CN110003518B - 一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜及其制备方法，先制备脱胶后的家蚕丝素纤维，然后制备家蚕丝素溶解液，接着制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液，再制备改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜，最后制备活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜。该方法制备的产品载有一种活性肽，这种活性肽具有调控血管细胞竞争性生长的功能及活化血管舒张的功能；显著促进了内皮细胞的粘附与增殖，同时对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用；尤其是采用静电结合力原理保护了活性肽发挥活性作用的官能团或结构域不因被化学反应而影响其活性。并且制备的活性丝素蛋白多孔材料或膜属于非溶血性材料，溶血率<0.2％。

Description

一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及加载生物活性因子的丝素蛋白材料的制备技术领域，具体涉及一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜及其制备方法。
背景技术
家蚕蚕丝是由家蚕合成与分泌的天然动物蛋白，来源广泛，其丝素蛋白具有良好的生物相容性，由20种人体可吸收的氨基酸组成，最终降解产物为氨基酸或小肽，易被细胞吸收或吞噬，不会引起明显的免疫反应。大量的研究表明丝素蛋白材料能够支持多种细胞的生长，并且含有大量的-COOH、NH2、-OH等官能团，提供了各种生物活性改性的化学结构基础，在组织再生医学领域越来越多地被研究与应用。
本发明旨在开发一种载有降钙素基因相关肽(CGRP)的丝素蛋白功能材料，应用于血管组织再生修复。CGRP是一个由37个氨基酸组成的广泛分布于中枢和外周神经***的活性肽，是中枢和外周神经***传递信息的重要递质。神经***是遍布全身的调节机体各项生理功能与行为活动的***。尤其是，CGRP是体内发现的最有效的舒血管活性肽，在调节血压、保护心脏和防止冠状动脉粥样硬化有着重要作用。几乎所有的血管中都分布着含有CGRP的神经纤维。CGRP活性肽具有刺激血管舒张，促进血管内皮细胞的增殖并迁移到受损血管壁。CGRP活性肽作为保护性成分，亦具有抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，参与血管损伤修复等功能。因此，将CGRP活性肽载入血管组织工程支架中用于调控缺损血管再生或功能修复具有重大的应用前景。
发明内容
本发明目的是提供一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜及其制备方法，是针对血管组织工程易形成血栓和血管组织再生早期舒张活性较低而开发，以促进病变和缺损血管的组织再生与功能恢复。
本发明的一种技术方案是：
提供一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜，加载了CGRP。
本发明的另一种技术方案是：
提供一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液；
(4)制备改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中加入己二酸，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入2-吗啉乙磺酸，冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜，将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后冷冻干燥或烘干，得到改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜；
(5)制备活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜：将所述改性的丝素蛋白多孔材料浸入CGRP的水溶液中，或在所述改性的丝素蛋白薄膜上加入CGRP的水溶液，放置，得到活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜。
进一步的，步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度下处理2～3次，或1.0～2.5g/L生物酶水溶液中在30～60℃的温度下处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
进一步的，步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
进一步的，步骤(3)中所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～14kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～15％。
进一步的，步骤(4)中纯化后的家蚕丝素蛋白与己二酸的质量比为100:1～20，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的30～50％，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的15～25％，所述2-吗啉乙磺酸的终浓度为0.05M。
进一步的，步骤(4)中在所述冷冻干燥之前还需在-80℃～-20℃的温度下预冷冻2～24小时。
进一步的，步骤(5)中所述将所述改性的丝素蛋白多孔材料浸入CGRP的水溶液中具体包括：将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度10～1000nM的CGRP的水溶液，CGRP的水溶液浸透改性的丝素蛋白多孔材料。
进一步的，步骤(5)中所述放置具体为：置于4℃下放置6～10小时，然后挤干溶液，冷冻干燥。
进一步的，步骤(4)中所述烘干具体为：将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃的温度下烘干。
进一步的，步骤(5)中所述在所述改性的丝素蛋白薄膜上加入CGRP的水溶液具体包括：将所述改性的丝素蛋白薄膜放回平皿中铺平，加入50～1000ng/cm2水溶性的带正电荷的降钙素基因相关肽CGRP的水溶液；所述放置具体为：置于4℃下放置6～10小时，取出溶液后，风干。
本发明提供了一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，所制得的产品载有一种活性肽，这种活性肽具有调控血管细胞竞争性生长的功能及活化血管舒张的功能；显著促进了内皮细胞的粘附与增殖，同时对平滑肌细胞的增殖有一定的抑制作用；尤其是采用静电结合力原理保护了活性肽发挥活性作用的官能团(-COOH、-NH2、-OH)或结构域不因被化学反应而影响其活性。并且制备的活性丝素蛋白多孔材料或膜属于非溶血性材料(溶血率<0.2％)，本发明获得的活性丝素蛋白多孔材料或膜具有快速内皮化和抑制增生的功能，快速内皮化是抑制血栓形成的根本因素，在血管组织工程中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明提供一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
步骤一、制备脱胶后的家蚕丝素纤维：
将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％的碳酸钠或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度下处理2～3次，或1.0～2.5g/L生物酶水溶液中在30～60℃的温度下处理2～3次，每次处理30分钟，清洗，拉松，在60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
步骤二、制备家蚕丝素溶解液：
称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解，获得丝素溶解液。
步骤三、制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：
将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋为半透膜，截留分子量为10～14kDa，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后采用旋转蒸发器浓缩，得到质量分数为5～15％的纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。
步骤四、制备改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜：
方法一：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中加入己二酸，纯化后的家蚕丝素蛋白与己二酸的质量比为100:1～20，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的30～50％，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的15～25％，再加入2-吗啉乙磺酸，所述2-吗啉乙磺酸的终浓度为0.05M，冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜，将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，在-80℃～-20℃的温度下预冷冻2～24小时，然后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
方法二：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中加入己二酸，纯化后的家蚕丝素蛋白与己二酸的质量比为100:1～20，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的30～50％，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的15～25％，再加入2-吗啉乙磺酸，所述2-吗啉乙磺酸的终浓度为0.05M，冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜，将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃的温度下烘干，得到改性的丝素蛋白薄膜。
步骤五、制备活性丝素蛋白多孔材料和活性丝素蛋白膜。
方法一(与步骤四的方法一对应)：将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度10～1000nM的CGRP的水溶液，CGRP的水溶液浸透改性的丝素蛋白多孔材料，置于4℃下放置6～10小时，挤干溶液后冷冻干燥，得到活性丝素蛋白多孔材料。
方法二(与步骤四的方法二对应)：将所述改性的丝素蛋白薄膜放回平皿中铺平，加入50～1000ng/cm2水溶性的带正电荷的降钙素基因相关肽CGRP的水溶液，置于4℃下放置6～10小时，取出溶液后，风干，得到活性丝素蛋白膜。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到丝素蛋白多孔材料。
5.将丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度20nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.采用CCK-8法测定培养5天后、活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞和内皮细胞的增殖能力。
实施例2
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:1.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
5.将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度20nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养5天后，活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞增殖能力为实施例1的1.02倍，增殖能力没有变化；内皮细胞增殖能力为实施例1的1.15倍，增殖能力稍有提高。
实施例3
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:1.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
5.将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度100nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养5天后，活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞增殖能力为实施例1的0.99倍，增殖能力没有明显变化；内皮细胞增殖能力为实施例1的1.2倍，增殖能力有明显提高。
实施例4
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:2.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
5.将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度100nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养5天后，活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞增殖能力为实施例1的0.85倍，增殖能力收到一定的抑制；内皮细胞增殖能力为实施例1的1.42倍，增殖能力有显著提高。
实施例5
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:2.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
5.将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度500nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养5天后，活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞增殖能力为实施例1的0.74倍，增殖能力显著下降；内皮细胞增殖能力为实施例1的1.8倍，增殖能力有显著提高。
实施例6
本实施案例展示一种活性丝素蛋白多孔材料的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:2.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后-80℃～-20℃预冷冻2～24小时后冷冻干燥，得到改性的丝素蛋白多孔材料。
5.将改性的丝素蛋白多孔材料浸渍于含终浓度800nM的CGRP的水溶液，溶液量以刚刚浸透丝素材料为宜，置于4℃下放置6～10小时后挤干溶液，然后冷冻干燥得加载CGRP的活性丝素蛋白多孔材料。
6.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白多孔材料的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
7.将制备好的活性丝素蛋白多孔材料进行辐照灭菌后剪成合适大小的小圆片铺于24孔细胞培养板底部，小心地向材料内部接种1～5×105个血管平滑肌细胞或血管内皮细胞，细胞悬液以刚刚充满材料为宜，置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下2～4小时，然后补足DMEM细胞培养基置于细胞培养箱中37℃/5％CO2的环境下5天，其中每隔1天更换一次新鲜的DMEM培养基。
8.细胞增殖实验结果显示：培养5天后，活性丝素蛋白多孔材料中平滑肌细胞增殖能力为实施例1的0.7倍，增殖能力显著下降；内皮细胞增殖能力为实施例1的1.78倍，增殖能力有显著提高，与实施例5相当。
实施例7
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得丝素蛋白薄膜表面电荷为-17.5mV。
6.将丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例8
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:0.5的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得改性丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得改性丝素蛋白薄膜表面电荷为-19.4mV，丝素蛋白薄膜表面负电荷稍有增加。
6.将改性丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量为实施例7的1.2倍。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例9
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:1.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得改性丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得改性丝素蛋白薄膜表面电荷为-22.4mV，丝素蛋白薄膜表面负电荷明显增加。
6.将改性丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量为实施例7的1.5倍。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例10
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:1.5的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得改性丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得改性丝素蛋白薄膜表面电荷为-27mV，丝素蛋白薄膜表面负电荷显著增加。
6.将改性丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量为实施例7的3.1倍。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例11
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:2.0的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得改性丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得改性丝素蛋白薄膜表面电荷为-29.1mV，丝素蛋白薄膜表面负电荷显著增加。
6.将改性丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量为实施例7的5.3倍。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
实施例12
本实施案例展示一种活性丝素蛋白膜的制备方法，包括：
1.将家蚕生丝或茧壳按1:50(g/mL)的浴比放入浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理三次，每次处理30分钟，然后用去离子水将丝充分清洗干净，拉松，置于60℃烘箱内干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维。
2.称取脱胶后的丝素按1:10(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，65℃处理直至丝素纤维完全溶解，得家蚕丝素溶解液。
3.将家蚕丝素溶解液灌注于透析袋内，透析袋壁是半透膜，截留分子量为14kDa，将灌注了家蚕丝素溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或纯水更换容器内的水，持续透析3天，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液。采用旋转蒸发器浓缩、调整透析后的丝素蛋白水溶液质量分数为8％。
4.向上述丝素蛋白水溶液中，加入与丝素质量比为100:2.5的己二酸，然后分别加入丝素蛋白质量30～50％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和15～25％的N-羟基琥珀酰亚胺，再加入终浓度0.05M的2-吗啉乙磺酸冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜。将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中于40～60℃烘干，得改性丝素蛋白薄膜。
5.采用固体表面Zeta电位仪测得改性丝素蛋白薄膜表面电荷为-33.8mV，丝素蛋白薄膜表面负电荷显著增加。
6.将改性丝素蛋白薄膜放回聚苯乙烯平皿中铺平，加入800ng/cm2的带正电荷的CGRP的水溶液，然后置于4℃下放置6～10小时后取出并收集溶液，得加载CGRP的活性丝素蛋白膜。
7.采用酶联免疫吸附和紫外吸收光谱法测定收集的溶液中没有与丝素蛋白反应的CGRP含量，通过转换计算得到活性丝素蛋白膜中CGRP的最大加载量为实施例7的8倍。
8.将制备好的活性丝素蛋白膜剪成合适大小的小圆片或小方形状，按照溶血率测试方法测定丝素材料的溶血性能，取生理盐水稀释的新鲜血液与丝素材料动态接触，测得活性丝素蛋白膜的溶血率<0.2％，完全符合非溶血性材料的标准(0-2％)。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)制备脱胶后的家蚕丝素纤维：将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理，清洗，拉松，干燥，得到脱胶后的家蚕丝素纤维；
(2)制备家蚕丝素溶解液：将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中，获得丝素溶解液；
(3)制备纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液：将所述丝素溶解液灌注于透析袋内，然后置于盛有去离子水的容器内，每隔2小时用新的去离子水或者纯水更换容器内的液体，持续透析3天后浓缩，得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液；
(4)制备改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜：向所述纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液中加入己二酸，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，再加入2-吗啉乙磺酸，冰浴搅拌10～30分钟后，置于4℃下反应过夜，将反应后的混合溶液装入透析袋用去离子水透析12～48小时，然后冷冻干燥或烘干，得到改性的丝素蛋白多孔材料或改性的丝素蛋白薄膜，其中，纯化后的家蚕丝素蛋白与己二酸的质量比为100:1～20，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的30～50％，所述N-羟基琥珀酰亚胺的加入量是纯化后的家蚕丝素蛋白质量的15～25％，所述2-吗啉乙磺酸的终浓度为0.05M，在所述冷冻干燥之前还需在-80℃～-20℃的温度下预冷冻2～24小时，所述烘干为将溶液倒入一平整的聚苯乙烯平皿中，于40～60℃的温度下烘干；
(5)制备活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜：将所述改性的丝素蛋白多孔材料浸入于含终浓度10～1000nM的CGRP的水溶液中，CGRP的水溶液浸透改性的丝素蛋白多孔材料，或在所述改性的丝素蛋白薄膜上加入50～1000ng/cm2水溶性的带正电荷的降钙素基因相关肽CGRP的水溶液，放置于4℃下放置6～10小时，然后挤干溶液，冷冻干燥，得到活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜。
2.根据权利要求1所述的活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述将家蚕蚕丝或茧壳放入碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液或生物酶水溶液中加温处理是指将家蚕蚕丝或茧壳按1g:50mL的浴比放入质量浓度为0.2～0.8％碳酸钠或0.5～1.0％碳酸氢钠的水溶液中在95～100℃的温度下处理2～3次，或1.0～2.5g/L生物酶水溶液中在30～60℃的温度下处理2～3次，每次处理30分钟，所述干燥是指在60℃烘箱内干燥。
3.根据权利要求1所述的活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述将所述脱胶后的家蚕丝素纤维完全溶解于溴化锂水溶液中是指称取所述脱胶后的家蚕丝素纤维，按1g:10mL的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中，在温度为65℃的条件下处理直至丝素纤维完全溶解。
4.根据权利要求1所述的活性丝素蛋白多孔材料或活性丝素蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述透析袋为半透膜，截留分子量为10～14kDa，所述浓缩具体为采用旋转蒸发器浓缩，使调整透析后的家蚕丝素蛋白水溶液的质量分数为5～15％。
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