CN109988757B

CN109988757B - 一种表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法

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Publication number: CN109988757B
Application number: CN201811638218.4A
Authority: CN
Inventors: 黄留琴; 刘庆国; 赵南; 邹亚男; 朱杰; 刘桂文; 陈勇; 应汉杰
Original assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; JIANGSU PRODUCTIVITY PROMOTION CENTER; Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Institute Of White Biotech Co ltd; JIANGSU PRODUCTIVITY PROMOTION CENTER; Nanjing Tech University
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109988757A

Abstract

本发明公开了一种表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法，它将纤维材料固定于球状的网格中作为固定化介质，同时将固定化介质填装于发酵罐中,使酵母通过吸附的作用固定于纤维载体上并进行发酵,发酵2‑4批结束后，每批发酵酒度到8‑10％(v/v)时，排料至另外发酵罐，并补料至满罐，待酒度至8‑10％(v/v)，继续排料至另外空罐。以此类推，进行半连续发酵。该固定化方法不仅生产成本低、操作方便、工艺稳定，发酵强度大，产物得率高，而且可以使固定化酵母具有持久、较高的活性。

Description

一种表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种表面固定化酵母半连续发酵技术。

背景技术

由于化石能源和其他不可再生能源的过度开发，能源危机已经成为当今世界发展首要解决的问题。寻找新的替代能源已成为这些年来能源战略的重点。乙醇不仅是一种可再生燃料,而且可以与汽油混合使用以任何比例混合,以缓解石油需求的压力，是一直良好的能源替代品。目前燃料乙醇生产企业通常采用的大接种量(20-35％)方式进行游离发酵，菌浓较高(>2.5亿个/ml)，消耗糖份较高，造成一定程度上的浪费；另外，发酵后期由于机械搅拌和产物抑制作用，导致酵母死亡率较高，发酵后劲不足，发酵周期长，残总糖水平较高，从而使得淀粉利用率较低。同时，在酒母扩陪和整个发酵过程中，易发生染菌现象，从而进一步降低淀粉利用率。

固定化酵母研究历史较为悠久，其优点也很明显，比如载体吸附的高密度酵母，其菌群优势明显，使得发酵过程不易染菌，发酵速度快，总糖消耗更为彻底。另外，固定化酵母能反复利用，省去了酒母扩陪过程中的人力物力及财力，且便于连续化发酵。然而投入生产的案列少之甚少，主要存在的问题有：固定化介质成本高、机械强度低、吸附效果和传质效果差以及连续化发酵酵母活性易退化和易染菌等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种表面固定化酵母半连续发酵技术，以解决现有技术存在的固定化酵母发酵产乙醇效果不佳等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种表面固定化酵母半连续发酵技术，它包括如下步骤：

(1)将装有吸附材料的球形网格状载体填充于具有循环管路的分层发酵罐中；

(2)向步骤(1)中所述的发酵罐中泵入酒母，循环式培养并使其中的酿酒酵母吸附固定于球形网格状载体的吸附材料上；

(3)酿酒酵母吸附固定结束后，排出酒母醪，泵入发酵培养基进行固定化酿酒酵母发酵，前2-4批发酵结束后更换新的发酵培养基；

(4)2-3批发酵稳定后，每批发酵酒度到8-10％(v/v)时排料50-100％至另外空发酵罐继续后发酵，并补充新的发酵培养基到固定化发酵罐至满罐。待酒度至8-10％(v/v)时再继续排料至另外空发酵罐继续后发酵，并补料至满罐。以此类推进行半连续发酵，且每2-3批更换一种抑菌剂；

步骤(1)中，所述的吸附介质为植物纤维、动物纤维和化学合成纤维中的任意一种或几种的组合。

步骤(1)中，所述的球型网格由聚丙烯或聚乙烯制成。

步骤(1)中，所述的吸附介质为正方形或圆形片状，其边长与球形网格直径的比值为0.6～0.8：1；其中，一个球型网格中装有2～5片吸附介质。

步骤(1)中，所述的发酵罐的高径比为1.5～2.5：1；每个发酵罐中，吸附介质绝干的量为2～8g/L。

步骤(1)中，所述的发酵罐罐内设置2-4层，每层用格栅隔开，格栅孔径为球形载体直径0.4-0.6倍，球形载体置于格栅之上。

步骤(2)中，所述的酒母为人工半合成培养基，玉米、木薯或陈化粮的糖化液和糖蜜中的任意一种或几种的组合，酵母数量为1.8～3.5亿个/ml；

其中，

所述的人工半合成培养基的配方为葡萄糖25～200g/L，蛋白胨2～20g/L，酵母膏2～10g/L，硫酸镁0.2～1g/L，Ph4.0～4.5；

所述的玉米、木薯或陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5～3：1，辅料为尿素0.1-0.5g/l；

所述的糖蜜的初始总糖为30～200g/L，不加辅料；

其中，所述的循环式培养并固定是指30～35℃下循环培养，循环量为0.5～4BV。

步骤(3)中，所述的种子固定结束是指残还原糖降至2g/l以下，且游离酵母菌体量下降幅度达1.0～2.0亿个/ml。

步骤(3)中，所述的发酵液为人工配置培养基，玉米、木薯或陈化粮的糖化液和糖蜜中的任意一种或几种的组合；

其中，

所述的人工半合成培养基的配方为葡萄糖200～250g/L，蛋白胨3～10g/L，酵母膏3～10g/L，硫酸镁0.1～1g/L，pH4.0～4.5；

所述的玉米、木薯或陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5～3：1；辅料尿素0.2-0.3g/l；

所述的糖蜜的初始总糖为200～260g/L；

所述的固定化酵母发酵条件为：温度32-35℃，循环量0.5-2BV。

步骤(3)中，单批发酵结束以外观糖降至0.3°Bx以下，还原糖降至2g/L以下为准。

步骤(4)中，发酵稳定是指连续2-3批的发酵周期相差不超过6小时，游离细胞浓度降至0.9亿个/ml以下。

步骤(4)中泵入新的发酵罐发酵条件：温度32-36℃，循环量0.5-1BV，发酵终点与固定化发酵前2-3批发酵相同。

有益效果：

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明采用的固定化技术所用材料成本低、无毒性；吸附介质表面积大，吸附效果好；

2、本发明采用的固定化方式装填密度低，载体间空隙大，与其他填充式吸附或交联载体相比，传质作用更强。传质效果较好；

3、本发明采用的半连续发酵比间歇式发酵效率更高，前期在固定化发酵罐中快速反应缩短了整个发酵周期，后期泵入空罐进行后发酵，由于菌浓低但活性较高，相比游离发酵，提高了淀粉转化率。

4、半连续发酵可以使得固定化酵母一直处于较高的活性，同时避免了连续式发酵过程中易染菌的现象，适用于工业化应用；

附图说明

图1为球状网格的结构示意图。

图2为本发明的流程示意图；

1糖化醪罐，2固定化罐，3空发酵罐，4空发酵罐连接管，5离心泵，6冷却进水，7冷却出水。

具体实施方式

实施例1以合成培养基为发酵原料采用竹纤维固定化酵母半连续发酵产燃料乙醇

首先，将剪成边长2.5cm的棉纤维(厚度0.22cm)固定于聚丙乙烯制成的如图1所示直径4.5cm球形网格中轴上(球孔边长0.8cm)，制备成固定化介质；然后将固定化介质以2g/L的填充量放入高径比2:1的100L反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为80L/min循环固定42h。直至菌体吸附浓度2.0亿个/ml。然后排出废液。再流加发酵培养基(葡萄糖浓度为220g/L，发酵液pH4.2)，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为34℃，流速为800L/h。发酵从三批开始溶液中游离酵母浓度降至0.8亿个/ml左右，并趋于稳定。发酵酒度达9％(v/v)时，将发酵液排至空罐进行后发酵，发酵10批后平均发酵周期为12小时左右，比固定化间歇式发酵时间缩短了4小时，糖醇转化率相当，比游离单批发酵快了12个，糖醇转化率提高了6个百分点。

实施例2以木薯液化醪培养基为发酵原料采用竹纤维固定化酵母半连续发酵产燃料乙醇。

首先，将剪成直径为18cm的柱纤维(厚度0.2cm)固定于聚乙烯制成的如图所示直径25cm球形网格中(球孔边长5cm)，制备成固定化介质；然后将固定化介质以2.2g/L的填充量放入高径比2.5:1的20吨反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为20吨m3/h循环固定48h。直至溶液游离菌体浓度下降1.8.2亿个/ml左右。然后制备木薯液化醪：料液比1:2.4，加液化酶(15U/g木薯干重)85℃液化2小时后压滤，排出固定化种子废液。再流加木薯液化醪，并加入糖化酶(180U/g木薯干重)和抑菌剂10ppm，装液量80％，进行循环发酵，其中温度为33℃，发酵液pH4.3，流速为10m3/h。发酵从第四批开始，游离菌体浓度降至0.9亿个/ml，酒度达10％(v/v)时，完全排至空罐进行后发酵。发酵20批平均发酵周期为42h，糖醇转化率和产率分别为92.6％和2.9g/L/h，比间歇式发酵产率提高了16％，比游离发酵提高了近40％左右。

实施例3以糖蜜培养基为发酵原料进行固定化酵母半连续发酵产燃料乙醇

首先，载体制备和固定化方法(用总糖180g/l糖蜜作为种子培养基)同实施例2，固定结束后，将酸化好的糖蜜稀释至糖浓245g/L泵入固定化发酵罐，进行循环发酵，其中温度为35℃，发酵液pH4.0，流量为10m3/h。发酵第三批时稳定，且游离菌浓为0.85亿个/ml，酒度达10％(v/v)时，排料50％至空罐进行后发酵，然后补料至原体积，并连续排料至之前装有40％发酵液的空罐，装满罐后，固定化发酵罐发酵液泵入第二个空罐。发酵15批平均发酵周期为40h，比固定化间歇式发酵快了近10小时，糖醇转化率提高了2.2个百分点。

实施例4以糖蜜为发酵原料进行固定化酵母半连续发酵产燃料乙醇

载体制备和固定化方法(用总糖200g/l糖蜜作为种子培养基)同实施例2，固定结束后，将酸化好的糖蜜稀释至糖浓230g/L泵入固定化发酵罐，进行循环发酵，其中温度为34℃，发酵液pH4.2，循环量为15m3/h。发酵第三批时稳定，且游离菌浓为0.9亿个/ml，酒度达8％(v/v)时，连续排料(酒度维持在8％(v/v))至空罐进行后发酵，并连续补料。待后发酵罐装液达80％时，固定化发酵罐发酵液泵入第二个空罐。发酵25批平均发酵周期为36h，比固定化间歇式发酵快了近12小时，糖醇转化率提高了2.6个百分点。

Claims

1.一种表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）将装有吸附介质的球形网格状载体填充于具有循环管路的分层发酵罐中；

（2）向步骤（1）中所述的发酵罐中泵入酒母，循环式培养并使其中的酿酒酵母吸附固定于球形网格状载体的吸附材料上；

（3）酿酒酵母吸附固定结束后，排出酒母醪，泵入发酵培养基进行固定化酿酒酵母发酵，前2~4批发酵结束后更换新的发酵培养基；

（4）2-3批发酵稳定后，每批发酵酒度达到体积分数为8~10%时排料50~100%至另外发酵罐继续后发酵，并补充新的发酵培养基到固定化发酵罐至满罐，待酒度达到体积分数为8~10%时重复以上步骤，以此类推进行半连续发酵；

所述的发酵罐罐内设置2~4层，每层用格栅隔开，格栅孔径为球形载体直径0.4-0.6倍，球形载体置于格栅之上；

步骤（3）中，所述的发酵培养基为人工半合成培养基、玉米的糖化液、木薯的糖化液、陈化粮的糖化液、糖蜜中的任意一种或几种的组合；

其中，

所述的人工半合成培养基的配方为：葡萄糖200~250g/L，蛋白胨3~10g/L，酵母膏3~10g/L，硫酸镁0.1~1g/L，pH4.0~4.5；

所述的玉米的糖化液、木薯的糖化液、陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5~3：1；辅料尿素0.2-0.3g/l;

所述的糖蜜的初始总糖为200~260g/L；

所述的固定化酵母发酵条件为：温度32-35℃，循环量0.5-2BV；

步骤（3）中，所述的酿酒酵母吸附固定结束是指残还原糖降至2g/L以下，且游离酵母菌含量下降幅度达1.0~2.0亿个/ml；

步骤（3）中，单批发酵结束以外观糖降至0.3°Bx以下，还原糖降至2g/L以下为准；

步骤（4）中，发酵稳定是指连续2-3批的发酵周期相差不超过6小时，游离细胞浓度降至0.9亿个/ml以下；

步骤（4）中泵入新的发酵罐发酵条件：温度32-36℃，循环量0.5-1BV，发酵终点与固定化发酵前2-3批发酵相同；

步骤（1）中，所述的吸附介质为植物纤维、动物纤维和化学合成纤维中的任意一种或几种的组合；

步骤（1）中，所述的球形网格状载体由聚丙烯或聚乙烯制成。

2.根据权利要求1所述的表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的吸附介质为正方形或圆形片状，其边长与球形网格直径的比值为0.6~0.8：1；其中，一个球形网格中装有2~5片吸附介质。

3.根据权利要求1所述的表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的发酵罐的高径比为1.5~2.5：1；每个发酵罐中，吸附介质的加入量为2~8g/L。

4.根据权利要求1所述的表面固定化酵母半连续发酵制备乙醇的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的酒母包含人工半合成培养基、玉米的糖化液、木薯的糖化液、陈化粮的糖化液、糖蜜中的任意一种或几种的组合，并且所述酒母中酿酒酵母数量为1.8~3.5亿个/ml；

其中，

所述的人工半合成培养基的配方为：葡萄糖25~200g/L，蛋白胨2~20g/L，酵母膏2~10g/L，硫酸镁0.2~1g/L，pH4.0~4.5；

所述的玉米的糖化液、木薯的糖化液、陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5~3：1，辅料为尿素0.1-0.5g/l；

所述的糖蜜的初始总糖为30~200g/L，不加辅料；

其中，所述的循环式培养是指30~35℃下循环培养，循环量为0.5~4BV。