CN109985235A

CN109985235A - 鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗

Info

Publication number: CN109985235A
Application number: CN201910086873.1A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本申请提供了一种免疫组合物及亚单位疫苗，包含：采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子以及SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子分别编码的鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白以及S2蛋白，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，这两个蛋白使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2‑3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

Description

鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗

技术领域

本申请涉及动物免疫药物技术领域，具体而言，涉及一种鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗。

背景技术

传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触传染性的呼吸道病和泌尿生殖道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏为主要特征。各种日龄性别和品种的鸡都有易感性，但以6周龄以下雏鸡更易感染。没有获得母源抗体的雏鸡感染传染性支气管炎病毒后引起永久性的输卵管损伤，到性成熟丧失产蛋能力，甚至可由于呼吸道或肾脏的感染而死亡。产蛋鸡群感染传染性支气管炎病毒后导致产蛋量下降，蛋形不整、畸形和质量低下，受精率降低，传染性支气管炎还使鸡的增重和饲料报酬降低。虽然疫苗的使用对传染性支气管炎的流行起到了一定的预防和控制作用，但由于传染性支气管炎病毒血清型众多，不同血清型毒株之间具有较小的交叉保护性甚至无交叉保护性。因此，传染性支气管炎目前仍在免疫鸡群和非免疫鸡群发生和传播，给养禽业造成了严重的经济损失。

IBV属于Nido病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)中第三群的成员。病毒基因组由单股不分节段的正链RNA组成，长约27.6kb。含有4种结构蛋白，即纤突(Spike，S)糖蛋白、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白、膜(Membrane，M)糖蛋白和小膜(Small Envelope，E)糖蛋白。

现有专利几乎均为全病毒灭活疫苗或者活疫苗，比如CN103007272A中所公开的IBV疫苗为活疫苗，通过悬浮细胞培养生产全病毒，需要血清同时存在散毒风险，且抗原表达量低；同时现有的疫苗是用鸡胚生产的，鸡胚难以处理，易造成污染。CN104353070A公开了一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法，其使用鸡支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因融合表达，利用昆虫杆状病毒表达***进行制备，但是昆虫细胞糖基化和动物细胞存在较大差异。

本发明因此而来。

发明内容

本申请旨在提供一种免疫组合物，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S1蛋白以及

SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子别编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S2蛋白。

本发明进一步的技术方案是：所述的鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；以及SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防鸡传染性支气管炎病毒感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种核酸分子组合物，其可以用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；以及SEQ ID NO:2的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。

本发明实施例还提供了一种重组真核表达载体pCI-S1-GS；所述载体包含用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白的SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。

本发明实施例还提供了一种重组真核表达载体pCI-S1-S2-GS，所述载体包含用于编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白的SEQ ID NO:2的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。

进一步的，所述的重组真核表达载体主要是通过在表达载体的pCI的CMV启动子下***所述的基因而形成。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受鸡传染性支气管炎病毒感染的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:3的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；

以及SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了导入所述重组真核表达载体的高表达目的基因的单克隆宿主哺乳细胞。所述CHO细胞系可以是为DG44,DXB11,CHO-K1,CHO-S细胞株，优选的，CHO-S细胞株。

本发明实施例还提供了所述免疫组合物、所述基因或者所述重组哺乳动物细胞在制备鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明实施例还提供了鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗，其包含所述的免疫组合物。进一步的，所述疫苗包含药学上有效量的的免疫组合物。

进一步的，所述的疫苗还包含赋形剂和/或佐剂，佐剂可以是包括白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或两种以上的组合。

本发明目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的IBV基因工程亚单位疫苗。为达到以上目的，本发明使用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞共表达IBV S1蛋白和S2蛋白，而且，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，能够激发中和抗体。

本发明公开了一种CHO细胞表达的重组鸡传染性支气管炎病毒蛋白以及亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸡能够抵御强毒攻毒，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，本发明还提供一种可大规模工业化生产的鸡传染性气管炎病毒重组亚单位疫苗的制备方法：首先克隆包含S1蛋白编码基因以及截短的S2基因表达框的真核表达载体；然后转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效共表达S1-S2蛋白的CHO细胞株；通过发酵培养高效表达S1-S2蛋白的细胞株，纯化后得到重组S1-S2蛋白；最后将重组S1-S2蛋白与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

本发明提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2-3g/L，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。

采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

本发明的免疫组合物不涉及全病毒，具有天然安全性，通过此方法的表达量非常高，分泌到上清液中，易于纯化，动物细胞真核表达表达糖基化修饰完善，最接近原始的分子，悬浮培养，易于大规模生产。

本发明使用CHO细胞表达IBV重要抗原蛋白S1-S2蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2-3g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。本发明的亚单位疫苗可以大规模生产，供量重组，质控容易；安全性高，免疫原性好；批次间稳定；生产成本低。

本发明使用了优化的S1蛋白序列，同一个载体中共表达S1蛋白和S2蛋白，两个蛋白能够形成异二聚体，和病毒表面结构类似，使用悬浮培养CHO细胞进行表达，表达量非常高，蛋白免疫原性好。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为将S1基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，可以看到一个1.6kbp的条带；其中1为IBV-S1基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图2为多个S1基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，1.6kbp条带出现为阳性样品。其中1～3、5～9均为S1基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，4为非阳性样品；M为分子量标记；

图3为将IBV-S2表达框基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，可以看到一个3.4kbp的条带；其中1～7为IBV-S2表达框基因；M为分子量标记；

图4为IBV-S2表达框基因转化后菌落PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，3.4kbp条带出现为阳性样品。其中1为IBV-S2表达框基因转化后菌落样品PCR扩增后的产物，2为阴性对照；M为分子量标记；

图5为实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，在分子量约100kDa和50kDa附近出现两个目的条带，其中100kDa左右为IBV-S1蛋白；50kDa为IBV-S2蛋白。其中1为实施例3中收获的细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图6为实施例4中单独表达S1蛋白的重组CHO细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果；其中1为单独表达S1蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图7为实施例4中单独表达S2蛋白的重组CHO细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果；其中1为单独表达S2蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图8为实施例3中重组CHO上清样品Western Blot检测结果，有两个细胞条带；其中1为重组CHO上清样品；2为阴性对照；M为分子量标记；

图9为实施例5中单独表达S1蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中1为单独表达S1蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图10为实施例5中单独表达S2蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中1为单独表达S2蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图11为重组CHO(pCI-S1-S2-GS)细胞表达产物免疫共沉淀检测结果，1为阴性对照；2为重组CHO(pCI-S1-S2-GS)细胞表达产物；可以看出通过S1蛋白单克隆抗体的结合产生沉淀，沉淀产物中除了抗体条带外，还存在S1以及S2蛋白条带，说明CHO表达的S1，S2蛋白形成一种复合物。

图12为蛋白纯化后的结果，其中1、6、7为阳性样品，2、3、4、5为阴性样品，8为阴性对照，M为分子量标记；

图13为使用本发明疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组鸡肾脏解剖的对比结果，左侧为阴性对照组；右侧为疫苗组，可以看出疫苗组鸡的肾脏正常，而阴性对照组鸡肾脏出现明显的充血，病变斑点(如箭头所示)。

图14为构建的真核表达载体pCI-S1-S2-GS图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子以及SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子分别编码的鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白。

本发明也涉及一种诱导针对IBV抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的疫苗。

本发明也涉及一种保护受试动物免受IBV感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的疫苗。

本发明还包括适用于诱导针对IBV的免疫反应的疫苗。本发明的疫苗可为包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本文提供一组选自由以下组成的组的蛋白组合物：包含SEQ ID NO:3的蛋白；在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；以及SEQ ID NO:4的片段；与SEQID NO:4的片段95％相同的蛋白。

本发明还提供一种构成异二聚体的蛋白组合物：选自以下的一种蛋白：(a)SEQ IDNO:3；(b)在如SEQ ID NO:3所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:3的包含SEQ ID NO:3的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；(d)在SEQ IDNO:3的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及选自以下的一种蛋白：(a)SEQ ID NO:4；(b)在如SEQ ID NO:4所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:4的包含SEQ ID NO:4的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；(d)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。

本发明还提供包含编码所述的一种或多种蛋白组的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1；在SEQ ID NO:1的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段95％相同的核苷酸序列；在另一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:2；在SEQ ID NO:2的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQID NO:2的片段；与SEQ ID NO:2的片段95％相同的核苷酸序列。

本发明一些方面提供诱导针对IBV的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用IBV抗原和/或其组合物。

本发明另外的方面提供保护个体免受IBV感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反应。

本发明的一些方面提供一种诱导针对IBV抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本发明的核酸分子。

本发明的一些方面提供一种保护受试动物免受IBV感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本发明的核酸分子。

向需要防御病毒感染的鸡施用免疫有效量的本发明的疫苗。通过常规测试可以很容易地测定或很容易地滴定要接种鸡的免疫有效量或者免疫原性量。有效量是获得对疫苗足够的免疫应答的剂量，以保护暴露于IBV的鸡。优选地，将鸡保护至这样的程度，其中病毒性疾病的一种至所有的不良生理症状或作用被显著地降低、改善或完全阻止。

可以以单剂量或以重复剂量施用所述疫苗。剂量范围可以是例如从约1微克至约1,000微克含有IBV DNA(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，优选100至200微克鸡IBVDNA，但不应当含有足以导致病毒感染的不良反应的剂量。现有技术中已知用于测定或滴定合适剂量的活性抗原，根据鸡的体重、抗原的浓度和其他典型因素发现最小有效剂量的方法。

在另一方面，本发明提供一种构成异二聚体的蛋白组合物：选自以下的一种蛋白：(a)SEQ ID NO:3；(b)在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQID NO:3的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:3的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段。以及选自以下的另一种蛋白：(a)SEQ ID NO:4；(b)在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:4的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ IDNO:4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段

本发明的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对IBV的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本发明的核酸分子组合物以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本发明的疫苗可以包括由所述核酸分子编码的蛋白组合物。本发明的疫苗可还包括所述的核酸分子组合物和由所述核酸分子编码的蛋白组合物。

1.定义.

本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个***的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的DNA质粒疫苗中来增强由下文所述的DNA质粒和编码核酸序列的所编码的抗原的免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定IBV抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定IBV抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株IBV抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株IBV抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。

如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如IBV共有抗原的引入，宿主的免疫***(例如动物的免疫***)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的IBV蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部***解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

如本文所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。

“亚型”或“血清型”：如本文交换使用的并且关于IBV，意指IBV的基因变体，以使得一个亚型被免疫***识别而从不同的亚型中分离。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的***、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

2.疫苗

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗。鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗(IBV)可包含编码IBV抗原的核酸。本发明的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种IBV血清型的免疫反应的程度或强度。

本发明的疫苗可包含IBV S1蛋白和/或S2蛋白。IBV重组蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。

所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗IBV免疫反应。IBV抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。

在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1或2的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或2。片段可与SEQ ID NO:1或2的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1或2的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:3同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:3中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:3中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:3中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:3中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:3中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与SEQ ID NO:4同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:4中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:4中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:4中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:4中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:4中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:3或4相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:3或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。

在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:3或4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:3或4。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:4的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQID NO:495％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:4的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQID NO:4中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

d.疫苗构建体和质粒

疫苗可包括编码IBV S1-S2蛋白的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的IBV抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开的IBV表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。

所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

本发明用于编码IBV重要抗原蛋白S1蛋白的核苷酸序列,优选是原始序列，增加以及截短的序列；本发明用于编码IBV抗原蛋白S2蛋白的核苷酸序列,优选是原始序列，增加以及截短的序列；使用载体pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS，优选的用pCI-GS。CHO细胞系可以是为DG44,DXB11,CHO-K1,CHO-S细胞株，优选的CHO-S。

实施例1重组真核表达载体pCI-S1-GS的构建

1.密码子优化的S1基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，将S1基因克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-S1质粒载体。优化后的S1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.S1基因扩增以pUC-S1作为模板，S1-F、S1-R作为引物进行PCR扩增(S1-F、S1-R的基因序列如SEQ ID NO.6、7所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 S1基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.6kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

3.酶切将pCI-GS质粒和纯化后的S1基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ酶37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 S1基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

4.连接将酶切过的pCI-GS质粒和S1基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接，过夜，连接体系见表4。

表4 S1基因与pCI-GS质粒连接体系

5.转化取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

6.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，S1-F和S1-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.6kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-S1-GS。

实施例2重组真核表达载体pCI-S1-S2-GS的构建。

1.密码子优化的S2基因表达框(序列如SEQ ID NO:5所示)来自南京金斯瑞生物科技有限公司(该表达框包含CMV启动子，截短的S2基因(序列如SEQ ID NO:2所示)以及SV40polyA转录终止信号，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-S2质粒载体。

2.S2基因表达框扩增以pUC-S2作为模板，S2-F、S2-R作为引物(S2-F、S2-R的基因序列如SEQ ID NO.8、9所示)进行PCR扩增，扩增体系见表5。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸4分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表5 S2基因表达框扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小如图3所示，可以看到一个3.4kbp的条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

3.酶切将pCI-S1-GS质粒和纯化后的S2基因表达框PCR产物分别使用HpaⅠ、ClaⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表6、表7。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表6 S2基因表达框酶切反应体系

表7 pCI-S1-GS质粒酶切反应体系

4.连接将酶切过的pCI-S1-GS质粒和S2基因表达框酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。

表4 S2基因表达框与pCI-S1-GS质粒连接体系

6.菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，S2-F和S2-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图4所示，出现3.4kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。即得到真核表达载体pCI-S1-S2-GS。构建好的载体图谱如图14所示。

实施例3：重组CHO-S细胞构建筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2质粒与细胞混合取实施例2中pCI-S1-S2-GS质粒载体5ug，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转化 280V20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50uMMSX加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用购自苏州市沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50uM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板稀释细胞至5个/mL，取200ul混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100ul0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mLCHO-WM培养基(含10％FBS+50uM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50uM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅中预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

实施例4 SDS-PAGE检测

将实施例3中收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loadingbuffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。如图5所示，在分子量约100kDa和50kDa附近出现两个目的条带，其中S1蛋白是100kDa左右，S2蛋白是50kDa。本实施例也构建了单独表达S1和S2蛋白的重组CHO细胞，两个蛋白分别电泳如图6和图7所示，说明S1，S2蛋白都得到正确表达。因为S1蛋白有较多的糖基化修饰，所以其分子量较通过氨基酸序列理论计算的分子量高约40kDa，S2蛋白大小和理论计算值大小一致，糖基化水平较低，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例5 WesternBlot检测

将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗IBV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图8所示，重组CHO上清样品有两个细胞条带，图9和图10分别是单独表达的S1和S2，WB检测图，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例6重组CHO(pCI-S1-S2-GS)细胞表达产物免疫共沉淀检测

1.取CHO表达的上清1mL，加入IBV-S1蛋白单克隆抗体10ul，4℃摇晃孵育过夜。

2.取10ulproteinA琼脂糖珠，用适量PBS缓冲液洗3次，每次3000rpm离心3min；

3.将预处理过的10ul protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的CHO表达上清液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteinA琼脂糖珠偶连；

4.免疫沉淀反应后，在4℃以3000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml PBS缓冲液洗3－4次；最后加入15ul的2xSDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；

5.SDS-PAGE检测结果如图11所示。通过S1蛋白单克隆抗体的结合产生沉淀，沉淀产物中除了抗体条带外，还存在S1以及S2蛋白条带，说明CHO表达的S1，S2蛋白形成一种复合物。

实施例7蛋白纯化

目的蛋白含有his标签，使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。

1.Ni柱的再生和平衡：

1.1 0.5mol/L的NaOH反向冲洗Ni柱10min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗。

1.2 50mol/L的NiSO₄冲洗5柱体积。结束后，用超纯水正向冲洗。

1.3用含有300mM咪唑PBS(pH＝7.4)缓冲液冲洗3个柱体积后继续用PBS缓冲液冲洗平衡5个柱体积。

2.Ni纯化过程:

PBS平衡Ni柱后，取培养的上清上样，上样结束后用PBS洗涤5个柱体积至基线平衡。然后分别使用含有30mM，150mM，300mM以及500mM咪唑的PBS进行洗脱。结果如图12所示，在150mM咪唑浓度的PBS溶液中洗脱出目的蛋白，同时纯化得到S1，S2蛋白复合物。

实施例8亚单位疫苗制备

将适量纯化的鸡传染性支气管炎病毒S1-S2蛋白加入到ISA201VG佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为100ug/mL，乳化，质检合格后置于4℃保存。

免疫实验：用14-42日龄SPF鸡40只，其中20只是阴性对照组，20只实验组。每只鸡先各点眼接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1份，接种后21-28日，分别采血，分离血清，实验组各接种本疫苗0.5ml，阴性对照组接种生理盐水配置的疫苗。二次接种后21-28日，再分别采血，分离血清。将两次血清分别作HI抗体效价测定。结果如下表所示。从结果中可以看出，实验组鸡免疫重组IBV灭活苗前后HI效价对数的几何平均值大于4，符合要求。

实验组别	免疫前HI效价平均值	免疫后HI效价平均值	差值
				组	2<sup>2.6</sup>	2<sup>6.8</sup>	2<sup>4.2</sup>
阴性对照组	2<sup>2.7</sup>	2<sup>2.5</sup>	2<sup>-0.2</sup>

对免疫组和阴性对照组分别攻毒IBV GD/2015株并对0.1mL(病毒含量≥10^6.4EID₅₀)，隔离饲养，观察至14d，攻毒后临床症状监测，攻毒后每日监测试验鸡的食欲，精神状态，呼吸等临床现象。对照组20只鸡在攻毒后陆续表现出呼吸困难、发出罗音、咳嗽、打喷嚏等临床表现，死亡率为50％，剖检病死鸡可见肾脏、气管等病理变化比较严重(如图13左侧)。疫苗组鸡只临床表现正常(图13右侧)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

ggtaccgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggcgccct gtacgactcc agctcttacg tgtactatta ccagtccgcc 120

ttcaggccac ctaacggatg gcacctgcat ggcggagctt acgctgtggt gaatatctcc 180

agcgagtcta acaatgctgg ctcttcccca ggatgcatcg tgggcacaat ccacggcgga 240

agggtggtga acgctagctc tatcgccatg accgctccct ccagcggaat ggcttggtct 300

tccagccagt tctgcacagc tcactgtaat ttttccgaca ccacagtgtt cgtgacacat 360

tgctataagt acgatggctg tcccatcacc ggcatgctgc agaagaactt tctgagagtg 420

agcgccatga agaacggcca gctgttctac aatctgacag tgtccgtggc taagtatcct 480

acctttaaga gcttccagtg cgtgaacaac ctgacctccg tgtacctgaa cggcgacctg 540

gtgtatacat ctaatgagac cacagatgtg acctccgccg gcgtgtactt taaggctggc 600

ggcccaatca cctataaagt gatgagagag gtgaaggccc tggcttactt cgtgaatggc 660

acagcccagg acgtgatcct gtgcgatggc tcccccaggg gcctgctggc ttgtcagtac 720

aacaccggca acttctccga tggcttttat cctttcatca actcttccct ggtgaagcag 780

aagtttatcg tgtatcgaga gaactctgtg aataccacat tcaccctgca caacttcaca 840

tttcataatg agaccggcgc caaccctaat ccatccggcg tgcagaacat ccagacctac 900

cagacccaga cagctcagag cggctattac aacttcaact tctccttcct gtcctccttc 960

gtgtacaagg agtctaactt catgtacggc tcttatcacc cctcctgcaa cttcaggctg 1020

gagaccatca acaatggcct gtggttcaac tccctgagcg tgtctatcgc ctacggccct 1080

ctgcagggcg gctgtaagca gtccgtgttc tccggccggg ccacatgctg ttatgcttac 1140

agctatggcg gcccatctct gtgcaagggc gtgtactccg gagagctggc cctgaatttc 1200

gagtgtggcc tgctggtgta tgtgaccaag agcggcggct ccagaatcca gaccgctaca 1260

gagccacccg tgatcacacg gcataactac aacaatatca ccctgaacac atgcgtggac 1320

tacaatatct atggcaggac cggccagggc tttatcacca acgtgacaga ctccgccgtg 1380

agctacaatt atctggccga tgctggcctg gctatcctgg acacctccgg cagcatcgat 1440

atctttgtgg tgcagggcga gtacggcctg acatattaca aggtgaaccc ctgtgaggat 1500

gtgaatcagc agttcgtggt gtccggcggc aagctggtgg gcatcctgac atcccggaac 1560

gagaccggca gccagctgct ggagaaccag ttctatatca agatcaccaa tggccatcac 1620

catcaccatc actgatgact cgag 1644

<210> 2

<211> 1773

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gttaacgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggcagcat caccgagaac gtggccaatt gtccttacgt gtcttatggc 120

aagttctgca tcaagccaga cggctccatc gctaccatcg tgcccaagca gctggagcag 180

ttcgtggccc ctctgctgaa cgtgacagag aatgtgctga tcccaaacag ctttaatctg 240

accgtgacag acgagtacat ccagacacgg atggataagg tgcagatcaa ctgtctgcag 300

tacgtgtgcg gcaattctct ggactgtaga gatctgtttc agcagtacgg cccagtgtgc 360

gacaacatcc tgagcgtggt gaactccatc ggccagaagg aggatatgga gctgctgaac 420

ttctattcca gcaccaagcc cgccggcttc aacacacctt ttctgtccaa tgtgagcacc 480

ggcgagttta atatctccct gctgctgacc acaccatctt cccccaggag gaggtccttc 540

atcgaggacc tgctgtttac atctgtggag tccgtgggac tgccaaccga cgatgcttac 600

aagaactgta cagccggccc tctgggcttc ctgaaggatc tggcctgcgc tcgagagtat 660

aatggcctgc tggtgctgcc ccctatcatc accgctgaga tgcagaccct gtacacaagc 720

tctctggtgg ctagcatggc cttcggcgga atcaccgctg ctggagctat cccctttgcc 780

acacagctgc aggccaggat caaccacctg ggcatcaccc agagcctgct gctgaagaac 840

caggagaaga tcgccgcttc tttcaataag gctatcggcc gcatgcagga gggctttagg 900

tctacatccc tggccctgca gcagatccag gacgtggtga acaagcagtc cgctatcctg 960

accgagacaa tggccagcct gaacaagaat tttggcgcta tctccagcgt gatccaggag 1020

atctatcagc agctggacgc catccaggcc aatgctcagg tggatcgcct gatcaccggc 1080

aggctgtctt ccctgtccgt gctggcttcc gccaagcagg ctgagcatat ccgggtgagc 1140

cagcagagag agctggccac ccagaagatc aacgagtgcg tgaagagcca gtctatccgc 1200

tactctttct gcggcaatgg caggcacgtg ctgacaatcc ctcagaacgc tccaaatggc 1260

atcgtgttta tccatagctc ttataccccc gattctttcg tgaacgtgac agccatcgtg 1320

ggcttttgcg tgaagccagc caatgcttcc cagtacgcta tcgtgccagc taacggaagg 1380

ggcatcttca tccaagtgaa tggctcttac tatatcaccg ctcgggacat gtatatgcct 1440

agagctatca cagccggcga tatcgtgacc ctgacatctt gccaggccaa ctacgtgtcc 1500

gtgaataaga ccgtgatcac cacatttgtg gacaacgacg atttcgactt taatgatgag 1560

ctgtctaagt ggtggaacga taccaagcac gagctgcctg acttcgataa gtttaattac 1620

acagtgccaa tcctggacat cgattccgag atcgacagaa tccagggcgt gatccagggc 1680

ctgaacgaca gcctgatcga tctggagaag ctgtctatcc tgaagaccta catcaagtgg 1740

cctcaccacc accatcatca ctgatgaatc gat 1773

<210> 3

<211> 539

<212> PRT

<213> 鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)

<400> 3

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Leu Tyr Asp Ser Ser Ser Tyr Val Tyr Tyr Tyr

20 25 30

Gln Ser Ala Phe Arg Pro Pro Asn Gly Trp His Leu His Gly Gly Ala

35 40 45

Tyr Ala Val Val Asn Ile Ser Ser Glu Ser Asn Asn Ala Gly Ser Ser

50 55 60

Pro Gly Cys Ile Val Gly Thr Ile His Gly Gly Arg Val Val Asn Ala

65 70 75 80

Ser Ser Ile Ala Met Thr Ala Pro Ser Ser Gly Met Ala Trp Ser Ser

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Asp Thr Thr Val Phe

100 105 110

Val Thr His Cys Tyr Lys Tyr Asp Gly Cys Pro Ile Thr Gly Met Leu

115 120 125

Gln Lys Asn Phe Leu Arg Val Ser Ala Met Lys Asn Gly Gln Leu Phe

130 135 140

Tyr Asn Leu Thr Val Ser Val Ala Lys Tyr Pro Thr Phe Lys Ser Phe

145 150 155 160

Gln Cys Val Asn Asn Leu Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu Val

165 170 175

Tyr Thr Ser Asn Glu Thr Thr Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr Phe

180 185 190

Lys Ala Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Lys Val Met Arg Glu Val Lys Ala

195 200 205

Leu Ala Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys Asp

210 215 220

Gly Ser Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn Phe

225 230 235 240

Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Phe Ile Asn Ser Ser Leu Val Lys Gln Lys

245 250 255

Phe Ile Val Tyr Arg Glu Asn Ser Val Asn Thr Thr Phe Thr Leu His

260 265 270

Asn Phe Thr Phe His Asn Glu Thr Gly Ala Asn Pro Asn Pro Ser Gly

275 280 285

Val Gln Asn Ile Gln Thr Tyr Gln Thr Gln Thr Ala Gln Ser Gly Tyr

290 295 300

Tyr Asn Phe Asn Phe Ser Phe Leu Ser Ser Phe Val Tyr Lys Glu Ser

305 310 315 320

Asn Phe Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ser Cys Asn Phe Arg Leu Glu

325 330 335

Thr Ile Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Ile Ala

340 345 350

Tyr Gly Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Ser Gly Arg

355 360 365

Ala Thr Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Gly Gly Pro Ser Leu Cys Lys

370 375 380

Gly Val Tyr Ser Gly Glu Leu Ala Leu Asn Phe Glu Cys Gly Leu Leu

385 390 395 400

Val Tyr Val Thr Lys Ser Gly Gly Ser Arg Ile Gln Thr Ala Thr Glu

405 410 415

Pro Pro Val Ile Thr Arg His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asn Thr

420 425 430

Cys Val Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Thr Gly Gln Gly Phe Ile Thr

435 440 445

Asn Val Thr Asp Ser Ala Val Ser Tyr Asn Tyr Leu Ala Asp Ala Gly

450 455 460

Leu Ala Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ser Ile Asp Ile Phe Val Val Gln

465 470 475 480

Gly Glu Tyr Gly Leu Thr Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp Val

485 490 495

Asn Gln Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Lys Leu Val Gly Ile Leu Thr

500 505 510

Ser Arg Asn Glu Thr Gly Ser Gln Leu Leu Glu Asn Gln Phe Tyr Ile

515 520 525

Lys Ile Thr Asn Gly His His His His His His

530 535

<210> 4

<211> 582

<212> PRT

<213> 鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ser Ile Thr Glu Asn Val Ala Asn Cys Pro Tyr Val

20 25 30

Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys Pro Asp Gly Ser Ile Ala Thr Ile

35 40 45

Val Pro Lys Gln Leu Glu Gln Phe Val Ala Pro Leu Leu Asn Val Thr

50 55 60

Glu Asn Val Leu Ile Pro Asn Ser Phe Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu

65 70 75 80

Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr

85 90 95

Val Cys Gly Asn Ser Leu Asp Cys Arg Asp Leu Phe Gln Gln Tyr Gly

100 105 110

Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser Val Val Asn Ser Ile Gly Gln Lys

115 120 125

Glu Asp Met Glu Leu Leu Asn Phe Tyr Ser Ser Thr Lys Pro Ala Gly

130 135 140

Phe Asn Thr Pro Phe Leu Ser Asn Val Ser Thr Gly Glu Phe Asn Ile

145 150 155 160

Ser Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Ser Pro Arg Arg Arg Ser Phe Ile

165 170 175

Glu Asp Leu Leu Phe Thr Ser Val Glu Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp

180 185 190

Asp Ala Tyr Lys Asn Cys Thr Ala Gly Pro Leu Gly Phe Leu Lys Asp

195 200 205

Leu Ala Cys Ala Arg Glu Tyr Asn Gly Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile

210 215 220

Ile Thr Ala Glu Met Gln Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser

225 230 235 240

Met Ala Phe Gly Gly Ile Thr Ala Ala Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr

245 250 255

Gln Leu Gln Ala Arg Ile Asn His Leu Gly Ile Thr Gln Ser Leu Leu

260 265 270

Leu Lys Asn Gln Glu Lys Ile Ala Ala Ser Phe Asn Lys Ala Ile Gly

275 280 285

Arg Met Gln Glu Gly Phe Arg Ser Thr Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile

290 295 300

Gln Asp Val Val Asn Lys Gln Ser Ala Ile Leu Thr Glu Thr Met Ala

305 310 315 320

Ser Leu Asn Lys Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Ile Gln Glu Ile

325 330 335

Tyr Gln Gln Leu Asp Ala Ile Gln Ala Asn Ala Gln Val Asp Arg Leu

340 345 350

Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln

355 360 365

Ala Glu His Ile Arg Val Ser Gln Gln Arg Glu Leu Ala Thr Gln Lys

370 375 380

Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Ile Arg Tyr Ser Phe Cys Gly

385 390 395 400

Asn Gly Arg His Val Leu Thr Ile Pro Gln Asn Ala Pro Asn Gly Ile

405 410 415

Val Phe Ile His Ser Ser Tyr Thr Pro Asp Ser Phe Val Asn Val Thr

420 425 430

Ala Ile Val Gly Phe Cys Val Lys Pro Ala Asn Ala Ser Gln Tyr Ala

435 440 445

Ile Val Pro Ala Asn Gly Arg Gly Ile Phe Ile Gln Val Asn Gly Ser

450 455 460

Tyr Tyr Ile Thr Ala Arg Asp Met Tyr Met Pro Arg Ala Ile Thr Ala

465 470 475 480

Gly Asp Ile Val Thr Leu Thr Ser Cys Gln Ala Asn Tyr Val Ser Val

485 490 495

Asn Lys Thr Val Ile Thr Thr Phe Val Asp Asn Asp Asp Phe Asp Phe

500 505 510

Asn Asp Glu Leu Ser Lys Trp Trp Asn Asp Thr Lys His Glu Leu Pro

515 520 525

Asp Phe Asp Lys Phe Asn Tyr Thr Val Pro Ile Leu Asp Ile Asp Ser

530 535 540

Glu Ile Asp Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Gly Leu Asn Asp Ser Leu

545 550 555 560

Ile Asp Leu Glu Lys Leu Ser Ile Leu Lys Thr Tyr Ile Lys Trp Pro

565 570 575

His His His His His His

580

<210> 5

<211> 3489

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

acgcgtggag ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat 60

atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac 120

ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgtcaat agggactttc 180

cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg 240

tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat 300

tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cctattagtc 360

atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt 420

gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc 480

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 540

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 600

cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc 660

tccgcggatt cgaatcccgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag 720

agtgacgtaa gtaccgccta tagagtctat aggcccacaa aaaatgcttt cttcttttaa 780

tatacttttt tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat 840

aatgatacaa tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg 900

ggttaaggca atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat 960

gtaagaggtt tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt 1020

atggttggga taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt 1080

catacctctt atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca 1140

tcactttggc aaagaattgg gattcgaacg ttaacgccgc caccatggaa acagatacac 1200

tcctcctctg ggtgctgctc ctctgggtgc caggatctac aggcagcatc accgagaacg 1260

tggccaattg tccttacgtg tcttatggca agttctgcat caagccagac ggctccatcg 1320

ctaccatcgt gcccaagcag ctggagcagt tcgtggcccc tctgctgaac gtgacagaga 1380

atgtgctgat cccaaacagc tttaatctga ccgtgacaga cgagtacatc cagacacgga 1440

tggataaggt gcagatcaac tgtctgcagt acgtgtgcgg caattctctg gactgtagag 1500

atctgtttca gcagtacggc ccagtgtgcg acaacatcct gagcgtggtg aactccatcg 1560

gccagaagga ggatatggag ctgctgaact tctattccag caccaagccc gccggcttca 1620

acacaccttt tctgtccaat gtgagcaccg gcgagtttaa tatctccctg ctgctgacca 1680

caccatcttc ccccaggagg aggtccttca tcgaggacct gctgtttaca tctgtggagt 1740

ccgtgggact gccaaccgac gatgcttaca agaactgtac agccggccct ctgggcttcc 1800

tgaaggatct ggcctgcgct cgagagtata atggcctgct ggtgctgccc cctatcatca 1860

ccgctgagat gcagaccctg tacacaagct ctctggtggc tagcatggcc ttcggcggaa 1920

tcaccgctgc tggagctatc ccctttgcca cacagctgca ggccaggatc aaccacctgg 1980

gcatcaccca gagcctgctg ctgaagaacc aggagaagat cgccgcttct ttcaataagg 2040

ctatcggccg catgcaggag ggctttaggt ctacatccct ggccctgcag cagatccagg 2100

acgtggtgaa caagcagtcc gctatcctga ccgagacaat ggccagcctg aacaagaatt 2160

ttggcgctat ctccagcgtg atccaggaga tctatcagca gctggacgcc atccaggcca 2220

atgctcaggt ggatcgcctg atcaccggca ggctgtcttc cctgtccgtg ctggcttccg 2280

ccaagcaggc tgagcatatc cgggtgagcc agcagagaga gctggccacc cagaagatca 2340

acgagtgcgt gaagagccag tctatccgct actctttctg cggcaatggc aggcacgtgc 2400

tgacaatccc tcagaacgct ccaaatggca tcgtgtttat ccatagctct tatacccccg 2460

attctttcgt gaacgtgaca gccatcgtgg gcttttgcgt gaagccagcc aatgcttccc 2520

agtacgctat cgtgccagct aacggaaggg gcatcttcat ccaagtgaat ggctcttact 2580

atatcaccgc tcgggacatg tatatgccta gagctatcac agccggcgat atcgtgaccc 2640

tgacatcttg ccaggccaac tacgtgtccg tgaataagac cgtgatcacc acatttgtgg 2700

acaacgacga tttcgacttt aatgatgagc tgtctaagtg gtggaacgat accaagcacg 2760

agctgcctga cttcgataag tttaattaca cagtgccaat cctggacatc gattccgaga 2820

tcgacagaat ccagggcgtg atccagggcc tgaacgacag cctgatcgat ctggagaagc 2880

tgtctatcct gaagacctac atcaagtggc ctcaccacca ccatcatcac tgatgaatcg 2940

atacgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac 3000

tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt 3060

gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa 3120

gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc 3180

ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 3240

gttgttggga ttccaggctt ggatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag 3300

acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc 3360

accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct 3420

tctgattttg taggtaacca cgtgcgtatc gagtagcccc tcactttggc aaagaattgg 3480

gattcgaac 3489

<210> 6

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 6

ataggtaccg ccgccaccat ggaaacagat ac 32

<210> 7

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 7

atactcgagt catcagtgat ggtgatggtg atggccattg gtgatc 46

<210> 8

<211> 35

<212> DNA/RNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 8

acgcgtggag ctagttatta atagtaatca attac 35

<210> 9

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> 人工引物(人工序列)

<400> 9

ggggctactc gatacgcacg tggttaccta c 31

Claims

1.一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S1蛋白；

以及SEQ ID NO:2的核酸分子或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的鸡传染性支气管炎病毒重组S2蛋白。

2.根据权利要求1所述的免疫组合物，所述的鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白包含：

SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

3.权利要求1所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

4.权利要求1所述的免疫组合物用于制备鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

5.一种核酸分子组合物，其可以用于分别编码鸡传染性支气管炎病毒重组蛋白，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列；以及SEQ ID NO:2的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:2的核苷酸序列95％以上相同的顺序核苷酸序列。

6.权利要求5所述的核酸分子组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对鸡传染性支气管炎病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

7.权利要求5所述的核酸分子组合物用于生产用于预防动物受鸡传染性支气管炎病毒感染的药剂的用途。

8.一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

9.一种鸡传染性支气管炎病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，包含：药学上有效量的权利要求8所述的蛋白组合物；

佐剂。

10.根据权利要求9所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂选自：白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合。