CN109964126B - 用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法 - Google Patents

用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109964126B
CN109964126B CN201780069270.XA CN201780069270A CN109964126B CN 109964126 B CN109964126 B CN 109964126B CN 201780069270 A CN201780069270 A CN 201780069270A CN 109964126 B CN109964126 B CN 109964126B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
antibody
test
secreted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780069270.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109964126A (zh
Inventor
S·麦凯
C·恩格
E·贝蒂尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Isoplexis Corp
Original Assignee
Isoplexis Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isoplexis Corp filed Critical Isoplexis Corp
Publication of CN109964126A publication Critical patent/CN109964126A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109964126B publication Critical patent/CN109964126B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Abstract

本发明公开了鉴定当受试细胞接触靶细胞(例如，受试免疫细胞接触靶癌细胞)或刺激试剂时来自在异质细胞群体内的受试细胞的分泌物质组(secretome)的方法，以及使用鉴定出的分泌物质组来鉴定对于细胞疗法(包括过继性CAR T‑细胞疗法)来说安全且有效的细胞的方法。

Description

用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法
相关申请
本申请要求2016年9月12日提交的美国专利申请号62/393,612、2016年12月7日提交的美国专利申请号62/431,318、2017年3月31日提交的美国专利申请号62/480,147和2017年4月3日提交的美国专利申请号62/480,752的优先权，这些专利申请中的每一个的内容通过提及而以其整体合并入本文。
本公开内容的领域
本公开内容涉及分子生物学，和更特别地涉及鉴定受试细胞的分泌物质组(secretome)的内容物的方法以及所述分泌物质组用于测定作为基于细胞的疗法的所述受试细胞的安全性和功效的用途。
发明背景
对于鉴定适合于在细胞疗法中使用的细胞的***和方法以及在可以同时分析数千个来自异质细胞群体的单细胞的高度多重反应中离体或体外评价这些细胞的安全性和功效的方法，本领域中存在长期以来一直有但未得到满足的需要。本发明提供了用于解决这些长期以来一直有但未得到满足的需要的***和方法。
发明概述
本公开内容的***提供了评价在与靶细胞或刺激试剂接触后在功能上异质的群体中的独个细胞的分泌物质组的高度多重方法。当在基于细胞的疗法中使用时，所述受试细胞的分泌物质组的组成的分析可以用于测定所述受试细胞的身份、生存力、安全性和功效。细胞疗法可以包括自体或同种异体细胞。细胞疗法可以包括经修饰的细胞，其包括但不限于表达至少一种人工或嵌合抗原受体的T-细胞。
本公开内容提供了鉴定来自在异质细胞群体内的受试细胞的分泌物质组的方法，其包括：(a)使所述受试细胞与靶细胞或刺激试剂在多个腔室中的至少一个腔室之中相接触，其中所述腔室与抗体组处于流体联通并且所述抗体组可移除地附着至所述腔室；(b)在足以允许下列情况的条件下，在所述腔室中维持所述受试细胞和所述靶细胞或所述刺激试剂：(1)所述受试细胞分泌肽、多肽和蛋白质中的至少一种，和(2)对于所述至少一种蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽、多肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽、抗体:分泌型多肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种；(c)从所述腔室中移除所述抗体组；和(d)对所述至少一种肽、多肽或蛋白质进行成像，从而形成抗体:分泌型肽、抗体:分泌型多肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种，由此鉴定出当所述受试细胞接触所述靶细胞或所述刺激试剂时所述受试细胞的分泌物质组。
本公开内容提供了鉴定来自在异质细胞群体内的受试细胞的分泌物质组的方法，其包括：(a)使所述受试细胞与靶细胞或刺激试剂在足以允许对所述受试细胞进行刺激的条件下相接触；(b)将所述受试细胞引入至多个腔室中的至少一个腔室，其中所述腔室与抗体组处于流体联通并且所述抗体组可移除地附着至所述腔室；(c)在足以允许下列情况的条件下，在所述腔室中维持所述受试细胞：(1)所述受试细胞分泌肽、多肽和蛋白质中的至少一种，和(2)对于所述至少一种蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽、多肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽、抗体:分泌型多肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种；(d)从所述腔室中移除所述抗体组；和(e)对所述至少一种肽、多肽或蛋白质进行成像，从而形成抗体:分泌型肽、抗体:分泌型多肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种，由此鉴定出在与所述靶细胞或所述刺激试剂相接触后所述受试细胞的分泌物质组。在某些实施方案中，该方法进一步包括破坏所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间的接触的步骤。在该方法的某些实施方案中，所述受试细胞和所述靶细胞或所述刺激试剂被组合物所包含，并且所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂处于流体联通。在某些实施方案(包括其中所述受试细胞和所述靶细胞或所述刺激试剂被组合物所包含并且其中所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂处于流体联通的那些)中，所述方法进一步包括从所述组合物中耗竭所述靶细胞或所述刺激试剂的步骤。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述异质细胞群体为在功能上异质的细胞群体。在某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含至少两种响应于刺激而产生分泌物质组的细胞，第一种细胞产生第一分泌物质组，第二种细胞产生第二分泌物质组，并且所述第一分泌物质组和所述第二分泌物质组不是相同的。
本公开内容的分泌物质组可以包含一种或多种肽、多肽、蛋白质、小分子和离子。在某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种肽、多肽或蛋白质。在某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种小分子。在某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种离子。当所述分泌物质组包含小分子或离子时，可以另外地或代替抗体地使用可检测标记物来鉴定、定量或者分析所述分泌物质组的小分子和离子。
本公开内容的分泌物质组可以从受试细胞中主动地或被动地释放。例如，本公开内容的分泌物质组可以经由小泡、细胞间间隙连接和/或跨膜通道或泵而从受试细胞中释放。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种免疫细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种免疫细胞包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞包括幼稚T-淋巴细胞、激活的T-淋巴细胞、效应T-淋巴细胞、辅助T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、γδT-淋巴细胞、调节T-淋巴细胞、记忆T-淋巴细胞或记忆干T-淋巴细胞。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达非天然出现的抗原受体。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种免疫细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种免疫细胞包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。在某些实施方案中，所述B-淋巴细胞包括成浆细胞、浆细胞、记忆B-淋巴细胞、调节B细胞、滤泡B细胞或边缘区B细胞。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述受试细胞为免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞包括幼稚T-淋巴细胞、激活的T-淋巴细胞、效应T-淋巴细胞、辅助T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、γδT-淋巴细胞、调节T-淋巴细胞、记忆T-淋巴细胞或记忆干T-淋巴细胞。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达非天然出现的抗原受体。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述受试细胞为免疫细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。在某些实施方案中，所述B-淋巴细胞包括成浆细胞、浆细胞、记忆B-淋巴细胞、调节B细胞、滤泡B细胞或边缘区B细胞。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种神经元细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种神经元细胞包括神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、卫星细胞或肠神经胶质细胞。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述受试细胞为神经元细胞。在某些实施方案中，所述神经元细胞包括神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、卫星细胞或肠神经胶质细胞。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种内分泌细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种内分泌细胞分离自或源自松果腺、脑垂体腺、胰腺、卵巢、睾丸、甲状腺、甲状旁腺、下丘脑或肾上腺。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述受试细胞为内分泌细胞。在某些实施方案中，所述内分泌细胞分离自或源自松果腺、脑垂体腺、胰腺、卵巢、睾丸、甲状腺、甲状旁腺、下丘脑或肾上腺。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述在功能上异质的细胞群体包含外分泌细胞。在某些实施方案中，所述外分泌细胞分离自或源自唾液腺、汗腺或胃肠道组成部分。所述胃肠道组成部分可以包括口、胃、小肠和大肠。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述受试细胞为外分泌细胞。在某些实施方案中，所述外分泌细胞分离自或源自唾液腺、汗腺或胃肠道组成部分。所述胃肠道组成部分可以包括口、胃、小肠和大肠。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，使所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂在腔室中相接触的步骤包括所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂的直接接触。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，使所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂在腔室中相接触的步骤包括所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂的间接接触。在某些实施方案中，所述间接接触包括所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间的流体联通。在某些实施方案中，所述间接接触包括所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间通过天然或人工细胞外基质的联通。在某些实施方案中，所所述间接接触包括所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间通过中间细胞的联通。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为癌细胞。在某些实施方案中，所述癌细胞为原初癌细胞或经培养的癌细胞。在某些实施方案中，所述原初癌细胞是转移性的。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为B-淋巴细胞。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为细菌、酵母或微生物。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为受感染细胞。示例性的受感染细胞可以已经接触了或可以已经暴露于病毒、细菌、酵母或微生物。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞使自身免疫应答永续存在。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为自身免疫应答的靶标。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为功能性细胞并且所述宿主细胞不刺激自身免疫应答。术语“功能性细胞”意在描述对于宿主中的疾病或病症不做出贡献的活细胞。备选地，或者另外地，术语“功能性细胞”可以描述没有任何已知的引起宿主中的疾病或病症的突变的细胞。例如，功能性细胞可以是非癌性的和/或非自身免疫性的。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述刺激试剂包括刺激性抗体。在某些实施方案中，所述刺激性抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，所述单克隆抗体为完全人抗体。在某些实施方案中，所述单克隆抗体为人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体或经修饰的抗体。在某些实施方案中，所述经修饰的抗体包含一个或多个相比于具有相同表位特异性的抗体的完全人版本而言的序列变异、一个或多个经修饰的或合成的氨基酸或者化学部分，以增强刺激功能。在某些实施方案中，所述刺激性抗体特异性地结合T细胞调节蛋白的表位。在某些实施方案中，所述T细胞调节蛋白包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)。在某些实施方案中，所述刺激性抗体包括Nivolumab或其生物相似物。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述刺激试剂包括刺激性配体。在某些实施方案中，所述刺激性配体包括程序性死亡配体1(PD-L1)。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述抗体组中的每一种抗体附着至可移除地附着至所述腔室的表面。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述抗体组中的每一种抗体附着至所述表面以形成重复图式，并且所述多个腔室中的每个腔室包含所述图式的重复。本公开内容的抗体组形成图式，其中每个重复包含完全的抗体组。例如，如果所述抗体组包括抗体“a”、“b”和“c”，那么所述图式的每个重复也包括抗体“a”、“b”和“c”中的至少一个。所述图式仅需要具有大小比例尺，从而使得每个腔室与所述图式的至少一个重复对齐。在优选的实施方案中，所述图式仅需要具有大小比例尺，从而使得每个腔室与所述图式的一个重复对齐。当向所述组添加额外的可检测标记物以鉴定、捕获或定量分泌出的小分子和/或离子时，所述可检测标志物也以与对于抗体图式所设定的相同规则进行重复。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述足以允许下列情况的条件可以包括5％CO2和37℃并持续2小时、大约2小时或至少2小时的时间段：(1)所述受试细胞分泌肽、多肽和蛋白质中的至少一种，和(2)对于所述至少一种蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽、多肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽、抗体:分泌型多肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种。备选地，所述时间段可以为4小时、大约4小时或至少4小时；8小时、大约8小时或至少8小时；12小时、大约12小时或至少12小时；16小时、大约16小时或至少16小时；或者24小时、大约24小时或至少24小时。在某些实施方案中，所述时间段为16小时、大约16小时或至少16小时。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，至少一个腔室包含维持来自步骤(a)至(c)(例如，从使所述受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂相接触，至移除包括与从所述受试细胞分泌出的肽、多肽或蛋白质中的一种或多种的抗体复合物的抗体组)的受试细胞的生存力的细胞培养基。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示减小或渐减的细胞功能或细胞生存力的肽、多肽或蛋白质。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示增大或渐增的炎症的肽、多肽或蛋白质。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示增加的细胞活性或细胞刺激的肽、多肽或蛋白质。
在本公开内容的***和方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括测定多功能力度指数(PSI：Polyfunctional Strength Index)。在某些实施方案中，所述多功能力度指数为在所述异质细胞群体内多功能受试细胞的百分比与两种或更多种细胞因子的平均信号强度的乘积。在某些实施方案中，两种或更多种细胞因子的平均信号强度为两种或更多种不同的细胞因子的平均信号强度(即AB对AA)。在某些实施方案中，所述多功能受试细胞以单细胞水平分泌至少两种细胞因子。在某些实施方案中，所述多功能受试细胞以单细胞水平分泌至少两种不同的细胞因子(即AB对AA)。由所述多功能受试细胞中的每一种所产生的所述至少两种细胞因子和具有所述平均信号强度的所述两种或更多种细胞因子包括相同的细胞因子(例如AB和AB)。在某些实施方案中，由所述多功能受试细胞中的每一种所产生的所述至少两种细胞因子和具有所述平均信号强度的所述两种或更多种细胞因子由相同的细胞因子组成。在某些实施方案中，所述PSI的增加指示所述多功能受试细胞的效能的增加。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于鉴定表达特异性地结合呈现在靶细胞上的抗原的CAR、特异性地结合刺激试剂的CAR或者特异性地结合呈现在靶细胞上的抗原且特异性地结合刺激试剂的CAR的T-淋巴细胞的用途。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的安全性的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，并且其中当所述分泌物质组缺少一种或多种刺激免疫***的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的安全性的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，并且其中当所述分泌物质组缺少一种或多种指示降低的细胞生存力的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的功效的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，并且其中当所述分泌物质组包含一种或多种指示对于所述靶细胞的选择性应答的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，并且其中所述受试细胞为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞；其中所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，其中所述靶细胞为表达所述嵌合抗原受体(CAR)与之特异性地结合的抗原的癌细胞，并且其中在结合了所述抗原后，所述嵌合抗原受体(CAR)刺激所述T细胞；其中当所述分泌物质组包含一种或多种刺激免疫***超过第一阈值的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是有效的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子组成的组；并且其中当所述分泌物质组包含一种或多种介导有害过程的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由调节细胞因子和炎性细胞因子组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述效应细胞因子选自由粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β组成的组。在该用途(权利要求59的用途)的某些实施方案中，所述刺激细胞因子选自由GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述趋化细胞因子选自由CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述调节细胞因子选自由IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述炎性细胞因子选自由IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括炎症。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括自身免疫应答。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括对所述靶细胞的非选择性应答。在该用途的某些实施方案中，所述受试细胞分离自或源自用于在癌症的治疗中使用的过继性细胞疗法。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，并且其中所述受试细胞为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞；其中所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，其中所述靶细胞为表达所述嵌合抗原受体(CAR)与之特异性地结合的抗原的自身免疫细胞，并且其中在结合了所述抗原后，所述嵌合抗原受体(CAR)刺激所述T细胞；其中当所述分泌物质组包含一种或多种刺激免疫***超过第一阈值的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是有效的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子组成的组；并且其中当所述分泌物质组包含一种或多种介导有害过程的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由调节细胞因子和炎性细胞因子组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述效应细胞因子选自由粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β组成的组。在该用途(权利要求59的用途)的某些实施方案中，所述刺激细胞因子选自由GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述趋化细胞因子选自由CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述调节细胞因子选自由IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述炎性细胞因子选自由IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括炎症。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括自身免疫应答。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括对所述靶细胞的非选择性应答。在该用途的某些实施方案中，所述自身免疫细胞为引发、执行或增强自身免疫应答的免疫细胞。在该用途的某些实施方案中，所述受试细胞分离自或源自用于在自身免疫状况的治疗中使用的过继性细胞疗法。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，并且其中所述受试细胞为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞；其中所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，其中所述靶细胞为表达所述嵌合抗原受体(CAR)与之特异性地结合的抗原的受感染细胞，并且其中在结合了所述抗原后，所述嵌合抗原受体(CAR)刺激所述T细胞；其中当所述分泌物质组包含一种或多种刺激免疫***超过第一阈值的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是有效的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子组成的组；并且其中当所述分泌物质组包含一种或多种介导有害过程的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由调节细胞因子和炎性细胞因子组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述效应细胞因子选自由粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β组成的组。在该用途(权利要求59的用途)的某些实施方案中，所述刺激细胞因子选自由GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述趋化细胞因子选自由CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述调节细胞因子选自由IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述炎性细胞因子选自由IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括炎症。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括自身免疫应答。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括对所述靶细胞的非选择性应答。在该用途的某些实施方案中，所述自身免疫细胞为引发、执行或增强自身免疫应答的免疫细胞。在该用途的某些实施方案中，所述受试细胞分离自或源自用于在感染或者感染性/接触传染性状况的治疗中使用的过继性细胞疗法。
本公开内容提供了通过本公开内容的方法所产生的分泌物质组用于评价细胞疗法的用途，其中所述细胞疗法包括所述受试细胞，并且其中所述受试细胞为表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞；其中所述细胞疗法旨在对所述靶细胞或所述刺激试剂作出应答，其中所述靶细胞为表达所述嵌合抗原受体(CAR)与之特异性地结合的抗原的心血管细胞，并且其中在结合了所述抗原后，所述嵌合抗原受体(CAR)刺激所述T细胞；其中当所述分泌物质组包含一种或多种刺激免疫***超过第一阈值的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是有效的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子组成的组；并且其中当所述分泌物质组包含一种或多种介导有害过程的肽、多肽或蛋白质时，所述细胞疗法被认为是安全的，其中所述一种或多种肽、多肽或蛋白质包括一种或多种细胞因子，并且其中所述一种或多种细胞因子选自由调节细胞因子和炎性细胞因子组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述效应细胞因子选自由粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β组成的组。在该用途(权利要求59的用途)的某些实施方案中，所述刺激细胞因子选自由GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述趋化细胞因子选自由CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述调节细胞因子选自由IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述炎性细胞因子选自由IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4组成的组。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括炎症。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括自身免疫应答。在该用途的某些实施方案中，所述有害过程包括对所述靶细胞的非选择性应答。在该用途的某些实施方案中，所述自身免疫细胞为引发、执行或增强自身免疫应答的免疫细胞。在该用途的某些实施方案中，所述心血管细胞为平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞或者整合到毛细血管、静脉或动脉中的任何其他细胞类型。在该用途的某些实施方案中，所述心血管细胞为局部或循环血液的组分，包括血小板。在该用途的某些实施方案中，所述血小板为血凝块或另一种对于健康血流的阻塞形式的组分。在该用途的某些实施方案中，所述心血管细胞为受损细胞。在该用途的某些实施方案中，所述心血管细胞为受感染细胞。在该用途的某些实施方案中，所述受试细胞分离自或源自用于在心血管状况或血管状况的治疗中使用的过继性细胞疗法。
本公开内容提供了将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法，其包括：根据本公开内容的鉴定来自受试细胞的分泌物质组的方法来检测所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少一种组分；鉴定出所述受试细胞群体的多功能细胞亚群体，其中所述受试细胞群体的受试细胞的多功能细胞分泌两种或更多种信号传导分子；计算所述受试细胞群体的多功能性百分比，其中所述多功能性百分比为在所述受试细胞群体内的多功能细胞的百分比；测量所述受试细胞群体的每个多功能细胞的分泌物质组的第一信号传导分子的信号强度；测量所述受试细胞群体的每个多功能细胞的分泌物质组的第二信号传导分子的信号强度；计算关于所述受试细胞群体的每个多功能细胞的多功能力度指数(PSI)，其中所述PSI包括(a)所述受试细胞群体的多功能性百分比与所述第一信号传导分子的信号强度的乘积，和(b)所述受试细胞群体的多功能性百分比与所述第二信号传导分子的信号强度的乘积；当出现下述情况时，将所述受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的：所述PSI指示在所述受试细胞群体中至少50％的受试细胞是多功能的，所述第一信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第一信号传导分子的浓度在2pg/ml和10,000pg/ml之间，包括端点，并且所述第二信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第二信号传导分子的浓度在2pg/ml和10,000pg/ml之间，包括端点；和当出现下述情况时，将所述受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说不是有效的：所述PSI指示在所述受试细胞群体中少于50％的受试细胞是多功能的，所述第一信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第一信号传导分子的浓度小于2pg/ml，并且所述第二信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第二信号传导分子的浓度小于2pg/ml。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含多个免疫细胞。在某些实施方案中，所述多个免疫细胞包括T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或其组合。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞为幼稚T-淋巴细胞、激活的T-淋巴细胞、效应T-淋巴细胞、辅助T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、γδT-淋巴细胞、调节T-淋巴细胞、记忆T-淋巴细胞或记忆干T-淋巴细胞。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达非天然出现的抗原受体。在某些实施方案中，所述T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含多个神经元细胞。在某些实施方案中，所述多个神经元细胞包括神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、卫星细胞、肠神经胶质细胞或其组合。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含多个内分泌细胞。在某些实施方案中，所述多个内分泌细胞包括一种或多种分离自或源自松果腺、脑垂体腺、胰腺、卵巢、睾丸、甲状腺、甲状旁腺、下丘脑或肾上腺的细胞。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含多个外分泌细胞。在某些实施方案中，所述多个外分泌细胞包括一种或多种分离自或源自唾液腺、汗腺或胃肠道组成部分的细胞。在某些实施方案中，所述胃肠道组成部分包括口、胃、小肠和大肠。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为癌细胞。在某些实施方案中，所述癌细胞为原初癌细胞或经培养的癌细胞。在某些实施方案中，所述原初癌细胞是转移性的。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为B-淋巴细胞。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为细菌、酵母或微生物。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为受感染细胞。示例性的受感染细胞可以已经接触了或可以已经暴露于病毒、细菌、酵母或微生物。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞使自身免疫应答永续存在。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为自身免疫应答的靶标。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述靶细胞为宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞包括任何分离自或源自与所述受试细胞相同的个体的细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞为功能性细胞并且所述宿主细胞不刺激自身免疫应答。术语“功能性细胞”意在描述对于宿主中的疾病或病症不做出贡献的活细胞。备选地，或者另外地，术语“功能性细胞”可以描述没有任何已知的引起宿主中的疾病或病症的突变的细胞。例如，功能性细胞可以是非癌性的和/或非自身免疫性的。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述第一信号传导分子为肽、多肽或蛋白质。在某些实施方案中，所述第一信号传导分子为细胞因子。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述第二信号传导分子为肽、多肽或蛋白质。在某些实施方案中，所述第二信号传导分子为细胞因子。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含多个T-淋巴细胞；所述靶细胞为癌细胞、受感染细胞或使自身免疫应答永续存在的宿主细胞；所述第一信号传导分子包括效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子，和所述第二信号传导分子包括效应细胞因子、刺激细胞因子或趋化细胞因子。在某些实施方案中，所述多个T-淋巴细胞中的至少一个T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，所述多个T-淋巴细胞中的每个T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，所述效应细胞因子为粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α或TNF-β。在某些实施方案中，所述刺激细胞因子为GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9。在某些实施方案中，所述趋化细胞因子为CCL-11、IP-10、MIP-1β或RANTES。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括：当出现下述情况时，将所述受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是安全的：所述PSI指示在所述受试细胞群体中至少50％的受试细胞是多功能的，所述第一信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第一信号传导分子的浓度小于2pg/ml，所述第二信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第二信号传导分子的浓度小于2pg/ml，所述受试细胞群体包含多个T-淋巴细胞，所述第一信号传导分子包括调节细胞因子或炎性细胞因子，并且所述第二信号传导分子包括调节细胞因子或炎性细胞因子；和当出现下述情况时，将所述受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说不是安全的：所述PSI指示在所述受试细胞群体中至少50％的受试细胞是多功能的，所述第一信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第一信号传导分子的浓度大于2pg/ml，所述第二信号传导分子的信号强度指示在所述腔室内所述第二信号传导分子的浓度大于2pg/ml，所述受试细胞群体包含多个T-淋巴细胞，所述第一信号传导分子包括调节细胞因子或炎性细胞因子，并且所述第二信号传导分子包括调节细胞因子或炎性细胞因子。在某些实施方案中，所述调节细胞因子为IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L。在某些实施方案中，所述炎性细胞因子为IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4。在某些实施方案中，所述多个T-淋巴细胞中的至少一个T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。在某些实施方案中，所述多个T-淋巴细胞中的每个T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述受试细胞群体包含至少100个细胞。在某些实施方案中，所述受试细胞群体包含至少500个细胞。在某些实施方案中，所述受试细胞群体包含至少1000个细胞。在某些实施方案中，所述受试细胞群体包含至少5000个细胞。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少2种组分。在某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少10种组分。在某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少20种组分。在某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少30种组分。在某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少50种组分。在某些实施方案中，所述检测步骤包括检测来自所述受试细胞群体的每个受试细胞的分泌物质组的至少100种组分。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述多功能细胞的百分比包括分泌两种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第一百分比，分泌三种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第二百分比，分泌四种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第三百分比，分泌五种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第四百分比，和分泌种类数目渐增的信号传导分子的多功能细胞的后续百分比。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述信号强度的测量包括：检测分别来自特异于所述第一或第二信号传导分子的抗体和所述第一或第二信号传导分子的复合物的荧光信号，和将每个荧光信号对参考信号进行标准化以确定相对荧光单位(RFU)值。在某些实施方案中，所述参考信号为最大信号、最小信号或来自具有恒定或已知浓度的分泌物质组的组分的信号。在某些实施方案中，所述参考信号为最丰富的受试细胞的分泌物质组的组分。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括测量每个多功能细胞的分泌物质组的第三或后续信号传导分子。
在所述将受试细胞群体鉴定为对于在过继性细胞疗法中使用来说是有效的方法的某些实施方案中，所述方法进一步包括测定所述第一信号传导分子、所述第二信号传导分子或所述后续信号传导分子对于所述多功能细胞亚群体对靶细胞或刺激试剂的应答的相对贡献，其中所述相对贡献为来自于来自每个多功能细胞的所述第一信号传导分子、所述第二信号传导分子或所述后续信号传导分子的每个多功能细胞的PSI的百分比的平均值与关于所述多功能细胞亚群体的总PSI的乘积。
附图简述
图1为照片，其显示了用于两细胞相互作用的高通量分析的本公开内容的***。将加载到多个腔室(例如，在该例子中，采取微槽的形式)中的天然杀伤(NK)细胞和白血病细胞(K562)群体混合，从而允许在一个腔室(例如，在该例子中，微槽)内独个两细胞相互作用的高通量分析。
图2为一系列图，其显示了在本公开内容的***中在以天然杀伤(NK)细胞作为受试细胞和白血病细胞(K562)作为靶细胞的两细胞相互作用后的单细胞分泌水平。将细胞亚群体分泌的百分比(％)作为在每个配对中由NK细胞所分泌的细胞因子的类型的函数来提供。根据本公开内容的方法来鉴定每个NK细胞的分泌物质组。箭头指明了在两细胞相互作用方法的每种条件下在单个NK细胞的分泌物质组中鉴定出的细胞因子水平之间的在统计学上显著的差异。
图3为一系列图，其比较了在本公开内容的***中在以天然杀伤(NK)细胞作为受试细胞和白血病细胞(K562)作为靶细胞的两细胞相互作用后的细胞多功能性。数据证明了在与白血病细胞相互作用后的增加的多功能NK细胞(分泌2+种细胞因子)的百分比(右边的图)。
图4为过程分析工具(PAT：Process Analytical Tools)-主要组分分析(PCA：Principal Component Analysis)标绘图，其显示了在本公开内容的***中在以天然杀伤(NK)细胞作为受试细胞和白血病细胞(K562)作为靶细胞的两细胞相互作用后的细胞多功能性。功能组由其中存在占优势的功能的群体进行颜色编码。经白血病激活的NK细胞导致增加的效应功能细胞亚群体和减少的炎性细胞亚群体。
图5为照片，其描绘了在本公开内容的***中人免疫细胞亚组的分离和操作。将以单细胞水平分离出的NK/K562相互作用与其相应的分泌物质组(也称为分泌特性谱)相组合，从而使得靶标/效应子关系的全面分析成为可能。
图6为一对图，其描绘了CD8-阳性T细胞的细胞因子和细胞毒性特性谱。双特异性抗体的添加实质地增加了细胞因子效应功能和对靶标Raji细胞的细胞毒性这两者(右边的图)。图上方的表格概括了在下面的图中所呈现的数据。
图7A-C为一系列图和凡例，其鉴定了在由CD19珠粒进行刺激后表达CAR的T-细胞的分泌物质组的组分。A.显示了相对于对照珠粒而言由用CD19刺激的CAR T-细胞进行的细胞因子分泌的上调。在上调的情况下，详细描述了某些与效能相关联的细胞因子(TNFα、粒酶等)以及某些与毒性相关联的细胞因子(IL-17A)。B.关于在A中的柱状图的凡例。每种柱颜色表示将细胞因子包括在特定功能组中。效应细胞因子包括但不限于：粒酶B、干扰素-γ(IFN-γ)、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β。刺激细胞因子包括但不限于：GM-CSF、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-2(IL-2)、白介素-21(IL-21)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)和白介素-9(IL-9)。趋化细胞因子包括但不限于：CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES。调节细胞因子包括但不限于：白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)、白介素-22(IL-22)、白介素-4(IL-4)、TGF-β1、sCD137和sCD40L。炎性细胞因子包括但不限于：白介素-17A(IL-17A)、白介素-17F(IL-17F)、白介素-1b(IL-1b)、白介素-6(IL-6)、MCP-1和MCP-4。C.在经对照或CD19珠粒刺激后单个CAR T-细胞的多功能性。多功能性与由免疫介导的疗法的效能或成功相关。
图8A-G为一系列图和凡例，其鉴定了在经靶细胞刺激后表达CAR的T-细胞的分泌物质组的组分。A.在用K562-CD19靶细胞刺激后由表达CAR的T-细胞进行的细胞因子分泌水平，其中CD19是关于作为细胞疗法靶标的白血病细胞或B-细胞恶性肿瘤的代理者。B.在用K562-NGFR对照细胞(阴性对照细胞，因为它们不包括CD19靶标)刺激后减缓的由表达CAR的T-细胞进行的细胞因子分泌。C.在包含单个表达CAR的T-细胞和单个K562-CD19靶细胞的腔室(对于该例子，采取微槽的形式)中的细胞因子分泌水平。D.在包含单个表达CAR的T-细胞和单个K562-NGFR对照细胞的腔室中的减缓的细胞因子分泌。E.关于在A-D中的柱状图的凡例。每种柱颜色表示将细胞因子包括在特定功能组中。效应细胞因子包括但不限于：粒酶B、干扰素-γ(IFN-γ)、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α和TNF-β。刺激细胞因子包括但不限于：GM-CSF、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-2(IL-2)、白介素-21(IL-21)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)和白介素-9(IL-9)。趋化细胞因子包括但不限于：CCL-11、IP-10、MIP-1β和RANTES。调节细胞因子包括但不限于：白介素-10(IL-10)、白介素-13(IL-13)、白介素-22(IL-22)、白介素-4(IL-4)、TGF-β1、sCD137和sCD40L。炎性细胞因子包括但不限于：白介素-17A(IL-17A)、白介素-17F(IL-17F)、白介素-1b(IL-1b)、白介素-6(IL-6)、MCP-1和MCP-4。F.响应于K562-CD19或对照刺激的单个表达CAR的T-细胞的多功能性。G.当K562-CD19靶细胞存在于具有表达CAR的T-细胞的腔室(对于该例子，采取微槽的形式)中时，多功能性的增加。
图9为一系列照片，其描绘了本公开内容的***和细胞毒性的荧光示踪的使用。将用膜染料CFSE标记的K562细胞与未标记的NK细胞相混合，并且加载到具有过量SYTOXOrange的腔室(对于该例子，采取微槽的形式)中。在加载后立即(T0)和然后在16小时温育后(T1)再次对腔室(对于该例子，采取微槽的形式)进行成像，并且通过荧光就细胞死亡进行评估。
图10A-C为对照和经刺激的表达CAR(嵌合抗原受体)的细胞的一系列信号标绘图。图版A.来自对照CAR细胞的PSI(多功能力度指数)概览和独个细胞因子贡献。图版B.来自经刺激的CAR细胞(使经刺激的细胞与缀合有CD19的珠粒相接触)的PSI概览和独个细胞因子贡献。图版C.对照CAR细胞和经刺激的CAR细胞两者的独个信号标绘图。
图11A-F为一系列图，其描绘了从由靶细胞刺激的CAR细胞中检测到的信号。来自用K562-NFGR对照细胞(A)或K562-CD19靶细胞(B)刺激的CAR细胞的PSI概览。来自用K562-NGFR(C)和K562-CD19(D)刺激的CAR细胞的独个细胞因子贡献。最后的标绘图显示了来自用K562-NGFR(E)或K562-CD19(F)刺激的CAR细胞的信号细胞分泌点。
图12A-M为一系列图，其比较了细胞因子分泌的纪念斯隆-凯特林癌症中心(MSKCC：Memorial Sloan-Kettering Cancer Center)测定法的结果与本公开内容的组合物、***和方法(在该图中称为“IsoPlexis”)的示例性检测灵敏度。在由MSKCC进行的研究(Brenthens等人,Blood.2011年11月3日,118(18):4817-4828；Safety and persistenceof adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients withrelapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias)中，MSKCC用表达CD19的3T3成纤维细胞刺激经EOP19-28z转导的T细胞48小时。然后，MSKCC在Luminex IS100上分析了来自经转导的细胞的细胞因子分泌水平，以测定分析物的pg/mL量。本公开内容的组合物、***和方法可以以与MSKCC测定法相等或更大的灵敏度收集与MSKCC测定法相同类型的数据。上面的并排的图显示了关于本公开内容的组合物、***和方法的灵敏度/分析物，相对于从MSKCC Luminex测定法测量的量而言。来自MSKCC测定法的测量结果明显地落在本公开内容的组合物、***和方法的可测量范围内(在高度多重反应中，每种细胞因子，在大约2pg/ml和大约10,000pg/ml之间的细胞因子浓度，包括端点)。因此，通过使用本公开内容的组合物、***和方法可以已经收集了相同的数据，另外的好处是能够转换该数据以表示独个细胞群体的多功能力度指数(PSI)。在大规模的实验(同时测量群体内的数千个独个细胞)中对于关于每个细胞的多种细胞因子中的每种细胞因子的PSI测量使得预测在统计学上强有力的生物标志物和驱动患者应答的细胞亚组成为可能。
图13A-B是一对表格，其比较了来自CAR的分泌的国立癌症研究所(NationalCancer Institute)细胞因子测定法的结果与本公开内容的组合物、***和方法(在该图中称为“IsoPlexis”)的示例性检测灵敏度。在由NCI进行的研究(Kochenderfer等人,Blood,2012年3月22日,119(12):2709-2720；B-cell depletion and remissions of malignancyalong with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19chimeric-antigen-receptor-transduced T cells)中，NCI将针对CD19的CAR细胞与CD19-阳性K562细胞或对照NGFR-阳性(CD19-阴性)细胞一起培养过夜，并且在次日在标准ELISA测定法上进行细胞因子分泌。在上面的表格中列出了关于IFN-γ、TNF和IL-2的细胞因子分泌水平。在下面的表格中列出了关于本公开内容的组合物、***和方法的检测极限，具有大于2或大于5的信噪比(SNR)。本公开内容的组合物、***和方法能够在与在该NCI研究中通过标准ELISA所测量的那些相同的范围内非常有信心地测量细胞因子分泌，另外的好处是能够转换该数据以表示独个细胞群体的多功能力度指数(PSI)。在大规模的实验(同时测量群体内的数千个独个细胞)中对于关于每个细胞的多种细胞因子中的每种细胞因子的PSI测量使得预测在统计学上强有力的生物标志物和驱动患者应答的细胞亚组成为可能。
图14A-C为一系列图，其比较了来自CAR的分泌的国立癌症研究所细胞因子测定法的结果与本公开内容的组合物、***和方法(在该图中称为“IsoPlexis”)的示例性检测灵敏度。在由NCI进行的研究(Zhao等人,The Journal of Immunology,2007,179:5845-5854；High-affinity TCRs generated by phage display provide CD4+cells with theability to recognize and kill tumor cell lines)中，NCI测量了来自经TCR转染的T细胞的细胞因子分泌。纯化了CD8+和CD4+T细胞并用TCR进行了转染。然后，将所述细胞用NY-ESO-1、MART-1或gp100肽进行脉冲，并且通过使用商购可得的ELISA试剂盒以在200pg/mL和30,000pg/mL之间(包括端点)的范围测量所得的IL-2和IFN-γ分泌。本公开内容的组合物、***和方法能够在与在该NCI研究中通过标准ELISA所测量的那些相同的范围内非常有信心地测量细胞因子分泌，另外的好处是能够转换该数据以表示独个细胞群体的多功能力度指数(PSI)。在大规模的实验(同时测量群体内的数千个独个细胞)中对于关于每个细胞的多种细胞因子中的每种细胞因子的PSI测量使得预测在统计学上强有力的生物标志物和驱动患者应答的细胞亚组成为可能。
图15为一系列图，其描绘了测量单细胞多功能力度指数(PSI)的方法。该度量量化了样品的总活性。PSI等于样品中的多功能细胞(分泌两种或更多种细胞因子)的百分比乘以所分泌的细胞因子的平均信号强度。为了确定哪些细胞因子正在驱动多功能应答，还可以计算每种独个细胞因子对于PSI的贡献。这等价于来自特定细胞因子的在总PSI中的份额，并且通过下述方式来得到：计算相应于那种细胞因子的每个细胞的信号的百分比，将它在所有细胞中进行平均，并将该百分比乘以总PSI。
发明详述
本公开内容提供了能够在单细胞水平上测量关键的效应蛋白的***和方法。例如，在某些实施方案中，本公开内容的***和方法可以在单细胞水平上同时测量42种关键的效应蛋白。例如，可以在管线药物开发和由基于细胞的治疗法的大规模开发者进行的CAR-T评估中直接使用本公开内容的***和方法。通过本公开内容的***和方法所测量的多重参数覆盖了例如相关免疫效应功能的完整范围，包括刺激的、促炎的、调节的(负面的)、趋化的、促生长的和细胞裂解的(有效的)。
本公开内容的***和方法要求更小数量的细胞输入(大约1000个细胞)，相比于现有的用于分析低量患者样品的单细胞仪器(例如，流式细胞仪)而言，其最小要求100,000个细胞/样品用于分析(和典型地要求数百万个细胞/样品)。
本公开内容的***和方法提供了能够以高度多重方式评价单细胞分泌特性谱的分析方法。在某些实施方案中，该分析涉及单个免疫细胞与患病靶细胞的交谈(即受试细胞与靶细胞的直接或间接接触)，同时避免或最小化来自总细胞群体的旁分泌效应(因为可以将每一对受试细胞和靶细胞隔离到与其余的多个腔室分开的腔室中)。该方法使得能够研究和检测罕见的受试细胞与靶细胞相互作用，其否则可能被该群体或样品内的其他细胞所掩盖。
本公开内容的***和方法通过下述步骤以非限制性方式进行例示：按照本公开内容的方法，证明本公开内容的***就免疫细胞(包括CAR细胞)与各种靶细胞或刺激试剂的靶标/效应子关系来评价独个细胞与细胞相互作用的能力。高度多重成对免疫细胞和癌细胞测定法提供了用于在单细胞水平上评估多功能细胞因子特性谱(响应于癌细胞及其特异性抗原)的机制。此类测定法可以进一步用于评价与对于癌细胞的免疫细胞应答的程度有关的免疫应答质量。甚至，此类测定法可以用于将免疫应答质量和/或对于癌细胞的免疫细胞应答的程度与所述免疫细胞杀伤所述癌细胞的能力相关联。因此，本公开内容的***和方法提供了新型工具用于解决在癌症免疫学领域中和还有在许多其他领域中就安全性和功效来鉴定和评价细胞疗法的紧急相关的需要。
本公开内容的***和方法提供了以高度多重方式来分析细胞(直至单细胞水平)的能力，并且能够测定对于特定的患病细胞的多功能应答。虽然示例性的方法包括监测在腔室内由免疫细胞对靶肿瘤细胞的杀伤以为了与高度多重免疫应答相关联，但是本公开内容的***和方法包括许多其他应用。
如在本公开内容的图(特别是图7、8、10和11)中所显示的，多功能性是旨在用于细胞疗法的细胞的功效和效能的量度。特别有价值的是多功能力度指数(PSI)。多功能力度指数(PSI)是将样品中的细胞的多功能性和由每个细胞所分泌的细胞因子的信号强度计算在内的度量。它通过将样品的多功能细胞(分泌两种或更多种细胞因子的单细胞)的百分比乘以这些细胞因子的平均信号强度来得到。该PSI显示在图10A和10B以及图11A和11B的左边。例如，图10B证明，多功能力度在经CD19刺激的样品中高至在图10A中所显示的对照PSI的大略2倍。图11B证明，经刺激的细胞具有高至对照细胞的大略5倍的多功能力度。关于有关PSI的更多细节，参见实施例7。
分析免疫细胞的方法：
分泌出的蛋白质(特别是细胞因子)是在免疫***内细胞间通讯的关键介体。内稳态免疫应答要求受到紧密调节的细胞因子合成和分泌。已开发了许多分析技术来分析在免疫应答期间的蛋白质分泌，但是所使用的方法通常局限于测量关于整个细胞群体的平均分泌。此类分析虽然在理解疾病发病机理和免疫过程中是有帮助的，但是不足以表征关于在群体内的独个细胞亚组的细胞因子活性。最近的使用单细胞分析的调查研究已显示，免疫细胞展示出高度异质的细胞因子特性谱，甚至在具有相似表型的细胞中，这进一步证明了仅聚焦于在大容量群体水平上的细胞应答的重大限制。在群体内的这些异质的细胞亚组可以支配在代表了关于疾病免疫疗法评价的重要的检查和平衡的细胞之间的复杂的信号传导相互影响。当细胞群体的应答可以由在罕见的细胞亚组中的细胞-细胞相互作用来决定时，这是特别值得注意的。因此，理解这些相互作用对于未来开发更有效的治疗性治疗来说是至关重要的。
对于定义在基于细胞的癌症免疫疗法中的一致且高功能质量的“药物”的挑战：尽管新兴的CAR-T癌症免疫治疗法具有经证明的益处，但是仍然有两个主要的关注点：一，一致地制备细胞疗法；和二，管理免疫毒性，例如细胞因子释放综合征，其可以是潜在地威胁生命的。在基于细胞的疗法例如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法(其中活细胞是“药物”)中，细胞制备仍然是相对新的，并且所产生的每个患者批次可能实质上上不同，即使存在标准化的操作过程(SOP)以确保在制备中的一致性。为临床医师和生物技术公司提供有效的细胞功能监测工具可以改变临床范例，这通过允许他们在注射之前去除或修改不一致或不安全的细胞疗法从而显著地降低对患者的风险和改善治疗成功的可能性来进行。
定义由细胞因子介导的抗肿瘤T细胞的“质量”：为了评价用于免疫疗法的经改造的T细胞或为了评价被再激活以对抗癌症或感染的内源性T细胞，T细胞的功能状态在很大程度上由分泌出的效应功能蛋白质(例如，细胞因子)的谱来决定。在保护性免疫应答中，免疫细胞的“质量”与多功能性(T细胞共分泌多种效应蛋白的能力)的程度相关联。虽然这些抗肿瘤的细胞裂解性趋化细胞因子产生有效的应答，但是这些多功能细胞亚组不是必须还分泌在NK或CAR-T细胞中普遍存在的免疫毒性的炎性或调节细胞因子(多达15种)。为了检测CAR单细胞亚组的该“质量”有效且安全的应答的一致表现，对于进行单个T细胞中的免疫效应蛋白的高度多重测量的新技术存在需要。并且，虽然单细胞流式细胞术技术固定细胞以检测细胞因子，但是更具预言性的平台将会检测真实的分泌。
目前的细胞功能评价方法：单参数ELISpot测定法仍然是用于T细胞激活测定法的现有技术，但是不测量多功能性。基于对珠粒进行平均化的多重化平台(基于Luminex)测量许多细胞因子，但仍不在所要求的单细胞水平上。基于荧光的多色流式细胞术是一种强有力的单细胞分析工具并且已被用于经由通过阻断小泡转运而将蛋白质保留在细胞质内并对其进行染色来检测细胞因子。可以同时进行测量的蛋白质的数目受到与ICS(细胞内细胞因子染色)的荧光光谱重叠的限制。最近CAR-T公司已经使用了飞行时间质谱仪联用流式细胞术(CyTOF)，虽然在试验中没有那么频繁。与荧光流式细胞术相似，它不测量真实的分泌，并且部分地由于高的ICS背景，迄今为止通过CyTOF在单细胞中共测量的细胞因子的数目为11。正在研究实验室中开发的其他单细胞技术(例如，微雕刻(microengraving))提供了在灵敏度和测定法速度方面的优势，但在多重化能力方面仍然是有限的(典型地<5)。
在过继性细胞疗法和其他由免疫介导的疗法中所牵涉的风险：细胞因子释放综合征(CRS)是非抗原特异性的威胁生命的毒性，其产生自由于免疫疗法(例如CAR T-细胞疗法)的免疫***的过激活。虽然CAR T-细胞是强有力的中靶“杀手”，但是它们远在自然出现的水平之上激活免疫***，并且由于其设计的性质，具有很大程度的“中靶，偏离肿瘤(ontarget,off tumor)”毒性。基于在最近临床试验中的死亡率水平，已变得明显的是，在引入至患者之前必须知道独个CAR-T细胞的细胞因子特性谱。本公开内容的***和方法测定了多达42种细胞因子/单细胞的丰富度，它们落入下列这些组：效应细胞因子、刺激细胞因子、炎性细胞因子和调节细胞因子。该信息允许使用者鉴定通过常规手段将会被错过的在群体内的任何潜在地有毒性的细胞亚组(促炎的或调节的)，从而提供更安全且更有效的在患者引入之前监测免疫疗法的手段。
***和阵列
本公开内容提供了用于来自单细胞的多种化合物的多重检测的***，其包括包含多个腔室和一组捕获试剂的阵列。优选的捕获试剂包括抗体，但是，捕获试剂可以包括特异性地结合本公开内容的分泌物质组的组分的任何可检测的实体。所述可检测的实体可以包括例如可检测标记物。可检测标记物可以包括但不限于荧光标记物。
本公开内容的***包含多个独个腔室，优选地以统一的排列。在某些实施方案中，所述多个独个腔室中的至少一些具有大于50μm的长度，和任选地，可以被配置成在亚纳升体积的内容物中包含分离的单细胞。
本公开内容的捕获试剂组可以包括多种经固定化的捕获试剂，每种经固定化的捕获试剂能够特异性地结合本公开内容的分泌物质组的多种组分之一。优选地，所述经固定化的捕获试剂以统一的捕获试剂组进行排列。优选地，所述经固定化的捕获试剂以可重复图式附着至表面，其中所述图式的每个重复与所述多个腔室中的一个腔室对齐。
将所述阵列和捕获试剂组相偶联以形成多个封闭界面，每个封闭界面包括腔室和捕获试剂组，从而使得每个腔室的内容物对于所述捕获试剂组中的每种捕获试剂来说是可接近的。
所述阵列的腔室可以采取任何形状并且可以具有任何尺寸，但是在本公开内容的某些实施方案中，所述阵列包含至少1、2、5、10、15、20、25、50、100、150、500、1000、1500、2000或之间的任何整数个腔室。每个腔室可以具有在1μm和2000μm之间的深度/高度，在1μm和2000μm之间的直径，在1μm和2000μm之间的宽度，和/或在1μm和2000μm之间的长度。所述阵列的任何两个腔室之间的距离可以在1μm和2000μm之间。
在某些实施方案中，至少一个腔室为高长宽比的长方形孔，其具有长度为大约1-2mm和深度为大约5-50μm的尺寸。
在某些实施方案中，每个腔室为具有大约10-2000μm的长度，大约10-100μm的宽度和大约10-100μm的深度的长方形孔。
在某些实施方案中，所述捕获试剂组可以包括3至50种不同的捕获试剂，由此允许检测分泌物质组中的3至50种不同的组分。在某些实施方案中，所述捕获试剂组可以包括多于3种不同的捕获试剂，由此允许检测分泌物质组中的多于3种不同的组分。在某些实施方案中，所述捕获试剂组可以包括多于10种不同的捕获试剂，由此允许检测分泌物质组中的多于10种不同的组分。在某些实施方案中，所述捕获试剂组可以包括多于42种不同的捕获试剂，由此允许检测分泌物质组中的多于42种不同的组分。
在某些实施方案中，所述阵列包含大约200个微孔/cm2至大约20,000个微腔室/cm2的腔室密度。
定义
除非另有定义，与本公开内容相关地进行使用的科学和技术术语应当具有由本领域技术人员通常所理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。通常，在本文中所描述的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡或多核苷酸化学和杂交相关地进行使用的名称以及它们的技术是本领域中众所周知且通常所使用的那些。对于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)，使用标准技术。酶促反应和纯化技术按照制造商的说明书或者如本领域中通常完成的那样或者如在本文中所描述的那样来进行。除非明确指出与之相反，本发明的实践将会采用在本领域技能之内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，其中的许多在下文中为了举例说明的目的进行了描述。此类技术在文献中有充分解释。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:APractical Approach,第I和II卷(D.Glover,编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,编辑,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,编辑,1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,编辑.,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney,编辑,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)。
下面的定义在理解本发明中是有用的：
在本文中所使用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示出所希望的生物学活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”可互换使用。
“分离的抗体”为已与其天然环境的组分分开和/或从其天然环境的组分中回收的抗体。其天然环境的污染组分为将会干扰关于该抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化：(1)至大于95重量％的抗体(如通过Lowry法所测定的)，和最优选地，大于99重量％；(2)至足以通过使用旋杯式序列分析仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)至同质(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染进行的SDS-PAGE)。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将会不存在。但是，通常地，分离的抗体将会通过至少一个纯化步骤来制备。
本公开内容的捕获试剂可以包括一种或多种单克隆抗体。在本文中所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群体中获得的抗体，即构成所述群体的独个抗体是相同的，除了可以以小量存在的可能的天然出现的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。进一步地，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对在抗原上的单一决定簇。除了其特异性外，单克隆抗体也是有利的，因为它们可以不被其他抗体污染地进行合成。
本文中所考虑的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与在源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与在源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展示出所希望的生物学活性。在本文中首要令人感兴趣的嵌合抗体包括这样的抗体，其具有一个或多个人抗原结合序列(例如，CDR)并且包含一个或多个源自非人抗体的序列(例如，FR或C区序列)。另外，在本文中首要令人感兴趣的嵌合抗体包括这样的那些抗体，其包含一种抗体类别或亚类的人可变结构域抗原结合序列和源自另一种抗体类别或亚类的另一个序列(例如，FR或C区)。在本文中令人感兴趣的嵌合抗体还包括这样的那些抗体，其包含与在本文中所描述的那些相关或源自不同物种例如非人灵长类(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列。嵌合抗体还包括灵长类化和人源化抗体。
本公开内容的捕获试剂可以包括人源化抗体。“人源化抗体”通常被认为是具有一个或多个从非人来源引入到它之中的氨基酸残基的人抗体。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。在传统上，人源化通过用输入高变区序列置换人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体为其中大大小于完整的人可变结构域的序列已被来自非人物种的相应序列置换的嵌合抗体。
“人抗体”为仅包含存在于由人天然地产生的抗体中的序列的抗体。但是，在本文中所使用的人抗体可以包含在天然出现的人抗体中未发现的残基或修饰，包括在本文中所描述的那些修饰和变体序列。典型地进行这些以进一步精炼或增强抗体性能。
本公开内容的捕获试剂可以包括完整抗体。“完整”抗体为包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。所述恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，所述完整抗体具有一种或多种效应功能。
本公开内容的捕获试剂可以包括抗体片段。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
本公开内容的捕获试剂可以包括抗体的功能性片段或类似物。短语“抗体的功能性片段或类似物”为与全长抗体一样具有定性的生物学活性的化合物。例如，抗-IgE抗体的功能性片段或类似物为这样的那种，其可以以这样的方式与IgE免疫球蛋白相结合从而阻止此类分子具有与高亲和力受体(FcεRI)相结合的能力或者实质上降低此类分子与高亲和力受体(FcεRI)相结合的能力。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段(反映了容易地进行结晶的能力的名称)。Fab片段由下列部分组成：整个L链连同H链的可变区结构域(VH)，和一条重链的第一恒定结构域(CH1)。每个Fab片段关于抗原结合来说是单价的，即它具有单一的抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个的大的F(ab')2片段，其大致相应于具有二价抗原结合活性的两个经二硫化物连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于：在CH1结构域的羧基末端处具有额外的几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab'-SH为在本文中对于其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离的硫羟基团的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段原先作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对而产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fc”片段包含通过二硫化物而保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能由Fc区中的序列来决定，Fc区还是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由以紧密的非共价联合形式的一个重链可变结区构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发出六个高变环(从H链和L链各三个环)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并且将抗原结合特异性赋予抗体。但是，即使单个可变结构域(或包含仅三个特异于抗原的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，虽然以比整个结合位点低的亲和力。
本公开内容的捕获试剂可以包括单链抗体(也称为scFv)。“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽连接体，其使得sFv能够形成用于抗原结合的所希望的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995,见下文。
本公开内容的捕获试剂可以包括双链抗体。术语“双链抗体”是指通过下述制备的小抗体片段：构建在VH和VL结构域之间具有短连接体(大约5-10个残基)的sFv片段(参见前一段落)，从而实现V结构域的链间而非链内配对，这导致二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双链抗体为两个“交换”sFv片段的异二聚体，其中这两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双链抗体更充分地描述在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
本公开内容的捕获试剂可以包括双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体是双特异性的或多特异性的。双特异性抗体为具有对于至少两个不同表位的结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以与单个抗原的两个不同表位相结合。其他此类抗体可以将第一抗原结合位点与对于第二抗原的结合位点相组合。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域中已知的。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中所述两条链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生可能的十种不同抗体分子的混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(其通常通过亲和层析步骤来进行)是相当繁琐的，并且产物产率是低的。
按照不同的方法，将具有所希望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。优选地，所述融合是与Ig重链恒定结构域，其包含铰链、CH2和CH3区的至少一部分。优选的是具有包含对于轻链键合来说必需的位点的第一重链恒定区(CH1)，存在于所述融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA***到分开的表达载体中，并且共转染到合适的宿主细胞中。当不等比例的在构建中所使用的三条多肽链提供所希望的双特异性抗体的最佳产量时，在实施方案中，这在调整所述三个多肽片段的相互比例中提供了更大的灵活性。但是，可能的是，将关于两个或所有三个多肽链的编码序列***到单个表达载体中，当至少两条多肽链的以相等比例的表达导致高产量时或者当所述比例对于所希望的链组合的产量不具有重大影响时。
在本文中所使用的抗体被说成是“免疫特异性的”、“特异于”或“特异性地结合”抗原，如果它以可检测的水平与抗原进行反应，优选地以大于或等于大约104M-1，或大于或等于大约105M-1，大于或等于大约106M-1，大于或等于大约107M-1，或大于或等于108M-1的亲和力常数Ka。对于其同族抗原的抗体的亲和力也通常被表示为解离常数KD，并且在某些实施方案中，抗体特异性地与分泌物质组的组分相结合，如果它以小于或等于10-4M，小于或等于大约10-5M，小于或等于大约10-6M，小于或等于10-7M，或者小于或等于10-8M的KD进行结合。抗体的亲和力可以通过使用常规技术而容易地测定，例如由Scatchard等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51:660(1949))所描述的那些。
本公开内容的受试细胞和靶细胞可以是从任何物种(包括任何哺乳动物)中分离、得到或制备的。用于治疗感染的目的的“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括人，家养和农场动物，和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。优选地，所述哺乳动物为人。
本公开内容的受试细胞可以在用于治疗疾病或病症的细胞疗法中使用。“治疗”或“减轻”是指治疗性治疗和预防性或防护性措施这两者；其中目标是防止或减缓(减小)所靶向的病理学状况或病症。需要治疗的那些包括已经具有所述病症的那些以及倾向于具有所述病症的那些或者在其中所述病症待预防的那些。受试者或哺乳动物可以成功地“被治疗”，当在接受用本公开内容的受试细胞进行的细胞疗法后，所述患者显示出下列中的一个或多个的可观察和/或可测量的减少或不存在时：与疾病或病症相关联的症状中的一个或多个的减少；降低的发病率和死亡率；和生活质量问题的改善。上面的用于评估疾病的成功治疗和改善的参数通过医师所熟悉的常规程序可容易地测量。本公开内容的方法可以用于在开始受试者的治疗之前、期间或之后测定细胞疗法的安全性和/或功效。
可以对本公开内容的捕获试剂进行标记，以使得它们通过使用一种或多种手段是可检测的。在本文中所使用的“标记物”是指可检测的化合物或组合物，其直接地或间接地与所述捕获试剂(例如，抗体)相缀合以便产生“经标记的”捕获试剂(例如，抗体)。所述标记物可以是通过自身可检测的(例如，荧光标记物)，或者在酶促标记物的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本公开内容的捕获试剂可以选择性地或特异性地鉴定、捕获和/或定量分泌物质组中的一种或多种小分子。“小分子”在本文中被定义成具有低于大约500道尔顿的分子量。
本公开内容的捕获试剂可以包括核酸或经标记的核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指单链或双链RNA、DNA或混合型聚合物。多核苷酸可以包括基因组序列，基因组外和质粒序列，和表达或可以经调整而适合于表达多肽的更小的经改造的基因区段。
“分离的核酸”为与其他基因组DNA序列以及天然地伴随天然序列的蛋白质或复合物(例如核糖体和聚合酶)基本上分开的核酸。该术语包括已从其天然出现的环境中移出的核酸序列，并且包括重组或经克隆的DNA分离物以及以化学方式合成的类似物或通过异源***以生物学方式合成的类似物。基本上纯的核酸包括所述核酸的分离的形式。当然，这是指最初分离出的核酸，并且不包括后来通过人工添加至所述分离出的核酸的基因或序列。
术语“多肽”以其常规含义进行使用，即作为氨基酸序列。所述多肽并不局限于产物的特定长度。肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义之内，并且此类术语在本文中可以互换使用，除非另有明确说明。该术语也不涉及或排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的其他修饰，包括天然出现的或非天然出现的两者。多肽可以是整个蛋白质，或其子序列。
“分离的多肽”为已被鉴定并且与其天然环境的组分分开和/或从其天然环境的组分中回收的多肽。在优选的实施方案中，将会将所述分离的多肽纯化：(1)至大于95重量％的多肽(如通过Lowry法所测定的)，和最优选地，大于99重量％；(2)至足以通过使用旋杯式序列分析仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度；或(3)至同质(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选地银染进行的SDS-PAGE)。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将会不存在。但是，通常地，分离的多肽将会通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然序列”多核苷酸为具有与源自自然界的多核苷酸相同的核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽为具有与源自自然界(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)相同的氨基酸序列的多肽。此类天然序列多核苷酸和多肽可以从自然界中分离，或者可以通过重组或合成手段来产生。
当该术语在本文中使用时，多核苷酸“变体”为这样的多核苷酸，其典型地在一个或多个置换、缺失、添加和/或***方面不同于在本文中具体地公开的多核苷酸。此类变体可以是天然出现的，或者可以以合成方式来产生，例如通过如在本文中所描述的那样和/或使用本领域中熟知的许多技术中的任何一种来修饰本发明的多核苷酸序列中的一种或多种并且评价所编码的多肽的一种或多种生物学活性。
当该术语在本文中使用时，多肽“变体”为这样的多肽，其典型地在一个或多个置换、缺失、添加和/或***方面不同于在本文中具体地公开的多肽。此类变体可以是天然出现的，或者可以以合成方式来产生，例如通过如在本文中所描述的那样和/或使用本领域中熟知的许多技术中的任何一种来修饰本发明的上述多肽序列中的一种或多种并且评价所述多肽的一种或多种生物学活性。
可以在本公开内容的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰，并且仍然获得编码具有所希望的特征的变体或衍生多肽的功能分子。当希望改变多肽的氨基酸序列以产生本发明的多肽的等价或甚至经改善的变体或部分时，本领域技术人员典型地将会改变编码DNA序列的密码子中的一个或多个。
例如，在蛋白质结构中可以将某些氨基酸置换为其他氨基酸，而没有其结合其他多肽(例如，抗原)或细胞的能力的可觉察的损失。由于蛋白质的结合能力和性质定义了蛋白质的生物学功能活性，因而可以在蛋白质序列中和当然在其作为基础的DNA编码序列中进行某些氨基酸序列置换，并且尽管如此而仍然获得具有类似特性的蛋白质。因此，预想到，可以在所公开的组合物的肽序列中或者在编码所述肽的相应的DNA序列中进行各种变化，而没有其生物学功用或活性的可觉察的损失。
在许多情况下，多肽变体将会包含一个或多个保守置换。“保守置换”为这样的置换，其中将氨基酸置换为另一种具有相似特性的氨基酸，从而肽化学领域的技术人员将会预期该多肽的二级结构和亲水性质基本上未变化。
在进行此类变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数。在赋予蛋白质以相互作用式的生物学功能中亲水氨基酸指数的重要性是本领域中普遍理解的(Kyte和Doolittle,1982)。得到认可的是，氨基酸的相对亲水特性对于所得的蛋白质的二级结构做出贡献，而二级结构又定义了该蛋白质与其他分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。已经基于其疏水性和电荷特征给每种氨基酸分配了亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
某些氨基酸可以被其他具有相似亲水指数或得分的氨基酸所置换，并且仍然导致具有相似生物学活性的蛋白质，即仍然获得生物学的在功能上等价的蛋白质。在进行此类变化时，其亲水指数在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和在±0.5之内的那些是更加特别优选的。类似氨基酸的置换可以基于亲水性来有效地进行。蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性所支配)与该蛋白质的生物学特性相关。
已将下面的亲水性值分配给了氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解的是，可以将氨基酸置换为另一种具有相似亲水性值的氨基酸，并且仍然获得在生物学上等价的(特别是在免疫学上等价的)蛋白质。在此类变化中，其亲水性值在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，和在±0.5之内的那些是更加特别优选的。
如上面所概述的，氨基酸置换因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑了各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员熟知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
氨基酸置换可以进一步地基于在残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性质方面的相似性来进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；和具有相似亲水性值的有着不带电荷的极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守变化的其他氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体可以还或备选地包含非保守变化。在一个优选的实施方案中，变体多肽由于五个或更少的氨基酸的置换、缺失或添加而不同于天然序列。变体可以还(或备选地)通过例如缺失或添加对于该多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸来进行修饰。
当比较多核苷酸和多肽序列时，如果在当如下面所描述的那样就最大对应进行比对时，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列是相同的，那么这两个序列被称为是“同一的”。两个序列之间的比较典型地通过在比较窗上比较所述序列以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域来进行。在本文中所使用的“比较窗”是指具有至少大约20个连续位置，通常30至大约75个连续位置，40至大约50个连续位置的区段，其中可以将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较，在将这两个序列进行最佳比对后。
用于比较的序列的最佳比对可以通过使用在Lasergene生物信息学软件套件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)中的Megalign程序来进行，其中使用缺省参数。该程序包括有数个在下列参考文献中所描述的比对规划方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model ofevolutionary change in proteins–Matrices for detecting distantrelationships.Dayhoff,M.O.(编辑)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC,第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes,第626-645页,Methods in Enzymology,第183卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)CABIOS4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy–the Principles andPractice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。
备选地，用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜寻方法，通过这些算法的计算机化执行(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package中，Genetics Computer Group(GCG),575ScienceDr.,Madison,WI)，或者通过检视来进行。
适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个优选的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述在Altschul等人(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。可以例如以在本文中所描述的参数来使用BLAST和BLAST 2.0，以测定关于本发明的多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件是通过National Center for Biotechnology Information而公众可得的。
“同源性”是指在比对序列并引入缺口(如果需要)以取得最大同源性百分比后，在多核苷酸或多肽序列变体中的与非变体序列同一的残基的百分比。在特别的实施方案中，多核苷酸和多肽变体与在本文中所描述的多核苷酸或多肽具有至少70％，至少75％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的多核苷酸或多肽同源性。
如在本说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包含复数引用，除非所述内容清楚地另有规定。
实施例
下面详细描述的方法能够在本公开内容的***(下面也称为阵列)上分析不同的单个受试细胞与单个靶细胞的相互作用。可以分开地培养细胞群体，并且在加载到阵列上之前简短地混合。所述阵列可以包含多个腔室(对于这些实施例，其可以采取微槽的形式)，其由表面(例如，载玻片或其他覆盖材料)进行封围，从而产生用于高通量细胞研究例如成对细胞相互作用的隔离的微环境。封围所述阵列的每个腔室的表面可以在其上附着有一种或多种检测试剂(包括但不限于抗体)。所述检测试剂(例如，在下面所提供的实施例中的抗体)可以以重复的图式附着至所述表面，从而使得每个腔室在封围该腔室的表面的那一部分上包含该图式的一个重复。在该情况下，所述图式的每个重复包含每种独个检测试剂(例如，特异于特定细胞因子的抗体)中的至少一种。所述表面可以在其上附着有20-1000种检测试剂，其各自特异于受试细胞的分泌物质组的不同组分。本公开内容的***包括多个腔室。所述多个腔室可以包括例如2至2000个腔室。
实施例1：天然杀伤(NK)细胞和靶细胞的分析
细胞培养。将以2.5×107个细胞/小瓶的浓度进行内部贮存的分离的外周血单核细胞(PBMC)解冻，并且在具有5mL的补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mM HEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)、100ng/mL重组IL-18(R&DSystems，B001-5)和10ng/mL IL-12(R&D Systems，219-IL-005)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)的T25细胞培养瓶中培养过夜。在过夜恢复后，按照制造商的说明书，通过使用Miltenyi NK细胞分离试剂盒来分离NK细胞。然后，将NK细胞在37℃和5％CO2下在经补充的X-Vivo 15培养基中以1×106个细胞/mL的浓度进行培养直至使用。人K562细胞系(ATCC CCL243)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且将其在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1XGlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTMRPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将本公开内容的***(在本实施例中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)微腔室阵列)用Plasma Etch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。在即将进行所述测定法之前，将K562细胞从培养物中取出，重悬浮在1mL的PBS中，并用CellTrace羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(1:1000，ThermoFisher)染色20分钟。然后，将K562细胞用经补充的X-Vivo 15培养基洗涤3次，并且以1×106个细胞/mL的浓度进行重悬浮。然后，将K562细胞与NK细胞以1:1比例相合并以产生细胞悬浮液。将该包含K562细胞和NK细胞的悬浮液以300×g离心10分钟，并且以2.5×106个细胞/mL的浓度重悬浮在新鲜培养基中。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
实施例2：用双特异性抗体来分析CD8+T-细胞和靶细胞
细胞培养。将以2.5×107个细胞/小瓶的浓度进行内部贮存的分离的PBMC解冻，并且在具有5mL的补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mMHEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和4ng/mL重组IL-2(BioLegend)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)的T25细胞培养瓶中培养过夜。在过夜恢复后，按照制造商的说明书，通过使用Miltenyi CD8+T-细胞分离试剂盒来分离CD8+T-细胞。然后，将CD8+T-细胞在37℃和5％CO2下在经补充的X-Vivo 15培养基中以1×106个细胞/mL的浓度进行培养直至使用。将人Raji B细胞系(购自美国典型培养物保藏中心(ATCC))在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTMcellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将本公开内容的***(在本实施例中，聚二甲基硅氧烷(PDMS)微腔室阵列)用Plasma Etch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。将CD8+T-细胞重悬浮在1mL的PBS中并用CellTrace Violet(1:1000，ThermoFisher)染色20分钟。然后，将CD8+T-细胞用经补充的X-Vivo 15培养基洗涤3次，并且以2×106个细胞/mL的浓度进行重悬浮。将Raji细胞从培养物中取出并重悬浮在1mL的PBS中，并且用Cell TraceCFSE(1:1000，ThermoFisher)染色20分钟。然后，将Raji细胞用经补充的X-Vivo 15培养基洗涤3次，并且以2×106个细胞/mL的浓度进行重悬浮。然后，将CD8+T-细胞与Raji细胞以1:1比例相合并以产生细胞悬浮液。随后，向该悬浮液添加100ng/mL的双特异性抗体。在加载到所述阵列上之前，将包含CD8+T-细胞和Raji细胞的细胞悬浮液以300×g离心10分钟并然后进行重悬浮。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。然后，将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
实施例3：CAR T-细胞和刺激珠粒之间的相互作用的分析
CD19珠粒设计。将1×108颗M450Tosylactivated Dynabeads(ThermoFisher)(250μL的M450Tosylactivated Dynabeads)用PBS洗涤3次。将重组人CD19-组氨酸(His)(Sino)以1μg/μL重悬浮在dH2O中并在室温下温育30分钟。然后，向珠粒添加50微升的CD19-His，并在室温下伴有转动地温育过夜。然后，将经CD19包被的珠粒用PBS洗涤3次。为了灭活在珠粒上的其余甲苯磺酰基基团，将珠粒重悬浮在250μL的具有0.1％BSA的0.2M Tris(pH 8.5)中并在室温下伴有转动地温育过夜。然后，将珠粒以4×106颗珠粒/mL的浓度重悬浮在PBS中并贮存于4℃直至使用。
CAR T-细胞刺激。将CAR-T细胞与经CD19包被的珠粒以1:4比例相混合，并且以1×106个细胞/mL的浓度在96-孔平板中进行铺板。在进行所述测定法之前，将所述平板在37℃和5％CO2下温育6小时。
细胞培养。将靶细胞在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。将CAR T-细胞解冻，并且以1×106个细胞/mL的浓度在补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mM HEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和4ng/mL重组人IL-2(BioLegend，589104)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)中培养过夜。在即将使用之前，通过使用DeadCell Removal Kit(Miltenyi，130-090-101)和LS Magnetic Column(Miltenyi，130-042-401)或者通过使用标准的Ficoll-Paque Plus(GE，17-1440-02)死细胞去除实验方案来从培养物中去除死细胞。如果希望将培养物中的CD8+细胞与CD4+细胞分开，那么可以在死细胞去除之后按照制造商的说明书使用CD8微珠粒(Miltenyi，130-045-201)来进行分离。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将所述阵列用PlasmaEtch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。收集经刺激的T-细胞，用抗人CD4RPE抗体(ThermoFisher，MHCD0404)和抗人CD8a Alexa Fluor 647抗体(BioLegend，300918)以1:100进行染色，并且在室温下温育10分钟。将经刺激的T-细胞以300×g离心10分钟，并且以2.5×106个细胞/mL的浓度重悬浮在新鲜培养基中。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。然后，将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
实施例4：CAR T-细胞和靶细胞之间的相互作用的分析
靶细胞设计。通过使用EcoRI和XhoI切割位点将全长cDNA(参见下面的靶cDNA的列表)克隆到pcDNA3.1(+)载体(ThermoFisher，V79020)中来产生靶细胞。遵循标准的Lipofectamine 3000(ThermoFisher)实验方案，在24-孔平板中将靶质粒转染到K562细胞(ATCC，CCL243)中。通过用500μg/mL遗传霉素(ThermoFisher)选择转化子3-4周来产生稳定的库系(pool lines)。一旦产生了稳定的库(pools)，就通过在96-孔平板中系列稀释细胞来发展出克隆系。培养具有单细胞的孔并用遗传霉素选择3-4周，直至发展出稳定的克隆系。将克隆系以1×107个细胞/小瓶的浓度在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)、1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)和10％DMSO的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行冷冻。靶cDNA包括但不限于下列：神经生长因子受体(NGFR；阴性对照cDNA)、CD19、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变(EGFRvIII；也称为de2-7EGFR或ΔEGFR)、黑素瘤相关抗原3(MAGE A3)、NY-ESO-1(也称为CTAG-1B；一种免疫原性癌抗原)、***干细胞抗原(PSCA)、黑素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、人表皮生长因子受体2(HER2)、B-细胞成熟抗原(BCMA；也称为CD296)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1(MUC-1；也称为episialin、PEM、H23Ag、EMA、CA15-3和MCA)、黏蛋白16(MUC-16)和间皮素。
细胞培养。将靶细胞在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。将CAR T-细胞解冻，并且以1×106个细胞/mL的浓度在补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mM HEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和4ng/mL重组人IL-2(BioLegend，589104)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)中培养过夜。在即将使用之前，通过使用DeadCell Removal Kit(Miltenyi，130-090-101)和LS Magnetic Column(Miltenyi，130-042-401)或者通过使用标准的Ficoll-Paque Plus(GE，17-1440-02)死细胞去除实验方案来从培养物中去除死细胞。如果希望将培养物中的CD8+细胞与CD4+细胞分开，那么可以在死细胞去除之后按照制造商的说明书使用CD8微珠粒(Miltenyi，130-045-201)来进行分离。
CAR T-细胞刺激。将靶细胞用CellTrace CFSE(ThermoFisher，C34554)染色20分钟，并且在使用之前用经补充的X-Vivo 15培养基漂洗3次。将靶细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)与CAR T-细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)以1:1比例相合并以产生细胞悬浮液。将200微升/孔的包含CAR T-细胞和靶细胞的细胞悬浮液铺板到96-孔平板中，并且在37℃和5％CO2下温育1-2小时。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将所述阵列用PlasmaEtch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。收集经刺激的T-细胞，用抗人CD4RPE抗体(ThermoFisher，MHCD0404)和抗人CD8a Alexa Fluor 647抗体(BioLegend，300918)以1:100进行染色，并且在室温下温育10分钟。将经刺激的T-细胞以300×g离心10分钟，并且以2.5×106个细胞/mL的浓度重悬浮在新鲜培养基中。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。然后，将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
实施例5：在具有靶细胞耗竭的情况下，CAR T-细胞和靶细胞之间的相互作用的分 析
靶细胞设计。通过使用EcoRI和XhoI切割位点将全长cDNA(参见下面的靶cDNA的列表)克隆到pcDNA3.1(+)载体(ThermoFisher，V79020)中来产生靶细胞。遵循标准的Lipofectamine 3000(ThermoFisher)实验方案，在24-孔平板中将靶质粒转染到K562细胞(ATCC，CCL243)中。通过用500μg/mL遗传霉素(ThermoFisher)选择转化子3-4周来产生稳定的库系(pool lines)。一旦产生了稳定的库(pools)，就通过在96-孔平板中系列稀释细胞来发展出克隆系。培养具有单细胞的孔并用遗传霉素选择3-4周，直至发展出稳定的克隆系。将克隆系以1×107个细胞/小瓶的浓度在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)、1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)和10％DMSO的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行冷冻。靶cDNA包括但不限于下列：神经生长因子受体(NGFR；阴性对照cDNA)、CD19、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变(EGFRvIII；也称为de2-7EGFR或ΔEGFR)、黑素瘤相关抗原3(MAGE A3)、NY-ESO-1(也称为CTAG-1B；一种免疫原性癌抗原)、***干细胞抗原(PSCA)、黑素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、人表皮生长因子受体2(HER2)、B-细胞成熟抗原(BCMA；也称为CD296)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1(MUC-1；也称为episialin、PEM、H23Ag、EMA、CA15-3和MCA)、黏蛋白16(MUC-16)和间皮素。
细胞培养。将靶细胞在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。将CAR T-细胞解冻，并且以1×106个细胞/mL的浓度在补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mM HEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和4ng/mL重组人IL-2(BioLegend，589104)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)中培养过夜。在即将使用之前，通过使用DeadCell Removal Kit(Miltenyi，130-090-101)和LS Magnetic Column(Miltenyi，130-042-401)或者通过使用标准的Ficoll-Paque Plus(GE，17-1440-02)死细胞去除实验方案来从培养物中去除死细胞。如果希望将培养物中的CD8+细胞与CD4+细胞分开，那么可以在死细胞去除之后按照制造商的说明书使用CD8微珠粒(Miltenyi，130-045-201)来进行分离。
CAR T-细胞刺激。将CAR T-细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)与靶细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)以1:1的比例相混合以产生细胞悬浮液。将200微升/96-孔平板的孔的细胞悬浮液进行铺板。然后，将所述平板在具有5％CO2的处于37℃的培养箱中温育过夜(在本实施例中，大约20小时)
靶细胞耗竭。在过夜刺激后，将包含CAR T-细胞和靶细胞的细胞悬浮液从孔中移除，并且以300×g离心10分钟。然后，移除上清液，并且将细胞重悬浮在缀合珠粒溶液中。缀合珠粒溶液包含与针对靶受体的抗体相缀合的M280Dynabeads。缀合珠粒溶液的珠粒被设计成用于从该溶液中去除所有靶细胞。将包含CAR T-细胞和靶细胞的该缀合珠粒溶液在室温下伴有温和混合地温育10分钟。在温育后，将包含CAR T-细胞和靶细胞的溶液用PBS提升至1mL的总体积并转移至5mL圆底聚丙烯Falcon管(Corning，352063)。然后，将所述管放置在EasySep Magnet(StemCell Technologies，18000)中2分钟，之后将CAR T-细胞的溶液滗析入干净的管中。将珠粒用培养基进行洗涤并滗析(2次)，之后离心CAR T-细胞并重悬浮靶细胞被耗竭的CAR-T细胞以用于在所述测定法中进行使用。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将所述阵列用PlasmaEtch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。收集经刺激的T-细胞，用抗人CD4RPE抗体(ThermoFisher，MHCD0404)和抗人CD8a Alexa Fluor 647抗体(BioLegend，300918)以1:100进行染色，并且在室温下温育10分钟。将经刺激的T-细胞以300×g离心10分钟，并且以2.5×106个细胞/mL的浓度重悬浮在新鲜培养基中。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。然后，将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
实施例6：靶标/效应子相互作用的荧光细胞毒性分析
该方法可以应用于本公开内容的靶标/效应子(受试者)细胞类型中的任一种，其中将下述步骤添加至单细胞分泌物质组测定法实验方案。如果希望细胞毒性的荧光追踪，那么可以在即将将细胞悬浮液加载到阵列上之前，向包含靶细胞和效应(受试)细胞的细胞悬浮液添加1μL/mL的SYTOX Orange(ThermoFisher)。
实施例7：评估在表达CAR的抗肿瘤T-细胞中的多功能性
为了评价用于免疫疗法的经改造的T细胞或为了评价被再激活以对抗癌症或感染的内源性T细胞，T细胞的功能状态在很大程度上由分泌出的效应功能蛋白质(例如，细胞因子)的谱来决定。在保护性免疫应答中，免疫细胞的“质量”与多功能性(T细胞共分泌多种效应蛋白的能力)的程度相关联。虽然这些抗肿瘤的细胞裂解性趋化细胞因子产生有效的应答，但是这些多功能细胞亚组不是必须还分泌在NK或CAR-T细胞中普遍存在的免疫毒性的炎性或调节细胞因子(多达15种)。
下面提供了一种用于在作为治疗法将表达CAR的抗肿瘤T-细胞群体的细胞或基本上相似的细胞施用给患者之前测定经刺激的表达CAR的抗肿瘤T-细胞是否以在治疗上有效且安全的方式作出应答的方法。
靶细胞设计。通过使用EcoRI和XhoI切割位点将全长cDNA(参见下面的靶cDNA的列表)克隆到pcDNA3.1(+)载体(ThermoFisher，V79020)中来产生靶细胞。遵循标准的Lipofectamine 3000(ThermoFisher)实验方案，在24-孔平板中将靶质粒转染到K562细胞(ATCC，CCL243)中。通过用500μg/mL遗传霉素(ThermoFisher)选择转化子3-4周来产生稳定的库系(pool lines)。一旦产生了稳定的库(pools)，就通过在96-孔平板中系列稀释细胞来发展出克隆系。培养具有单细胞的孔并用遗传霉素选择3-4周，直至发展出稳定的克隆系。将克隆系以1×107个细胞/小瓶的浓度在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)、1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)和10％DMSO的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行冷冻。靶cDNA包括但不限于下列：神经生长因子受体(NGFR；阴性对照cDNA)、CD19、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变(EGFRvIII；也称为de2-7EGFR或ΔEGFR)、黑素瘤相关抗原3(MAGE A3)、NY-ESO-1(也称为CTAG-1B；一种免疫原性癌抗原)、***干细胞抗原(PSCA)、黑素瘤中优先表达的抗原(PRAME)、人表皮生长因子受体2(HER2)、B-细胞成熟抗原(BCMA；也称为CD296)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1(MUC-1；也称为episialin、PEM、H23Ag、EMA、CA15-3和MCA)、黏蛋白16(MUC-16)和间皮素。
细胞培养。将靶细胞在补充有10％FBS(Sigma-Aldrich，F2442)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和1X GlutaMAX补充物(ThermoFisher，35050061)的具有L-谷氨酰胺的CorningTM cellgroTM RPMI 1640培养基(改进的)1X(Corning；ThermoFisher MT10040CV)中进行培养。将CAR T-细胞解冻，并且以1×106个细胞/mL的浓度在补充有1X GlutaMAX(ThermoFisher，35050061)、1mM丙酮酸钠(ThermoFisher，11360-070)、1X MEM维生素溶液(Gibco；ThermoFisher，11120-052)、20mM HEPES(Gibco；ThermoFisher，15630-080)、2％人AB血清(Valley Biomedical，HP1022HI)、1X青霉素-链霉素-新霉素(Sigma-Aldrich，P4083)和4ng/mL重组人IL-2(BioLegend，589104)的没有艮他霉素或酚红的X-Vivo 15(Lonza，04-744Q)中培养过夜。在即将使用之前，通过使用DeadCell Removal Kit(Miltenyi，130-090-101)和LS Magnetic Column(Miltenyi，130-042-401)或者通过使用标准的Ficoll-Paque Plus(GE，17-1440-02)死细胞去除实验方案来从培养物中去除死细胞。如果希望将培养物中的CD8+细胞与CD4+细胞分开，那么可以在死细胞去除之后按照制造商的说明书使用CD8微珠粒(Miltenyi，130-045-201)来进行分离。
CAR T-细胞刺激。将靶细胞用CellTrace CFSE(ThermoFisher，C34554)染色20分钟，并且在使用之前用经补充的X-Vivo 15培养基漂洗3次。将靶细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)与CAR T-细胞(以1×106个细胞/mL的浓度)以1:1比例相合并以产生细胞悬浮液。将200微升/孔的包含CAR T-细胞和靶细胞的细胞悬浮液铺板到96-孔平板中，并且在37℃和5％CO2下温育1-2小时。
单细胞分泌物质组测定法。在进行该单细胞测定法之前，将所述阵列用PlasmaEtch PE-25等离子体清洁器进行等离子体处理2.5分钟以增加亲水性。然后，将所述阵列在3％BSA/PBS中封闭30分钟。收集经刺激的T-细胞，用抗人CD4RPE抗体(ThermoFisher，MHCD0404)和抗人CD8a Alexa Fluor 647抗体(BioLegend，300918)以1:100进行染色，并且在室温下温育10分钟。将经刺激的T-细胞以300×g离心10分钟，并且以2.5×106个细胞/mL的浓度重悬浮在新鲜培养基中。在即将进行所述测定法之前，将所述阵列用培养基进行漂洗，并且使用压缩空气来进行干燥。然后，将所述阵列安置在载玻片上并固紧入定制的夹紧***中。用移液管将30微升的细胞悬浮液逐室地吸移到所述阵列上。使在其上附着有抗体重复图式的表面(在本实施例中，载玻片)与所述阵列相接触，从而使得所述抗体重复图式面向所述阵列并且所述图式的每个重复与所述阵列的腔室对齐。将所述阵列和封围所述阵列的表面(具有抗体图式)在我们的定制的夹紧***中紧紧地夹在一起。将细胞困陷在微腔室中并且在加载后立即进行成像，如下面所描述的那样。将微腔室组件放置在处于37℃的标准的5％CO2培养箱中16小时。在温育后，将具有抗体图式的表面迁移到1％BSA/PBS浴中并用1％BSA/PBS进行漂洗。随后，将300μL的经生物素标记的二抗混合物引至所述表面并温育45分钟。该混合物包含浓度为0.25μg/mL的检测抗体，各自在1％BSA/PBS的1:200悬浮液中。在该步骤后，将所述表面用1％BSA进行漂洗，添加300μL的APC链霉抗生物素蛋白(BioLegend，405207)的1:100溶液，并且将所述表面温育30分钟。在该温育后，将所述表面用1％BSA/PBS进行洗涤，然后在设定于125rpm的离心机中在科普林缸中依次用PBS、50％PBS/DI水、DI水、DI水洗涤3分钟。将所述表面在Labnet载玻片旋转器(C1303-T)中干燥30秒。如下面所描述的那样，使用GenePix微阵列扫描仪来分析所述表面。
微腔室阵列成像。使用具有自动载物台的Zeiss Axio Observer.Z1荧光显微镜来获取所述阵列的亮场图像和荧光图像这两者。用54183uM x 24866uM面积的HamamatsuOrca-Flash4.0LT数码CMOS照相机(C11440-42U)来拍摄整个阵列的图像，相应于253个拼贴片(5X图像)和494个拼贴片(10X图像)。使用Zen2Pro软件，将所述拼贴片以0％重叠缝合在一起并且输出为TIFF以用于通过我们专有的CytoSpeak软件来进行分析。
有抗体图式的表面的成像。使用GenePix 4400A扫描仪(Molecular Devices)来获得有抗体图式的表面的扫描荧光图像。将两个颜色通道即488(蓝色，PMT 350，Power 90)和635(红色，PMT600,Power 90)用于通过使用GenePix Pro软件(Molecular Devices)来收集荧光信号。然后，在使用CytoSpeak软件进行分析之前，将所述图像输出为TIFF。
多功能性的分析。测量在对照和经靶细胞刺激的CAR T-细胞的分泌物质组中每种细胞因子的绝对和相对贡献。图10和11在单细胞基础上证明了在分泌物质组中每种所检测的细胞因子的多功能力度指数(PSI)贡献。如在图11(图版E和F)中所显示的，当独个地检测细胞群体但作为群体进行分析时，可以测定在给定的群体中的在阈值水平之上表达任何一种细胞因子的细胞的百分比。在该标绘图中所使用的细胞因子可以包括指示CAR-T细胞在体内诱导有害或不相要的反应的风险的那些细胞因子，并且根据什么被认为是安全的和可容忍的，可以升高或降低阈值。使用该方法，可以在体外测试旨在用于作为细胞疗法进行体内施用的任何细胞群体，以在所述细胞群体可能负面地影响患者之前揭示潜在的有害反应。
多功能力度指数(PSI)是将样品中的细胞的多功能性和由每个细胞所分泌的细胞因子的信号强度计算在内的度量。它通过将样品的多功能细胞(分泌两种或更多种细胞因子的单细胞)的百分比乘以这些细胞因子的平均信号强度来得到。该PSI显示在图10A和10B以及图11A和11B的左边。例如，图10B证明，多功能力度在经CD19刺激的样品中高至在图10A中所显示的对照PSI的大略2倍。图11B证明，经刺激的细胞具有高至对照细胞的大略5倍的多功能力度。
如在图10和11的柱状图中所看出的，可以将多功能力度进一步划分为所定义的细胞因子组(参见在图8E中所显示的凡例)，其举例说明了特定的细胞因子组对于样品的多功能性的影响。例如，在图10B的左图中，效应细胞因子是多功能性的主要驱动者，因为它们占总PSI的大约75％。右边的相应的图显示了每种独个细胞因子对于总PSI的贡献。在该情况下，粒酶B为样品的多功能性的主要驱动者。
在图11D的右图中，我们看到存在数种驱动样品的多功能力度的细胞因子。所述PSI主要由炎性细胞因子IL-6和MCP-1以及效应细胞因子粒酶B和穿孔蛋白组成。许多其他细胞因子在较小的程度上对于样品的PSI做出贡献。
图10C和11C显示了来自指定群体的所有单细胞分泌物的垂直散点图。每个橙色点相应于由单细胞以特定强度分泌的特定细胞因子。这些是减去了背景的强度；这里所显示的所有强度都在0之上，并因此相应于单细胞分泌物。未显示≤0的数据点，其表明单细胞不分泌特定细胞因子。
在图中所显示的强度水平(y-轴)的单位是任意的，但是基于“芯片上(on-chip)”校准曲线(“芯片上”也可以称为“原位”，关于本公开内容的组合物)，将这些值转换成大约pg/mL分泌量。在每种细胞因子的垂直散点图上方的百分比标注相应于在样品中的分泌那种细胞因子的单细胞的百分比。在图的顶部处的更大的百分比指明了多少种分泌物(作为所有分泌物中的份额)落在1000之上，以突显强分泌物(1000是任意的阈值，其可以进行调整和/或变得对于每种细胞因子来说是特异的)。
通过提及的合并
在本文中所引用的每篇文献(包括任何交叉引用的或相关的专利或申请)在此通过提及而以其整体合并入本文，除非明确排除或另有限制。任何文献的引用并非承认，它是关于在本文中所公开或所要求保护的任何发明的现有技术，或者它单独地或以与任何其他参考文献的任何组合地教导、暗示或公开了任何这样的发明。进一步地，当出现在本文件中的术语的任何含义或定义与在通过提及而合并的文献中的相同术语的任何含义或定义相冲突的情况，应当以在本文件中分配给那个术语的含义或定义为准。
其他实施方案
虽然已经举例说明并描述了本公开内容的具体实施方案，但是可以进行各种其他变化和修改而不背离本公开内容的精神和范围。所附权利要求书的范围包括在本公开内容的范围之内的所有此类变化和修改。

Claims (78)

1.将异质细胞群体鉴定为高质量细胞群体的方法，其中所述异质细胞群体包含受试细胞并且其中每个受试细胞为表达非天然出现的抗原受体的T-淋巴细胞，所述方法包括：
(a)使每个受试细胞与靶细胞或刺激试剂在多个腔室中的相应的腔室之中相接触，其中所述相应的腔室与抗体组处于流体联通并且所述抗体组可移除地附着至所述相应的腔室；
(b)在足以允许下列情况的条件下，在所述相应的腔室中维持每个受试细胞和所述靶细胞或所述刺激试剂：
(1)每个受试细胞分泌肽和蛋白质中的至少一种，和
(2)对于所述至少一种肽或蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种；
(c)从所述相应的腔室中移除所述抗体组；
(d)对所述至少一种肽或蛋白质进行成像，所述至少一种肽或蛋白质形成抗体:分泌型肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种，由此鉴定出当每个受试细胞接触所述靶细胞或所述刺激试剂时每个受试细胞的分泌物质组；
(e)基于在其中的每个受试细胞的分泌物质组来计算所述异质细胞群体的多功能性百分比，其中当相应的分泌物质组指示至少两种信号传导分子的分泌时，将所述异质细胞群体的每个受试细胞标记为多功能细胞；
(f)基于所述至少两种信号传导分子的成像来计算关于每个多功能细胞的多功能力度指数即PSI，所述计算生成多个PSI并且对于每个多功能细胞包括：
(i)所述异质细胞群体的多功能性百分比与相应的分泌物质组的第一信号传导分子的所测量的信号强度的第一乘积，和
(ii)所述异质细胞群体的多功能性百分比与所述相应的分泌物质组的第二信号传导分子的所测量的信号强度的第二乘积，
其中每个所测量的信号强度通过成像来测定；和
(g)当所述多个PSI指示所述异质细胞群体的至少50％是多功能的之时，将所述异质细胞群体鉴定为高质量细胞群体。
2.将异质细胞群体鉴定为高质量细胞群体的方法，其中所述异质细胞群体包含受试细胞并且其中每个受试细胞为表达非天然出现的抗原受体的T-淋巴细胞，所述方法包括：
(a)使每个受试细胞与靶细胞或刺激试剂在足以允许对每个受试细胞进行刺激的条件下相接触；
(b)将每个受试细胞引入至多个腔室中的相应的腔室，其中所述相应的腔室与抗体组处于流体联通并且所述抗体组可移除地附着至所述相应的腔室；
(c)在足以允许下列情况的条件下，在所述相应的腔室中维持每个受试细胞：
(1)每个受试细胞分泌肽和蛋白质中的至少一种，和
(2)对于所述至少一种肽或蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种；
(d)从所述相应的腔室中移除所述抗体组；
(e)对所述至少一种肽或蛋白质进行成像，所述至少一种肽或蛋白质形成抗体:分泌型肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种，由此鉴定出在与所述靶细胞或所述刺激试剂相接触后每个受试细胞的分泌物质组；
(f)基于在其中的每个受试细胞的分泌物质组来计算所述异质细胞群体的多功能性百分比，其中当相应的分泌物质组指示至少两种信号传导分子的分泌时，将所述异质细胞群体的每个受试细胞标记为多功能细胞；
(g)基于所述至少两种信号传导分子的成像来计算关于每个多功能细胞的多功能力度指数即PSI，所述计算生成多个PSI并且对于每个多功能细胞包括：
(i)所述异质细胞群体的多功能性百分比与相应的分泌物质组的第一信号传导分子的所测量的信号强度的第一乘积，和
(ii)所述异质细胞群体的多功能性百分比与所述相应的分泌物质组的第二信号传导分子的所测量的信号强度的第二乘积，
其中每个所测量的信号强度通过成像来测定；和
(h)当所述多个PSI指示所述异质细胞群体的至少50％是多功能的之时，将所述异质细胞群体鉴定为高质量细胞群体。
3.如权利要求2所述的方法，其进一步包括破坏每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间的接触的步骤。
4.如权利要求2所述的方法，其中每个受试细胞和所述靶细胞被组合物所包含，并且其中每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂处于流体联通。
5.如权利要求4所述的方法，其进一步包括从所述组合物中耗竭所述靶细胞或所述刺激试剂的步骤。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述异质细胞群体为在功能上异质的细胞群体。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述在功能上异质的细胞群体包含至少两种响应于刺激而产生分泌物质组的T-淋巴细胞，其中第一种T-淋巴细胞产生第一分泌物质组，其中第二种T-淋巴细胞产生第二分泌物质组，并且其中所述第一分泌物质组和所述第二分泌物质组不是相同的。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述在功能上异质的细胞群体包含下列中的一种或多种：B-淋巴细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述至少两种T-淋巴细胞包括下列中的一种或多种：幼稚T-淋巴细胞、激活的T-淋巴细胞、效应T-淋巴细胞、辅助T-淋巴细胞、细胞毒性T-淋巴细胞、γδT-淋巴细胞、调节T-淋巴细胞、记忆T-淋巴细胞和记忆干T-淋巴细胞。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述至少两种T-淋巴细胞表达嵌合抗原受体。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述B-淋巴细胞包括成浆细胞、浆细胞、记忆B-淋巴细胞、调节B细胞、滤泡B细胞或边缘区B细胞。
12.如权利要求6所述的方法，其中所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种神经元细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种神经元细胞包括神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、卫星细胞或肠神经胶质细胞。
14.如权利要求6所述的方法，其中所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种内分泌细胞。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种内分泌细胞分离自或源自松果腺、脑垂体腺、胰腺、卵巢、睾丸、甲状腺、甲状旁腺、下丘脑或肾上腺。
16.如权利要求6所述的方法，其中所述在功能上异质的细胞群体包含一种或多种外分泌细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种外分泌细胞分离自或源自唾液腺、汗腺或胃肠道组成部分。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述胃肠道组成部分包括口、胃、小肠和大肠。
19.如权利要求中1或2所述的方法，其中使每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂在腔室中相接触的步骤包括每个受试细胞与所述靶细胞的直接接触。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中使每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂在腔室中相接触的步骤包括每个受试细胞与所述靶细胞的间接接触。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述间接接触包括每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间的流体联通。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述间接接触包括每个受试细胞与所述靶细胞或所述刺激试剂之间通过天然或人工细胞外基质的联通。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述间接接触包括每个受试细胞与所述靶细胞之间通过中间细胞的联通。
24.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞为癌细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌细胞为原初癌细胞或经培养的癌细胞。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述原初癌细胞是转移性的。
27.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞为B-淋巴细胞。
28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞为微生物。
29.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞为受感染细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述受感染细胞接触了微生物。
31.如权利要求1或2所述的方法，其中所述靶细胞为宿主细胞。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞包括任何分离自或源自与每个受试细胞相同的个体的细胞。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞使自身免疫应答永续存在。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞为自身免疫应答的靶标。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞为功能性细胞并且其中所述宿主细胞不刺激自身免疫应答。
36.如权利要求1或2所述的方法，其中所述刺激试剂包括刺激性抗体。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述刺激性抗体为单克隆抗体。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述单克隆抗体为完全人抗体。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述单克隆抗体为人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体或经修饰的抗体。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述经修饰的抗体包含一个或多个相比于具有相同表位特异性的抗体的完全人版本而言的序列变异、一个或多个经修饰的或合成的氨基酸或者化学部分，以增强刺激功能。
41.如权利要求36所述的方法，其中所述刺激性抗体特异性地结合T细胞调节蛋白的表位。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述T细胞调节蛋白包括程序性细胞死亡蛋白1。
43.如权利要求36所述的方法，其中所述刺激性抗体包括Nivolumab或其生物相似物。
44.如权利要求1或2所述的方法，其中所述刺激试剂包括刺激性配体。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述刺激性配体包括程序性死亡配体1。
46.如权利要求1或2所述的方法，其中所述抗体组中的每一种抗体附着至可移除地附着至所述腔室的表面。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗体组中的每一种抗体附着至所述表面以形成重复图式，并且其中所述多个腔室中的每个腔室包含所述图式的重复。
48.如权利要求1或2所述的方法，其中所述足以允许下列情况的条件包括5％CO2和37℃并持续至少2小时的时间段：
(1)每个受试细胞分泌肽和蛋白质中的至少一种，和
(2)对于所述至少一种肽或蛋白质来说特异性的抗体组中的至少一种抗体结合所述至少一种肽或蛋白质，从而形成抗体:分泌型肽或抗体:分泌型蛋白质复合物中的至少一种。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述时间段为至少4小时。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述时间段为至少16小时。
51.如权利要求1或2所述的方法，其中所述腔室包含维持来自步骤(a)至(c)的每个受试细胞的生存力的细胞培养基。
52.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示减小或渐减的细胞功能或细胞生存力的肽或蛋白质。
53.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示增大或渐增的炎症的肽或蛋白质。
54.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含一种或多种不同的指示增加的细胞活性或细胞刺激的肽或蛋白质。
55.如权利要求1或2所述的方法，其中所述PSI的增加指示所述多功能受试细胞的效能的增加。
56.通过如前述权利要求中任一项所述的方法所产生的分泌物质组用于鉴定表达特异性地结合呈现在靶细胞上的抗原的嵌合抗原受体的T-淋巴细胞的用途。
57.如权利要求1或2所述的方法，其中当将所述异质细胞群体鉴定为高质量细胞群体时，所述第一信号传导分子的信号强度指示在所述相应的腔室内所述第一信号传导分子的浓度在2pg/ml和10,000pg/ml之间，包括端点，并且所述第二信号传导分子的信号强度指示在所述相应的腔室内所述第二信号传导分子的浓度在2pg/ml和10,000pg/ml之间，包括端点。
58.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含效应细胞因子，所述效应细胞因子为粒酶B、IFN-γ、MIP-1α、穿孔蛋白、TNF-α或TNF-β。
59.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含刺激细胞因子，所述刺激细胞因子为GM-CSF、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-5、IL-7、IL-8和IL-9。
60.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含趋化细胞因子，所述趋化细胞因子为CCL-11、IP-10、MIP-1β或RANTES。
61.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含调节细胞因子，所述调节细胞因子为IL-10、IL-13、IL-22、IL-4、TGF-β1、sCD137和sCD40L。
62.如权利要求1或2所述的方法，其中所述分泌物质组包含炎性细胞因子，所述炎性细胞因子为IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-4。
63.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试细胞包含至少100个细胞。
64.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试细胞包含至少500个细胞。
65.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试细胞包含至少1000个细胞。
66.如权利要求1或2所述的方法，其中所述受试细胞包含至少5000个细胞。
67.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少2种组分。
68.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少10种组分。
69.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少20种组分。
70.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少30种组分。
71.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少50种组分。
72.如权利要求1或2所述的方法，其中所述鉴定步骤包括鉴定来自所述受试细胞的每个受试细胞的分泌物质组的至少100种组分。
73.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多功能细胞的百分比包括分泌两种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第一百分比，分泌三种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第二百分比，分泌四种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第三百分比，分泌五种或更多种信号传导分子的多功能细胞的第四百分比，和分泌种类数目渐增的信号传导分子的多功能细胞的后续百分比。
74.如权利要求1或2所述的方法，其中所述信号强度的测量包括：
检测分别来自特异于所述第一或第二信号传导分子的抗体和所述第一或第二信号传导分子的复合物的荧光信号，和
将每个荧光信号对参考信号进行标准化以确定相对荧光单位值。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述参考信号为最大信号、最小信号或来自具有恒定或已知浓度的分泌物质组的组分的信号。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述参考信号为来自最丰富的受试细胞的分泌物质组的组分的信号。
77.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括测量每个多功能细胞的分泌物质组的第三或后续信号传导分子。
78.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括测定所述第一信号传导分子、所述第二信号传导分子或后续信号传导分子对于所述多功能细胞亚群体对靶细胞的应答的相对贡献，其中所述相对贡献为来自于来自每个多功能细胞的所述第一信号传导分子、所述第二信号传导分子或所述后续信号传导分子的每个多功能细胞的PSI的百分比的平均值与关于所述多功能细胞亚群体的总PSI的乘积。
CN201780069270.XA 2016-09-12 2017-09-12 用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法 Active CN109964126B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662393612P 2016-09-12 2016-09-12
US62/393,612 2016-09-12
US201662431318P 2016-12-07 2016-12-07
US62/431,318 2016-12-07
US201762480147P 2017-03-31 2017-03-31
US62/480,147 2017-03-31
US201762480752P 2017-04-03 2017-04-03
US62/480,752 2017-04-03
PCT/US2017/051223 WO2018049418A1 (en) 2016-09-12 2017-09-12 System and methods for multiplexed analysis of cellular and other immunotherapeutics

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109964126A CN109964126A (zh) 2019-07-02
CN109964126B true CN109964126B (zh) 2022-12-27

Family

ID=60083408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780069270.XA Active CN109964126B (zh) 2016-09-12 2017-09-12 用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20200166518A1 (zh)
EP (1) EP3510398A1 (zh)
CN (1) CN109964126B (zh)
WO (1) WO2018049418A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4148118A1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Yale University System, device and method for high-throughput multi-plexed detection
EP3227684B1 (en) 2014-12-03 2019-10-02 Isoplexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
US11353448B2 (en) 2015-02-13 2022-06-07 California Institute Of Technology Methods and compositions for quantifying metabolites and proteins from single cells
EP4036578A1 (en) 2016-11-11 2022-08-03 Isoplexis Corporation Compositions and methods for the simultaneous genomic, transcriptomic and proteomic analysis of single cells
EP3545284A4 (en) 2016-11-22 2020-07-01 Isoplexis Corporation SYSTEMS, DEVICES AND METHODS FOR CAPTURING CELLS AND MANUFACTURING METHODS THEREOF
WO2018187332A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Kite Pharma, Inc. Treatment using chimeric receptor t cells incorporating optimized polyfunctional t cells
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
CN110824158A (zh) * 2018-08-07 2020-02-21 上海恒润达生生物科技有限公司 一种检测cart细胞针对靶抗原细胞因子的分泌的方法
US20220348682A1 (en) 2018-08-30 2022-11-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
EP3864139A4 (en) * 2018-10-12 2022-08-31 Georgia Tech Research Corporation METHODS AND SYSTEMS FOR DYNAMIC PREDICTIVE MODELING AND INFLAMMATION CONTROL
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
WO2022178253A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 IsoPlexis Corporation Methods and devices for spatially resolved analysis of proteomic and genetic information

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419597A (zh) * 2000-02-24 2003-05-21 埃克斯西特治疗公司 细胞的同步刺激和富集

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
WO2010017559A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods and systems for predicting proteins that can be secreted into bodily fluids
US9409987B2 (en) * 2011-04-15 2016-08-09 Compugen Ltd Polypeptides and polynucleotides, and uses thereof for treatment of immune related disorders and cancer
US20190055519A1 (en) * 2014-07-14 2019-02-21 Neelam Krishman Venkataramanaa A method for the regeneration and differentiation of human perinephric fat derived mesenchymal stromal cells into astroglial, renal, neuronal and pancreatic progenitor cells
CA2963935A1 (en) * 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
EP3227684B1 (en) * 2014-12-03 2019-10-02 Isoplexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
KR20170109538A (ko) * 2014-12-05 2017-09-29 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 B-세포 성숙화 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체 및 그의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1419597A (zh) * 2000-02-24 2003-05-21 埃克斯西特治疗公司 细胞的同步刺激和富集

Also Published As

Publication number Publication date
CN109964126A (zh) 2019-07-02
US20230221328A1 (en) 2023-07-13
WO2018049418A1 (en) 2018-03-15
EP3510398A1 (en) 2019-07-17
US20200166518A1 (en) 2020-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109964126B (zh) 用于细胞治疗法和其他免疫治疗法的多重分析的***和方法
US20220017858A1 (en) Systems, devices and methods for identification, selective ablation, and selection and collection of single cells
JP6466397B2 (ja) 抗原特異的ｂ細胞の同定及び単離ならびに所望の抗原に対する抗体作製のプロトコール
CN108700582B (zh) 免疫突触的质量预测了嵌合抗原受体（car）t细胞的效能
JP2023502625A (ja) 共有新抗原を標的にする抗原結合タンパク質
US20210393691A1 (en) Process for producing genetically engineered t cells
SG171927A1 (en) Method for diagnosing allergic reactions
JP2007536522A (ja) Ｃｔｌの媒介による抗原提示細胞の溶解を検出するためのｍｈｃ架橋系
JPWO2018124005A1 (ja) 被験物質の免疫原性を評価する方法
Van Nuffel et al. Epitope and HLA-type independent monitoring of antigen-specific T-cells after treatment with dendritic cells presenting full-length tumor antigens
EP3417052B1 (en) Methods for expanding and differentiating b cells for producing antibody
CN114616467A (zh) 筛选原代人类细胞中的同源t细胞和表位反应性的高通量方法
Vasquez et al. Rapid proliferation and differentiation of a subset of circulating IgM memory B cells to a CpG/cytokine stimulus in vitro
AU2006269490B8 (en) Stable quantitation and detection of immune response levels with non-zero background peptides
JP6474788B2 (ja) 抗原特異的ｔ細胞応答を刺激するための方法
KR20180108585A (ko) T 세포 반응성 플랫폼
JP2022500674A (ja) 操作された細胞組成物のマススペクトロメトリー分析のための方法
CN113167786A (zh) 免疫细胞的分析方法及细胞分析装置
Balko et al. Cytotoxic T cells specific for alpha-myosin drive immunotherapy related myocarditis
Schäbitz et al. Low numbers of cytokine transcripts drive inflammatory skin diseases by initiating amplification cascades in localized epidermal clusters
CN111316098B (zh) 用于治疗的基于流动的测定
Effenberger Isolation, Characerization and Functional Re-Expression of T Cell Receptors with Therapeutic Value for Adoptive T Cell Therapy
Wiarda et al. Conserved B cell signaling, activation, and differentiation in porcine jejunal and ileal Peyer's patches despite distinct immune landscapes
CN117280213A (zh) 生物标志物
WO2011024458A1 (ja) 宿主対移植片疾患の検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant