CN109988729B - 一组常温复配菌系及其在木质纤维素降解中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一组高效稳定常温复配菌系及其在木质纤维素降解中的应用，属于农业资源与环境微生物领域；该菌系由潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)和台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)复配组成，复配菌系CFU为108/mL；该复配菌系在35℃培养条件下48h对滤纸的降解率可达97.10％‑99.41％，7d对稻草的降解率为61.56％‑63.25％，该菌系中两株菌均为常温纤维素降解细菌，在30‑37℃条件下均可快速生长，生物量较大；在本菌系中菌株的活化及培养保存均较简单且耗时少，复配方法操作简单且降解功能持续稳定，优于单菌株的降解能力；此外，本菌系优于普通传代驯化所获得的混合菌系，弥补了传代菌系所通有的混合菌株组分不明、降解能力不稳定及活化时间长等弊端，提高了降解效率，可缩短木质纤维素类堆肥周期。

Description

一组常温复配菌系及其在木质纤维素降解中的应用
技术领域
本发明涉及农业资源与环境微生物领域，特别是一组高效稳定常温复配菌系及其在木质纤维素降解中的应用。
背景技术
资源、环境和人口是当今国际社会影响人类可持续发展的三个关键问题。资源和环境问题是当今面临的巨大挑战，寻找再生能源替代不可再生能源是应对这一挑战的唯一途径。我国是农业大国，秸秆是我国丰富的可再生资源，但是每年大部分的秸秆被焚烧和废弃，不仅造成资源的浪费，同时也造成严重的环境污染。相较于物理化学等处理方法，微生物降解秸秆具有无二次污染、处理方式温和、能耗低等特点，因此，开发高效利用木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景。
微生物降解是目前对木质纤维素的降解利用的有效手段，利用纤维素降解菌可将木质纤维素转化为饲料、化工原料以及生物燃料等，因此获得高效降解木质纤维素的微生物意义重大，而在目前已经获得的可降解木质纤维素的微生物中，真菌中有小部分酵母也具有降解木质纤维素的能力，但其降解能力较弱，霉菌具有生长缓慢、相关酶类结构复杂且热稳定性较差、不耐碱性等缺点。放线菌可以降解木质纤维素，但大多数的放线菌生长较慢，繁殖需要较长时间。细菌具有来源更广、种类更多、生长更快等优点，且生长温度和适应pH值很宽，在降解方面显现了潜在的应用前景，降解效果较好。目前报道的具有纤维素降解功能的细菌包括潮湿纤维单胞菌、芽孢杆菌属、纤维菌属、假单胞菌属，但这些报道大多侧重于单株菌的降解性能研究，此外，对于复合菌系，不少研究学者采用木质纤维素底物富集和驯化传代的方式进行复合菌系筛选，但用此种方式获得的菌系往往具有菌系组分不明、多次传代后纤维素降解效果不稳定的缺点，且获得的菌系冻存后复苏使用，若想要达到最优降解效果往往需要耗费较长的时间。目前，针对对潮湿纤维单胞菌和台湾假单胞菌两者复配后采用复配菌系的形式进行木质纤维素降解应用的研究还未见报道。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一组常温复配菌系，该菌系由潮湿纤维单胞菌和台湾假单胞菌共培养后获得，此菌系在常温下具有高效稳定的木质纤维素降解能力。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一组常温复配菌系，包括保藏号为CGMCC NO：16561的潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)以及保藏号为CGMCC NO：16839的台湾假单胞菌(Pseudomonastaiwanensis)。这两株纤维素降解菌为发明人在2018年于连云港中药渣堆肥样品(青蒿与金银花混合中药渣)中筛选分离获得，上述潮湿纤维单胞菌菌株在LB固体培养基上可形成凝胶状、表面较光滑、湿润、易挑取的浅黄色菌落，该菌株已于2018年10月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter,CGMCC)，地址为中国北京，保藏号为CGMCC NO：16561。上述台湾假单胞菌菌株在LB固体培养基上可形成表面光滑、湿润且易挑取的米白色菌落，该菌株于2018年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为中国北京，保藏号为CGMCC NO：16839。
进一步，在本申请提供的常温复配菌系中，保藏号为CGMCC NO：16561的潮湿纤维单胞菌及保藏号为CGMCC NO：16839的台湾假单胞菌的含菌量相同。
其次，本发明还提供了上述常温复配菌系在木质纤维素降解中的应用；上述木质纤维素优选滤纸纤维和稻草秸秆。
进一步而言，上述在纤维素降解中的应用是指，具体步骤如下：
1)将1％(W/V，g/mL)木质纤维素类物质加入降解培养基中，121℃灭菌20min备用；
2)取常温复配菌系菌液1mL(含菌量1×108CFU/mL)，接入到50mL降解培养基中，35℃150rpm摇床培养，即可实现对纤维素类物质的降解；
所述复配菌系菌液是这样获得的：将保藏号为CGMCC NO：16561的潮湿纤维单胞菌在LB液体培养基中培养至含菌量1×108CFU/mL(约培养48h)，保藏号CGMCC NO：16839的台湾假单胞菌在LB液体培养基中培养至含菌量1×108CFU/mL(约培养24h)，然后将获得的两种菌液以1:1的体积比混合，即为常温复配菌系菌液；
上述LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物(OXOID,上海源叶生物科技有限公司)5.0g，NaCl 10.0g，pH 7.2-7.4.蒸馏水1000mL，121℃灭菌待用；
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉15.0g，pH7.2-7.4，蒸馏水1000mL，121℃灭菌后冷却至60℃倒平板待用；
降解培养基：KH2PO42 g，(NH4)2PO41.4 g，Mg-SO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3g，酵母提取物1.0g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO41.6 mg，ZnCl21.7 mg，CoCl21.7mg，蒸馏水1000mL，pH自然；121℃灭菌待用。
进一步，上述步骤2)中，常温复配菌系中菌液的接种量为1mL，其中包括500uL含菌量为1×108CFU/mL的潮湿纤维单胞菌和500uL含菌量为1×108CFU/mL的台湾假单胞菌，将此1mL混合菌液接入50mL降解培养基中，此外，在该降解培养基中还含有(1％，W/V)木质纤维素(0.5g)。
在本申请中，常温复配菌系所涉及的两种菌株均为申请人2018年在中药渣堆肥中分离筛选获得菌株，对其中一株菌株进行16srRNA测定及序列比对与MEGA 7.0分子进化树分析，确定其为潮湿纤维单胞菌，与潮湿纤维单胞菌DSM20107(T)亲缘关系最近，序列相似性为99.93％，申请人将该菌株自命名为Cu-CW35，并进行保藏，保藏号为CGMCC NO：16561；该菌株生长快速，35℃过夜培养即可在LB液体及固体平板上长出大量的菌落。申请人对同时获得的另一菌株进行16srRNA测定及序列比对与MEGA 7.0分子进化树分析，确定其为台湾假单胞菌，与Pseudomonastaiwanensis BCRC 17751亲缘关系最近，序列相似性为100％，申请人将该菌株命名为Pt-CW19,且在CGMCC保藏，保藏号为NO:16839，该菌株在LB培养基中生长极为快速，生物量明显较大，过夜培养即可达107-108CFU/mL，此外，筛选获得的这两株菌均可以在CMC-Na为唯一碳源的平板上快速生长。
申请人在筛选后的研究中，人工复配实验时发现当这两菌株共培养时，可“催化式”大大加速提高对木质纤维素的降解能力，且该菌系与其他菌株的任意组合相比，降解能力都极显著提高。该复配菌系在6h即可启动滤纸崩解，可在24h使滤纸明显破碎降解，在48h即可使滤纸完全降解为乳白色糊状物，对滤纸降解率可达97.10％-99.41％；7d后对稻草的降解率可达61.56％-63.25％，明显高于单菌株Cu-CW35(42.66％-43.80％)及Pt-CW19(17.81％-19.93％)的降解效果。与单菌株台湾假单胞菌相比，该复配菌系降解效率提高约7倍，且该复合菌系对滤纸纤维素降解能力优于目前崔宗均等(“一组高效稳定纤维素分解菌复合系MC1的筛选及功能”环境科学,2002,23:36-39.)报道的复合菌系MC1，该文献提供的菌株可在3d内可降解94％的滤纸，而王伟东(“Characterization ofa microbialconsortium capable of degrading lignocellulose”.Bioresour Technol,2011,102:9321-9324.)筛选的木质纤维素快速降解复合菌系，也需要在培养3d将滤纸完全降解，与目前研究报道相比(李静等，“高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析”应用与环境生物学报,2016,22:0689-0696；Yuan X F,et al.“Enhancing anaerobicdigestion ofcotton stalkby pretreatment with a microbial consortium(MC1).”Bioresour Technol,2016,207:293-301.)也处于较高水平，且已有研究者表明单独以酶活力的高低来衡量菌株或者菌系的降解能力是片面的(徐春淼等，“一种评价稻秆降解菌分解能力的方法”，南京农业大学学报，2015,38:417-423；Rastogi G,etal.“Characterizationofthermostable cellulases producedbyBacillus and Geobacillus strains”.Bioresource Technology,2010,101:8798-8806；)，采用多种手段全面检测菌株或者菌系的降解能力才更为可靠准确。
复配菌系酶活力测定表明与单菌株相比，该菌系Cu-CW35/Pt-CW19具有较高的纤维素酶活力，其中CMCase酶活力在36h时达到最大值为31.55IU/mL,木聚糖酶活力在36h达到最高值为89.62IU/mL，β-葡萄糖苷酶在48h时达到最大值为30.56IU/mL，滤纸糖化酶FPase在48h达到最大值58.02IU/mL。
该菌系Cu-CW35/Pt-CW19分泌的几种纤维素酶活力表明复配后菌系的降解酶活力水平显著高于单株菌的酶活力，滤纸糖化酶FPase酶活力也是增强的。
该复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19在LB液体培养基中生长迅速且在常温下短时间内即可对滤纸和稻草秸秆进行高效降解，因此本菌系在常温木质纤维素的降解及固体废弃物的处理应用中可发挥重要作用，同时也可在有效缩短木质纤维素类(稻草、小麦、玉米等秸秆)堆肥腐熟周期及城乡秸秆降解处理中具有重要的应用价值，对生态环境的保护和优化均具有重要的意义，特别是该菌系菌株为常温菌(30-37℃)，适用范围更广，因此具有巨大的市场应用价值和潜力。
附图说明
图1.试管滤纸条培养基筛选纤维素降解功能菌株。
图2.Cu-CW35和Pt-CW19在LB平板上的菌落形态。
图3.Mega7.0对Cu-CW35和Pt-CW19的16srRNA序列进行分子进化树分析。
图4.单菌株与复合菌系在24h对滤纸的降解能力比较。
图5.单菌株与复配菌系在48h对滤纸的降解能力比较。
图6.单菌株与复配菌系在7d对稻草秸秆的降解情况。
图7.单菌株与复配菌系在48h内纤维素相关酶活力的变化(A.CMC酶；B.滤纸糖化酶FPase；C.木聚糖酶；D.β-1,4-糖苷酶)。
具体实施方式
以下实施例所涉及的培养基：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，pH 7.2-7.4.蒸馏水1000mL,121℃灭菌待用。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂粉15.0g，pH7.2-7.4，蒸馏水1000mL，121℃灭菌后冷却至60℃倒平板待用。
改良CMC液体培养基：CMC-Na 15.0g，KH2PO4 1.0g，NH4P04 1.0g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母提取物1.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。
改良CMC固体培养基：CMC-Na 15.0g，KH2PO4 1.0g，NH4P04 1.0g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母提取物1.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。
产酶发酵培养基：CMC-Na 10g，KH2PO4 2g，(NH4)2PO4 1.4g，Mg-SO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，酵母提取物1.0g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO41.6mg，ZnCl2 1.7mg，CoCl2 1.7mg，蒸馏水1000mL，pH自然；121℃灭菌20min待用。
降解培养基：KH2PO4 2g，(NH4)2PO4 1.4g，Mg-SO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，酵母提取物1.0g，FeSO4·7H2O 5mg，MnSO4 1.6mg，ZnCl2 1.7mg，CoCl2 1.7mg，蒸馏水1000mL，pH自然；121℃灭菌20min待用。
改良试管滤纸条培养基：向直径1.5cm、长15cm试管中加入降解培养基5mL，加1条6cm×1cm滤纸条直立于试管中，121℃20min灭菌待用。
改良摇瓶滤纸培养基：向锥形瓶中加入50ml降解培养基，同时在其中加入0.5g滤纸，121℃20min灭菌待用。实施例中的滤纸为Whatman新华双圈定量滤纸(直径11cm)，购自于通用电气生物科技(杭州)有限公司，其主要成分为纤维素，灰分为0.01％，自行裁剪为统一规格为(6cm×1cm)的滤纸条。
改良摇瓶稻草秸秆培养基：向锥形瓶中加入50ml降解培养基，同时在其中加入粗细均匀的0.5g稻草秸秆统一裁剪为5cm，121℃20min灭菌待用。实施例1潮湿纤维单胞菌Cu-CW35与台湾假单胞菌Pt-CW19的筛选分离
不同采样时期的中药渣堆肥样品(来源于江苏省连云港市东海县中药渣堆肥)，取5g加入50mL灭菌超纯水中混匀，35℃150rpm 30min，取1mL悬浊液，用灭菌后的超纯水依次梯度稀释，稀释后的悬液取100μL涂布于改良CMC固体培养基上，35℃培养箱中培养1d，将改良CMC固体培养基上的菌落进行单菌株划线纯化。
挑取菌落形态、颜色、大小不一的单菌落进行划线纯化培养，以能在改良CMC平板上快速生长，生物量较大的菌落为优。然后将纯化培养后的单菌落分别接种于改良试管滤纸条培养基中，并以不加菌液的滤纸条作为对照(K)，与初筛温度相同条件培养，观察滤纸条的溃烂情况，筛选出可使滤纸条崩解的菌株即为具有纤维素降解功能的菌株。
申请人筛选到两株可使滤纸条崩解的菌株，并将两菌株分别命名为Cu-CW35和Pt-CW19,这两株菌在LB固体培养基上生长形成的菌落如图2所示，该两个菌株在试管中进行滤纸条崩解实验结果如图1所示。
申请人对菌株Cu-CW35进行16srRNA测定及序列比对与MEGA 7.0分子进化树分析，确定其为潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)，并与潮湿纤维单胞菌株DSM20107(T)亲缘关系最近，序列相似性为99.93％；此外，菌株Pt-CW19分子鉴定为台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)，与台湾假单胞菌菌株BCRC17751亲缘关系最近，序列相似性为100％。这两株菌分子进化树分析如图3所示，其中，A为Cu-CW35的16srRNA序列进行分子进化树分析示意图，B为Pt-CW19的16srRNA序列进行分子进化树分析示意图。
申请人将两菌株分别于2018年10月及11月均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。潮湿纤维单胞菌Cu-CW35保藏编号为NO:16561，台湾假单胞菌Pt-CW19保藏编号为NO:16839。
实施例2.复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19对滤纸纤维素的降解能力检测
将实施例1筛选获得的潮湿纤维单胞菌Cu-CW35及台湾假单胞菌Pt-CW19单菌落接种于LB液体培养基中，35℃150rpm培养，Cu-CW35培养48h，Pt-CW19培养24h，使两菌株CFU均达到108/mL(此时将CFU达到同一数量级的两菌株等体积1:1混合则为复配菌系)，然后分别转接1mLCu-CW35，1mL Pt-CW19及总体积1mL的复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19于50mL改良摇瓶滤纸培养基中，每组设定3个重复，同时设立不加菌液的对照组(K)，35℃培养，观察并记录降解结果。
图4中，A、B、C为单菌株与复配菌系在培养24h后对滤纸的降解效果图，A、B显示菌株Cu-CW35和Pt-CW19在24h时对滤纸的降解并不明显，滤纸片只有裂缝存在且无碎片化现象，而复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19在24h时已经使滤纸呈现明显的碎片化，出现了明显的滤纸崩解现象(图4.C)。而继续培养至48h时，Cu-CW35对滤纸也表现出降解现象(图5.A)，此时Pt-CW19对滤纸的降解仍然不明显，滤纸片仍处于完整状态(图5.B)，而在48h时，复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19则表现了高效的降解能力，使滤纸基本降解为均一乳白色糊状物(图5.C)。图5.D为复配菌系对滤纸的降解物与空白对照滤纸的比较。
将摇瓶中的滤纸降解物用失重法对降解前后的滤纸纤维素进行称量计算。经计算可得：48h单菌株Cu-CW35对滤纸降解率为52.30％-53.64％，单菌株Pt-CW19对滤纸的降解率为12.81％-13.93％，而复配后的菌系Cu-CW35/Pt-CW19对滤纸的降解率为97.10％-99.41％。由此可见，复配后菌系对于纤维素的降解能力是大大增强的，甚至是“催化式”级联放大的效应，远高于单菌株的降解效果。
两菌株复配后，复合菌系对木质纤维素的降解“催化式”提高，与单菌株相比降解率提高了2-7倍，同时对纤维素的降解效率也大大提高，启动崩解时间加快，由单菌株培养时最快30h启动加快至6h即可启动崩解，24h就已经破碎化明显，48h完全降解。重复实验后，降解效果一致。此外，当两菌株分别培养至对数期时(潮湿纤维单胞菌培养48h和台湾假单胞菌培养24h时，两者分别到达对数期且CFU≈1×108mL)将其进行复配降解效果最优，这可以解释为两菌株分别在对数培养期时，菌体生长最快，生长状态及酶活力均处于旺盛时期，因此降解效果最优。而在其他时间点，如生长期或平台期时进行复配，总菌体数及菌体生长状态较差，复配后降解效果不如该菌系。
实施例3.复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19在稻草秸秆降解中的应用
将实施例1中筛选获得的潮湿纤维单胞菌Cu-CW35及台湾假单胞菌Pt-CW19单菌落接种于LB液体培养基中，35℃150rpm培养，Cu-CW35培养48h，Pt-CW19培养24h，使两菌株CFU均达到108/mL(此时将CFU达到同一数量级的两菌株等体积1:1混合则为复配菌系)，然后分别转接1mL Cu-CW35，1mL Pt-CW19及1mL的复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19于50mL改良摇瓶稻草秸秆培养基中，同时设立不加入菌液的对照组(K)，继续培养7d后，降解结果如图6所示。
图6为35℃150rpm培养7d后单菌株与复配菌系对稻草秸秆的降解图片，图6中，A、B为单菌株Cu-CW35和Pt-CW19对稻草的降解情况，C为复合菌系Cu-CW35/Pt-CW19对稻草秸秆的降解情况示意图。由图中可知，与单株菌相比，复配菌系可使绝大多数稻草已经降解为细碎的粉末状，培养基变为浑浊褐色液体，而单株菌中褐色降解粉末较少，尤其是Pt-CW19，降解能力明显较弱。
将摇瓶中的稻草降解物用失重法进行烘干称重，计算降解率得：7d单菌株Cu-CW35对稻草秸秆降解率为52.66％-53.80％，单菌株Pt-CW19对稻草秸秆的降解率为22.81％-23.93％，而复配后的菌系Cu-CW35/Pt-CW19对稻草秸秆的降解率为61.56％-63.25％。以上结果表明，复配后菌系对稻草秸秆的降解能力明显优于单菌株的降解能力。
失重法:将降解后的稻秆置于50m L离心管中,8000r/min离心15min，倒上清液，用盐酸和硝酸的混合液冲洗以消除菌体，离心，用无菌水冲洗，离心，105℃烘干至恒重后称重，计算稻秆的失重量及降解率。
实施例4.复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19木质纤维素酶活力及与单菌株酶活力比较
由于复配菌系与单菌株相比在48h内对滤纸的降解能力大大增强，呈现明显的对比，因此选择48h为取样时间范围，将实施例1筛选获得的菌株Cu-CW35、Pt-CW19及两菌株的复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19在产酶发酵培养基中培养，35℃，150r/min培养48h，在0,6,12,24,36,48h时取上清液进行相关木质纤维素酶活力(CMC酶、滤纸糖化酶FPase、木聚糖酶、β-1,4-糖苷酶)测定。
酶活力检测方法如下：
CMCase测定：取0.5mL粗酶液于容量瓶中，加入1.5mL含0.5％CMC-Na的0.5mol/L、pH5.0的柠檬酸缓冲液，于50℃水浴锅中准确作用30min，再加入1.5mL3,5－二硝基水杨酸(DNS)溶液，沸水浴5min后立即用流水冷却。测其在540nm处的OD值，并通过萄萄糖标准曲线求葡萄糖含量。空白对照为于100℃水浴锅中灭活10min的粗酶液。
FPase测定：将新华1号滤纸条(1cmx6cm)折成M型，放入盛有1.5mL
Figure GDA0003466800210000091
(0.05mol/L,pH5.0)HAC-NaAC缓冲液的试管底部，加入0.5mL粗酶液后充分摇匀，使落液完全浸泡滤纸。于50℃水浴锅中准确作用60min，按DNS法测还原糖(采用葡萄糖标准曲线)。
Figure GDA0003466800210000092
木聚糖酶测定：取1mL的1％木聚糖溶液和0.8mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)于25mL刻度试管中，加入0.2mL粗酶液，混合均匀后在50℃条件下水浴10min，按DNS法测还原糖(采用木糖标准曲线)。
β-1,4-糖苷酶测定：取1mL的1％D-水杨苷溶液和0.8mL的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.5)于25mL刻度试管中，加入0.2mL粗酶液，混合均匀后在50℃条件下水浴30min，按DNS法测还原糖(采用葡萄糖标准曲线)。
上述酶活定义：每min每mL酶液催化底物水解生成1μg葡萄糖或木糖的酶量，为1个酶活为单位IU。上述检测方法也可参见文献(Mudasir et al.Prospecting the gut fluidofgiant African land snail,Achatina fulica for cellulose degradingbacteria.International Biodeterioration&Biodegradation,2018,126:103-111.)中公开的方法。
检测结果如图7所示，图7中，A.CMC酶；B.滤纸糖化酶FPase；C.木聚糖酶；D.β-1,4-糖苷酶；由图7可见，与单菌株Cu-CW35和Pt-CW19的降解酶活力相比，复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19的CMC酶、滤纸糖化酶FPase、木聚糖酶、β-1,4-糖苷酶活力在48h内均有不同程度的增加，其中复配菌系的CMCase酶活力在36h时达到最大值为31.55IU/mL,木聚糖酶活力也在36h达到最高值为89.62IU/mL，β-葡萄糖苷酶在48h时达到最大值为30.56IU/mL，滤纸糖化酶FPase在48h达到最大值58.02IU/mL。值得一提的是，复配菌系的酶活力虽然没有达到目前国内外报道中的最高酶活力水平，但复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19对纤维素类基质的降解率高于已报道的菌株或菌系。而对于纤维素降解菌系降解能力的评价，采用酶活力与木质纤维素底物降解效果测定等多手段全面的检测菌株或者菌系的降解能力更为可靠准确。本发明中，经过检测复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19对木质纤维素物质具有高效的降解能力。
除此之外，本复配菌系还具有木质纤维素降解能力稳定的优势，以上关于复配菌系对滤纸及稻草秸秆的降解效果实验中每次都设有三个重复，且进行了生物学重复三次，重复实验结果保持一致，因此我们认为该复配菌系具有稳定的木质纤维素启动崩解快速且降解效率高的优点和特性。而传统的驯化传代培养所获得的菌系，往往具有菌系降解能力不够稳定，以及-80℃保存后，再次活化时面临降解效果大打折扣的问题。这是因为驯化传代获得的菌系中含有大量不易平板培养的菌株且混合菌株众多，成分不明，而统一的低温冻存可能会对其造成严重损伤，因此想要达到稳定的效果需要再次传代活化，具有耗时较长的缺陷。本复配菌系Cu-CW35/Pt-CW19菌株成分明确，且易培养，活化及复配操作简单耗时短，尤其是复配后降解效果持续稳定且高效。本菌系中菌株均为常温菌，在30-37℃下均能大量生长，因此具有更广泛的用途和利用空间，该菌系可在木质纤维素类堆肥中加速堆肥腐熟进程，也可在农业作物秸秆等木质纤维素固体废弃物的降解和处理中发挥重要的作用，可对废弃物资源进行更为充分的物质转化和利用，更有利于生态环境的保护和优化，因此具有重要的广阔的市场应用前景和巨大的价值潜力。

Claims (5)

1.一组常温复配菌系，由保藏编号为 CGMCC NO: 16561的潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）Cu-CW35以及保藏编号为 CGMCC NO：16839的台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis）Pt-CW19组成。
2.如权利要求1所述的常温复配菌系，其特征在于，所述复配菌系中，潮湿纤维单胞菌与台湾假单胞菌的含菌量相同。
3.如权利要求1或2所述常温复配菌系在木质纤维素降解中的应用；所述木质纤维素为滤纸或秸秆。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是指：将木质纤维素加入降解培养基中，接种所述常温复配菌系，即实现对木质纤维素的降解；
所述降解培养基配方如下：KH2PO4 2 g，(NH4)2PO4 1.4 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，酵母提取物 1.0 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸馏水 1000 mL，pH 自然。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述常温复配菌系是这样获得的：将保藏编号为CGMCC NO：16561的潮湿纤维单胞菌Cu-CW35和保藏编号为CGMCC NO：16839的台湾假单胞菌Pt-CW19分别接种于LB液体培养基中培养至含菌量均为1×108 CFU/mL；然后等体积混合，即获得所述常温复配菌系。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109355227A (zh) * 2018-11-20 2019-02-19 江苏省农业科学院 一株高温紫链霉菌及其在纤维素降解中的应用
CN109439585A (zh) * 2018-11-20 2019-03-08 江苏省农业科学院 一株己二酸凯氏菌及其在纤维素降解中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Enhancing anaerobic digestion of cotton stalk by pretreatment with a microbial consortium (MC1)";Xufeng Yuan et al.,;《Bioresource Technology》;20161231;第293-301页 *
"常温纤维素降解菌群的筛选及其特性初探";费辉盈等;《生态与农村环境学报》;20071231;第23卷(第3期);第60-64页 *
"常温降解玉米秸秆复合菌系及其微生物多样性研究";邓兵等;《可再生能源》;20170831;第35卷(第8期);第1127-1134页 *

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