CN109988727A

CN109988727A - 大丽轮枝菌内生菌及其应用

Info

Publication number: CN109988727A
Application number: CN201811591585.3A
Authority: CN
Inventors: 张�林; 陶冶; 陈俊梅; 李文鹏; 黄冰纷; 牛秋红
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2038-12-25
Also published as: CN109988727B

Abstract

本发明提供大丽轮枝菌内生菌，所述内生菌为肠杆菌属Enterobacter xiangfangensis V1菌株，保藏编号为CCTCC M 2018715。本发明采用的是肠杆菌属(Enterobacter xiangfangensis)V1菌株，该菌株具有抑制大丽轮枝菌的功能。该肠杆菌中的过氧化物酶基因全长603bp，编码200个氨基酸，将该基因异源表达后，其表达产物亦具有抑制大丽轮枝菌的功能。本发明利用生防技术为棉花黄萎病的防治提供了微生物资源，同时同化学防治相比避免了环境污染等方面的问题。

Description

大丽轮枝菌内生菌及其应用

技术领域

本发明属于生物防治植物病害技术领域，具体涉及大丽轮枝菌内生菌及其应用。

背景技术

棉花是重要的纤维植物，由大丽轮枝菌侵染引起的黄萎病是棉花的主要病害之一，被称为“棉花癌症”。其病原菌存活力强，菌核在土壤中无寄主情况下可存活10多年之久，病原菌群体遗传多样性丰富，易变异等。此外，大丽轮枝菌的寄主范围极广，国外报道可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。我国经鉴定，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等作物。其中棉花是世界上分布最广、种植面积最大的经济作物之一，也是受危害最为严重的农作物之一，棉花黄萎病是是世界性的危险病害，也是中国棉花生产中的严重病害，并且由于大丽轮枝菌能形成休眠结构的微菌核，其对不良环境有较强的抵抗力，能耐80℃高温和-30℃低温，故在极端条件下可以形成有较强保护作用的微菌核，当外界环境适合其萌发时又可以形成具有较强感病性的真菌状态。我国每年棉花黄萎病的的发病面积将近占全国种植面积的15％-20％，严重年份甚至可以达到50％之多，有些病害严重的种植区域可能会发生绝收的现象。黄萎病不但降低了棉花的产量而且也会降低棉花的纤维品质、种子产量和种子的产油量等，进而造成较为严重的经济损失。

目前，国内外对棉花黄萎病的防治主要是采用轮作倒茬、选育抗病品种、化学防治等传统手段，但防病效果都不理想，这些方法均有一定的限制和不足之处，操作性、适应性差或者效果不理想。植物病害的生物防治由于其安全、有效、低毒、残留少越来越引起人们的重视，生物防治被认为是最具有发展潜力的防治方法。内生细菌作为一种生防资源，己成为近年来生防菌剂研制开发的热点，因此，对黄萎病的生防研究自然成为重点和焦点问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述问题，提供一种对大丽轮枝菌防治效果高、对环境污染小的大丽轮枝菌内生菌，以及该内生菌中的过氧化物酶。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：

本发明提供大丽轮枝菌内生菌，所述内生菌为肠杆菌属Enterobacterxiangfangensis V1菌株，保藏编号为CCTCC M 2018715。

本发明提供大丽轮枝菌内生菌在抑制大丽轮枝菌活性中的应用。

本发明提供大丽轮枝菌内生菌在防治棉花黄萎病或制备防治棉花黄萎病的菌剂中的应用。

本发明提供大丽轮枝菌中过氧化物酶在抑制大丽轮枝菌活性、防治棉花黄萎病或制备防治棉花黄萎病的菌剂中的应用。

作为优选，所述过氧化物酶基因的cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1。

作为优选，所述过氧化物酶基因的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2。

作为优选，所述应用是将过氧化物酶异源表达后，表达产物具有抑制大丽轮枝菌活性或防治棉花黄萎病的作用。

作为优选，所述将过氧化物酶异源表达是将过氧化物酶与载体PET32a连接，导入感受态细胞，进行诱导表达。

作为优选，所述诱导表达是在25℃，用0.5mM IPTG诱导8h。

作为优选，在所述诱导表达后还包括蛋白纯化的步骤。

本发明采用的是肠杆菌属(Enterobacter xiangfangensis)V1菌株，该菌株具有抑制大丽轮枝菌的功能。该肠杆菌中的过氧化物酶基因全长603bp，编码200个氨基酸，将该基因异源表达后，其表达产物亦具有抑制大丽轮枝菌的功能。该基因的拮抗功能主要是过氧化物酶活性增加，能进一步增加棉花体内抗性成分酚及木质素等的合成，使细胞壁增厚，起到保护植物细胞的作用。且过氧化物酶与植株体内产生的抗病性反应相关联。本发明利用生防技术为棉花黄萎病的防治提供了微生物资源，同时同化学防治相比避免了环境污染等方面的问题。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为肠杆菌属Enterobacter xiangfangensisV1菌株的平板对峙实验。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

步骤1)、从南阳师范学院棉花试验田中的抗性棉叶片中筛选到V1菌株，该菌株对大丽轮枝菌具较强的拮抗作用，通过多次平板对峙实验确定其拮抗活性后，已于2018年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路229号武汉大学校内，保藏编号：CCTCC M 2018715，并对菌株进行鉴定，确定为肠杆菌属Enterobacter xiangfangensisV1菌株。

平板对峙实验结果见图1。

图1为肠杆菌属Enterobacter xiangfangensisV1菌株的平板对峙实验。

步骤2)、将V1菌体接种到LB液体培养基试管中(每管装5ml)，于37℃、220rpm摇床培养12h，获得试管种。再将其接种到500ml三角瓶LB液体培养基中，于37℃、220rpm摇床培养56h，得发酵培养物。

将发酵培养物于10000rpm离心20min，取上清液分别加入固体硫酸铵至饱和度为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，4℃搅拌2～3h，4℃静置2～3h，8000r/min离心20min，将沉淀溶解在PBS缓冲液中得粗提液。粗提液装入透析袋中透析24h，透析完后进行SDS-PAGE电泳。采用滤纸片法分别测定各组分的活性，确定最佳硫酸铵饱和度为40％，分子量大小为35KDa。将此条带送到上海颢泽生物医药科技有限公司进行质谱鉴定，确定为过氧化物酶。

肠杆菌属Enterobacter xiangfangensisV1菌株中的过氧化物酶的核苷酸序列为：

ATGGTTCTGGCAACTCGTCCGGCTCCGGATTTGACAGCTGCCGCCGTTCTGGGCAACGGTGACATCGTTGAAAACTTCAACTCCAAACAGCACAACACCGGTAAAGCGACCGTTCTGTCTTTCTGGCCAATGGACTTCACTTTCGCTTGCCCCTCTGAGCTGATCGCGTTCGCCAAACGTTACGAAGAATTCCAGAAACGTGGCGAGGAAGTGGTTGGCGTCTCCTTCGACTCTGAATTTGTACACAAAGCATGGCGTATCACCCCTGTCGAAAACGGCGACATCGATGCGGTGAAATACGCGATGGTTGCGGACATCAAACGTGGAACCCAGCAGGCTTACGGTATCGAACATCCGGACGCTGGCGTTGCGCTGCGTGGTTCTTTCCTGATCGACGCGAACGACATCGTTTGTCACCAGGCTGTGAACGATCTGCTGCTGGATCGTAACATTGACGAAATGCGGCGCATGGTTGACGCGCTCCTGTTCCACGAAGCGCACGGTGAAGTGTGCCTGGCTCAGTGGGAAAAAGGTATAGAAGGTATGGCGGCTTCCCTAGACGGCGTAGCTAAACACCTGTCTGAGAACGTATACAGcCTGTAA

其编码的氨基酸序列为：

MVLATRPAPDLTAAAVLGNGDIVENFNSKQHNTGKATVLSFWPMDFTFACPSELIAFAKRYEEFQKRGEEVVGVSFDSEFVHKAWRITPVENGDIDAVKYAMVADIKRGTQQAYGIEHPDAGVALRGSFLIDANDIVCHQAVNDLLLDRNIDEMRRMVDALLFHEAHGEVCLAQWEKGIEGMAASLDGVAKHLSENVYSL

步骤3)、构建所述的过氧化物酶基因的蛋白表达载体PET32a，对V1提质粒进行双酶切，双酶切验证成功后，导入BL21感受态细胞，加入一定浓度的诱导剂IPTG进行诱导表达，并通过优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度三个因素，以提高过氧化物酶的表达水平，表达条件优化参数见表1。

表1过氧化物酶表达条件优化参数

SDS-PAGE电泳跑胶结果显示，在25℃、0.5mM IPTG诱导8h的表达条件下过氧化物酶的表达量最高，确定25℃、0.5mM IPTG诱导8h为最佳表达条件。采用0.5mM IPTG进行诱导表达，利用一站式His标记蛋白质微量纯化套装进行蛋白纯化。

步骤四、利用对峙培养方法，对所述的过氧化物酶基因表达产物测试拮抗能力，测量抑菌圈直径，计算抑制率，抑菌率(％)＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-供试病原菌菌饼直径)×100，通过三次平板对峙试验其抑菌率可达40％。该基因的表达产物具有较好的抑菌活性。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南阳师范学院

<120> 大丽轮枝菌内生菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggttctgg caactcgtcc ggctccggat ttgacagctg ccgccgttct gggcaacggt 60

gacatcgttg aaaacttcaa ctccaaacag cacaacaccg gtaaagcgac cgttctgtct 120

ttctggccaa tggacttcac tttcgcttgc ccctctgagc tgatcgcgtt cgccaaacgt 180

tacgaagaat tccagaaacg tggcgaggaa gtggttggcg tctccttcga ctctgaattt 240

gtacacaaag catggcgtat cacccctgtc gaaaacggcg acatcgatgc ggtgaaatac 300

gcgatggttg cggacatcaa acgtggaacc cagcaggctt acggtatcga acatccggac 360

gctggcgttg cgctgcgtgg ttctttcctg atcgacgcga acgacatcgt ttgtcaccag 420

gctgtgaacg atctgctgct ggatcgtaac attgacgaaa tgcggcgcat ggttgacgcg 480

ctcctgttcc acgaagcgca cggtgaagtg tgcctggctc agtgggaaaa aggtatagaa 540

ggtatggcgg cttccctaga cggcgtagct aaacacctgt ctgagaacgt atacagcctg 600

taa 603

<210> 2

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Leu Ala Thr Arg Pro Ala Pro Asp Leu Thr Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Leu Gly Asn Gly Asp Ile Val Glu Asn Phe Asn Ser Lys Gln His Asn

20 25 30

Thr Gly Lys Ala Thr Val Leu Ser Phe Trp Pro Met Asp Phe Thr Phe

35 40 45

Ala Cys Pro Ser Glu Leu Ile Ala Phe Ala Lys Arg Tyr Glu Glu Phe

50 55 60

Gln Lys Arg Gly Glu Glu Val Val Gly Val Ser Phe Asp Ser Glu Phe

65 70 75 80

Val His Lys Ala Trp Arg Ile Thr Pro Val Glu Asn Gly Asp Ile Asp

85 90 95

Ala Val Lys Tyr Ala Met Val Ala Asp Ile Lys Arg Gly Thr Gln Gln

100 105 110

Ala Tyr Gly Ile Glu His Pro Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Gly Ser

115 120 125

Phe Leu Ile Asp Ala Asn Asp Ile Val Cys His Gln Ala Val Asn Asp

130 135 140

Leu Leu Leu Asp Arg Asn Ile Asp Glu Met Arg Arg Met Val Asp Ala

145 150 155 160

Leu Leu Phe His Glu Ala His Gly Glu Val Cys Leu Ala Gln Trp Glu

165 170 175

Lys Gly Ile Glu Gly Met Ala Ala Ser Leu Asp Gly Val Ala Lys His

180 185 190

Leu Ser Glu Asn Val Tyr Ser Leu

195 200

Claims

1.大丽轮枝菌内生菌，其特征在于：所述内生菌为肠杆菌属Enterobacterxiangfangensis V1菌株，保藏编号为CCTCC M 2018715。

2.权利要求1所述的大丽轮枝菌内生菌在抑制大丽轮枝菌活性中的应用。

3.权利要求1所述的大丽轮枝菌内生菌在防治棉花黄萎病或制备防治棉花黄萎病的菌剂中的应用。

4.权利要求1所述的大丽轮枝菌中过氧化物酶在抑制大丽轮枝菌活性、防治棉花黄萎病或制备防治棉花黄萎病的菌剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述过氧化物酶基因的cDNA核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述过氧化物酶基因的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述应用是将过氧化物酶异源表达后，表达产物具有抑制大丽轮枝菌活性或防治棉花黄萎病的作用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述将过氧化物酶异源表达是将过氧化物酶与载体PET32a连接，导入感受态细胞，进行诱导表达。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述诱导表达是在25℃，用0.5mM IPTG诱导8h。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：在所述诱导表达后还包括蛋白纯化的步骤。