CN109991222A - 一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学尿液检测领域，具体是一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法，包括进样单元、尿液除干扰单元、检测单元、运算单元、显示单元。尿液除干扰单元采用预处理后的弱碱型阴离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂以0.5～1:0.6～1.2的比例混合，以1～3g树脂处理1～3mL尿液的量，用于婴儿尿液去除干扰，其效果较好。配合酶反应分时检测法，拓宽了尿液半乳糖的检测范围，可达到半乳糖血症和乳糖吸收状况的一同检测，节省了检测药品，提高了检测效率。

Description

一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法

技术领域

本发明涉及医学尿液检测领域，尤其涉及一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法。

背景技术

半乳糖血症是一种由于先天性半乳糖代谢酶缺乏导致半乳糖利用障碍而引起一系列代谢紊乱症状的常染色体隐性遗传病。半乳糖在肝脏中经至少三种酶催化最后转变成葡萄糖而被利用。肝脏中三种酶的任意一种或几种活性降低或缺乏都会造成半乳糖异常堆积，导致血液和尿液中半乳糖含量升高。

半乳糖代谢产物半乳糖-1-磷酸及半乳糖醇均为有毒代谢产物，异常堆积于神经元中及肾脏的上皮细胞中,干扰它们的代谢活动,妨碍了正在成长中的神经组织细胞膜的形成，影响婴儿智力发育，还会造成肾脏衰竭；半乳糖醇损伤晶状体，甚至会导致白内障的形成。

若半乳糖血症发现及时，只需停止摄入含乳糖、半乳糖的食物即可以有效避免婴儿智力发育落后，极大提高患者生活质量。因此半乳糖血症的及早筛查非常重要。

目前半乳糖血症诊断方法主要有：①酶学检验，主要方法为Beutler试验，Beutler试验主要是检测全血中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的活性，结果容易出现假阳性。②血液和尿液中半乳糖检验，主要方法有Paigen试验，主要为半定量检测血液样本中半乳糖和半乳糖-1-磷酸浓度。实验需用细菌，结果易受抗生素等干扰。此法不仅能检测半乳糖的含量,还包括其他几种物质,如尿苷二磷酸半乳糖和乳糖,故须注意这些物质的污染所产生的假阳性。③基因检验，由于耗时较长且费用较高不适用筛查检验，可作为辅助诊断方法。除此之外，还有利用气相色谱和质谱联用的方法检测代谢产物，但此方法费用较高，效率低，不适用于筛查检验。我国报道的半乳糖血症病例，其检测流程一般为：先检查尿液中尿糖的含量，当尿糖显示++及以上，且葡萄糖氧化酶检测结果为阴性时进行还原物分析，分析方法有，色谱分析、尿液粘液酸试验、成脎试验、纸层析等，检测方法较复杂。

通过上述描述可知，半乳糖血症患儿在饮奶期间（0～6个月），其尿液中半乳糖含量会明显高于正常值（＜3.33mmol/L），因此只要通过检测婴儿尿液中半乳糖含量即可实现快速筛查半乳糖血症。相对于血液检测来说，尿液检测为无创检测，患儿接受度高，实验耗时少，成本低。

尿液中半乳糖的含量不仅和半乳糖血症有联系，还和乳糖吸收状况有关。婴儿在饱和饮奶，肠道乳糖酶活性正常的情况下，尿液中半乳糖含量在0.9mmol/L以上。当婴儿乳糖吸收不良或不耐受时，尿液中半乳糖含量会减少。因此可通过检测婴儿尿液中半乳糖的含量来辅助诊断乳糖吸收状况。

由于乳糖吸收不良不会对婴儿生命造成严重威胁，因此一直未得到重视，但据国内文献调查表明，我国新生儿乳糖吸收不良的发生率在40%左右。乳糖约占母乳的7%左右，是新生儿的主要能量来源之一，乳糖的分解产物半乳糖苷参与婴儿大脑的发育，乳糖的分解产物短链脂肪酸还能促进婴儿对矿物质的吸收，因此婴儿对乳糖的消化吸收状况，会影响其身体和智力发育。当乳糖酶分泌减少时虽然不会出现临床症状但会影响婴儿的身高、体重发育；当乳糖酶分泌严重不足时会导致乳糖不耐受的发生，此时婴儿会出现腹泻的症状，持续喂食含乳糖食物甚至会导致腹泻迁延不愈，严重影响婴儿身体发育和智力发育，因此对婴儿乳糖吸收状况的检测有重要的意义。

目前市场上已经有了尿半乳糖的检测试剂盒，但主要针对成人，无法对婴儿尿液中半乳糖含量进行检测。这是因为尿液中半乳糖含量较低，检测结果易受干扰物影响，且与成人尿液相比，婴儿尿液中含有更多的干扰，如果无法对婴儿尿液进行有效除杂，就不能对其尿液半乳糖含量进行准确检测。发明专利CN104764648A利用三氯化铝或气象二氧化硅絮凝剂对尿液进行初步除杂，再利用预处理后的活性炭进一步除干扰，此法需两步操作，操作复杂费时；发明专利CN1811395A使用预处理后的活性炭结合氧化铝吸附干扰物，经滤纸过滤后得到纯化尿液，由于氧化铝和活性炭均为非特异性吸附，因此除干扰效果不理想；国外有对尿液稀释来达到降低干扰的方法，此法只适用于浓度较大物质的测定，不适合半乳糖等浓度较低物质的测定；国外文献还有用离子交换纸除干扰的实验，此方法除干扰效果较好，但离子交换纸价格昂贵，不适用于快速筛查。

发明专利CN107741491A和发明专利CN1811395A都是关于尿半乳糖检测的发明专利，针对的是乳糖吸收状况方面的检测无法检测半乳糖血症，且检测目标多为成人。发明专利CN104316692A和CN102816833A是针对半乳糖血症的检测试剂盒，其检测的是婴儿血液，操作较复杂，无法实现自动化和快速筛查。发明专利CN1461347A是针对半乳糖血症和其他三种遗传病的检测方法和设备，无法对乳糖吸收状况进行检测。

综上所述，现有尿液半乳糖检测产品无法对婴儿尿液进行有效去除干扰，且由于半乳糖血症检测半乳糖含量高于3.33mmol/L，乳糖吸收状况检测半乳糖含量在0.9mmol/L左右，两种疾病同时筛查，检测范围需至少达到0～3.33mmol/L，检测范围太宽，无法实现同时定量检测。

通过查阅文献和实验室研究，我们发现：①一定比例的离子交换树脂能去除婴儿尿液中大部分的干扰物，从而实现对婴儿尿液中半乳糖含量的准确测定；②采用酶反应法检测底物浓度，当pH、反应温度和酶活相同（过量）时，通过反射光度和底物浓度的曲线发现，反应时间越长，曲线初始斜率越大，其检测范围（呈线性部分）越窄，反应时间越短，曲线初始斜率越小，其检测范围越宽（如图），通过增加检测时间点可加大样品的定量检测范围。对于同一个单孔测试板，当反应时间短时，检测半乳糖血症的反射光度，反应时间长时，检测乳糖吸收状况的反射光度，使半乳糖血症和乳糖吸收状况能在一个单孔测试板实现一同检测。

发明内容

本发明提供一种可对婴儿尿液中半乳糖进行定量检测的婴儿尿液半乳糖定量检测仪，应用其检测方法可实现对婴儿半乳糖血症和乳糖吸收状况的一同检测。

本发明的技术方案如下：本发明为一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法，包括进样单元、尿液除干扰单元、检测单元、运算单元、显示单元，其特点是尿液除干扰单元采用离子交换树脂和滤膜达到过滤除干扰的目的；检测单元所使用的检测方法为酶反应分时检测法。

所述的离子交换树脂优选弱碱型阴离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂，按0.5～1:0.6～1.2重量比混合均匀后，以1～3g处理1～3mL尿液的量使用。所述的离子交换树脂需进行预处理，先用30～40℃纯水浸泡2～3次，每次30min，以除去水溶性杂质，沥水后用乙醇浸泡24小时，以除去醇溶性有机杂质，纯水冲洗至无乙醇，沥水备用。

所述滤膜为亲水性滤膜，可以为醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、混酯膜再生纤维素膜、聚醚砜膜、尼龙膜、改性聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、滤纸中的一种或几种。

所述酶反应分时检测法为在两个及以上时间点对测试板进行检测。

所述测试板优选单孔测试板。

所述的两个及以上时间点需取在所测底物反应未达到平衡前。

所述两个时间点分别为：滴加尿样后在5～10min检测半乳糖血症相关的反射光度，在10～20min检测乳糖吸收状况相关的反射光度。

所述单孔测试板为酶偶联单孔测试板，显色原理为尿液中半乳糖和氧气在半乳糖氧化酶的催化下产生过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶催化下产生有氧化活性的分子氧，分子氧氧化Trinder试剂显色。

使用婴儿尿液半乳糖定量检测仪的具体操作步骤如下：①进样单元定量吸取婴儿尿液，将婴儿尿液注入尿液除干扰单元，震荡1～3min；②将震荡后的婴儿尿液移入移液器；③用移液器定量将过滤后尿液加入单孔测试板并计时；④检测器分别在设定的两个或以上时间点自动检测反射光度；⑤运算单元根据室温修正反应结果，并计算；⑥显示单元显示具体结果。

本发明提供的自动婴儿尿液半乳糖检测仪及其检测方法的优点如下：①有效去除婴儿尿液中的干扰物质，实现婴儿尿液中半乳糖的准确测定，纯化速度快，价格低廉；②将尿液半乳糖的定量检测范围拓宽到0～3.33mmol/L以上，用一个单孔测试板实现了对半乳糖血症和乳糖吸收状况的一同测定，检测效率高，节省药品；③可制作为半自动和全自动两种形式，满足不同的需求。

附图说明

图1为不同反应时间下样品浓度和反射光度的曲线。

具体实施方式

实施例1

自动婴儿尿液半乳糖检测仪及其检测方法

自动婴儿尿液半乳糖检测仪包括：自动进样单元、尿液除干扰单元、检测单元、运算单元、机电控制单元、显示单元。

其中尿液除干扰单元使用的除干扰物为预处理后的树脂。树脂预处理方法为先用30℃纯水浸泡2次，每次30min，沥水后用乙醇浸泡24小时，纯水冲洗至无乙醇，沥水备用。

所用弱碱型阴离子交换树脂：弱酸型阳离子交换树脂=1:1，填充量为2g，滤膜为醋酸纤维素膜。

具体操作步骤如下：①将4mL婴儿尿液盛于试管，置于样品插槽；②机器用真空吸管将2mL尿样吸入尿液除干扰单元，采用超声波震荡2min；③压杆装置将震荡后的尿样经醋酸纤维素膜过滤后推入移液器；④移液器移动到单孔测试板加样孔，定量加50μL样品后启动计时器；⑤检测器分别在5min和20min两个时间点自动检测单孔测试板反射光度；⑥运算单元室温修正反应结果后，根据5min时和20min时的标准曲线进行计算并分析；⑦显示单元显示不同时间点测定的半乳糖浓度的检测结果和结果分析报告。

实施例2

半自动婴儿尿液半乳糖检测仪及其检测方法

半自动婴儿尿液半乳糖检测仪包括：进样单元（移液器）、尿液除干扰单元、检测单元、运算单元、显示单元。

其中尿液除干扰单元使用的除干扰物为预处理后的树脂。树脂预处理方法为先用35℃纯水浸泡3次，每次30min，沥水后用乙醇浸泡24小时，纯水冲洗至无乙醇，沥水备用。

所用弱碱型阴离子交换树脂：弱酸型阳离子交换树脂=0.8:1，填充量为3g，滤膜为尼龙膜。

具体操作步骤如下：①用移液器吸取3mL婴儿尿液注入尿液除干扰单元；②手动震荡3min后将尿液用尼龙膜过滤，移入移液器；③移液器定量加50μL样品于单孔测试板后，将单孔测试板***检测单元，检测器自动启动计时器；④检测器分别在6min和18min两个时间点自动检测单孔测试板反射光度；⑤运算单元室温修正反应结果后，根据6min时和18min时的标准曲线进行计算并分析；⑥显示单元显示不同时间点测定的半乳糖浓度的检测结果和结果分析报告。

Claims (9)

1.一种婴儿尿液半乳糖定量检测仪及其检测方法，包含进样单元、尿液除干扰单元、检测单元、运算单元、显示单元，其特征在于尿液除干扰单元使用离子交换树脂和滤膜对尿液进行去除干扰，检测单元所用的检测方法为酶反应分时检测法。

2.根据权利要求1所述的尿液除干扰单元，其特征在于所述离子交换树脂为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂按0.5～1:0.6～1.2的重量比混合均匀后，以1～3g处理1～3mL尿液的量使用。

3.根据权利要求2所述尿液除干扰单元，其特征在于所述阴离子交换树脂优选弱碱型阴离子交换树脂，阳离子交换树脂优选弱酸型阳离子交换树脂。

4.根据权利要求2所述尿液除干扰单元，其特征在于所述的离子交换树脂需进行预处理，先用30～40℃纯水浸泡2～3次，每次30min，以除去水溶性杂质，沥水后用乙醇浸泡24小时，以除去醇溶性有机杂质，纯水冲洗至无乙醇，沥水备用。

5.根据权利要求1所述尿液除干扰单元，其特征在于所述滤膜为亲水性滤膜，可以为醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、混酯膜再生纤维素膜、聚醚砜膜、尼龙膜、改性聚偏氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚偏二氟乙烯膜、滤纸中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的酶反应分时检测法，其特征在于在两个及以上时间点对测试板进行检测。

7.根据权利要求6所述的酶反应分时检测法，其特征在于所述的测试板优选单孔测试板。

8.根据权利要求6所述的酶反应分时检测法，其特征在于所述的两个及以上时间点取在所测底物反应达到平衡之前。

9.根据权利要求6所述的酶反应分时检测法，其特征在于所述的两个时间点分别为：滴加尿样后在5～10min检测半乳糖血症相关的反射光度，在10～20min检测乳糖吸收状况相关的反射光度。