CN109999196B - 一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，该方法为：以金纳米棒为无机核，利用巯基透明质酸在金纳米棒表面修饰羧基并活化，随后接枝上酸性磷酸酶，加入小分子凝胶因子，利用酸性磷酸酶的酶切作用使小分子凝胶因子由亲水性变成疏水性，并在金纳米棒表面自组装，形成纳米凝胶，最后在纳米凝胶上负载氯过氧化物酶，即得到金纳米棒基工程纳米凝胶。与现有技术相比，本发明成胶方法简洁高效，成胶厚度和速率均可调，且应用于光热‑酶联合治疗具有温和高效的特点。
Description
技术领域
本发明属于高分子生物医学材料技术领域，具体涉及一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法。
背景技术
纳米凝胶就是纳米尺寸的相互交联的三维的纳米粒子，它既具有纳米材料的特性也具有水凝胶的特性。其纳米尺寸能够增加在体内循环的时间，有极好的生物相容性，易于表面修饰，并且能够提供靶向。水凝胶是通过凝胶因子在水中通过非共价键的作用自组装形成的，微凝胶的网状结构使其能够负载药物等客体分子，因此在生物学领域有着很大的应用潜力。
近年来，随着纳米技术的飞速发展，有机无机杂化纳米凝胶备受关注。这种杂化纳米凝胶将无机材料的功能性和有机凝胶层良好的生物相容性相结合，无机核具有极好的化学稳定性，有机壳又可进行一定的功能化，赋予一定的刺激响应性。在无机核的选择上，常见的有量子点，超顺磁氧化铁，金纳米颗粒等等。
专利CN108704144A公开了一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，该方法利用多肽分子中存在氨基基团，可以与经过活化的金纳米棒表面的羧基发生酰胺反应，前驱液的pH值为9-10，当酰胺反应发生时，溶液的pH值下降至6，多肽分子开始发生自组装，沉积在金纳米棒的表面，从而合成了金纳米棒基杂化纳米凝胶。该专利利用多肽分子中的氨基基团在pH发生变化时可发生自组装的特性而合成纳米凝胶，没有进一步结合金纳米棒本身存在的光热特性做出改进，以实现纳米凝胶在治疗方面的应用。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，该方法为：以金纳米棒为无机核，利用巯基透明质酸对金纳米棒表面进行羧基修饰和活化，随后接枝上酸性磷酸酶，加入小分子凝胶因子进行酶切，使小分子凝胶分子自组装并沉积在金纳米棒表面形成纳米凝胶，再在纳米凝胶上负载氯过氧化物酶，得到金纳米棒基工程纳米凝胶。
优选地，该方法具体包括以下步骤：
(1)将HA(透明质酸)溶于缓冲溶液中，依次加入EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、HOBt(1-羟基苯并***)、胱胺二盐酸盐和DTT(二硫代苏糖醇)搅拌反应并透析，得到巯基化的HA-SH；
(2)用巯基化的HA-SH修饰AuNRs(金纳米棒)，得到的羧基化AuNRs分散在缓冲溶液中，分别加入EDC·HCl和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)搅拌以活化羧基，得到活化的AuNRs溶液，将酸性磷酸酶(AP)加入到活化的AuNRs中，搅拌反应，得到AuNRs-AP溶液；
(3)将小分子凝胶因子溶解在去离子水中，并将其加入到AuNRs-AP溶液中，搅拌反应，得到金纳米棒基杂化纳米凝胶；
(4)将金纳米棒基杂化纳米凝胶分散在缓冲溶液中，加入氯过氧化物酶进行负载，得到金纳米棒基工程纳米凝胶。
优选地，所述巯基化的HA-SH通过以下步骤制备而成：
(a)将HA溶于缓冲溶液中，分别加入EDC·HCl和HOBt进行搅拌以活化羧基；
(b)将胱胺二盐酸盐加入步骤(a)所得的溶液中，即发生酰胺反应，搅拌后透析；
(c)将DTT加入步骤(b)所得的溶液中用于还原双硫键，搅拌后透析，得到巯基化的HA-SH。
优选地，所述步骤(a)中的搅拌时间为1-3h；所述步骤(b)中的搅拌时间为10-14h，透析时间为0.5-1.5d；所述步骤(c)中的搅拌时间为22-26h，透析时间为1.5-2.5d。
优选地，以5g透明质酸HA计：所述步骤(a)中加入的缓冲溶液体积为250mL，EDC·HCl为3.71g，HOBt为5.067g，其中缓冲溶液为PBS溶液，pH为7.0；所述步骤(b)中加入的胱胺二盐酸盐为8.445g；所述步骤(c)中加入的DTT为9.64g。
优选地，所述羧基化AuNRs通过以下步骤制备而成：
(Ⅰ)制备Au晶种溶液：配制十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，加入氯金酸(HAuCl4)溶液和超纯水，再往其中加入NaBH4溶液，搅拌反应后恒温静置，溶液逐渐由无色变为浅棕色；
(Ⅱ)制备Au生长溶液：配制十六烷基三甲基溴化铵水溶液，恒温水浴和搅拌下依次加入HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液，搅拌至溶液从黄色变为无色；
(Ⅲ)AuNRs生长：将Au生长溶液保持恒温，加入Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为***，再继续搅拌一段时间后静置，得到AuNRs溶液；
(Ⅳ)AuNRs羧基化：去除AuNRs溶液中过量的十六烷基三甲基溴化铵，并分散在缓冲溶液中，加入HA-SH搅拌，得到羧基化的的金纳米棒AuNRs-COOH；
(V)制备AuNRs-AP：配制酸性磷酸酶水溶液，将其加入到羧基化的AUNRs溶液中，搅拌反应。
优选地，所述步骤(Ⅰ)中，十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、超纯水和NaBH4溶液的添加量比为7.5mL：250μL：1650μL：600μL，其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，NaBH4溶液浓度为0.01mol/L；所述步骤(Ⅱ)中十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液的添加量比为：100mL：5mL：800μL：2mL：800μL，其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，AgNO3溶液浓度为0.01mol/L，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/L；所述步骤(Ⅲ)中以制备Au生长溶液所需的AgNO3溶液计，每800μL AgNO3溶液对应的Au生长溶液中加入240μL Au晶种溶液；所述步骤(Ⅳ)中缓冲溶液体积为20mL，加入的HA-SH为20mg，其中缓冲溶液为MES溶液，浓度为0.1mol/L，pH为6.5。所述步骤(V)中加入的酸性磷酸酶溶液浓度为1mg/mL，搅拌时间为1-2h。
优选地，所述步骤(Ⅰ)中的搅拌反应时间为1-3min，反应后保持28-32℃恒温1.5-2.5h；所述步骤(Ⅱ)中的恒温温度为28-32℃，所述步骤(Ⅲ)中的再继续搅拌时间为40-60min，静置条件为恒温28-32℃，静置时间为16-20h；
所述步骤(Ⅳ)中的搅拌时间为22-26h。
优选地，所述步骤(2)中的搅拌时间为25-35min；所述步骤(3)中的搅拌反应时间为22-26h，温度为28-32℃；所述步骤(4)中的负载时间为10-14h。
优选地，所述小分子凝胶因子为Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH；AuNRs、AP酶、EDC·HCl、NHS和Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的添加量之比为5mg：10mg：2mg：10mg：30mg；所述步骤(4)中的缓冲溶液为Tris·HCl缓冲溶液，pH为7.4，加入量为5mL，氯过氧化物酶的加入量为10μL。
本发明选择以金纳米棒为无机核，通过酸性磷酸酶的酶切作用去切除Fmoc-Tyr-(H2PO3)-OH中的磷酸根，降低其亲水性，使其变成一个疏水性的凝胶因子Fmoc-Tyr-OH，继而在无机核表面自组装形成微凝胶，并结合了金纳米棒的光热特性和纳米凝胶层负载的氯过氧化物酶诱导的单线态氧实现串联治疗。本发明利用核壳结构的小分子纳米凝胶装载氯过氧化物酶(CPO)，利用金纳米棒能将近红外光转化为热，即在体外光热诱导产生活性氧簇(ROS)，CPO诱导级联放大的酶动力学治疗产生单线态氧1O2，从而实现光热-酶促协同治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
(1)与传统的成胶方法相比，本发明成胶方法简洁高效。酶和多肽均具有较高的生物相容性，酶切法成胶是通过降低多肽的亲水性，在金纳米棒表面自组装，成胶过程简洁，生物相容性好，在生物医学领域应用广泛。
(2)与传统成胶方法相比，本发明的成胶厚度和速率均可调。通过改变多肽凝胶因子的量将凝胶层调节到合适的厚度，既有利于细胞内化，又能装载较多的客体分子。
(3)与传统治疗方法相比，光热-酶联合治疗具有温和高效的特点。金纳米棒由于其独特的光学特性，被广泛应用于光动力学治疗。在特定波长的入射光下，金纳米棒可以作为光热转换器产生活性氧组分引起组织的破坏。本发明是以肿瘤微环境特异性为基础的治疗手段，低强度的外源刺激具有较高的安全性，酶诱导的级联放大治疗具有高效性。为生物医学肿瘤治疗提供了一种新的可能性。
附图说明
图1为本发明一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法示意图；
图2为本发明巯基化的HA-SH的合成示意图；
图3为本发明巯基化的HA-SH的NMR图；
图4为本发明金纳米棒的透射电子显微镜形貌表征图；
图5为本发明金纳米棒修饰前后电位表征图；
图6为本发明金纳米棒基工程纳米凝胶的透射电子显微镜形貌表征图；
图7为本发明金纳米棒基工程纳米凝胶在荷瘤小鼠瘤内注射后瘤体变化示意图；
图8为本发明金纳米棒基工程纳米凝胶在荷瘤小鼠瘤内注射后各瘤体实物图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例中所用试剂均为购买的市售产品，具体商家型号详见表1。
表1各试剂一览表
一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，该方法为：利用巯基透明质酸对金纳米棒表面进行羧基修饰和活化，随后接枝上酸性磷酸酶，加入小分子凝胶因子进行酶切，使小分子凝胶分子自组装并沉积在金纳米棒表面形成纳米凝胶，再在纳米凝胶上负载氯过氧化物酶，得到金纳米棒基工程纳米凝胶。其中，小分子凝胶因子为Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH。具体如图1所示，该方法具体包括以下步骤：
(1)将HA溶于缓冲溶液中，依次加入EDC·HCl、HOBt、胱胺二盐酸盐和DTT搅拌反应并透析，得到巯基化的HA-SH；
(2)用巯基化的HA-SH修饰AuNRs，得到的羧基化AuNRs分散在缓冲溶液中，分别加入EDC·HCl和NHS搅拌以活化羧基，得到活化的AuNRs溶液，将该溶液用高速离心机高速(9000rpm)离心之后，分散在18mL超纯水中，配制酸性磷酸酶(AP)溶液，并将其加入活化的AuNRs溶液中，搅拌反应得到AuNRs-AP溶液；
(3)将小分子凝胶因子溶解在去离子水中，并将其加入到AuNRs-AP溶液中，搅拌反应，得到金纳米棒基杂化纳米凝胶(AuNRs-SNgel)；
(4)用超高速离心机高速(8000rpm)将金纳米棒基杂化纳米凝胶离心三次，分散在5mL pH为7.4的Tris·HCl缓冲溶液中，加入氯过氧化物酶进行负载，得到金纳米棒基工程纳米凝胶(AuNRs-SNgel@CPO)，将产物用pH为7.4的Tris·HCl缓冲溶液洗3次即可。
其中，AuNRs、AP酶、EDC·HCl、NHS和Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH多肽小分子的添加量之比5mg：2mg：10mg：10mg：30mg；步骤(4)中加入的氯过氧化物酶体积为10μL。步骤(2)中的搅拌时间为30min；步骤(3)中的搅拌反应时间均为24h，温度为30℃；步骤(4)中的负载时间为12h。如图6所示，AuNRs-SNgel与AuNRs相比，可以看到明显的凝胶层，呈现核壳结构。如图7和8所示，在生物应用中，分别对荷载SMMC-7721的裸鼠组进行相应PBS缓冲溶液和AuNRs-SNgel@CPO药物瘤内注射50uL(注射点为0天，1天，2天，4天，7天)，每次注射药物后NIR治疗1次，金纳米棒基工程纳米凝胶治疗效果最为明显。
修饰羧基的药品可以采用常规已制成的商品，在本发明的实施方式中，巯基化的HA-SH通过以下步骤制备而成：(a)将5g HA溶于250mL pH为7.0的PBS缓冲溶液中，分别加入3.71g EDC·HCl和5.067g HOBt进行搅拌2h以活化羧基；(b)将8.445g胱胺二盐酸盐加入步骤(a)所得的溶液中，即发生酰胺反应，搅拌12h后用MW3500的透析袋透析1d；(c)将9.64gDTT加入步骤(b)所得的溶液中用于还原双硫键，搅拌22-26h后透析2d，得到巯基化的HA-SH。如图3和4所示，通过NMR测试可以发现，巯基已成功修饰，并且巯基的接枝率约为33％。
羧基修饰的金纳米棒可以采用现有商品，在本发明的实施例中，羧基化AuNRs通过以下步骤制备而成：(Ⅰ)制备Au晶种溶液：配制0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液7.5mL，加入0.01mol/L HAuCl4溶液250μL和超纯水1650μL，再往其中加入0.01mol/LNaBH4溶液600μL，快速搅拌反应2min，反应后保持30℃恒温静置2h，溶液逐渐由无色变为浅棕色；(Ⅱ)制备Au生长溶液：配制0.1mol/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液100mL，在30℃水浴和高速搅拌下依次加入0.01mol/L HAuCl4溶液5mL、0.01mol/L AgNO3溶液800μL、0.5mol/L H2SO4溶液2mL和0.1mol/L抗坏血酸溶液800μL，搅拌至溶液从黄色变为无色；(Ⅲ)AuNRs生长：将Au生长溶液保持恒温，加入240μL晶种溶液Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为***，再继续搅拌50min后，停止搅拌并恒温30℃静置18h，得到AuNRs溶液，如图3所示，通过透射电子显微镜观察AuNRs的形貌，可以看到粒径大小为13×46nm的AuNRs，分散性良好，粒径均一；(Ⅳ)AuNRs羧基化：用去离子水去除AuNRs溶液中过量的CTAB，并分散在0.1mol/L且pH为6.5的MES缓冲溶液中，加入20mg巯基化的HA-SH搅拌24h，得到羧基化的AuNRs，即AuNRs-COOH，将得到的羧基化产物用高速离心机高速离心三次，去除溶液中的过量HA-SH，并重新分散于5mL超纯水中，如图5所示，通过电位测试可以发现由于金纳米棒表面存在CTAB，故显正电位，当修饰上羧基之后，电位变成负值，说明金纳米棒成功修饰上羧基。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，该方法为：以金纳米棒为无机核，利用巯基透明质酸在金纳米棒表面修饰羧基并活化，随后接枝上酸性磷酸酶，加入小分子凝胶因子，利用酸性磷酸酶的酶切作用使小分子凝胶因子由亲水性变成疏水性，并在金纳米棒表面自组装，形成纳米凝胶，最后在纳米凝胶上负载氯过氧化物酶，即得到金纳米棒基工程纳米凝胶；
所述方法具体包括以下步骤：
（1）将HA溶于PBS溶液中，依次加入EDC·HCl、HOBt、胱胺二盐酸盐和DTT搅拌反应并透析，得到巯基化的HA-SH；
（2）用巯基化的HA-SH修饰AuNRs，得到羧基化AuNRs，分散在MES溶液中，分别加入EDC·HCl和NHS搅拌以活化羧基，得到活化的AuNRs溶液，随后接枝上酸性磷酸酶，得到AuNRs-AP；
（3）将小分子凝胶因子溶解在去离子水中，并将其加入到活化的AuNRs溶液中，搅拌反应，得到金纳米棒基杂化纳米凝胶；
（4）将金纳米棒基杂化纳米凝胶分散在缓冲溶液中，加入氯过氧化物酶进行负载，得到金纳米棒基工程纳米凝胶；
步骤（1）具体方法为：
（a）将HA溶于PBS溶液中，分别加入EDC·HCl和HOBt搅拌；
（b）将胱胺二盐酸盐加入步骤（a）所得的溶液中，搅拌后透析；
（c）将DTT加入步骤（b）所得的溶液中，搅拌后透析，得到巯基化的HA-SH；
所述HA与PBS溶液的用量配比为1g/50mL，所述HA、EDC·HCl、HOBt、胱胺二盐酸盐及DTT的质量比为5：3-4：5-5.5：8-9：9-10；
步骤（2）具体方法为：
（Ⅰ）制备Au晶种溶液：配制十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入HAuCl4溶液和超纯水，再往其中加入NaBH4溶液，搅拌反应后恒温静置；
（Ⅱ）制备Au生长溶液：配制十六烷基三甲基溴化铵水溶液，恒温水浴和搅拌下依次加入HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液，搅拌至溶液从黄色变为无色；
（Ⅲ）AuNRs生长：将Au生长溶液保持恒温，加入Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为***，再继续搅拌一段时间后，停止搅拌并静置，得到AuNRs溶液；
（Ⅳ）AuNRs羧基化：去除AuNRs溶液中过量的十六烷基三甲基溴化铵，并分散在缓冲溶液中，加入巯基化的HA-SH搅拌，得到羧基化的的金纳米棒AuNRs-COOH；
（）制备AuNRs-AP：配制酸性磷酸酶水溶液，将其加入到羧基化的AuNRs溶液中，搅拌反
应。
2.根据权利要求1所述的一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（Ⅰ）中，十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、超纯水和NaBH4溶液的添加量比为7.5mL：250µL：1650µL：600µL，其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，NaBH4溶液浓度为0.01mol/L；搅拌反应时间为1-3min，反应后保持28-32℃恒温静置1.5-2.5h。
3.根据权利要求1所述的一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（Ⅱ）中十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液的添加量比为100mL：5mL：800µL：2mL：800µL，其中十六烷基三甲基溴化铵水溶液浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，AgNO3溶液浓度为0.01mol/L，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/L；步骤（Ⅱ）中的恒温温度为28-32℃。
4.根据权利要求1所述的一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（Ⅲ）中以制备Au生长溶液所需的AgNO3溶液计，每800µL AgNO3溶液对应的Au生长溶液中加入240µL Au晶种溶液；搅拌时间为40-60min，静置条件为恒温28-32℃，静置时间为16-20h；
所述步骤（Ⅳ）中缓冲溶液为20mL，加入的HA-SH为20mg，其中缓冲溶液为MES溶液，浓度为0.1mol/L，pH为6.5，所述步骤（Ⅳ）中的搅拌时间为22-26h；
所述步骤（）中加入的酸性磷酸酶溶液浓度为1mg/mL，搅拌时间为1-2h。
5.根据权利要求1所述的一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的搅拌时间为25-35min；所述步骤（3）中的搅拌反应时间均为22-26h，温度为28-32℃；所述步骤（4）中的负载时间为10-14h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种金纳米棒基工程纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述小分子凝胶因子为Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH；AuNRs-AP、EDC·HCl、NHS和Fmoc-Tyr(H2PO3)-OH的质量之比为5：10：10：30；所述步骤（4）中的缓冲溶液为三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，pH为7.4。
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