h，制得发酵液；
所述发酵培养基，每升组份如下：
葡萄糖30.0g，K2HPO4×3H2O 7.0g，KH2PO4 3.0g，(NH4)2SO4 1.5g，柠檬酸钠·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，pH7.0～7.2，加水定容至1L。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，种子培养基为LB肉汤培养基，每升组份如下：
蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母膏5克，水定容至1000毫升。
来源于短小芽孢杆菌的抗菌活性物质，结构式分别如下所示：
化合物I，名称为：6,7-(α-羟基)二乙基十二烷，英文名称：6,7-(α-hydroxy)-diethyl-dodecane：
Figure GDA0003429386020000031
化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇，英文名称：4,5-dibutyl-1,2-(α-methyl)-cyclohexanedimethanol：
Figure GDA0003429386020000032
化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮，英文名称：4,5-dibutyl-1,2-(α-methyl)-cyclohexanedimethanol：
Figure GDA0003429386020000033
上述来源于短小芽孢杆菌的抗菌活性物质的制备方法，步骤如下：
(i)将上述发酵液经固液分离，取上清液，经浓缩，制得浓缩液；
(ii)将步骤(ii)制得的浓缩液经乙酸乙酯萃取，取萃取相，浓缩后经硅胶柱层析分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度洗脱，收集具有抗菌活性的石油醚/乙酸乙酯＝50:50洗脱液，浓缩，干燥，制得浓缩干燥物；
(iii)将步骤(ii)制得的浓缩干燥物经高效液相色谱分离，制得抗菌活性物质分别为上述化合物I、化合物II、化合物III。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，固液分离为在3500～4500转/分的条件下离心25～35分钟。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中，浓缩为采用旋转蒸发，浓缩至原溶液浓度的8～12倍。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1；优选的，萃取次数为2～4次。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，硅胶柱为200～300目的硅胶柱。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度具体如下，均为体积比：
石油醚、石油醚/乙酸乙酯＝75:25、石油醚/乙酸乙酯＝50:50；石油醚/乙酸乙酯＝25:75；石油醚/乙酸乙酯＝0:100；乙酸乙酯/甲醇＝75:25；乙酸乙酯/甲醇＝50:50；乙酸乙酯/甲醇＝25:75，乙酸乙酯/甲醇＝0:100。
根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，干燥为采用氮吹干燥方式。
根据本发明优选的，所述步骤(iii)中，高效液相色谱分离条件如下：
制备柱采用YMC-Pack SIL柱，250mm×10mm；流动相为60％的乙酸乙酯和40％的正丁醇，波长260nm，进样量5μL，流速2.0mL/min，柱温为25℃，压力为40bar。
上述具有抗菌活性的化合物I、化合物II、化合物III在制备抑制致病菌药物中的应用。
上述具有抗菌活性的化合物I、化合物II、化合物III在制备抗菌化妆品中的应用。
上述具有抗菌活性的化合物I、化合物II、化合物III在制备农药中的应用。
有益效果
1、本发明首次发现了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株可以生成三种具有抗菌活性的脂肪醇类化合物，而现有短小芽孢杆菌中并未发现上述三种抗菌活性物质；
2、本发明首次公开了三种烯醇类具有抗菌活性的化合物，该类化合物具有很强的抑制致病菌的作用，且采用微生物发酵制备生产周期短、产物稳定、含量高，该化合物可广泛应用于农药、医药及化妆品生产中。
附图说明
图1为化合物I的质谱检测结果图；
图2为化合物I的氢谱检测结果图；
图3为化合物I的碳谱检测结果图；
图4为化合物II的质谱检测结果图；
图5为化合物II的氢谱检测结果图；
图6为化合物II的碳谱检测结果图；
图7为化合物III的质谱检测结果图；
图8为化合物III的氢谱检测结果图；
图9为化合物III的碳谱检测结果图；
图10为实施例3步骤(ii)制得的浓缩干燥物的抑菌活性实验结果照片；
图11为实施例3制得的三种化合物的抑菌活性实验结果照片；
其中：1、化合物I的抑菌圈；2、化合物II的抑菌圈；3、化合物III的抑菌圈；
图12为化合物I针对不同菌株的抑菌结果曲线图；
图13为化合物II针对不同菌株的抑菌结果曲线图；
图14为化合物III针对不同菌株的抑菌结果曲线图；
具体实施方式
为进一步解释说明本发明，下面将结合具体实施方式对本发明所述的技术方案进行更详细的介绍，但实施例仅用于说明，不对本发明有任何限制，基于本发明教导所作的任何替换或变换，均属于本发明的保护范围。
生物材料
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.17424。
短小芽孢杆菌BP-5，购于中国微生物菌种保藏，编号：CGMCC 1.8167。
实施例1
一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO.17424。
该菌株的生物学特征：为芽孢杆菌属，菌体细杆状，革兰氏阳性。在LB斜面上生长为透明状，能产生抗菌活性成分。
实施例2
短小芽孢杆菌短(Bacillus pumilus)BP的培养方法，步骤如下：
(1)将上述短小芽孢杆菌接种于种子培养基中，在37℃、180转/分的条件下，培养16小时，制得种子液；
所述种子培养基为LB肉汤培养基，每升组份如下：
蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母膏5克，水定容至1000毫升；
(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比3％的比例接种至发酵培养基中，在30℃，180转/分培养48h，制得发酵液；
所述发酵培养基，每升组份如下：
葡萄糖30.0g，K2HPO4×3H2O 7.0g，KH2PO4 3.0g，(NH4)2SO4 1.5g，柠檬酸钠·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，pH7.0～7.2，加水定容至1L。
实施例3
来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP的抗菌活性物质的制备方法，步骤如下：
(i)将实施例2制备的发酵液在3500转/分的条件下离心35分钟，取上清液，采用旋转蒸发，浓缩至原溶液浓度的8倍，制得浓缩液；
(ii)将步骤(ii)制得的浓缩液经乙酸乙酯萃取，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1，取萃取相，萃取4次，合并萃取相，浓缩，然后经200目的硅胶柱层析分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度洗脱，收集具有抗菌活性的石油醚/乙酸乙酯＝50:50洗脱液，浓缩，氮吹干燥，制得浓缩干燥物；
所述石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度具体如下，均为体积比：石油醚、石油醚/乙酸乙酯＝75:25、石油醚/乙酸乙酯＝50:50；石油醚/乙酸乙酯＝25:75；石油醚/乙酸乙酯＝0:100；乙酸乙酯/甲醇＝75:25；乙酸乙酯/甲醇＝50:50；乙酸乙酯/甲醇＝25:75，乙酸乙酯/甲醇＝0:100；
采用琼脂扩散法方式检测大肠杆菌抑菌活性，如图10所示；
(iii)将步骤(ii)制得的浓缩干燥物经高效液相色谱分离，制得抗菌活性物质分别为上述化合物I、化合物II、化合物III；
所述高效液相色谱分离条件如下：
制备柱采用YMC-Pack SIL柱，250mm×10mmI.D，S-5μm,12nm，SL 12S-2510WT，Ser.No.114EA80134；流动相为60％的乙酸乙酯(Eta-00060458HPLC)和40％的正丁醇(a-He-00010273HPLC)，波长260nm，进样量5μL，流速2.0mL/min，柱温为25℃，压力为40bar。
分别对化合物I、化合物II、化合物III进行质谱、氢谱、碳谱检测，检测结果如图1-9所示；通过上述结果得出化合物I，名称为：6,7-(α-羟基)二乙基十二烷，英文名称：6,7-(α-hydroxy)-diethyl-dodecane，结构式如下：
Figure GDA0003429386020000061
化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇，英文名称：4,5-dibutyl-1,2-(a-methyl)-cyclohexanedimethanol，结构式如下：
Figure GDA0003429386020000062
化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮，英文名称：4,5-dibutyl-1,2-(a-methyl)-cyclohexanedimethanol，结构式如下：
Figure GDA0003429386020000071
对上述三种化合物分别进行大肠杆菌的抑菌实验，实验化合物浓度分别为2.6mg/mL，3mg/mL，3.2mg/mL，根据实验进行稀释，结果如图11所示。
实施例4
来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的抗菌活性物质的制备方法，步骤如下：
(i)将实施例2制备的发酵液在4500转/分的条件下离心25分钟，取上清液，采用旋转蒸发，浓缩至原溶液浓度的12倍，制得浓缩液；
(ii)将步骤(ii)制得的浓缩液经乙酸乙酯萃取，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1，取萃取相，萃取2次，合并萃取相，浓缩，然后经200目的硅胶柱层析分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度洗脱，收集具有抗菌活性的石油醚/乙酸乙酯＝50:50洗脱液，浓缩，氮吹干燥，制得浓缩干燥物；
所述石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度具体如下，均为体积比：石油醚、石油醚/乙酸乙酯＝75:25、石油醚/乙酸乙酯＝50:50；石油醚/乙酸乙酯＝25:75；石油醚/乙酸乙酯＝0:100；乙酸乙酯/甲醇＝75:25；乙酸乙酯/甲醇＝50:50；乙酸乙酯/甲醇＝25:75，乙酸乙酯/甲醇＝0:100；
(iii)将步骤(ii)制得的浓缩干燥物经高效液相色谱分离，制得抗菌活性物质分别为上述化合物I、化合物II、化合物III；
所述高效液相色谱分离条件如下：
制备柱采用YMC-Pack SIL柱，250mm×10mm；流动相为60％的乙酸乙酯和40％的正丁醇，波长260nm，进样量5μL，流速2.0mL/min，柱温为25℃，压力为40bar。
对分离的三种化合物进行检测，结果同实施例3。
对比例1
采用现有的短小芽孢杆菌(BP－5)，购于中国微生物菌种保藏，编号：CGMCC1.8167。
按照实施例2-3的方法进行制备，结果未获得相关的化合物I～III(脂肪醇类化合物)。
实验例
抗菌试验方法：通过检测致病细菌不同时段的OD600来测定该致病菌生长情况，判断是否具有抑菌效果。具体操作步骤如下：
试验前将致病菌液配制成105cfu/mL，在超净工作台上，根据试验用量，在每个EP管中添加100μL致病菌菌液，高速离心1min，去除上清保留菌体，并添加900μL新鲜LB肉汤培养基，标记并对应添加100μL待测样品，混匀。分别在0小时和15小时，测定OD600，记录数据。每组试验重复3次。
经检测，化合物I针对不同菌株的抑菌结果如图12所示；化合物II针对不同菌株的抑菌结果如图13所示；化合物III针对不同菌株的抑菌结果如图14所示。

Claims (16)

1.一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP，该菌株已于2019年3月21日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.17424。
2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将上述短小芽孢杆菌接种于种子培养基中，在35～38℃、160～200转/分的条件下，培养14～16小时，制得种子液；
(2)将步骤(1)制得的种子液按体积百分比3～5％的比例接种至发酵培养基中，在28～32℃，160～200转/分培养45～50h，制得发酵液；
所述发酵培养基，每升组份如下：
葡萄糖30.0g，K2HPO4×3H2O 7.0g，KH2PO4 3.0g，(NH4)2SO4 1.5g，柠檬酸钠·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，pH7.0～7.2，加水定容至1L。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，种子培养基为LB肉汤培养基，每升组份如下：
蛋白胨10克，氯化钠10克，酵母膏5克，水定容至1000毫升。
4.来源于权利要求1所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP的抗菌活性物质，结构式分别如下所示：
化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇：
Figure FDA0003424047690000011
化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮：
Figure FDA0003424047690000012
5.来源于短小芽孢杆菌的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(i)将权利要求2中所述发酵液经固液分离，取上清液，经浓缩，制得浓缩液；
(ii)将步骤(ii)制得的浓缩液经乙酸乙酯萃取，取萃取相，浓缩后经硅胶柱层析分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度洗脱，收集具有抗菌活性的石油醚/乙酸乙酯＝50:50洗脱液，浓缩，干燥，制得浓缩干燥物；
(iii)将步骤(ii)制得的浓缩干燥物经高效液相色谱分离，制得抗菌活性物质分别为化合物I、化合物II、化合物III；
所述化合物I，名称为：6,7-(α-羟基)二乙基十二烷：
Figure FDA0003424047690000021
化合物II，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲醇：
Figure FDA0003424047690000022
化合物III，名称为：4,5-二丁基-1,2-(α-甲基)-环己烷二甲酮：
Figure FDA0003424047690000023
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中，固液分离为在3500～4500转/分的条件下离心25～35分钟。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(i)中，浓缩为采用旋转蒸发，浓缩至原溶液浓度的8～12倍。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，浓缩液与乙酸乙酯的体积比为1:1。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，萃取次数为2～4次。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，硅胶柱为200～300目的硅胶柱。
11.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇不同溶液不同梯度具体如下，均为体积比：
石油醚、石油醚/乙酸乙酯＝75:25、石油醚/乙酸乙酯＝50:50；石油醚/乙酸乙酯＝25:75；石油醚/乙酸乙酯＝0:100；乙酸乙酯/甲醇＝75:25；乙酸乙酯/甲醇＝50:50；乙酸乙酯/甲醇＝25:75，乙酸乙酯/甲醇＝0:100。
12.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，干燥为采用氮吹干燥方式。
13.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，高效液相色谱分离条件如下：
制备柱采用YMC-Pack SIL柱，250mm×10mm；流动相为60％的乙酸乙酯和40％的正丁醇，波长260nm，进样量5μL，流速2.0mL/min，柱温为25℃，压力为40bar。
14.权利要求4所述具有抗菌活性的化合物II、化合物III在制备抑制致病菌药物中的应用。
15.权利要求4所述具有抗菌活性的化合物II、化合物III在制备抗菌化妆品中的应用。
16.权利要求4所述具有抗菌活性的化合物II、化合物III在制备农药中的应用。
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