CN109985238A

CN109985238A - 一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN109985238A
Application number: CN201910303504.3A
Authority: CN
Inventors: 魏瑗; 邝栋明
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明提供了一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用，并阐明其在肿瘤治疗过程中的生物学机制。所述基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物包含免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物。该药物组合物抗癌效果良好；由于免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物分别清除了两个不同的促肿瘤因素，两者联合用药产生了协同作用，可更有效抑制肿瘤生长。因此，该药物组合物具有较好的临床应用前景。

Description

一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用。

背景技术

癌症(恶性肿瘤)已成为一个全球性公共健康问题，在我国尤为突出。***报道，中国城乡居民的癌症死亡率在过去30年中增长了八成以上。目前，癌症已经成为中国城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因。尽管随着医学进步，肿瘤的诊断和治疗已取得重大进步，恶性肿瘤致死率仍然居高不下，寻求新的治疗手段仍然是目前亟待解决的医学难题。

过往癌症最常见的治疗方法包括手术切除、化疗以及化疗。然而这些手段无法彻底清除肿瘤，还可能对机体造成一定程度的损伤。肿瘤免疫治疗是指通过重新启动和维持机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而达到控制与清除肿瘤目的的治疗手段。这种方法由于可以利用机体本身的免疫***长期监控以及清除肿瘤而成为肿瘤精准治疗领域最具有前景的发展方向。近年来，随着研究的深入，免疫疗法被使用于多种肿瘤的治疗中，并极大的改善了晚期肿瘤患者的生存。因此，肿瘤免疫治疗被Science杂志列为2013年十大科学突破之首。其中，程序性死亡受体PD-1及其配体PD-L1是目前免疫治疗中最受瞩目的作用靶点之一。

PD-1主要由耗竭或免疫抑制的淋巴细胞表达，代表适应性免疫的缺陷。抗PD-1/PD-L1抗体***的过程并不是由抗体本身介导的反应，而是通过阻断PD-1/PD-L1的相互作用，恢复肿瘤特异性T细胞的功能效应。因此，局部肿瘤微环境中T细胞的浸润情况及其介导的细胞免疫状况决定了患者对抗PD-1/PD-L1免疫治疗的响应程度。PD-L1分子主要表达在炎性上皮组织或活化的基质细胞。PD-L1可作为T细胞效应分子IFN-γ下游的诱导产物，因而其表达被认为可反映局部组织微环境中的细胞免疫状况。因此，目前临床治疗中常根据患者PD-L1的表达情况来指导是否进行抗PD-1/PD-L1免疫治疗。然而，对于具有PD-L1阳性特征的癌症患者，PD-1/PD-L1单克隆抗体的临床反应仍然非常低。提示：PD-L1的表达可能代表着肿瘤中更复杂的免疫特征，不能很好预测治疗效果的改善。因此，综合评价PD-L1所反映的肿瘤免疫微环境特点，寻求更有效的生物标记物，并探讨有效的联合治疗方案对提高抗PD-1/PD-L1免疫治疗的效果有着极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤组合药物及其应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，所述基于免疫检查点阻断的抗肿瘤组合药物包含免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物。

进一步地，所述免疫检查点抑制剂为程序性死亡受体PD-1或其配体PD-L1抑制剂。

优选地，所述程序性死亡受体PD-1抑制剂为Nivolumab(欧狄沃)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)或特瑞普利。

优选地，所述程序性死亡受体配体PD-L1抑制剂为Atezolizumab(阿特朱单抗)、Durvalumab(度伐鲁单抗)或Avelumab(阿维单抗)。

进一步地，所述巨噬细胞反应阻断物为巨噬细胞特异性清除抗体、细胞因子TNF-α、细胞因子IL-1β抑制剂或NF-κB信号通路抑制剂。

优选地，所述细胞因子TNF-α抑制剂为Infliximab(英夫利昔单抗)、Golimumab(戈利木单抗)、Etanercept(依那西普)或Certolizumab(赛妥珠单抗)。

优选地，所述细胞因子IL-1β抑制剂为Anakinra(阿那白滞素)或Canakinumab(卡那单抗)。

本发明还包括所述基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物在制备治疗与预防癌症药物或在制备提高肿瘤患者对免疫检查点治疗响应效果药物中的应用。

进一步地，所述应用中的肿瘤为实体瘤。

进一步地，所述实体瘤包含原发性肝细胞肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、该药物为基于免疫检查点抑制与巨噬细胞反应阻断的抗肿瘤联合用药组合物，在提高肿瘤患者响应免疫检查点治疗效果，以及在制定临床抗肿瘤治疗策略上均有广泛的应用。

2、本发明提供的免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物分别清除了两个不同的促肿瘤因素，两者联合用药产生了协同作用，可更有效抑制肿瘤生长。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是肿瘤标本中PD-L1表达情况与局部CD3⁺T细胞以及CD68⁺巨噬细胞浸润情况的关系。

图2是肿瘤标本中PD-L1、CD3以及CD68表达情况与病人复发的关系。

图3是肿瘤巨噬细胞通过分泌细胞因子TNF-α和IL-1β激活肿瘤细胞P65通路，促进肿瘤转移的体外实验。

图4是联合用药组合物治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响。

具体实施方式

本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

本发明所采用的人CD3免疫组化特异抗体由中杉金桥公司(中国)购得；人CD68免疫组化特异抗体由DAKO公司(丹麦)购得；人P65荧光抗体由Cell Signaling Technology(美国)购得；人重组TNF-α和IL-1β细胞因子由RD公司(美国)购得；NF-κB通路抑制剂BAY11-7082由Sigma Aldrich公司(美国)购得；鼠巨噬细胞特异性清除抗体(αCSF1R抗体)以及鼠PD-L1封闭抗体(PD-L1抑制剂)由Bio X cell公司(美国)购得。

本发明所采用的人P65干扰RNA序列及阴性对照RNA序列(NC)由上海吉玛公司合成，RNA序列如下，

人siP65正向序列：5’-UGG AGU ACC CUG AGG CUA UdTdT-3’(SEQ ID NO.1)，

反向序列：5’-AUA GCC UCA GGG UAC UCC AUC-3’(SEQ ID NO.2)；

人siNC正向序列：5’-UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG-3’(SEQ ID NO.3)，

反向序列：5’-GUA CUU UUG UGU AGU ACA GUU-3’(SEQ ID NO.4)；

本发明所采用的鼠P65干扰引物序列及阴性对照引物序列(NC)由上海英潍捷基公司合成，引物序列如下，

鼠shP65：5'-GCG AAT CCA GAC CAA CAA TAA-3'(SEQ ID NO.5)

鼠shNC：5'-GAC CAA ACT CGA CAA TCA GAA-3'(SEQ ID NO.6)

其中，对照序列NC是目的基因干扰序列打乱后重新组合所得，不能结合任何有意义基因的阴性对照序列，用于对比目的基因组的实验效果。

本发明的实施例将采用以下实验方法：

1、人肿瘤标本检测及预后分析

1.1免疫组化检测

人肿瘤组织由中山大学附属肿瘤医院提供。制成石蜡切片后4℃保存。后续检测步骤为：

(1)预处理：取出55℃烤片1h，放于二甲苯中脱蜡两次，每次10min；依次用100％、95％、90％、80％、70％的乙醇洗一次，每步3min，后用双蒸水洗3min；0.3％的双氧水处理10min，双蒸水再洗3次，每次3min；浸泡于修复液中，用微波炉进行热修复，室温冷却半小时；用1×PBS洗三次，每次3min；

(2)杂交染色：用人CD3免疫组化特异抗体或人CD68免疫组化特异抗体进行孵育，4℃过夜；恢复室温，弃去抗体液，用1×PBS洗三次，每次5min；加入二抗，37℃半小时；用1×PBS洗三次，每次5min；加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染。

(3)计数：染色后20倍镜下随机拍5个视野，通过Imagine Pro Plus软件计数CD3⁺T细胞数量与CD68⁺巨噬细胞数量。

1.2实时定量PCR检测

取荷瘤小鼠肿瘤组织使用Trizol裂解，剧烈震荡摇匀，室温孵育15min；加预冷的氯仿，充分震摇后静置待其分层；4℃，12000g离心15min，吸取上层水相至新管；加入等体积异丙醇沉淀过夜；4℃，16000g离心1h，弃上清；70％预冷乙醇洗涤沉淀；4℃，16000g离心15min，弃上清；室温干燥5min；预冷DEPC水溶解；检测RNA质量，合格样品按照ABM公司的ALL-IN-ONE RT MasterMix试剂盒进行反转录。反转录后的cDNA产物使用SYBR GreenReal-Time PCR MasterMix(TOYOBO)在Roche LightCycler 480System进行实时定量PCR检测PD-L1表达情况。

1.3病理相关性分析

根据实时定量PCR检测PD-L1表达情况，按照中位值把标本分为PD-L1高表达和低表达两组，对照病人的复发情况和复发时间，通过Statistical Product and ServiceSolutions(SPSS)软件比较两组病人复发情况的差异。挑选出PD-L1高表达的标本，根据CD68⁺巨噬细胞/CD3⁺T细胞比例将标本分为四组(肝癌，比例>2；比例≤2且>1；比例≤1且>0.5；比例≤0.5)或两组(肠癌、胃癌及肺癌，比例>1；比例≤1)，比较不同组之间病人复发情况的差异。复发曲线通过Kaplan-Meier方法做出，而P值则由log-rank检验得出。P值<0.05定义为具有统计学显著性差异。

2、体外迁移实验

2.1细胞转染

将siRNA导入细胞的步骤是利用Invitrogen公司的转染试剂LipofectamineRNAiMAX进行反转实现。以24孔板为例，具体实验步骤为：

取胰蛋白酶消化细胞重悬于含有10％FBS的无双抗DMEM培养基(购自Invitrogen公司)中，使得细胞密度为3×10⁴个细胞/ml；将30p mol目的RNA稀释于100μl opti-MEM(购自Invitrogen公司)中，轻敲管壁混匀；每管加入1μl LipofectamineRNAi MAX，轻敲管壁混匀，室温放置15min；得到RNAi MAX/siRNA稀释液；每孔加入100μl RNAi MAX/siRNA稀释液，再加入500μl细胞稀释液，该细胞稀释液可使细胞密度在转染24h后大约为30-50％汇合。

上述目的RNA可为siP65、siNC(阴性对照RNA)中的一种。上述实施例为24孔板，其他孔板可根据孔的大小按比例放大或者缩小试剂用量。

2.2肿瘤细胞迁移实验

在转移小室中加入1ml无血清无双抗DMEM，使聚碳酸酯膜泡充分润湿；用胰蛋白酶消化细胞，离心后用无血清的DMEM将细胞重悬为4×10⁵/ml；吸出转移小室中的DMEM，在下室加入600μl含10％FBS的DMEM，在上室加入100μl细胞悬液，37℃培养10h；将转移小室中的聚碳酸酯膜用1×PBS润洗一次，甲醇固定15min后用0.1％的结晶紫染色20min，1×PBS润洗3次；棉签擦掉膜正面的细胞，显微镜下计数转移到膜另一面的细胞并照相。

上述进行迁移实验的细胞可为HepG2细胞、肿瘤巨噬细胞培养上清处理过的HepG2细胞、细胞因子TNF-α和IL-1β处理过的HepG2细胞、转染了siP65的HepG2细胞或转染了siNC的HepG2细胞中的一种。

2.3细胞爬片的免疫荧光染色

(1)细胞爬片：24孔培养板中滴加少量培养基，放置玻片；胰酶消化计数后将肿瘤细胞重悬于完全培养基中；按3×10⁴/孔密度将细胞加入培养板；根据实验需求分别加入完全培养基或含细胞因子TNF-α和IL-1β的完全培养基培养；20h后进行免疫荧光染色。

(2)免疫荧光染色：4％PFA室温固定15min；PBST洗5min×3次；滴加封闭液，室温放置1h；甩去封闭液，滴加一抗，4℃孵育过夜；PBST洗5min×4次；滴加荧光二抗，室温孵育1h；PBST洗5min×4次；DAPI室温孵育3min；H₂O₂洗5min×1次；擦去防渗圈，滴加Mountingmedium封片；晾干后于进行共聚焦成像。

3、小鼠成瘤实验

3.1细胞转染

将小鼠shP65干扰序列和以及阴性对照序列克隆到慢病毒载体PSIF-H1-COPGFP-SHRNA(System Biosciences)中。用磷酸钙转染法将慢病毒载体连同其辅助病毒载体pFIV-34N和pVSV-G(System Biosciences)一起导入HEK293T细胞。培养2天后，通过超速离心方法收集并浓缩病毒颗粒。病毒液感染肿瘤细胞3天后，通过流式分选出GFP⁺细胞，检测沉默效率，供后续实验使用。

3.2小鼠成瘤及处理

在一部分实验中，选取40只6周龄的C57BL/6小鼠，在其背部皮下种植5×10⁵小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。成瘤15天后通过腹腔注射的方式对小鼠进行处理(不处理、或同型对照抗体处理、或巨噬细胞特异性清除抗体处理、或PD-L1封闭抗体处理、或巨噬细胞特异性清除抗体与PD-L1封闭抗体联合用药组合物处理，每三天注射一次)。在另一部分实验中，选取40只6周龄的C57BL/6小鼠，在其背部皮下种植5×10⁵Hepa1-6细胞、或shNC Hepa1-6细胞、或shP65Hepa1-6细胞。成瘤15天后通过腹腔注射的方式对荷有shP65Hepa1-6肿瘤的小鼠进行处理(不处理、或同型对照抗体处理、或PD-L1封闭抗体处理，每三天注射一次)。定期测量肿瘤生长大小，成瘤39天后处死小鼠。

试验中，根据小鼠的体重，对其用药量为：巨噬细胞清除抗体(αCSF1R):10mg/kg；PD-L1阻断抗体:10mg/kg。

实施例1

通过人肿瘤组织检测研究PD-L1表达情况所反映的局部免疫特征。

上述实验根据标本PD-L1表达情况分为高表达和低表达两组。以PD-L1低表达组作为对照，探讨PD-L1高表达组中CD3⁺T细胞与CD68⁺巨噬细胞的浸润情况。

图1为肿瘤标本中PD-L1表达情况与局部CD3⁺T细胞以及CD68⁺巨噬细胞浸润情况的关系。图1中，肝癌(HCC)、肠癌(COAD)、胃癌(STAD)以及肺癌(LUAD)四种肿瘤中，PD-L1高表达标本与PD-L1低表达标本中CD3⁺T细胞及CD68⁺巨噬细胞数量统计图。结果显示，在肝癌(HCC)、肠癌(COAD)、胃癌(STAD)以及肺癌(LUAD)中，PD-L1高表达的组织标本中CD3⁺T细胞以及CD68⁺巨噬细胞的浸润数量显著高于PD-L1低表达的组织标本。

对实验结果进行对比分析表明：与对照组相比，PD-L1高表达组中CD3⁺T细胞与CD68⁺巨噬细胞的密度均显著更高。由此推测，肿瘤表达中PD-L1的表达情况不能专一的反映T细胞介导的免疫反应情况，还可能反映了局部组织中正在进行的巨噬细胞反应。

实施例2

通过人肿瘤组织检测研究PD-L1所反映的免疫状况与病人预后的关系。

上述实验根据标本PD-L1表达情况分为高表达和低表达两组，并比较两组病人复发情况的区别。挑选出PD-L1高表达的标本，进一步根据CD68⁺巨噬细胞/CD3⁺T细胞比例将标本分为两组或四组，比较不同组间病人复发情况的区别。

图2为肿瘤标本中PD-L1、CD3以及CD68表达情况与病人复发的关系。图2中，肝癌(HCC)、肠癌(COAD)、胃癌(STAD)以及肺癌(LUAD)四种肿瘤中，PD-L1高表达患者与PD-L1低表达患者复发情况比较统计图(左)以及在PD-L1高表达患者中，CD68⁺巨噬细胞/CD3⁺T细胞比例高与比例低的患者复发情况比较统计图。结果显示，在肝癌(HCC)、肠癌(COAD)、胃癌(STAD)以及肺癌(LUAD)中，组织标本中PD-L1的表达情况无法有效预测患者的复发情况：具体表现为PD-L1高表达的患者与PD-L1低表达的人群复发比例以及无瘤生存时间无显著差异。而在PD-L1高表达的人群中，局部CD68⁺巨噬细胞/CD3⁺T细胞比例越高的患者，复发时间越短。

对实验结果进行对比分析表明：PD-L1高表达的患者与PD-L1低表达的人群复发比例以及无瘤生存时间无显著区别。而在PD-L1高表达的人群中，局部CD68⁺巨噬细胞/CD3⁺T细胞比例越高的患者，复发时间越短。由此推测，巨噬细胞和T细胞的平衡决定了PD-L1高表达患者的临床结果，这可能为部分PD-L1高表达患者对免疫检查点治疗无响应的潜在原因。

实施例3

通过体外实验研究肿瘤巨噬细胞对肿瘤恶性生物学行为的影响。

实验A：检测肿瘤细胞在巨噬细胞上清(Tumor associated macrophage culturedmedium，本发明中简称TAM-CM)处理情况下迁移能力的改变。实验设置阴性对照组和实验组。阴性对照组肿瘤细胞不处理，实验组肿瘤细胞给与巨噬细胞上清处理。

实验B：检测抑制肿瘤细胞的NF-κB信号通路或沉默肿瘤细胞NF-κB亚基P65情况下，肿瘤巨噬细胞上清对肿瘤迁移能力的影响。实验设置阴性对照组和实验组。阴性对照组肿瘤细胞不处理、给与DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜，P65抑制剂的溶剂)处理或进行转染siNC处理，实验组肿瘤细胞给与P65抑制剂处理或进行转染siP65处理。进一步检测上述细胞在接受肿瘤巨噬细胞上清处理情况下迁移能力的改变。

实验C：检测细胞因子TNF-α和IL-1β对肿瘤细胞P65入核情况以及对肿瘤细胞迁移能力的影响。实验设置阴性对照组和实验组。阴性对照组肿瘤细胞不处理，实验组肿瘤细胞给与人重组细胞因子TNF-α(20ng/ml)和IL-1β(10ng/ml)处理。

图3为肿瘤巨噬细胞通过分泌细胞因子TNF-α和IL-1β激活肿瘤细胞P65通路，促进肿瘤转移的体外实验。图3中，A为肿瘤巨噬细胞上清(TAM-CM)对肿瘤细胞迁移能力影响的代表图及统计图；图3B为抑制肿瘤细胞NF-κB信号通路及沉默肿瘤细胞P65表达情况下，肿瘤巨噬细胞上清对肿瘤迁移的影响统计图；图3C为细胞因子TNF-α和IL-1β对肿瘤细胞P65入核情况荧光代表图；图3D为细胞因子TNF-α和IL-1β对肿瘤细胞迁移能力影响统计图。结果显示，A图显示肿瘤巨噬细胞培养上清能显著提高肿瘤细胞的迁移能力。B图显示抑制肿瘤细胞的NF-κB或沉默NF-κB信号通路亚基P65能显著废除肿瘤巨噬细胞上清诱导的肿瘤细胞迁移。C图显示肿瘤巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-1β能激活NF-κB信号通路，促进P65入核发挥功能。D图显示肿瘤巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-1β也能有效促进肿瘤细胞迁移能力的上调。

对实验结果进行对比分析表明：与对照组相比，肿瘤巨噬细胞培养上清能大幅度提高肿瘤细胞的迁移能力，并且这种上调能被抑制肿瘤细胞的NF-κB信号通路或沉默NF-κB亚基P65所废除。提示：肿瘤巨噬细胞通过激活肿瘤细胞的NF-κB信号通路，从而增强其迁移能力。因此，NF-κB可作为免疫检查点治疗的联合治疗靶点之一。过往工作表明肿瘤巨噬细胞能分泌多种炎症细胞因子，因此我们也检测细胞因子TNF-α以及IL-1β是否参与巨噬细胞诱导肿瘤细胞迁移的过程中。结果分析表明，TNF-α和IL-1β能激活NF-κB信号通路，促进P65入核发挥功能，并能有效促进肿瘤细胞迁移能力的上调。提示肿瘤巨噬细胞通过细胞因子TNF-α和IL-1β促进肿瘤细胞迁移。因此，TNF-α以及IL-1β也可作为免疫检查点治疗的联合治疗靶点之一。

实施例4

通过小鼠成瘤实验研究基于免疫检查点抑制与阻断巨噬细胞反应的联合用药组合物对肿瘤生长的影响。

上述小鼠实验设置对照组和实验组。

实验A：对照组小鼠不处理、或给与腹腔注射同型对照抗体处理、或免疫检查点PD-L1封闭抗体单独处理、或巨噬细胞清除抗体单独处理，实验组小鼠给与腹腔注射联合组合物处理。

实验B：对照组小鼠进行Hepa1-6细胞成瘤、或shNC Hepa1-6细胞成瘤、或shP65Hepa1-6细胞成瘤、或在shP65 Hepa1-6细胞成瘤的基础上进行同型对照抗体处理，实验组小鼠在shP65 Hepa1-6细胞成瘤的基础上进行PD-L1封闭抗体处理。

上述成瘤实验所采用的小鼠品系为C57BL/6，所采用的肿瘤细胞株为小鼠肝癌细胞株Hepa1-6。

图4为联合用药组合物治疗对荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响。图4中，A为巨噬细胞清除抗体单独治疗、PD-L1封闭抗体单独治疗、以及组合物治疗对荷瘤小鼠肿瘤大小影响统计图；图4B为沉默肿瘤细胞P65的情况下，PD-L1封闭抗体治疗对荷瘤小鼠肿瘤大小影响统计图。结果显示，A图显示对荷瘤小鼠中进行巨噬细胞清除抗体处理和PD-L1封闭抗体处理均能有效抑制肿瘤生长，并且两种药物联合能更有效的抑制肿瘤生长甚至促进肿瘤消退。B图显示对荷瘤小鼠中进行PD-L1封闭抗体处理或沉默肿瘤细胞中的NF-κB信号通路亚基P65均能有效抑制肿瘤生长，并且两种手段联合能更有效的抑制肿瘤生长甚至促进肿瘤消退。

对实验结果进行对比分析表明：与阴性对照组相比，联合药物处理组小鼠肿瘤明显更小。更重要的是，与单独进行免疫检查点治疗以及单独进行巨噬细胞反应阻断相比，联合用药组合物对肿瘤生长有更好的抑制效果。

本发明实施例所采用的鼠PD-L1封闭抗体为试验中常见的一种PD-L1抑制剂，由于PD-1/PD–L1的相互作用，可以预测采用PD-1抑制剂来做实验可以获得同样的实验效果。既然在小鼠实验中，PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂可以与巨噬细胞反应阻断物发生协同作用，更好的抑制肿瘤，那么同样的采用临床使用的PD-1抑制剂包括但不限于以下药物Nivolumab(欧狄沃)、Pembrolizumab(帕博利珠单抗)、特瑞普利，或者采用临床使用的PD-L1抑制剂包括但不限于以下药物Atezolizumab(阿特朱单抗)、Durvalumab(度伐鲁单抗)或Avelumab(阿维单抗)也可以与巨噬细胞反应阻断物发生协同作用，用来抑制肿瘤。

本发明实施例采用的αCSF1R为实验中常见的一种巨噬细胞特异性清除抗体，可以与PD-L1抑制剂产生协同作用，更好的抑制肿瘤。那么，在人体中，临床使用的巨噬细胞特异性清除抗体同样可以用来和免疫检查点抑制剂一起作用抑制肿瘤。

本发明实施例采用人重组TNF-α和IL-1β细胞因子来进行实验，证明两者联合使用可以激活NF-κB信号通路，促进P65入核发挥功能，并能有效促进肿瘤细胞迁移能力的上调。由于这两种细胞因子已经被证明其发挥作用的机制很类似，那么单独的采用其中一种细胞因子来进行实验也可以得出与本实验同样的结果。因此，采用临床使用的细胞因子TNF-α抑制剂包括但不限于以下药物Infliximab(英夫利昔单抗)、Golimumab(戈利木单抗)、Etanercept(依那西普)、Certolizumab(赛妥珠单抗)，或者采用临床使用的细胞因子IL-1β抑制剂包包括但不限于Anakinra(阿那白滞素)、Canakinumab(卡那单抗)也可以抑制肿瘤细胞的迁移能力，结合免疫检查点抑制剂可以产生协同作用，用来抑制肿瘤。

本发明实施例中采用的NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082是一种常见的实验试剂，其可以抑制肿瘤细胞迁移能力，与PD-L1抑制剂产生协同作用，更好的抑制肿瘤。因此，采用临床使用的NF-κB信号通路抑制剂同样可以与免疫检查点抑制剂在人体中产生协同作用，用来抑制肿瘤。

综上所述，本发明提供的基于免疫检查点抑制与巨噬细胞反应阻断的抗肿瘤联合用药组合物在提高肿瘤患者响应免疫检查点治疗效果，以及在制定临床抗肿瘤治疗策略上均有广泛的应用。同时，本发明提供的免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断药物分别清除了两个不同的促肿瘤因素，两者联合用药产生了协同作用，可更有效抑制肿瘤生长。因此，该药物组合物具有较好的临床应用前景。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变动。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用

<160> 13

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人siP65正向序列

<400>1

UGGAGUACCC UGAGGCUAUdT dT 21

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人siP65反向序列

<400>2

AUAGCCUCAG GGUACUCCAU C 21

<210>3

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人siNC正向序列

<400>3

UUGUACUACA CAAAAGUACU G 21

<210> 4

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人siNC反向序列

<400>4

GUACUUUUGU GUAGUACAGU U 21

<210>5

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>鼠shP65干扰引物序列

<400>5

GCGAATCCAG ACCAACAATA A 21

<210>6

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>鼠shNC阴性对照引物序列

<400>6

GACCAAACTC GACAATCAGA A 21

Claims

1.一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物包含免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物。

2.根据权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为程序性死亡受体PD-1或其配体PD-L1抑制剂。

3.根据权利要求2所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述程序性死亡受体PD-1抑制剂为Nivolumab、Pembrolizumab或特瑞普利。

4.根据权利要求2所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述程序性死亡受体配体PD-L1抑制剂为Atezolizumab、Durvalumab或Avelumab。

5.根据权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述巨噬细胞反应阻断物为巨噬细胞特异性清除抗体、细胞因子TNF-α抑制剂、细胞因子IL-1β抑制剂或NF-κB信号通路抑制剂。

6.根据权利要求5所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述细胞因子TNF-α抑制剂为Infliximab、Golimumab、Etanercept或Certolizumab。

7.根据权利要求5所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述细胞因子IL-1β抑制剂为Anakinra或Canakinumab。

8.权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物在制备治疗与预防癌症药物或在制备提高肿瘤患者对免疫检查点治疗响应效果药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述实体瘤包含原发性肝细胞肝癌、肠癌、胃癌或肺癌。