CN109963589B - 抗-pd-l1抗体及变异体 - Google Patents

抗-pd-l1抗体及变异体 Download PDF

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Abstract

本发明提供抗‑PD‑L1抗体、其变异体、其突变体、及其抗原结合片段。亦提供编码抗‑PD‑L1抗体、其变异体、其突变体、或其抗原结合片段的经分离核酸分子，以及相关表达载体，及宿主细胞。提供制造抗‑PD‑L1抗体、其变异体、其突变体、及其抗原结合片段的方法。亦提供相关医药组合物及其使用于治疗个体的方法。

Description

抗-PD-L1抗体及变异体
交叉引用
本PCT国际申请要求于2016年10月30日提交的美国临时专利申请No.60/414,785的权益及优先权。所述申请的内容以参考文献的方式并入本文。
背景技术
程序性死亡配体(PD-L1)及程序性死亡配体2(PD-L2)表达于抗原提呈细胞以及许多人类癌症，且已显示在结合至PD-1时下调T细胞活化以及细胞因子分泌(Freeman etal.,2000；Latchman et al.,2001)。不同于CTLA-4，PD-1主要在活化的T-细胞遭遇由肿瘤及/或基质细胞所表达的免疫抑制性PD-L1(B7-H1)及PD-L2(B7-DC)配体的周边组织发挥功能(Flies et al.,2011；Topalian et al.,2012a)。PD-1/PD-L1相互作用的抑制在临床前模型中表明有效的抗肿瘤活性(美国专利第8,008,449号及第7,943,743号)，以及用于治疗癌症的PD-1/PD-L1相互作用的抗体抑制剂的使用已进入临床试验(Brahmer et al.,2010；Flies et al.,2011；Topalian et al.,2012b；Brahmer et al.,2012)。
PD-L1的上调可使癌症逃避宿主免疫***。虽然许多PD-L1抑制剂已被发展用于免疫-肿瘤学疗法且于临床试验显示良好结果。仍有需求发展直接对抗-PD-L1的抗癌症疗法。本发明符合此方面及其他的需求。
发明内容
本发明提供一种抗-PD-L1抗体及/或其抗原结合片段。一些具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL2抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL3抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL6抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL8抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL12抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL15抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含于SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明进一步包含抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，或其抗原结合片段。某些具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#3抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-19抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-H3；某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体的突变体包含CDR-12，该CDR12包含于N-糖基化位点的一个或多个突变。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-43抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-H3；某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体的突变体包含CDR-12，该CDR12包含于N-糖基化位点的一个或多个突变。
其他具体实施例中，本发明抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-54抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#4抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#5抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#39抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-H3。
各抗-PD-L1及其变异体/突变体的上述记载的CDRs(CDR-L1、-L2及-L3；以及CDR-H1、-H2及-H3)的氨基酸序列提供于下表1。
表1
Figure GDA0002062456120000061
Figure GDA0002062456120000071
一些具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体及其变异体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含选自SEQ ID NO:35-40、65-67、94、97及100的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含选自SEQ ID NO:41-43、68-70及106的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含选自SEQ ID NO:44-50、71-74、95、98及107的组中选择的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含选自SEQ ID NO:51-54、75及108的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含选自SEQ ID NO:55-58及76的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含选自SEQ ID NO:59-64、77-81、96、99、101及109的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明亦提供抗-PD-L1抗体、其变异体、或其抗原结合片段，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含选自SEQ ID NO:1-7、16、20、24、28、32、83、87、91或103的氨基酸序列；以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含选自SEQ ID NO:8-14、18、22、26、30、34、85、89、93或105的氨基酸序列。亦提供编码所述LC及HC区的核酸序列。
根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，本发明的抗体包含于可变区中的一个或多个CDR的N-糖基化位点的一个或多个突变。所得的去糖基化抗体区保留与亲代未去糖基化抗体相等功能性。
根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，抗体包含人类IgG的Fc片段。根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体(diabody)及线性抗体。根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，抗体为多特异性抗体。
根据(或应用于)上述任何一个具体例，抗-PD-L1抗体、其变异体或抗原结合片段，与治疗剂结合。根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，抗-PD-L1抗体、其变异体或抗原结合片段，与标记物结合。根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，该标记物选自放射性同位素、荧光染剂及酶。
根据(或应用于)上述任何一个具体实施例，本发明提供编码抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
根据(或应用于)上述任何具体实施例，亦提供编码该核酸分子的表达载体。根据(或应用于)上述任何具体实施例，亦提供包含该表达载体的细胞。
本发明亦提供制造抗体、其变异体或抗原结合片段的方法，该方法包括培养根据(或应用于)上述任何具体实施例的细胞以及自细胞培养物回收抗体或其抗原结合片段。
根据(或应用于)上述任何具体实施例，细胞为哺乳动物细胞。根据(或应用于)上述任何具体实施例，哺乳动物细胞为CHO细胞。根据(或应用于)上述任何具体实施例，细胞为稳定的哺乳动物细胞株。根据(或应用于)上述任何具体实施例，稳定的哺乳动物细胞株为CHO细胞株。
本发明提供组合物，该组合物包含根据(或应用于)上述任何具体例的抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体或抗原结合片段，以及医药上可接受的载体。
本发明提供于来自患者的样品中检测PD-L1蛋白质的方法，该方法包含使根据(或应用于)上述任何具体实施例的抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体或抗原结合片段与样品接触，以及检测结合至PD-L1蛋白质的抗-PD-L1抗体。根据(或应用于)上述任何具体实施例，抗-PD-L1抗体、其变异体或抗原结合片段，使用免疫组织化学检测(IHC)或使用于ELISA检测。
本申请还提供对个体治疗癌症的方法，该方法包含(或应用于)对该对象给予治疗有效量的根据上述任何具体实施例的组合物。
亦提供组合物，该组合物包含根据(或应用于)上述任何具体实施例的抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体或抗原结合片段，用以治疗癌症。
提供根据(或应用于)上述任何具体实施例的抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体或抗原结合片段的用途，用于制造用以治疗癌症的药物。
根据(或应用于)上述任何具体实施例，癌症选自黑色素瘤、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌及非小细胞肺癌(NSCLC))、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌及唾腺癌。
根据(或应用于)上述任何具体实施例，对个体进一步给予选治疗剂，抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂或细胞毒性剂。根据(或应用于)上述任何具体实施例，对个体进一步给予放射疗法。
附图说明
图1A-1B：选自先导物PL1、PL2、PL3、PL6、PL8、PL12、PL15的抗-PD-L1的轻链(A)及重链(B)的氨基酸序列比对图。在后续ELISA及流式细胞测量中对于人类PD-L1具有结合与阻断活性的7种经选择的抗体先导物，通过具有人类PD-L1_ECD-His的人类Fab天然噬菌体展示库的筛选而确定。然后将所述经选择的Fab序列克隆至人类IgG1Fc骨架的N297A突变体以成为全长抗体。图中列出抗体先导物的序列比对以及互补决定区(CDRs)用粗体及下加底线文字标识。
图2A-2B：经选择抗体对重组人类PD-L1/Fc融合蛋白质(第2A图)及活化CD3+T细胞(第2B图)的结合图。经选择的抗体通过ELISA测试其对重组人类PD-L1蛋白质的结合，以及通过流式细胞仪测试活化的CD3+T细胞。抗-PD-L1参照抗体及抗-PD-1参照抗体分别使用作为阳性对照及阴性对照。
图3：经选择的抗体对PD-1结合至PD-L1的阻断图。抗-PD-L1抗体使用流式细胞仪检测阻断PD-1结合至PD-L1表达的CHO-S细胞的能力。抗-PD-L1参照抗体及阿瓦斯汀(Avastin)分别作为阳性对照及阴性对照。抗-PD-L1单克隆抗体阻断PD-1和经PD-L1-转染的CHO-S细胞的结合，通过染色的平均荧光强度(MFI)测量。
图4A-4B：抗-PD-L1先导物于混合的白细胞反应(MLR)中对于细胞因子产生以及T细胞增殖的功效图。对抗人类PD-L1的单克隆抗体在混合的白细胞反应检测中增强IFN-γ分泌及T细胞增殖。抗-PD-L1参照抗体及抗-PD-1抗体作为阳性对照。阿瓦斯汀(抗-VEGF)使用作为阴性对照。4A图显示IFN-γ分泌的条状图；4B图显示在指定的抗体浓度中的CD3+T细胞增殖的条状图。
图5A-5B：PL2及PL3抗体在A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性图。小鼠(n＝4/群)皮下植入人类黑色素瘤细胞株A375及抗原-特异性T细胞(T细胞:癌细胞＝1:100)的混合物。测试的抗体自第0日每周二次腹膜内注射至小鼠。经PL2-处理的小鼠及经PL3-处理的小鼠的肿瘤生长曲线显示于第5A及5B图。所有数据点为平均±SEM。
图6：PL2变异体及PL3变异体于混合的白细胞反应中(MLR)对于细胞因子产生的效果。PL2变异体及PL3变异体于混合的白细胞反应中增强IL-2分泌。抗-PD-L1参照抗体及阿瓦斯汀分别作为阳性对照及阴性对照。6A图显示通过PL2亲代及变异体所诱发分泌的IL-2的条状图；6B图显示在PL3亲代及变异体的指定浓度的MLR中IL-2分泌的条状图。
图7A-7B：PL2及PL3顶级变异体(top variant)于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性图。小鼠(n＝4/群)皮下植入人类黑色素瘤细胞株A375及抗原-特异性T细胞(T细胞:癌细胞＝1:100)的混合物。测试的抗体自第0日每周二次腹膜内注射至小鼠。经PL2#3处理的小鼠及经PL3#7处理的小鼠的肿瘤生长曲线显示于图7A。第35日的个别肿瘤体积显示于图7B。所有数据点为平均±SEM。
图8A-8D：在混合的白细胞反应(MLR)中，PL2#3及PL3#7的不同IgG形式的药效。PL2#3及PL3#7的不同IgG形式使用MLR进行测试。阿瓦斯汀作为阴性对照抗体。通过测试抗体所诱发的IFN-γ及IL-2分泌的条状图分别显示于图8A及8B。图8C显示在各种抗体浓度中的CD4+T细胞增殖的条状图；图8D显示在指定抗体浓度的CD8+T细胞增殖的条状图。
图9A-9B：各种PL2#3及PL3#7IgG同型体在A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性图。图9A显示小鼠(n＝4/群)经不同IgG形式的PL2#3之处理后，第32天的个别肿瘤体积。天的经各种PL3#7IgG亚型(subclass)处理的小鼠(n＝4/群)在第32天的个别肿瘤体积显示于图9B。
图10：hPD1 KI小鼠中的PL2#3-mtIgG1抗体及PL3#7-mtIgG1抗体的肿瘤生长抑制活性图。敲入(konck-in)人类PD-1的(hPD1 KI)小鼠(n＝6/群)皮下植入MC38-huPD-L1(MC38经人类PD-L1转染)细胞。当肿瘤体积接近约86mm3时开始抗体处理。测试抗体每周二次腹膜内注射至小鼠持续3周。所有数据点为平均±SEM。
图11A-11B：抗-PD-L1顶级变异体的轻链(A)(分别为SEQ ID NOS 136-140，依照出现顺序)及重链(B)(分别为SEQ ID NOS 141-145，依照出现顺序)的氨基酸序列比对图。具有优异的较高亲和性以及优异功能活性的PL2顶级变异体(PL2#3)、PL3顶变异体(PL3#7)及PL3#7顶变异体(PL3#7-19、PL3#7-43、PL3#7-54)由活体外基于噬菌体展现的亲和性成熟试验而产生。一般而言，使用生物素化hPD-L1-His偶合至链霉亲合素磁珠
Figure GDA0002062456120000111
M-280进行筛选3次。然后由ELISA筛选顶级变异体的Fab并克隆至人类IgG1Fc骨架的N297A突变体以成为全长抗体。此处列出顶级变异体的序列比对以及CDRs(互补决定区)用粗体及下加底线文字标示。
图12A-12B：PL3#7变体于混合的白细胞反应(MLR)中对细胞因子产生及T细胞增殖的功效图。经修饰的PL3#7变体在混合的白细胞反应检测中增强IFN-γ分泌及CD8+T细胞增殖。抗-PD-L1参照抗体及阿瓦斯汀分别作为阳性对照及阴性对照。图12A显示IFN-γ分泌的条状图；图12B显示在指定抗体浓度中的CD8+T细胞增殖的条状图。
图13A-13C：PL2#3变体及PL3#7变体和PD-L1表达细胞的细胞表面的结合图。PL3#7变体通过流式细胞仪测试与活化T细胞(图13A)、A375人类黑色素瘤细胞株(图13B)及NCI-H292人类NSCLC细胞株(图13C)的细胞表面的结合。抗-PD-L1参照抗体及HLX01(抗-CD20mAb)分别作为阳性对照及阴性对照。
图14A-14B：PL2#3变体及PL3#7变体在NCI-H292/PBMC异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性图。小鼠(n＝4/群)皮下植入人类NSCLC细胞株NCI-H292及新鲜分离的人类PBMC(癌细胞(T):PBMC(E)＝3:1)的混合物。抗-PD-L1抗体自第0日每周二次腹膜内注射至小鼠。生长曲线显示于图14A。于第28天的个别肿瘤体积显示于图14B。所有数据点为平均±SEM。
图15A-15B：PL2#3变体及PL3#7变体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性图。小鼠(n＝4/群)皮下植入人类黑色素瘤细胞株A375及抗原-特异性T细胞(T细胞(E):癌细胞(T)＝1:100)的混合物。测试抗体自第0日每周二次腹膜内注射至小鼠。经mAb处理的小鼠的肿瘤生长曲线显示于图15A。在第31天的个别肿瘤体积显示于图15B。所有数据点为平均±SEM。
图16：抗人类PD-L1单克隆抗体对小鼠黑色素瘤细胞的交叉结合图。通过流式细胞仪测试PL2#3变体及PL3#7变体与小鼠PD-L1表达黑色素瘤细胞(B16-F10)的结合。抗-PD-L1参照抗体分别作为阳性及阴性对照。
图17A-17B：PL2#3变体(图17A)及PL3#7变体(图17B)与食蟹猴PD-L1的交叉结合图。通过ELISA测试PL2#3变体及PL3#7变体与重组食蟹猴
PD-L1_ECD Fc-融合蛋白质的结合。HLX01(抗-CD20mAb)作为阴性对照。所有数据点为三次重复的平均±SD。
图18：PL3#7-19变体及PL3#7-43变体的去糖基化版本的轻链可变区的氨基酸序列比对图(分别为SEQ ID NOS 20,24,111,113,115,28,117与119，依照出现顺序)。还列出所述去糖基化变体的轻链的序列比对，CDRs(互补决定区)用粗体及下加底线文字标示。所述变体的重链无改变且与其亲代变体相同(此处未显示序列比对)。
图19A-19B：PL3#7-19变体(图19A)及PL3#7-43变体(图19B)的去糖基化版本的全细胞结合图。以流式细胞仪测定所得的PL3#7-19(即PL3#7-19去糖基1、去糖基2、去糖基3)的三个去糖基化变体及PL3#7-43(即PL3#7-43去糖基1、去糖基2)的二个去糖基化变体与经PD-L1转染的CHO-S细胞的全细胞结合活性。此处所测试的所有去糖基化抗体变体为人类IgG1Fc骨架的N297A突变体。内部抗-PD-1抗体(亦即HLX10)作为阴性对照。
图20A-20B：PL3#7-19去糖基1及PL3#7-43去糖基2的不同的IgG同型体于混合的白细胞反应(MLR)中的功效。P3#7-19去糖基1及PL3#7-43去糖基2的不同IgG同型体使用MLR检测。HLX04及HLXC20(PL2#3)分别作为阳性对照及阴性对照。条状图显示测试抗体所诱发分泌的IFN-γ(A)及IL-2(B)。
图21A-21D：去糖基化的PL3#7-19变体及PL3#7-43变体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中肿瘤生长抑制活性。小鼠(n＝5/群)皮下植入人类黑色素瘤细胞株A375及抗原-特异性T细胞(T细胞:癌细胞＝1:100)的混合物。测试抗体自第0日每周二次腹膜内注射至小鼠。经去糖基化的PL3#7-19变体及PL3#7-43变体处理的小鼠的肿瘤生长分别显示于图21A及图21C。第28日的个别肿瘤体积分别显示于图21B及图21D。所有数据点为平均±SEM。图22A-22B：抗-PD-L1mAb加上抗-VEGF mAb在NSCLC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制活性图。小鼠(n＝5/群)皮下植入人类NSCLC细胞NCI-H292及新鲜分离的人类PBMC(癌细胞:PBMC＝3:1)的混合物。抗-PD-L1(PL2#3)及抗-VEGF(HLX04)抗体自第1日每周二次腹膜内注射至小鼠。肿瘤生长曲线显示于图22A。第21日的个别肿瘤体积显示于图22B。所有数据点为平均±SEM。
具体实施方式
本发明提供新颖的抗-PD-L1抗体、其变体、突变体及/或抗原结合片段。
本发明人已意外地发现某些抗-PD-L1抗体及其亲和性变体及/或突变体，增强T细胞分泌IL-2和IFNγ以及增强CD4+与CD8+T细胞的增殖。本文所公开的抗-PD-L1抗体，相较于已使用的治疗癌症的某些抗-PD-L1参照单克隆抗体，显现增强的药效及/或抗肿瘤活性。
本发明还提供所述新颖抗-PD-L1抗体的免疫接合物、编码新颖抗-PD-L1抗体的核酸、其亲和性变体或抗原结合片段，如本文所述，以及其组合物(如医药组合物)。本发明还提供使用新颖抗-PD-L1抗体、其亲和性变体及/或突变体、或抗原结合片段的方法，以检测样品(如活体或离体样品)中的PD-L1，使用包含该抗体、其变体及/或突变体、或其抗原结合片段的组合物，用于治疗癌症，以及所述抗体、其变体或抗原结合片段制造治疗癌症的药物的用途。
定义
在本文中使用的，「治疗」或「处理」为用于获得有利或期望的结果包括临床结果的方案。对于本发明的目的，有利或期望的临床结果包括，但不限于，下述之一或多种:缓和由疾病所造成的一或多种症状，缩小疾病的范围，稳定化疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分或全部)，减低一或多种其他药物治疗疾病所需的剂量，延迟疾病的进展，增加或改善生活质量，增加体重，及/或延长存活。「治疗」亦涵盖癌症的病理结果的降低(如，例如，肿瘤体积)。本文所提供的方法考虑治疗上述情况的一或多种。
用语「复发」、「再发」或「已再发」意指临床评估疾病消失后，癌症或疾病的回复。远处转移或局部复发的诊断可考虑为再发。
用语「难治性」或「阻抗性」意指癌症或疾病对于治疗已无响应。
用语「辅助性疗法」意指在通常为手术的主要疗法后所给予的治疗。对于癌症或疾病的辅助性疗法可包括免疫疗法、化学疗法、放射疗法、或荷尔蒙疗法。
用语「维持疗法」意指有助于维持先前疗法功效所给予的经计划的再治疗。维持疗法通常给予以助于保持癌症的缓解或延长对特定疗法的回应，而无关于疾病进展。
用语「浸润性癌症」意指已扩散超过组织层的癌症，并在正常的周围组织出现。浸润性可为或可不为转移性。
用语「非侵袭性癌症」意指非常早期的癌症或未扩散超过起始组织的癌症。
肿瘤学中用语「无进展的存活」意指治疗中或治疗后癌症不生长的时间长度。无进展的存活包括患者已经历完全反应或部分反应的时间量，及病患已经历稳定疾病的时间量。肿瘤学中用语「进展性疾病」可意指治疗开始，因肿瘤的质量增加或扩散，肿瘤生长超过20％。
「异常(disorder)」为可由抗体治疗的任何疾病状态。例如，哺乳动物罹患或需要预防异常PD-L1活性。包括慢性或急性异常或疾病，包括考虑哺乳动物易罹患异常的病理状况。本文中欲治疗的异常的非限制实例包括癌症(如头颈癌、喉癌、直肠癌、肺癌等)。
「肿瘤」，如使用于本文，意指所有赘生性细胞生长及增殖，无论为恶性或良性，以及所有癌前期及癌细胞及组织。
用语「抗体」用于最广义及具体地涵盖，例如，单克隆抗体(包括促效剂、拮抗剂、及中和抗体)、具有多抗原决定特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体、及抗体的片段(参照下文)，只要其特异性地结合天然多肽及/或显现本发明的生物活性或免疫活性。根据一个具体实施例，抗体结合至目标蛋白质的寡聚物型，例如三聚物型。根据另一具体实施例，抗体特异性地结合至蛋白质，该结合可受到本发明的单克隆抗体所抑制(例如，本发明所设置的抗体)。词组抗体的「功能性片段或类似物」为具有与所述的抗体相同的定性生物活性的化合物。例如，本发明的抗体的功能性片段或类似物可以是那些能特异性结合至PD-L1者。一个具体实施例中，该抗体可预防或实质上降低PD-L1诱发细胞增殖的能力。
「经分离抗体」为已从其天然环境的成分中经鉴定且经分离及/或经回收。其天然环境的污染成分为将干扰抗体的诊断用途或治疗用途的材料，且可包括酵素、荷尔蒙、以及其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。优选具体实施例中，抗体将经纯化至(1)通过Lowry方法测定时大于抗体的95％重量，且优选为大于99％重量，(2)使用转杯测序仪足以获得N-终端或中间氨基酸序列至少15个氨基酸残基的程度，或(3)使用考马西蓝(Coomassie blue)在还原或非还原条件下的SDS-PAGE为均质，或较佳为银染(silver stain)。由于抗体的天然环境的至少一个成分不具备，经分离抗体包括在重组细胞中的抗体原样。然而，传统地，经分离抗体通过至少一个纯化步骤而制备。
基础4-链抗体单元由二个相同轻(L)链及二个相同重(H)链所组成的异源四聚物性糖蛋白所组成(IgM抗体由5个基础的异源四聚物与称为J链的额外的多肽所组成，且因此含有10个抗原结合位点，而分泌的IgA抗体可聚合以形成包含2至5个基础4-链单元与J链的多价装配polyvalent assemblages)。IgG的情况中，4-链单元通常约150,000道耳顿(Dalton)。各L链由一个共价双硫键连结至H链，而二个H链根据H链同型体而由一或多个双硫键彼此连结。各H及L链亦具有规律空间结构的链间双硫键。各α及γ链的H链在N-端具有可变区(VH)，并连接有3个恒定区(CH)，对于μ及ε同型体具有四个CH区。各L在N-终端具有可变区(VL)、于其另一端接着恒定区(CL)。VL对准VH及CL对准重链的第一恒定区(CH1)。相信特定的氨基酸残基形成轻链可变区与重链可变区之间的接口。成对的VH与VL一起形成单一抗原结合位点。对于抗体的不同类型的结构与性质，参照Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,page 71and Chapter 6。
来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定区的氨基酸序列，指定为二种清楚区别类型之一，称为κ及λ。根据重链的恒定区的氨基酸序列(CH)，免疫球蛋白可指定为不同类型或同型体。有五种类型的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，分别具有指定为α、δ、δ、ε及μ的重链。该γ及α类型基于CH序列及功能的相对微小差异进一步分为亚类型，例如，人类表现下列亚类型:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
用语「可变」意指抗体中可变区的某些节段在序列上显著地不同。V区调节抗原结合及定义其特定抗原的特定抗体的特异性。然而，该可变性于可变区的110-氨基酸跨距中并非均匀分布。替代地，由15至30个氨基酸称为框架区(FR)，相对非可变拉伸物所组成的V区，与各为9至12个氨基酸长的称为「高可变区」的极端可变性的较短区所分开。天然重链及轻链之可变区各包含四个FR、大幅采用β-片构型，由三个高可变区连接，其形成环连接，且于某些情况中，形成部份的β-片结构。各链中的高可变区系藉由FR相近接近，自其他链与该高可变区维持在一起，而有助于抗体之抗体结合位点的形成(参照Kabat et al.,Sequenceof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定区不直接涉及结合抗体至抗原，但显现各种起效子功能，如抗体相关于细胞之细胞毒性依赖性的抗体(ADCC)。
如使用于本文，用语「CDR」或「互补决定区」意指可见于重链多肽及轻链多肽的可变区的非连续的抗原组合位点。该特定区已公开于Kabat et al.,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,“Sequences ofproteins of immunological interest”(1991)；by Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；and MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中当彼此相对比较时该定义包括氨基酸残基的重迭或亚类。然而，所述抗体或经接枝抗体或其变体的CDR的任一定义的应用，意图涵盖本文所定义的用语及本文的用途的范畴。涵括如上述引用文献所定义的CDR的氨基酸残基列于下表2作为比较。
表2
Figure GDA0002062456120000161
用语「单克隆抗体」如使用于本文，意指来源于实质上为同源抗体的群体所获得的抗体，亦即，除了可存在微小量的天然发生的突变以外之包含相同族群的个别抗体。单克隆抗体为高度特异性，直接针对单一抗原性位点。再者，相对于包括直接针对不同决定物(抗原决定基)之不同抗体的多克隆抗体制剂，各单克隆抗体是直接针对抗原的单一决定子。除了其特异性外，单克隆抗体有利于其可不受其他抗体污染而合成。改质剂「单克隆」非解释为如抗体制造所需藉由任何特定方法。例如，适用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备，该杂交瘤方法首先揭示于Kohler et al.,Nature.256:495(1975)，或于细菌、真核动物细胞或植物细胞中使用重组DNA方法而制备(参照美国专利第4,816,567号)。「单克隆抗体」的制备也可使用例如揭示于Clacksin et al.,Nature,352:624-628(1991),Markset al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1981)，以及下述实施例的技术，自噬菌体抗体库分离。
本文的单克隆抗体包括「嵌合」抗体，其中重链及/或轻链的部份相同或同源于衍生自特定物种的抗体或属于特定抗体类型或亚类型的对应序列，而其余链同于或同源于衍生自另一物种的抗体或属于另一抗体类型或亚类型的对应序列，以及所述抗体的片段，只要其显现本发明的生物活性(参照美国专利第4,816,567号；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括「灵长化」抗体，包括衍生自非人类的灵长类(例如，旧世界猴，人猿等)的可变区抗原-结合序列，以及人类恒定区序列。「完整」抗体包含抗结合位点以及CL与至少重链恒定区CH1、CH2及CH3。恒定区可为天然恒定区(例如，人类天然序列恒定区)或其氨基酸序列变异体。较佳地，完整抗体具有一或多种效应子功能。
「抗体片段」包含完整抗体的一部份，较佳地为完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；双功能性抗体；线性抗体(参照美国专利5,641,870号专利，实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子；以及由抗体片段所形成的多特异性抗体。表达「线性抗体」通常指揭示于Zapataet al.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)的抗体。简明地，所述抗体包括一对串联Fd节段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽形成一对抗原结合区。线性抗体可为双特异性或单特异性。
抗体的木瓜酵素分解产生二个相同的抗原结合片段，称为「Fab」片段，以及残余的「Fc」片段，命名反映容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链与H链的可变区(VH)区域，以及重链的第一恒定区(CH1)所组成。就抗原结合而言，各Fab片段为单价，亦即，其具有单一的抗原结合位点。抗体的胰蛋白酶处理生成单一大的F(ab’)2片段，其粗略地对应于具有二价抗原结合活性的二个双硫键连接的片段且仍能交联抗原。Fab’片段不同于片段Fab片段之处在于CH1的羧基终端具有额外的少数残基，包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。Fab’-SH于本文指恒定区的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’。最初产生的F(ab’)2抗体片段为一对中间具有铰链半胱氨酸的Fab’。亦已知抗体片段的其他化学偶合。
Fc片段包含通过双硫键维持在一起的H链的羧基-终端部份。抗体的效应功能由Fc区中的序列决定，该区也是可被某些类型的细胞的Fc受体(FcR)识别的部分。
「变异体Fc区」包含氨基酸序列，其不同于依赖本文所定义的至少一「氨基酸修饰」的天然序列Fc区者。较佳地，相较于天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区，变异体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，由约一至约十个氨基酸取代，以及较佳地由约一至约五个氨基酸取代天然序列Fc区或亲代多肽的Fc区。一个具体实施例中，本文的变异体Fc区，与天然序列Fc区，将具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。根据其他具体实施例，本文的变异体Fc区，与亲代多肽的Fc区，将具有至少约80％同源性、至少约85％同源性、至少约90％同源性、至少约95％同源性或至少约99％同源性。
用语「包含Fc区的多肽」意指多肽，如抗体或免疫黏附素(参照本文另一处的定义)，其包含Fc区。该Fc区的C-终端赖氨酸(根据EU编号***之残基447)可被移除，例如，在通过重组工程该编码多肽的核酸的多肽纯化期间。因此，包含具有根据本发明的Fc区的多肽的组成物，该多肽包括抗体，可包含具有所有K447残基被移除的多肽群体，不具有K447残基被移除的多肽群体或具有或不具有K447残基被移除的多肽的混合物的多肽群体。
抗体「效应功能」意指可归因于抗体的Fc区(Fc区的天然序列或氨基酸变异体Fc区)的所述生物活性，且依抗体同型体变化。抗体效应功能的实例包括:C1q结合及互补依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞媒介细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调；以及B细胞活化。「天然序列Fc区」包含与天然可见的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。Fc序列的实例揭示于，例如，但不限于，Kabat et.Al.,Sequences ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Md.(1991))。
「Fv」为含有完整抗原-识别及-结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密非共价相连的一重链及一轻链可变区区域的二聚物所组成。由该二区的折迭折出有助于抗原结合的氨基酸残基及对抗体赋予抗原结合特异性的六个高可变环(各来自H连及L链的3个环)。
然而，即便单一可变区(或仅包含特异于抗原之三个CDR的Fv的一半)具有识别与结合抗原的能力，然而相较于完整的结合位点仍为较低亲和性。
「单链Fv」亦简称为「sFv」或「scFv」，为包含VH及VL抗体区经连接至单一多肽链的抗体片段。较佳地，sFv多肽进一步包含介于VH及VL区之间的多肽连结基，其使得sFv形成对于抗原结合的所期望的结构。对于sFv的总结，参照Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Spring-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995,infra。
用语「双功能抗体」意指小的抗体片段通过构筑sFv片段(参照前文段落)与介于VH及VL区之间的连结基(约5至10个残基)而达成V区的链间而非链内的成对，形成二价片段，亦即具有二个抗原结合位点的片段。双特异性双功能抗体为二个「交联」sFv片段的异源二聚物，其中二个抗体的VH及VL区呈现于不同的多肽链。双功能抗体更完全地公开于，例如，欧洲专利第404,097号；世界专利WO 93/11161；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90:6444-6448(1993)。
非人类(例如，啮齿动物)抗体的「经人源化」形式为含有衍生自非人类抗体的最少序列的嵌合抗体。对于多数而言，经人源化抗体为人类免疫球蛋白(接受者抗体)的高可变区的残基经非人类物种(捐赠者抗体)的高可变区的残基所置换，该非人类物种包括例如小鼠、大鼠、兔、或具有所期望的抗体特异性、亲和性及能力的非人类灵长类。某些情况中，该人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基由对应的非人类残基所置换。
再者，经人源化抗体可包含未见于接受者抗体或捐赠者抗体的残基。这些修饰是为了进一步改良抗体表现。一般而言，经人源化抗体将包含实质上所有可变区的至少一个，及典型为二个的可变区，其中所有或实质上所有的高可变环对应于非人类免疫球蛋白，以及所有或实质上所有FR为人类免疫球蛋白序列。经人源化抗体视需要亦包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部份，典型地为人类免疫球蛋白。对于进一步详细内容，参照Jones etal.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-593(1992)。
「百分比(％)氨基酸序列同一性」或「同源性」关于本文所鉴定的多肽及抗体序列定义为氨基酸序列残基于候选序列的百分比，该候选序列与比较的多肽中的氨基酸残基相同，在考虑任何保留取代作为部分序列同一性而比对序列之后。用于决定百分比氨基酸序列同一性的比对可以所属技术领域所习知的多种方式达成，举例而言，使用公众可取得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属技术领域中具有通常知识者可决定用于测量对准的合适参数，包括于比较的全长序列达成最大比对所需要的任何演算。对于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比对计算机程序ALIGN-2所产生。ALIGN-2序列比对计算机程序由Genetech公司授权，以及启动原始码已于华盛顿特区，20559，美国著作权办公室以使用者建档存档，于该处登记为美国著作权注册号TXU510087。ALIGN-2程序经由加州南旧金山的Genetech公司为公众可取得。ALIGN-2程序应遵循使用于UNIX操作***，较佳为数为UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序而设定且不变换。
用语「Fc受体」或「FcR」用于描述结合至抗体的Fc区的受体。一具体实施例中，本发明的FcR为结合IgG抗体者(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚型的受体，包括等位基因变异体及该类受体的替代性剪切型。FcγRII受体包括FcγRIIA(「活化受体」)及FcγRIIB(「抑制受体」)，其具有类似的氨基酸序列而主要不同于其细胞质域。活化受体FcγRIIA于其细胞质域含有免疫受体酪氨酸系活化模体(ITAM)。抑制受体FcγRIIB于其细胞质域含有免疫受体酪氨酸系抑制模体(ITIM)(参照总论于M.in
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Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。该用语包括同种异型，如FcγRIIIA同种异型:FcγRIIIA-Phe158、FcγRIIIA-Val158、FcγRIIA-R131及/或FcγRIIA-H131。FcR总结于Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods4:25-34(1994)；及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其他的FcR，包括将于未来被定义者，涵盖于本文的用语「FcR」。该用语亦包括新生儿受体，FcRn，其负责转移母系IgG至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)及Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
用语「FcRn」意指新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn为结构上类似于主要组织兼容复合体(MHC)且由非共价性结合至β2-微球蛋白的α-链所组成。新生儿Fc受体FcRn的多重功能总结于Ghetie and Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766。FcRn发挥作用于免疫球蛋白IgG自母体至幼体的被动传输及血清IgG浓度的调节。FcRn可作为救援受体，在细胞内及跨细胞以完整形式结合及输送胞饮化IgG，，以及自内定的降解途径将其援救。
人类IgG Fc区的「CH1区」(亦指称为「C1」或「H1」区)通常由约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号***)。
「铰链区」通常定义为由人类IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其他IgG同型体之铰链区可通过将于相同位置形成重链间S-S键的第1及最后半胱氨酸残基置放而与IgG1序列对准。
Fc区的「较低铰链区」通常定义为紧接于铰链区C-终端残基的延伸，亦即，Fc区的残基233至239。于先前的报告中，FcRn结合通常归因于IgG Fc区的较低铰链区的氨基酸残基。
人类IgG Fc区的「CH2区」(亦指称为「C2」或「H2」区)通常由约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2区独特在于其不与另一区接近成对。相反地，两个N连接的分支糖链间插于完整天然IgG分子的两个CH2域之间。已推测该糖可取代区-区的成对且有助于CH2区的稳定。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。
「CH3区」(亦指称为「C2」或「H3」区)包含Fc区中残基C-终端对CH2区的延伸(亦即，自约氨基酸残基341至抗体序列的C-终端末，典型地于IgG的氨基酸残基446或447)。
「功能性Fc区」具有天然序列Fc区的「效应子功能」。例示性「效应子功能」包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞-媒介细胞毒性(ADCC)；巨噬作用；细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体；BCR)等。该等效应子功能通常需要Fc区与结合区(例如，抗体可变区)组合且可使用，例如，本文所揭示的各种检测予以评估。
「C1q」为多肽，其包括对于免疫球蛋白Fc区的结合位点。C1q与二个丝氨酸蛋白酶，C1r及C1s，形成复合体C1，其为补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第1个组成。人类C1q可自，例如，加州旧金山的Quidel公司，商业购得。用语「结合区」意指结合至另一分子的多肽区。FcRT的情况中，结合区可包含其多肽链的一部份(例如，其α链)，其负责结合Fc区。一个有用的结合区为FcRα链的胞外区。
具有「改变的」FcR结合亲和性或ADCC活性的变异体IgG Fc的抗体，相较于亲代多肽或包含天然序列Fc区具有增强的或减少的FcR(例如，FcγR或FcRn)结合活性及/或ADCC活性者。其「显现增强的结合」至FcR的变异体Fc，相较于亲代多肽或天然序列IgG Fc，以较高亲和性(例如，明显较低的Kd或IC50值)结合至少一个FcR。根据某些具体实施例，相较于亲代多肽，结合改良约3倍，较佳约5、10、25、50、60、100、150、200、多达500倍，或约25％至1000％结合改进。其「显现降低的结合」至FcR的多肽变异体，相较于亲代多肽，以较低亲和性(例如明显较高的Kd或IC50值)结合至少一个FcR。相较于亲代多肽，结合降低可为约40％或更多的结合降低。
「抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性」或「ADCC」意思指细胞毒性形式，其中分泌的Ig经结合的Fc受体(FcR)显示于某细胞毒性细胞(例如，天然杀手(NK)细胞、嗜中性球及巨噬细胞)使得这些细胞毒性效应子细胞特异性地结合至抗原附载目标细胞以及后续地以细胞毒素杀死目标细胞。抗体「装备」细胞毒性细胞为这种致死所绝对需要的。用于介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。于造血细胞的FcR表现总结于Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的464页表3。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行活体外ADCC检测，如美国专利第5,500,362号及第5,821,337号或下文实施例所揭示的。对于这类检测有用的效应子细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)及天然杀手(NK)细胞。替代地，或额外地，感兴趣分子的ADCC活性，可于例如揭示于Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)的动物模型中，于活体内评估。
当具有变异体Fc区的多肽的量与具有野生型Fc区(或亲代多肽)的量于检测中为基本上相同时，在人类效应子细胞存在下，比具有野生型IgG Fc的多肽或亲代多肽更有效地「显示增加的ADCC」或介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的包含变体Fc区的多肽在活体外或活体内大体上更有效介导ADCC的多肽。一般而言，所述变异体将使用所属技术领域习知的活体外ADCC检测予以鉴定，如用于决定ADCC活性的检测或方法，例如于动物模型中等。一具体实施例中，相较野生型Fc(或亲代多肽)，较佳变异体为约5倍至约100倍，例如，约25至约50倍，更有效于介导ADCC。
「补体依赖性细胞毒性」或「CDC」意思指于补体存在下的目标细胞的裂解。典型补体途径的活化是由补体***的第1补体(C1q)与已结合至其同源抗体的(合适亚型的)抗体的结合而起始。为了评估补体活化，可进行CDC检测，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)所公开的。具有改变的Fc区氨基酸序列以及增加的或减低的C1q结合能力的多肽变异体揭示于美国专利第6,194,551B1号及世界专利WO 99/51642。所述专利文献的内容通过参考方式具体地并入本文。亦参照Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。如揭示于本文的抗-PD-L1抗体(或其片段)或组合物的「有效量」为足以进行具体所陈述目的的量。「有效量」可实验性地以及通过相关于所陈述目的的熟知方法而测定。用语「治疗有效量」意思指如本文所揭示的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)或组合物的量，有效于哺乳动物「治疗」疾病或疾患。癌症情况中，如本文所揭示的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)或组合物的治疗有效量，可降低癌细胞数；降低肿瘤的尺寸或重量；抑制(亦即，减缓至某程度以及较佳为中止)癌细胞增殖至周边器官；抑制(亦即，减缓至某程度以及较佳为中止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长至某程度；及/或缓解与癌相关症状之一或多种至某程度。至如本文所揭示的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)或组合物可预防生长及/或杀死现存癌细胞的程度，其可为细胞增殖抑制及/或细胞毒性。一具体实施例中，治疗有效量为生长抑制量。另一具体实施例中，治疗有效量为延伸患者存活的量。另一具体实施例中，治疗有效量为促进患者存活而无进展(progression)的量。
如本发明揭示于本文的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)或组合物的「生长抑制量」为能抑制细胞，特别是肿瘤，例如癌细胞，活体外或活体内，生长的量。抑制赘生性本细胞生长目的的本发明的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的「生长抑制量」，可实验性及通过已知方法或通过本文所提供的实施例予以测定。
本发明的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)的「细胞毒性量」，为能引起细胞、特别是肿瘤，例如癌细胞，活体外或活体内破坏的量。抑制赘生性细胞生长目的的本发明的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的「细胞毒性量」，可实验性及通过已知方法或由本文所提供的实施例予以测定。
本发明的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)或组合物的「生长抑制量」为能抑制细胞，特别是肿瘤，例如癌细胞，活体外或活体内，生长的量。抑制赘生性本细胞生长目的的本发明的多肽、抗体、拮抗剂或组合物的「生长抑制量」，可实验性及由已知方法或通过本文所提供的实施例予以测定。
如使用于本文，「医药可接受」或「医药可相容」指材料并非在生物学上或其他方面不适宜的，例如，材料可并入投药至患者的医药组合物而不引起任何显著的非期望的生物效果或以不佳的方式与组合物所包含的其他任何成分交互作用。医药上可接受载剂或赋形剂优选地具有符合毒物学要求标准及制造测试及/或包括于美国食品药物管理局所制备的非活性成分准则。
用语「检测」指包括测定物质的存在或不存在或者定量物质(如PD-L1)的量。因此该用语意思指本发明的材料、组合物及方法的用途，用于定性及定量测定物。一般而言，对于实施本发明用于检测所使用的特定技术非重点。
例如，根据本发明的「检测」可包括:观察PD-L1基因产物、mRNA分子或PD-L1多肽的存在或不存在；PD-L1多肽或结合至目标的量的程度变化；PD-L1多肽的生物功能/活性的变化。一些具体实施例中，「检测」可包括检测野生型PD-L1的程度(例如，mRNA或多肽程度)。当相比于对照时，检测可包括定量介于10％及90％之间任何值，或介于30％及60％之间任何值，或超过100％的变化(增加或减少)。
当「标记」使用于本文时，指直接地或间接地接合至抗体的可检测化合物或组合物。标记本身可通过其而检测(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记物的情况下，可催化可检测的基质化合物或组合物的化学改变。
关于本文的「约」值或参数指对于个别值容易地为所属技术领域中具有通常知识人员所知的一般的误差范围。关于本文的「约」值或参数包括(及叙述)直接关于该值或参数本身的状态。例如，关于「约X」的叙述包括「X」的叙述。
应了解揭示于本文本发明的状态及具体实施例包括「包含」、「由其所组成」以及「主要由其所组成」的状态及具体实施例。
本文所引用的所有参考文献，包括专利申请及公开，皆以参考方式将其全部内容并入本文。
抗-PD-L1抗体及亲和性变异体/突变体
本发明基于结合PD-L1受体(PD-L1)的新颖抗体的鉴定。抗-PD-L1抗体，以及其亲和性变异体及/或突变体，或其抗原结合片段，可使用于各种治疗及诊断方法。例如，抗-PD-L1抗体及其亲和性变异体及/或突变体或其抗原结合片段，可单独使用或与其他药剂组合，用于治疗特征为异常PD-L1表达或异常PD-L1活性的疾病，包括，例如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC))、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、乳腺癌、子***、甲状腺癌。本文所提供的抗体亦可使用于检测患者或患者样品中的PD-L1蛋白质，通过对患者投与抗-PD-L1抗体，及/或其亲和性变异体/突变体或其抗原结合片段，以及检测来自患者的样品(例如，活体外或离体)中结合至PD-L1蛋白质的抗-PD-L1抗体，及/或其变异体/突变体或其抗原结合片段，或者将抗-PD-L1抗体，及/或其亲和性变异体/突变体或其抗原结合片段，与来自患者的样品接触，以及定性地或定量地检测结合至PD-L1蛋白质的抗-PD-L1抗体，及/或其亲和性变异体/突变体或其抗原结合片段。
已知分化274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)的群体的程序性死亡配体1(PD-L1)，在人类中是由CD274(PD-L1)基因所编码的蛋白质。PD-L1为第1型穿膜蛋白质且于特定事件期间发挥作用于抑制免疫***，如妊娠、组织同种异体移植、自体免疫疾病及如肝炎的其他疾病状态。PD-L1对PD-1或B7.1的结合，传输抑制信号，该信号降低***CD8+T细胞的增殖以及作为补充地，PD-L1进一步通过调低的基因Bcl-2来调节细胞凋亡从而调控***的外来抗原特异性T细胞的累积。
抗-PD-L1抗体是以充分的亲和性及特异性结合至PD-L1的抗体。较佳地，本文所提供的抗-PD-L1抗体(或其变异体或其抗原结合片段)可使用作为治疗剂用于靶向及干扰涉及PD-L1活性的疾病或状况。抗-PD-L1抗体(或其变异体/突变体或其抗原结合片段)通常将不结合至其他免疫球蛋白超级家族。较佳地，抗-PD-L1抗体(或其变异体/突变体或其抗原结合片段)为人类或重组人源化抗-PD-L1单克隆抗体。
根据某具体实施例，抗-PD-L1抗体包含本文所揭示抗体的任一个的CDR、可变重链区、及/或可变轻链区。
本发明提供抗-PD-L1抗体、其亲和性变异体/突变体、及/或其抗原结合片段。某些具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL2抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL3抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL6抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL8抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明之抗-PD-L1抗体，亦即PL12抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体，亦即PL15抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明提供记载于本文的重链及轻链可变区与CDR，是组合所有可能的配对组合以制造为数众多的抗-PD-L1抗体。某些具体实施例中，氨基酸取代为保守性取代。某些具体实施例中，氨基酸取代实质上不降低抗体结合至抗原的能力。例如，可制备实质上不降低PD-L1结合亲和性的保守性替换(例如，本文所提供的保守性取代)。抗-PD-L1抗体变异体的结合亲和性可使用下文实施例所揭示的方法评估。
保守性取代显示于表3，标注为「保守性取代」下。更多的实质改变提供于表3，标注为「示例性取代」下，以及参照氨基酸侧链类型进一步显示于下文。氨基酸取代可经导入至感兴趣的抗体以及根据所期望的活性筛选产物，例如，保持/改良PD-L1结合、减低的免疫原性、或改良的ADCC或CDC。
表3:保守性取代
原始残基 示例性取代 较佳取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Norleucine Leu
Leu(L) Norleucine；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；Norleucine Leu
非保守性取代将意味着交换所述类型的一种为另一类型。示例性取代变异体为亲和性成熟抗体，例如，其可使用基于如揭示于本文的亲和性成熟技术的噬菌体展现库，便利地制得。简明地，一或多个CDR是经突变以及该变异体抗体展现于噬菌体且根据对于特定生物的活性筛选(例如，结合亲和性)。替换(例如，取代)可从HVR中得到，例如，改良抗体亲和性。这类替换可从HVR「热点」得到，亦即由体细胞成熟过程期间以高频率进行突变的密码子所编码的残基(参照，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，及/或SDR(a-CDR)，所得变异体VH或VC经测试结合亲和性。来自二级库的通过构筑及再选择的亲和性成熟已公开，例如，Hoogenboom et al.,in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,(2001)。
亲和性成熟的一些具体实施例中，多样性经导入至通过任何多种方法选择用于成熟的可变基因(例如，易错(error-prone)PCR、链改组(chain shuffling)或寡核苷酸导向突变(oligonucleotide-directed mutagenesis)。然后创建二级库。然后该库经筛选以鉴定具有所期望的亲和性的任何抗体变异体。导入多样性的另一方法涉及HVR-导向方案，其中数重HVRF残基(例如，一次4-6残基)经随机化。HVR涉及抗原结合的HVR残基可特异性地鉴定，例如，使用丙氨酸扫描突变或模型化。
本发明进一步提供抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，或其抗原结合片段。某些具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#3抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明之抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明之抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-19抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-H3。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体的突变体包含CDR-12，该CDR12包含于N-糖基化位点的一个或多个突变。某些具体实施例中，该糖基化位点在CDR-L2区中，例如，序列段N-X-S/T。在序列段N-X-S/T具有一个或多个突变的抗-PD-L1抗体清除N-糖基化位点但仍有相等功能。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-43抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-H3。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体的突变体包含CDR-12，该CDR12包含于N-糖基化位点的一个或多个突变。某些具体实施例中，该糖基化位点位于CDR-L2区中，例如，于序列段N-X-S/T。于序列段N-X-S/T具有一个或多个突变的抗-PD-L1抗体移除N-糖基化位点但仍有相等功能。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#7-54抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#4抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#5抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL2#39抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H3。
其他具体实施例中，本发明的抗-PD-L1抗体变异体及/或突变体，亦即PL3#1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L3
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2:及
(3)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明提供记载于本文的重链及轻链可变区与CDR，是所有可能的配对组合的组合以制造为数众多的抗-PD-L1抗体。
一些具体实施例中，本发明提供抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，包含轻链可变区(VL)序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含选自SEQ ID NO:35-40、65-67、94、97及100的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含选自SEQ ID NO:41-43、68-70及106的胺氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含选自SEQ ID NO:44-50、71-74、95、98及107氨基酸序列的CDR-L3；以及重链可变区(VH)序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含选自SEQ ID NO:51-54、75及108的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含选自SEQ ID NO:55-58及76的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含选自SEQ ID NO:59-64、77-81、96、99、101及109的氨基酸序列的CDR-H3。
本发明亦提供抗-PD-L1抗体、其变异体及/或突变体、或其抗原结合片段，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含SEQ ID NO:1-7、16、20、24、28、32、83、87、91或103的氨基酸序列；以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含SEQ ID NO:8-14、18、22、26、30、34、85、89、93或105的氨基酸序列。亦提供编码该等LC及HC区的核酸序列。重链及轻链可变区是所有可能的成对组合的组合以制造为数众多的抗-PD-L1抗体及/或其变异体。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体、其变异体或突变体、或其抗原结合片段，于重链或轻链可变区可缺乏N-糖基化模体，而这将于一批的抗体中引起差异，造成改变的功能、免疫原性或稳定性。分析抗体糖基化的方法包括，但不限于，例如，层析(如阳离子层析(CEX)或液体层析)、质谱法(如电洒离子化质谱法)、及毛细管电泳-十二碳硫酸钠。该等方法公开于，例如，Jung et al.,(2011)Curr Op Biotechnol.22(6):858-67；Cummings RD,Etzler ME.Antibodies and Lectins in Glycen Analysis.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD,et al.,editors.Essentials of Glycobiology.2nd edition.Cold SpringHarbor(NY):Cold Spring Harbor Laboratory Press；2009.Chapter45；Mulloy B,HartGW,Stanley P.Structural Analysis of Glycans.In:Varki A,Cummings RD,Esko JD etal.,editors.Essentials of Glycobiology.2nd edition.Cold Sprinf Harbor(NY):ColdSpring Harbor Laboratory Press；2009Chapter 47；Leymarie et al.(2012)AnalChem.84(7):3040-3048；Fernandez(2005)Euproean Biopharmaceutical Review.Pp 106-110；and Raju,T.(2013)Methods Mol Biol.988:169-180。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体、其变异体及/或突变体、或其抗原结合片段，相比于其对PD-L1同源物所具有的结合亲和性，对于PD-L1配体具有较强的结合亲和性。通常，抗-PD-L1抗体、及/或其变异体或抗原结合片段，「特异性地结合」至PD-L1(亦即，具有结合亲和性(Kd)值不大于1×10-7M，较佳不大于1×10-8M及更佳不大于1×10-9M)但对于PD-L1家族成员具有结合亲和性为至少约50倍、或至少约500倍或至少约1000倍较弱于对于PD-L1的结合亲和性。特异性地结合至PD-L1的抗-PD-L1抗体可为如上述抗体的多种类型的任一个，但较佳为人源化抗体或人类抗体。
一些具体实施例中，抗-PD-L1抗体对非目标蛋白质的结合程度，小于约10％的该抗体对PD-L1的结合，如通过所属技术领域熟知的方法所测定，该方法如ELISA、荧光活化细胞分选(FACS)分析、或放射免疫沉淀(RIA)。特异性结合，例如，和分子的结合可通过比较测定对照分子的结合而测量，该对照分子通常为不具有结合亲和性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于目标的对照分子的竞争而测定，例如，过剩的非标记目标。此情况中，特异性结合指示经标记目标对探针的结合由过剩的非标记目标竞争性地抑制。如使用于本文，用语「特异性结合」或「特异性结合至」或为「特异性于」特定的多肽或于特定多肽目标的抗原决定基，例如，可通过分子而展现，该分子对于目标的Kd至少约10-4M、替代地至少约10-5M、替代地至少约10-6M、替代地至少约10-57M、替代地至少约10-8M、替代地至少约10- 9M、替代地至少约10-10M、替代地至少约10-11M、替代地至少约10-12M、或更大。一具体实施例中，用语「特异性结合」指结合，其中分子结合至特定多肽或特定多肽的抗原决定基而不实质上结合至任何其他多肽或多肽抗原决定基。
抗体-依赖性细胞-介导细胞毒性(ADCC)为一种治疗抗体对抗肿瘤细胞的作用机制。ADCC为细胞-介导免疫防护***，通过此***的效应子细胞活性地裂解目标细胞(例如，癌细胞)，其膜表面抗原已被特异性抗体(例如，本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或亲和性变异体)结合。一些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或亲和性变异体显现类似于参照抗-PD-L1单克隆抗体的抗体-依赖性细胞-介导细胞毒性(ADCC)效应子功能，如同，例如由实施例所公开的检测所测定。
例如，某些具体实施例中，本申请所公开的抗-PD-L1抗体及/或其亲和性变异体或突变体的ADCC效应子功能为参照抗-PD-L1抗体的ADCC效应子功能活性的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约100％、或多于100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、或约130％)，包括介于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其亲和性变异体或突变体对于PD-L1表现类似于参照抗-PD-L1抗体的结合亲和性。某些具体实施例中，结合至PD-L1是由ELISA展示，如实施例所示。例如，抗-PD-L1及/或其变异体或突变体对于PD-L1的结合亲和性，为约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或超过100％(例如，约105％、约106％、约107％、约108％、约109％、约110％、约111％、约112％、约113％、约114％、约115％、约116％、约117％、约118％、约119％、约120％、约121％、约122％、约123％、约124％、约125％、或超过125％)较高于参照抗-PD-L1抗体对于PD-L1的结合亲和性。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其亲和性变异体或突变体结合人类PD-L1的Kd介于约0.1pM至200pM(0.2nM)，例如，约0.1pM、约0.25pM、约0.5pM、约0.75pM、约1pM、约5pM、约10pM、约20pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约80pM、约90pM、约100pM、约110pM、约120pM、约130pM、约140pM、约150pM、约160pM、约170pM、约180pM、约190pM、或超过约190pM，包括介于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体对于PD-L1的结合亲和性为约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、或超过100％(例如，约105％、约110％、约120％、或约130％)较高于参照抗-PD-L1抗体对于PD-L1的结合亲和性。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体对于PD-L1的结合亲和性为约1.1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3倍、约3.25倍、约3.5倍、约3.75倍、约4倍、约4.25倍、约4.5倍、约4.75倍、或超过4.75倍较高于参照抗-PD-L1抗体对于PD-L1的结合亲和性，包括介于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，本发明所提供的抗-PD-L1抗体及其变异体或突变体，相较于参照抗-PD-L1抗体，具有延长的活体内半衰期。某些具体实施例中，本发明所揭示的抗-PD-L1抗体及其变异体或突变体的活体内半衰期不短于参照抗-PD-L1抗体的活体内半衰期。
某些具体实施例中，本发明所提供的抗-PD-L1抗体及其变异体或突变体展现的药物动力学性质类似于参照抗-PD-L1抗体的药物动力学性质。某些具体实施例中，本发明所提供的抗-PD-L1抗体及其变异体或突变体展现AUC(曲线下面积)为参照抗-PD-L1抗体的血清浓度-时间分布图的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或超过约95％(如约96％、约97％、约98％、约99％、或超过约99％)，包括介于这些值之间的任何范围。
某些具体实施中，抗体包含人类IgG的Fc序列，例如人类IgG1或人类IgG4。某些具体实施例中，Fc序列已经替换或改变使其缺乏抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)效应子功能，通常与其结合至Fc受体(FcR)有关。有许多对于Fc序列的改变或突变可替换效应子功能。例如，国际专利WO 00/42072及Shields et al.,J Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)揭示具有改良的或消除的对FcR的结合的抗体变异体。这些文献的内容具体地以参考方式并入本文。抗体可为Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段；双功能抗体及线性抗体。再者，抗体其及变异体或突变体可为结合至PD-L1的多特异性的抗体或变异体或突变体，但亦结合一或多种其他目标且抑制它们的功能。抗体及/或其变异体或突变体可接合至治疗剂(例如，细胞毒性剂、放射性同位素及化疗剂)或于患者样品中用于检测PD-L1或活体内成像(例如，放射性同位素、荧光染剂及酶)的标记。其他修饰包括毒素与本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的接合。
本申请还研究了编码抗-PD-L抗体、其变异体及/或突变体的核酸分子，包含编码本文揭示的CDR及/或重链可变区及/或轻链可变区的核酸分子的表达载体，以及包含该核酸分子的细胞。这些抗体及其变异体或突变体可使用于本文所揭示的疗法中以及于患者样品(例如，经由FACS、免疫组织化学(IHC)、ELISA检定)或对患者检测PD-L蛋白质。
单克隆抗体
单克隆抗体，例如，可使用杂交瘤方法制备，如揭示于Kohler and Milstein,Nature,256:495(1975)或可由重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)制备或可通过本文下述实施例所揭示的方法产生。杂交瘤方法中，典型地以免疫剂将仓鼠、小鼠或其合适的宿主动物免疫以引发产生或能产生抗体的淋巴细胞，该淋巴细胞特异性地结合至免疫剂。替代地，淋巴细胞可于活体外免疫。
免疫剂典型地包括感兴趣的蛋白质的多肽或融合蛋白质或包含该蛋白质的组合物。一般而言，若人类起源的细胞为所需要的，则使用周边血液淋巴细胞(PBL)，若非人类哺乳动物来源为所需要的则使用脾脏细胞或***细胞。然后淋巴细胞使用如聚乙二醇的合适的融合剂与永生化细胞株融合，形成杂交瘤细胞(Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE,New York:Academic Press,1986,pp.59-103)。永生化细胞株通常为转型的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛及人类来源的骨髓瘤细胞。通常，利用大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞株。杂交瘤细胞可培养于合适的培养基，该培养基较佳地含有抑制未融合、永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤及鸟嘌呤(「HAT培养基」)，这些物质预防HGPRT-缺陷细胞的生长。
较佳的永生化细胞株为融合充分地、支持经选择的产生抗体的细胞稳定高水平地表达抗体、并且对如HAT培养基之类的培养基敏感。更佳的永生化细胞株为鼠类骨髓瘤株，其可，例如由加州圣地亚哥的Salk Institute Cell Distribution Center以及维吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保存中心获得。人类骨髓瘤及小鼠-人类异源骨髓瘤细胞株亦已揭示用于产生人类单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur et al.,MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS,Marcel Dekker,Inc.:New York,1987,pp.51-63)。
然后其中培养杂交瘤细胞的培养基检测直接针对多肽的单克隆抗体的存在。通过杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性，可由免疫沉淀或活体外结合检测予以测定，如放射免疫检测(RIA)或酶联免疫吸附检测(ELISA)。这些技术及检测为所属技术领域所熟知。单克隆抗体的结合亲和性，例如，可由Scatchard analysis of Muson andPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)予以测定。在所期望的杂交瘤细胞经鉴定后，克隆株可由限制稀释步骤次克隆及通过标准方法生长。如前述Goding。用于此目的的合适培养基包括，例如，Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium及RPMI-1640培养基。替代地，杂交瘤细胞可于活体内生长如哺乳动物的腹水中。
由亚克隆株所分泌的单克隆抗体可通过传统免疫球蛋白纯化步骤，例如，用蛋白质A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，由培养基或腹水分离或纯化。
单克隆抗体亦可通过重组DNA方法制备，如揭示于美国专利第4,816,567号的方法。本文所提供的编码单克隆抗体的DNA可使用传统步骤(例如，通过使用能特异性结合至编码鼠类抗体的重链及轻链的基因的寡核苷酸探针)方便地分离及定序。本文所提供的杂交瘤细胞作为该DNA的较佳来源。一旦经分离，DNA可置入表达载体，然后该表达载体转染至如类人猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不生产免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞的宿主细胞，已于重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。DNA亦可被修饰，例如，通过取代人类重链及轻链恒定区的编码序列代替同源鼠类序列(美国专利第4,816,567号；Morrisonet al.,如前述)或通过共价地联接至免疫球蛋白编码序列的用于免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列。该非免疫球蛋白多肽可经取代为本文所提供的抗体的恒定区，或可经取代为本文所提供的抗体的一个抗原组合位点的可变区以创建嵌合二价抗体。
某些具体实施例中，本发明所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体由稳定的哺乳动物细胞株表达。某些具体实施例中，本发明所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体由稳定的哺乳动物细胞株表达为滴度约2.0克/升、约2.5克/升、约3.0克/升、约3.5克/升、约4.0克/升、约4.5克/升、约5.0克/升、约5.5克/升、约6克/升、约6.5克/升、约7.0克/升、或超过约7.0克/升，包括介于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，其中本发明所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体经表达的稳定的哺乳动物细胞株为CHO细胞株。
某些具体实施例中，抗体为单价抗体。用于制备单价抗体的方法为所属技术领域熟知的。例如，一方法涉及免疫球蛋白轻链与经修饰重链的重组表达。重链通常于Fc区中的任何点予以截短而预防重链交联。替代地，相应的半胱氨酸残基被另一氨基酸残基取代或被删除以预防交联。
活体外方法亦适合用于制备单价抗体。分解抗体以产生其片段，特别是Fab片段，可使用，但不限于，所属技术领域熟知的方法完成。
人类抗体及人源化抗体
抗体(及/或变异体)可为人源化抗体或人类抗体。非人类(例如，鼠类)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链、或其片段(如，Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、或抗体的其他抗体次序列)典型地含有衍生自非人类免疫球蛋白的最少序列。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(接受者抗体)其中来自接受者CDR的残基被置换为来自如小鼠、大鼠或兔的非人类物种CDR(捐赠者抗体)的残基，具有所期望的特异性、亲和性及能力。某些情况中，人类免疫球蛋白的Fv框架残基被置换为相应的非人类残基。人源化抗体亦可包含未见于接受者抗体、未见于输入的CDR或框架序列的残基。一般而言，人源化抗体可实质上包含所有至少一个，典型地为2个的可变区，其中所有或实质上所有地对应于非人类免疫球蛋白地CDR区，以及所有或实质上所有地FR区为人类免疫球蛋白一致序列。人源化抗体较佳亦包含至少一部份的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地为人类免疫球蛋白。Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)。
一般而言，人源化抗体具有经导入的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常意指「输入」残基，其典型地采用「输入」可变区。根据一具体实施例，人源化可基本上采用下述Winter及其共同工作者的方法(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))，通过取代啮齿动物CDR或CDR序列为人类抗体的相应序列。因此，该「人源化」抗体为实质上少于完整人类可变区已被来自非人类物种的相应序列所取代的抗体(美国专利第4,816,567号)。实际上，人源化抗体典型地为人类抗体，其中某些CDR残基及可能的某些FR残基，由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代。
关于替代人源化，可制造人类抗体。例如，目前可能产生基因改造动物(例如，小鼠)，通过对其免疫而在不产生内源性免疫球蛋白的情况下得到人类抗体的全组库。。例如，已揭示将嵌合及生殖系突变体小鼠的抗体重链接合区(JH)的同合子删除，造成内源性抗体制造的完全抑制。人类生殖系免疫球蛋白基因数组转移至这些生殖系突变体小鼠，将通过抗原挑战得到人类抗体。参照，例如，Jakobovits et al.,PNAS USA,90:2551(1993)；Jakobovits et al.,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann et al.Year inImmunol.7:33(1993)；美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,591,669号、第5,545,807号及世界专利WO 97/17852。
替代地，人类抗体可通过将人类免疫球蛋白基因座导入至基因改造动物而制备，例如，小鼠，其内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活。在挑战时，观察到人类抗体制造在所有方面接近相似于人类，包括基因重排、组装、及抗体组库。此方案公开于，例如，美国专利第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号及第5,661,016号，以及Marks et al.,Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；Lonberg and Huszar,Inter.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
替代地，可使用噬菌体展现技术(MaCafferty et al.,Nature 148:552-553,1990)自未经免疫的捐赠者的免疫球蛋白可变(V)区基因组库，于活体外制造人类抗体及抗体片段。根据此技术一具体实施例，抗体V区序列经框架内克隆至如M13或fd的丝状噬菌体的主要或次要被覆蛋白质基基因，以及于噬菌体颗粒表面展现功能性抗体片段。噬菌体展现可以多种形式进行，例如，如下文实施例段所揭示者或总结于例如，Johnson,KevinS.and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)。V-基因节段的数种来源可使用于噬菌体展现。Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)由衍生自经免疫小鼠脾脏的V基因的小的随机组合库，分离抗恶唑酮抗体的多样性数组。根据Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith et al.,EMBOJ.12:725-734(1993)所揭示的技术，可构筑来自未经免疫人类捐赠者的V基因组库以及可基本上分离对抗原(包括自抗原)的多样性数组的抗体。亦参照美国专利第5,565,332号及第5,573,905号。
如上文所讨论，人类抗体可通过活体外活化B细胞而制得(参照美国专利第5,567,610号及第5,229,275号)。
人类抗体亦可使用所属技术领域熟知的各种技术制造。包括噬菌体展示库。Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole et al.及Bortner et al.的技术亦可用于制备人类单克隆抗体。Cole etal.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)andBoerner et al.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。
多特异性抗体
多特异性抗体为单克隆，较佳为人类或人源化抗体，其对于二种或更多种不同的抗原具有结合特异性(例如，双特异性对于至少二种抗原具有结合特异性)。例如，结合特异性之一为对于a5～1蛋白质，另一者可为对于任何其他抗原。根据一较佳具体实施例，其他抗原为细胞表面蛋白质或受体或受体次单元。例如，细胞表面蛋白质可为天然杀手(NK)细胞受体。因此，根据一具体实施例，本发明的双特异性抗体可结合PD-L1及例如第二细胞表面受体二者。
用于制造双特异性抗体的合适方法为所属技术领域熟知。例如，双特异性抗体的重组制造基于二个免疫球蛋白重链/轻链对，其中二个重链具有不同的特异性。Milsteinand Cuello,Nature,305:537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链及轻链的随机分配，该等杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和性层析步骤完成。类似的步骤公开于世界专利WO93/08829以及Traunecker et al.,EMBO,10:3655-3659(1991)。
具有所期望的双特异性的抗体可变区(抗体-抗原组合位点)可融合至免疫球蛋白恒定区序列。较佳为与免疫球蛋白重链恒定区融合，包含至少一部分的铰链、CH2及CH3区。较佳为具有第一重链恒定区(CH1)，其含有存在于至少一个融合物的轻链结合所需位点。编码免疫球蛋白重链融合物的DNA，以及，若期望，免疫球蛋白轻链，经***至分开的表达载体，且共转染至合适的宿主有机体。对于制造双特异性抗体的进一步详细内容，参照，例如，Suresh et al.,Methods in Enzymology,121:210(1986)。
已揭示用于直接自重组细胞培养物制造及分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链制造双特异性抗体。Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)。来自Fos及Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连结至二个不同抗体的Fab’部分。于铰链区降低抗体的同元二聚物以形成单体，然后再度氧化以形成抗体异元二聚物。此方法亦可用于抗体同元二聚物的制造。由Hollinger et al.,PNAS,USA,90:6444-6448(1993)所揭示的「双功能抗体」，已提供用于制造双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过连结子连接至VL的VH，其过短而使得二个区之间配对于相同链。因此，一个片段的VH及VL区被迫与另一片段的互补VH及VL配对，借此形成二个抗原结合位点。已报导用于制造双特异性抗体片段的另一策略是通过使用单链Fv(sFv)二聚物。参照Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994)。
本发明涵盖具有多于二个价数的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt etal.J.Immunol.147:60(1991)。
缀合抗体(heteroconjugate antibody)
缀合抗体由二个共价联接的抗体所组成。该抗体已建议，例如，靶向非所欲细胞的免疫***细胞(美国专利第4,676,980号)，以及用于治疗HIV感染。世界专利WO 91/00360；WO 92/00373；欧洲专例EU 03089。抗体可使用合成蛋白质化学熟知的方法于活体外制备，包括涉及使用交联剂。例如，免疫毒素通过使用双硫交换反应或形成硫醚键而制得。对于此目的的合适药剂的实例包括亚胺硫醇盐及甲基-4-巯基丁酰亚胺，所述技术公开于，例如，美国专利第4,676,980号。
效应子功能工程
就效应子功能而言，可期望地修饰本文所提供的抗体，以增加，例如，治疗癌症中抗体的有效性。例如，半胱氨酸残基可经导入至Fc区，以使得链间双硫键于此区形成。因此所制得的同元二聚物性抗体可具有经改良的内化能力及/或增加的补体-媒介细胞致死及抗体性细胞性细胞毒性(ADCC)。参照，Caron et al.,J.Exp.Med.,176:1191-1195(1992)及Shapes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同元二聚物性抗体亦可使用异源双功能交联剂而制备，如揭示于Wolff et al.,Cancer Research,53:2560-2565(1993)。替代地，抗体可经工程化而具有双重Fc区且可借此具有增强的补体裂解及ADCC能力。参照，Stevenson et al.,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。
可制作Fc区序列中的突变或替换以改良FcR结合(例如，FcγR、FcRn)。根据一具体实施例，本发明的抗体具有选自下述的至少一种经替换的效应子功能:ADCC、CDC及相较于天然IgG或亲代抗体为经改良的FcRn结合。数种有用的特异性突变揭示于Shield,RL etal.(2001)JBC 276(6)6591-6604；Presta,L.G.,(2002)Biochemical SocietyTransactions 30(4):487-490；及世界专利WO 00/42072。根据一具体例，Fc受体突变选自下述集合的至少一个位置的取代:Fc区的238、239、246、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区中残基的编号根据EU编号***。一些具体实施例中，Fc受体突变为D265A取代。一些具体实施例中，Fc受体突变为N297A取代。额外的合适突变揭示于美国专利第7,332,581号。
免疫接合物
本发明亦属于免疫接合物，其包含抗体、或其变异体或突变体，接合至如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)、或放射活性同位素(亦即，放射接合物)。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪毒素(modeccin)A链、α-八迭球菌素(sarcin)、三年桐(Aleurties fordii)蛋白质、香竹石(dianthin)蛋白质、美洲商陆(Phytolaca american)蛋白质(PARI、PARII及PARIII)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、痲疯树蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、皂角树(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(neomycin)及单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射核素适合用于制造放射偶联抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y、及186Re。可用于制造该免疫偶联物的示例性化疗剂包括本文他处所公开的。
某些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体接合至美登素(maytansine)、美登素生物碱(maytansinoid)、或卡奇霉素(calicheamicin)。某些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体偶联至美登素生物碱DM1。
使用多种双功能蛋白质-偶合剂制造抗体与细胞毒性剂的偶联物，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸己二酰亚胺酸二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双迭氮化合物(如双(对_迭氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)、及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可偶联至被蓖麻毒素免疫毒素如揭示于Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见世界专利WO 94/11026。
另一具体实施例中，抗体、或其变异体或突变体，可经结合至「受体」(如链霉素亲和素)用以利用于肿瘤预-靶定，其中该抗体-受体偶联物投药至患者，接着使用清洁剂由血液循环移除未结合的接合物后，投与经结合至细胞毒性剂(例如，放射核苷酸)的「配体」(例如，抗生物素蛋白)。
共价修饰
抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体及片段的共价修饰包括于本发明的范畴。共价修饰的一种类型包括将多肽的靶向氨基酸残基与能与该多肽的经选择的侧链或N-或C-终端残基反应的有机衍生剂反应。利用双功能剂的衍生有利于，例如，交联多肽至不溶于水的支持体或基质，以利用于纯化抗体的方法，且反之亦然。通常使用的交联剂包括，例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚氨酯类(例如，与4-迭氮水杨酸之酯类)、同元双功能亚氨酯类，包括二琥珀酰亚氨酯类，如3,3’-二硫基双(琥珀酰亚氨基-丙酸酯)、双功能马来西亚氨类如双-N-马来西亚氨基-1,8-辛烷及如甲基-3-[(对-迭氮苯基)-二硫基丙酰亚氨酯之剂。
其他的修饰包括谷氨酰胺基及天冬酰胺基残基分别去胺基化为相应的谷氨酰基与天冬酰基残基，脯氨酸及赖氨酸的羟基化，丝氨酰基及苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸及组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,ProteinsL Structure andMolecular Properties,W.H.Freeman&Co.San Francisco,pp.79-86(1983))，N-终端胺的乙酰化，以及任何C-终端羧基的酰胺化。
多肽的共价修饰的另一类型包含连结多肽至多种非蛋白质聚合物中的一种，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧烯类，方式揭示于美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号；或第4,179,337号。
嵌合分子
本发明的抗-PD-L1抗体、其变异体、其突变体、及/或其片段，若为有利方式亦可经修饰以形成嵌合分子，该嵌合分子包含经融合至另一异源多肽或氨基酸序列(例如，免疫黏附素或肽体)的多肽。
一具体实施例中，嵌合分子包含多肽与靶向多肽用于传递至各种组织的蛋白质转导区的融合物，以及更特定地为横跨血脑屏障，例如使用，人类免疫缺乏病毒TAT蛋白质的蛋白质转导区(Schwarze et al.,1999,Science 285:1569-72)。
另一具体例中，该嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合物，该标签多肽提供抗-标签抗体可选择性结合的抗原决定基。抗原决定基标签通常置于多肽的氨基-或羧基-终端。多肽的所述抗原决定基-标签型的存在可使用针对该标签多肽的抗体检测。再者，抗原决定基标签的存在使得该多肽通过使用抗标签抗体或结合至该抗原决定基标签的亲和性基质的另一类型的亲和性纯化而可容易的纯化。各种标签多肽及其对应的抗体为所述技术领域所熟知。实例包括多-组氨酸(poly-His)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-His-gly)标签；流感病毒HA卷标多肽及其抗体12CA5[Field et al.,Mol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988)]；c-myc标签及针对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7、及9E10抗体[Evan et al.,Molecular andCellular Biology,5:3610-3616(1985)]；及单疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体[Paborsky et al.,Protein Engineering,3(6):547-553(1990))。其他标签多肽包括旗标-肽[Hopp et al.,BioTechnology,6:1204-1210(1988)]；KT3抗原决定基肽[Martin etal.,Science,255:192-194(1992)]；α-微管蛋白抗原决定基肽[Skinner et al.,J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)]；及T7基因10蛋白质肽标签[Lutz-Freyermuth etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]。
一替代具体例中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区的融合物。对于嵌合分子的双价型(例如，「免疫黏附素」)，该融合物可对应于IgG分子的Fc区。本发明的IgG融合物包括多肽，该多肽包含接近或仅有人类的残基94-243、残基33-53或残基33-52替换Ig分子内的至少一可变区。特别优选具体实施例中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2及CH3，或铰链、CH1、CH2及CH3区。对于免疫球蛋白融合物的制备，亦参照于1995年6月27日授权的美国专利第5,428,130号。
免疫脂质体
本文揭示的抗体亦可调配为免疫脂质体。含有抗体的脂质体由所属技术领域熟知的方法制备，如Epstein et al.,PNAS USA,82:3688(1985)；Hwang et al.,PNSA USA,77:4030(1980)公开的；及美国专利第4,485,045号及第4,544,545号。具有增强的循环时间的脂质体系揭示于美国专利第5,013,556号。
特别有用的脂质体可由具有脂质组合物的逆相蒸发方法产生，该脂质组合物包含磷脂胆碱、胆固醇及PEG-衍生的磷脂乙醇胺(PEG-PE)。脂质体由经定义孔径的滤器挤出以产生具有期望直径的脂质体。本发明的抗体的Fab'片段可经由双硫交换反应接合至揭示于Martinet etal.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)中报道的脂质体。抗赘生性剂、生长抑制剂或化疗剂(如阿霉素)视需要亦可包含于脂质体中。参照Gabizon et al.,J.NationalCancer Inst.,81(19):1484(1989)。使用抗-PD-L1抗体及其变异体的治疗
本文所提供的抗-PD-L1抗体、其变异体、其突变体、及/或其片段、及/或组成物可给药至对象(例如，如人类的哺乳动物)以治疗涉及异常PD-L1活性的疾病或失调，包括，例如，癌(例如，头颈癌、喉癌、直肠癌、肺癌等)。某些具体实施例中，本发明提供本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或变异体使用于制造用以于对象中治疗癌(如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)的药物。某些具体实施例中，本发明提供所揭示的抗-PD-L1抗体及/或变异体(或其片段)使用于对象中治疗癌(如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)。
某些具体实施例中，本发明提供包含本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体(或其片段)的医药组合物用于对象中治疗癌(如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性腺乳癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)。某些具体实施例中，待治疗的对象为哺乳动物(例如，人类、非人类灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、羊、山羊、狗、猫等)。某些具体实施例中，该对象为人类。某些具体实施例中，该对象为临床患者，临床试验自愿者、试验动物等。某些具体实施例中，该对象为怀疑罹患或有风险罹患癌(如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)或经诊断具有癌或具有异常PD-L1表现或活性的其他疾病。
用于癌(如，黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHLPMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)或显现异常PD-L1活性的任何其他疾病的许多诊断方法以及这些疾病的临床探讨为所属技术领域所熟知。所述方法包括，但不限于，例如，免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于对于异常PD-L1活性或表达的诊断方法的额外详述揭示于，例如，Gupta et al.(2009)Mod Pathol.22(1):128-133；Lopez-Rios et al.(2013)J ClinPathol.66(5):381-385；Ellison et al.(2013)J Clin Pathol 66(2):78-89；及Guha etal.(2013)PLos ONE 8(6):e67782。
给药可为任何合适途径，例如，静脉内、肌内、或皮下。一些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)及/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括，例如，抗赘生剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、或化疗剂)组合给药以治疗涉及异常PD-L1活性的疾病或失调。该药剂包括，例如，多西他赛(docetaxel)、吉非替尼(gefitinib)、FOLFIRI(爱莱诺迪肯(irinotecan)、5-氟尿嘧啶、及亚叶酸(leucovorin))、爱莱诺迪肯(irinotecan)、顺铂(crisplatin)、卡铂(carboplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、贝伐单抗(bevacizumab)(抗-VEGF抗体)、FOLFOX-4、输液5-尿嘧啶、亚叶酸、及奥沙利铂(oxaliplatin)、阿法替尼(afatinib)、吉西他滨(gemcitabine)、卡培他滨(capecitabin)、培美曲塞(pemetrexed)、依维莫斯(everolimus)、CpG-ODN、雷帕霉素(rapamycin)、来那度胺(lenalidomide)、维罗非尼(vemurafenib)、内皮抑制素(endostatin)、拉帕替尼(lapatinib)、PX-866、葡聚醣(Imprime PGG)、以及埃罗替尼(irlotinibm)。一些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或变异体(或其片段)偶联至额外的药剂。
某些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或变异体或突变体(或其片段)及/或组成物与一种或多种额外的疗法组合投药，如放射疗法、手术、化疗、及/或标靶疗法。某些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或变异体(或其片段)及/或组合物与放射疗法组合投药。某些具体实施例中，本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或变异体(或其片段)及/或组合物与放射疗法的组合用于治疗选自下述的癌症:黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***及甲状腺癌。
取决于待治疗的适应症及相关所属技术领域的医药人员熟悉的用药因素，本文所提供的抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体、或其片段，将以有效于治疗该适应症而毒性及副作用最小化的剂量投药。用于治疗癌(如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌)，典型剂量可为，例如，范围为0.001至1000μg；然而，低于或高于此示例性范围的剂量皆属于本发明的范畴。每日剂量可为总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg(例如，约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约50mg/kg、或上述数值的任二个所界定的范围)，优选为总体重的约0.3μg/kg至约10mg/kg(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg、或上述值之任二者所界定的范围)，更优选为总体重的约1μg/kg至约1mg/kg(例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg、或上述数值的任二个所界定的范围)，以及甚至更优选为每日体重的约0.5mg/kg至约10mg/kg(例如，约2mg/kg、约4mg/kg、约7mg/kg、约9mg/kg、或上述数值的任二个所界定的范围，包括介于上述数值之间的任何范围)。如上所述，治疗或预防药效可通过受治疗患者的定期评估而检测。对于数日或长时期的重复给药，取决于情况，治疗重复直至所期望的抑制疾病症状发生。然而，其他治疗方案可为有效的且属于本发明范畴。所期望的剂量可通过组合物的单一剂量给药、组合物的多重剂量给药、或通过组成物的连续输液投药。
包含抗-PD-L1抗体、其变异体、突变体、或其片段的医药组合物可每日给药一次、二次、三次、或四次。组合物亦可给药频率少于每日，例如，一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周二次、一周一次、每二周一次、每三周一次、一个月一次、每二个月一次、每三个月一次、或每六个一次。组合物亦可以持续释放制剂来给药，如在一段时期内以植入物逐渐释放组合物，用于允许组合物以较少频率给药，如一个月一次、每2至6个月一次、或每年一次、或甚至单次投药。持续释放装置(如小粒、纳米颗粒、微颗粒、纳米球体、微球体等)可通过注射给药。
抗体及/或变异体或突变体(或其片段)可以单一每日剂量给药，或每日总剂量可以每日二、三或四次分割剂量给药。组合物亦可给药频率少于每日，例如，一周六次、一周五次、一周四次、一周三次、一周二次、一周一次、每二周一次、每三周一次、一个月一次、每二个月一次、每三个月一次、或每六个月一次。抗体(或其片段)亦可以持续释放制剂来给药，如在一段时期内以植入物逐渐释放组合物，以使组合物以较少频率给药，如一个月一次、每2至6个月一次、或每年一次、或甚至单次投药。持续释放装置(如小粒、纳米颗粒、微颗粒、纳米球体、微球体等)可通过注射给药。
癌症治疗可通过，例如，但不限于，肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩减、至进展(progression)的时间、存活时间、无进展的存活、总响应率、响应历时、生活质量、蛋白表达及/或活性。可应用于测定疗法的药效的方案，包括例如，经由放射成像的响应测量。
一些具体实施例中，疗法的药效用微肿瘤生长抑制的百分比(％TGI)测量，使用方程式100-(T/C×100)计算，其中T为经***的相对肿瘤体积的平均值，以及C为***的相对肿瘤体积的平均值。某些具体实施例中，％TGI为约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、或多于约95％。某些具体实施例中，抗-PD-L1及/或其变异体或突变体之％TGI为相同于或较大于参照抗-PD-L1抗体的％TGI，如约1.1-倍、约1.2-倍、约1.3-倍、约1.4-倍、约1.5-倍、约1.6-倍、约1.7-倍、约1.8-倍、约1.9-倍、约2-倍、约2.1-倍、约2.2-倍、约2.3-倍、约2.4-倍、约2.5-倍、约2.6-倍、约2.7-倍、或介于这些值之间的任何范围，或超过约2.7-倍大于参照抗-PD-L1抗体的％TGI。
医药制剂
抗-PD-L1抗体及/或变异体或突变体(或其片段)可与合适的载体或赋形剂调配，使其适合用于给药。抗体的合适制剂的获得可通过混合具有所需要纯度的抗体(或其片段)与可选地医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，为冻干调配物或水溶液形式。可接受载剂、赋形剂或稳定剂在应用的剂量及浓度内对接受者无毒性，以及包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、及其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸及甲硫胺酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯札氯铵、氯化苯铵松宁；酚、丁基醇或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯类如对羟基苯甲酸甲基酯或对羟基苯甲酸丙基酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇或间-苯甲醇)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、双糖类、以及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；盐型抗衡离子如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；及/或非离子性界面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性抗体制剂揭示于国际专利WO 98/56418，以参考方式展示并入本文。适用于皮下给药的冻干调配物揭示于国际专利WO 97/04801。该冻干调配物可与合适的稀释剂复水为高蛋白质浓度且该复水调配物可皮下给药至本文中欲治疗的哺乳动物。
本文的制剂对于欲治疗的特别适应症有需要时亦可含有多于一种活性化合物，特别是具有补助性活性而不会彼此有不良影响者。例如，可进一步根据需要提供抗赘生剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、或化疗剂。这些分子的组合含量与有效地达到期望的目的相适宜。所述其他药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、疾病或失调或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。通常使用相同剂量以及利用如本文所揭示的给药途径或迄今应用剂量的约1至99％。活性成分亦可封装于所制备的微胶囊，例如，通过凝聚(coacervation)技术或通过界面聚合，例如，分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，于胶体药物传输***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或于聚乳液中。这些技术揭示于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed(1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质呈塑形物形式，例如，膜，或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水合胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚***酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸及乙基L-谷氨酸酯、非可降解的乙烯-乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)所组成的可注射微球体)、或聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
脂质转染法或脂质体可使用于传送本发明的多肽或抗体(或其片段)或组合物至细胞。当使用抗体片段，优选为特异性结合至目标蛋白质的结合区的最小抑制片段。例如，基于抗体的可变区序列，肽分子可经设计为保留结合目标蛋白质序列的能力。该肽可化学合成及/或由重组DNA技术而制造。参照，例如，Marasco et al.,PNSA USA,90:7889-7893(1993)。
活性成分亦可封装于所制备的微胶囊，例如，由凝聚(coacervation)技术或通过界面聚合，例如，分别于羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，于胶体药物传送***(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或于聚乳液中。该等技术揭示于前述Remington’s Pharmaceutical Sciences。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体(或其片段)的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质呈塑形物形式，例如，膜，或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水合胶(例如，聚(2-羟基乙基-甲基丙酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚***酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸及乙基L-谷氨酸酯、非可降解的乙烯-乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)所组成的可注射微球体)、或聚-D-(-)-3-羟基丁酸。如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸的聚合物可释放分子超过100日，某些水合凝胶释放蛋白质期间较短。当经囊封的抗体长时期停留于体内时，其于37℃暴露于湿度的可导致变性或凝集，造成生物活性的损失及免疫原性的可能改变。根据涉及的机制可衍生合理的方案用于稳定化。例如，如果发现凝集机制为经由硫-双硫交换的分子间S-S键形成，稳定化可由修改巯基残基，由酸溶液冻干，调控湿度含量、使用合适的添加剂以及发展特异性聚合物基质组合物而实现。
某些具体实施例中，调配物包含本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体，浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约2mg/ml、大于约3mg/ml、大于约4mg/ml、大于约5mg/ml、大于约6mg/ml、大于约7mg/ml、大于约8mg/ml、大于约9mg/ml、大于约01mg/ml、大于约11mg/ml、大于约12mg/ml、大于约13mg/ml、大于约14mg/ml、大于约15mg/ml、大于约16mg/ml、大于约17mg/ml、大于约18mg/ml、大于约19mg/ml、大于约20mg/ml、大于约21mg/ml、大于约22mg/ml、大于约23mg/ml、大于约24mg/ml、大于约25mg/ml、大于约26mg/ml、大于约27mg/ml、大于约28mg/ml、大于约29mg/ml、大于约30mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体经调配(例如，以浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)于包含柠檬酸盐、NaCl、乙酸盐、琥珀酸盐、甘氨酸、聚山梨醇酯80(Tween80)、或前述任何组合的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体经调配(例如，以浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)于包含约100mM至约150mM甘氨酸的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体经调配(例如，以浓度大于约mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)于包含约10mM至约50mM乙酸盐的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体经调配于包含约10mM至约50mM琥珀酸盐的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体经调配(例如，以浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)于包含约0.005％至约0.02％聚山梨醇酯80的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或其突变体经调配于具有pH介于约5.1及5.6的缓冲液中。某些具体实施例中，抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体经调配于包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中该调配物pH＝5.5。
某些具体实施例中，包含本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(例如，以浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)的调配物(如包含缓冲液的调配物，该缓冲液包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中该调配物pH＝5.5)于室温是稳定的(如于约20至25℃历时约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周、5.0周包括界于这些值之间的任何范围)。某些具体实施例中，包含本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(例如，以浓度大于约0.5mg/ml、大于约1mg/ml、大于约5mg/ml、大于约10mg/ml、大于约15mg/ml、大于约20mg/ml、大于约25mg/ml，包括界于这些值之间的任何范围)的调配物(如包含缓冲液的调配物，该缓冲液包含10mM柠檬酸盐、100mM NaCl、100mM甘氨酸及0.01％聚山梨醇酯80的缓冲液中，其中该调配物pH＝5.5)于加速条件(如储存于约37℃)稳定的时间约0.5周、1.0周、1.5周、2.0周、2.5周、3.5周、4.0周、4.5周、5.0周，包括界于这些值之间的任何范围。
尺寸排除层析(SEC)为熟知且广泛使用的蛋白质稳定性研究的方法，以检测相应的物理及化学不稳定定性的可能的片段化及凝集化。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、1周后，相对于起始％高分子量种类(HMWS)，显示少于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％增加于高分子量种类，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体的调配物，于37℃、2周后，相对于起始％高分子量种类，显示少于约2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％的高分子量种类增加，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、4周后，相对于起始％高分子量种类，显示少于约3.3％、3.2％、3.1％、3.0％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％的高分子量种类的增加，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、4周后，相对于起始％低分子量种类(LMWS)，显示少于约1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％的高分子量种类的增加，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、2周后，相对于起始％低分子量种类，显示少于约2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％的低分子量物种的增加，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、4周后，相对于起始％低分子量种类，显示少于约2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2.0％、1.8％、1.6％、1.4％、1.2％、1.0％、0.8％、0.6％、0.4％、0.2％、或0.1％的低分子量种类增加，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、1周后，相对于起始％单体，显示不多于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％的单体的减少，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、2周后，相对于起始％单体，显示不多于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％的单体的减少，如使用SEC所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物，于37℃、2周后，相对于起始％单体，显示不多于约0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、或3.5％的单体的减少，如使用SEC所测定，包括界于该这些之间的任何范围。
阳离子交换层析(CEX)为熟知且广泛使用的工具来检测蛋白质降解如去胺化或氧化(Moorehouse et al.(1997)J.Pharm.Biomed.Anal.16,593-603)。降解产物典型地指称为酸性或碱性的种类。酸性种类为较主峰更早自CEX溶出的变异体，而碱性种类为较主峰更晚溶出的变异体。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物的酸性峰的流出液，于37℃、1周后，显示不多于约7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于该这些之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体的调配物的酸性峰流出液，于37℃、2周后，显示不多于约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、或18％的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的酸性峰的流出液，于37℃、2周后，显示不多于约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、或27％的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。
某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的碱性峰的流出液，于37℃、1周后，显示不多于约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml之本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的碱性峰的流出液，于37℃、2周后，显示不多于约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的碱性峰的流出液，于37℃、4周后，显示不多于约39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。
某些具体例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的主峰流出液，于37℃、1周后，显示不少于约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml之本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的基础峰(basic peak)的流出液，于37℃、2周后，显示不少于约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。某些具体实施例中，包含5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或25mg/ml的本文所揭示的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)的调配物的碱性基础峰的流出液，于37℃、4周后，显示不少于约32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、或46％的的总蛋白质，如使用CEX所测定，包括界于这些值之间的任何范围。
使用于活体内给药的调配物必须为无菌。此可容易地通过如经无菌滤膜的滤器而实现。
使用抗-PD-L1抗体及其变异体/突变体的诊断及成像方法
经标记的抗-PD-L1抗体、其变异体、其突变体、其片段，以及其衍生物与类似物，特异性地结合至PD-L1多肽，可使用于诊断目的以检测、诊断或监控与PD-L1的表达、异常表达及/或活性相关的疾病及/或失调。例如，本文所提供的抗PD-L1抗体及/或其变异体或其突变体(或其片段)可使用于原位、活体内、离体、及活体外诊断检测或成像检测。用于检测PD-L1多肽表达的方法，包含(a)使用本发明的一或多种抗体检测多肽于个体的细胞(例如，组织)或体液的表达及(b)与标准基因表达程度比较基因表达程度，通过与标准表达程度的比较测出被测基因表达程度的增加或减少，显示为异常表达。
本文所提供的额外的具体实施例包括于动物(例如，如人类的哺乳动物)诊断与PD-L1异常表达相关的疾病或失调的方法。这些方法包含于哺乳动物检测PD-L1分子。某些具体实施例中，诊断包含:(a)对哺乳动物投与有效量的经标记的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)；(b)投药后等候一段间隔时间，使标记的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)在个体的PD-L1表达的位点达较佳浓度(且对于未接合的经标记的分子经清理至背景水平)；(c)测定背景水平；以及(d)对个体检测经标记分子，使得经标记分子高于背景水平的检测显示个体具有与PD-L1的表达或异常表达相关的疾病或失调。背景水平可由各种方法测定，包括，比较被检测的经标记分子的量与特定***预先测定的标准值。
本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)可使用生物样品中使用的所属技术领域所熟知的免疫组织化学方法检测蛋白质水平(参照，Jalkanen etal.,J.Cell.Biol.101:976-985(1985)；Jalkaneneet al.,J.Cell.Biol.105:3087-3096(1987))。其他可用于检测蛋白质基因表达的基于抗体的方法包括免疫检测，如酶联免疫吸附检测(ELISA)及放射免疫检测(RIA)。合适的抗体检测标记为所述技术领域所熟知的且包括酶标记，如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)、及鎝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺(luminol)；及荧光标记，如荧光素及罗丹明(rhodamine)，及生物素。
所属技术领域熟知的技术可应用于本文所提供的经标记的抗体(或其片段)。这些技术包括，但不限于，双功能性偶联剂的使用(参照，美国专利第5,756,065号；第5,714,631号；第5,696,239号；第5,652,361号；第5,505,931号；第5,489,425号；第5,435,990号；第5,428,139号；第5,342,604号；第5,274,119号；第4,994,560号；及第5,808,003号)。
替代地，或额外地，可测量细胞中编码PD-L1多肽的核酸或mRNA，例如，经由荧光原位杂交使用相应于编码PD-L1的核酸或其互补物的核酸系探针；(FISH；参照世界专利WO98/45479，公开于1998年10月)，Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、或聚合酶链式反应(PCR)技术，如实时定量PCR(RT-PCR)。亦可基于抗体的分析通过测量如血清的生物液中的流出抗原而研究PD-L1过度表达(亦参照，例如，于1990年6月12日授权的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公开的世界专利案WO 91/05264；1995年3月28日授权的美国专利第5,401,638号；以及Sias et al.,J.Immunol.Methods 132:73-80(1990))。除上述检测，所述技术领域中具有通常知识的人可采用多种活体内及离体的检测。例如，可于哺乳动物体内将细胞暴露于视需要被可检测物标记的抗体，例如，放射活性同位素，以及抗体对细胞的结合予以评估，例如通过外部扫描或分析从预先暴露于抗体的哺乳动物采集的样品(例如，生物切片或其他生物样品)的放射活性。
制品及试剂盒
本文所提供的另一具体实施例为含有用于治疗癌症的材料的制品，该癌如黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌，TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、子***、甲状腺癌及唾液腺癌。制品可包含容器及容器上或容器内的标签或插页。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料制成，如玻璃或塑料。一般而言，容器装有有效于治疗症状的组合物且可具有无菌入口部分(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的瓶塞的小瓶)。组合物中至少一种活性剂为本文所提供的抗-PD-L1抗体及/或其变异体或突变体(或其片段)。标签或插页指示组合物是使用于治疗特定症状。标签或插页将进一步包含用于给药抗体组合物治疗患者的指引。亦涵盖包含本文所揭示的组合疗法的制品和试剂盒。
插页意思指包括于治疗产品的商用包装的客制化指引，其含有关于使用所述治疗产品相关的适应症、用法、剂量、投药、限制及/或警语的信息。一具体实施例中，插页指示组合物用于治疗癌(如头颈癌、肺癌或直肠癌)。
此外，制品可进一步包含第二容器，其包含医药可接受缓冲剂，如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏液及聚葡萄糖溶液。其可进一步包括商业及使用者所需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针及注射器。
亦可提供实现各种目的的试剂盒，例如，用于患者分离或检测PD-L1，视需要地与制品组合。对于PD-L1的分离及纯化，试剂盒可含有经偶合至珠粒(例如，SEPHAROSETM珠粒)的本发明所提供的抗-PD-L1抗体及/或提变异体或突变体(或其片段)。可提供含有用于活体外检测及定量PD-L1的抗体(或其片段)的试剂盒其，例如于ELISA或蛋白质印迹法中。如同制品，试剂盒包含容器及容器上或容器内的标签或插页。例如，容器容纳组合物，其包含本文所提供的至少一种抗-PD-L1抗体及或其变异体或突变体(或其片段)。额外的容器可包括含有，例如，稀释剂及缓冲剂、对照抗体。标签或插页可提供组合物的内容以及意图使用于活体外或诊断用途的指引。
【实施例】
实施例1
人类抗-PD-L1抗体及变异体的开发
对于抗-PD-L1抗体的开发，完整的方案总结如下所述:7个阳性先导物(lead)(亦即，PL1、PL2、PL3、PL6、PL8、PL12、PL15)由人类噬菌体展示库利用人类PD-L1_ECD-His筛选而鉴定。一般而言，以生物素化的经偶合至经链霉亲合素包被的磁性
Figure GDA0002062456120000521
M-280(Thermo Fisher Scientific#11205D)的人类PD-L1_ECD-His筛选三次后，经由ELISA测量筛选先导物的Fab对于hPD-L1_ECD-Fc及hPD-L1_ECD-His的结合，然后七个经选择的先导物的Fab序列克隆至人类IgG1Fc骨架的N297A突变体以成为全长抗体，使用该抗体进行更多试验以测定动力学特征、全细胞PD-L1结合活性、PD-L1阻断活性、活体外及活体内功能。基于所有数据，相较于其他经选择的先导物，发现PL2及PL3具有优异的抗-肿瘤活性，且它们的亲和性进一步通过制造PL2及PL3的噬菌体展示库优化以及对活体外亲和性成熟进行至少三次筛选。然后鉴定出具有增强的亲和性的PL2及PL3所衍生的变异体(亦即，PL2#3及PL3#7)，接着以与选择抗体先导物的非常类似的过程证实其活性及功能性。应注意的是于此阶段，同时制备不同的IgG同型体的变异体(亦即，IgG1、mtIgG1(N297A)、IgG2、IgG4)以及同时比较经与各种Fc骨架接合的一组PL2#3及PL3#7的亲和性及活体内与活体外的功效。除了肿瘤/抗原-特异性T细胞异种移植模型(tumor/antigen-specific T cell xenograftmodel)，亦使用hPD-1敲入模型(hPD-1knock-in model)证实PL2#3及PL3#7的功效，以及数据显示该二者皆与抗-PD-L1参照抗体可相比较。为了进一步改良PL3#7的亲和性，如之前方式制备基于PL3#7的另一噬菌体展示库用于亲和性成熟。通过这些过程，三个新颖的变异体(亦即，PL3#7-19、-43、-54)被鉴定且被使用于比较它们与PL2顶级变异体PL2#3的功效。详细的比较数据描述于本文下述实施例。
此处，七个经选择的先导物的结合亲和性及动力学(ka、kd及kD)使用表面等离子共振(SPR)测量且显示于表4。抗-人类IgG Fc首先固定至感测芯片，然后捕捉抗-PD-L1参照抗体以及该抗-PD-L1抗体先导物:PL1、PL2、PL3、PL6、PL8、PL12、及PL15，Rmax约250RU。试验于25℃进行，以及测量以下述方法进行：以hPD-L1_ECD-His自55.4nM至11.1nM的梯度稀释物，以流速25μL/min通过含有捕捉的抗体且补充有0.1％(w/v)BSA的HBS-P+缓冲液。所有数据利用评估软件分析以及曲线符合1:1Langmuir结合模型。数据表示二次重复进行的二个独立的试验。
表4
Ref-1 PL1 PL2 PL3 PL6 PL8 PL12 PL15
Ka(1/Ms) 1.45E+05 2.91E+05 4.38E+05 3.48E+05 1.05E+06 3.82E+05 4.16E+05 6.45E+05
Kd(1/s) 1.29E-03 4.53E-03 3.90E-03 4.10E-03 1.22E-02 3.48E-03 2.67E-03 9.33E-03
<![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]> 9.79E-09 1.58E-08 8.72E-09 1.19E-08 1.12E-08 8.85E-09 6.68E-09 1.50E-08
经选择的抗-PD-L1抗体先导物:PL1、PL2、PL3、PL6、PL8、PL12、及PL15的轻链(LC)及重链(HC)的氨基酸序列比对系示于第1A-1B图。该等先导物的LC及HC中的互补决定区(CDR)用粗体及下加底线文字标示。
实施例2
抗体PL2的抗-PD-L1变异体的结合亲和性与动力学
抗体先导物PL22使用活体外噬菌体展示为基础的亲和性成熟试验，以产生具有改良的结合表现的额外的克隆(clone)。首先，CDR-L1/CDR-L3/CDR-H3(着重于3个CDR)核酸库经由PCR产生、克隆至噬菌体展示载体，然后转化为大肠杆菌TG1或SS320细胞以产生噬菌体库。以偶合至链霉亲合素包被的磁性
Figure GDA0002062456120000531
M-280(Thermo Fisher Scientific#11205D)的生物素化hPD-L1-His筛选三次后，经由ELISA筛选40个Fab克隆，并发现四个Fab(亦即，#3、#4、#5、及#39)较亲代PL2具有较佳结合表现。进一步的动力学特征通过表面等离子共振(SPR)使用PL2#3、PL2#4、PL2#5、及PL2#39的全长IgG进行测量，且发现具有相当于或较佳于PD-L1参照抗体的结合表现。
下文表5显示于L1(分别为SEQ ID NOS 36,65,94,36与100，依照出现顺序)、L3(分别为SEQ ID NOS 45,71,95,98与95，依照出现顺序)及H3区(分别为SEQ ID NOS 60,77,96,99与101，依照出现顺序)具有突变的PL2变异体的氨基酸序列。
表5
Figure GDA0002062456120000541
Figure GDA0002062456120000542
使用表面等离子共振(SPR)测量结合亲和性及动力学。抗-人类IgG Fc首先固定于感测芯片，然后捕捉抗-PD-L1参照抗体以及PL2变异体，Rmax约250RU。试验于25℃进行，以及测量以hPD-L1-His自19.1nM至0.71nM的梯度稀释物，以流速25μL/min通过补充有0.1％(w/v)BSA的含有捕捉的抗体的HBS-P+缓冲液来做出。所有数据利用评估软件分析以及曲线符合1:1Langmuir结合模型。所有数据表示重复二次的二个独立的试验。
表6显示结合动力学与解离动力学，以及由表面等离子共振(SPR)所测量的PL2变异体相较于抗-PD-L1参照抗体的计算亲和性(kD)。此研究中，所有变异体、亲代PL2以及参照抗体克隆至人类IgG2骨架。相对于参照抗-PD-1抗体，对于PL2变异体的亲和性的改良显示于表6。表6所呈现的数据显示，PL2变异体中，PL2#3对于人类PD-L1-His具有最佳结合亲和性。表7显示于后续研究中着重于PL2#3的不同人类IgG同型体的动力学的比较的结果。此处，PL2#3的不同的同型体对于人类PD-L1-His显示类似的结合亲和性。
表6
平均(N＝2) ka[1/(M·s)] kd[1/s] <![CDATA[K<sub>D</sub>[M]]]> 相对于ref-1的改良
抗-PD-L1ref-1(IgG2) 2.47E+05 2.48E-03 8.41E-09 1.00
抗-PD-L1ref-2(IgG2) 1.24E+06 9.88E-04 9.07E-10
PL2IgG2 7.47E+05 2.17E-03 6.96E-09 1.21
PL2#3IgG2 1.32E+06 5.57E-04 5.16E-10 16.30
PL2#4IgG2 8.82E+05 9.90E-04 1.27E-09 6.62
PL2#5IgG2 8.12E+05 2.21E-03 3.07E-09 2.74
PL2#39IgG2 2.04E+06 1.43E-03 7.79E-10 10.80
表7
平均(N＝2) ka[1/(M·s)] kd[1/s] <![CDATA[K<sub>D</sub>[M]]]> 相对于ref-1的改良
抗-PD-L1ref-1(mtIgG1) 7.90E+05 5.05E-04 6.32E-10 1.00
抗-PD-L1ref-2(IgG2) 1.18E+06 2.68E-04 2.37E-10
PL2IgG1 1.25E+06 1.93E-03 1.56E-09 0.41
PL2#3IgG1 1.14E+06 2.76E-04 2.50E-10 2.53
PL2#3mtIgG1(N297A) 1.33E+06 2.86E-04 2.21E-10 2.86
PL2#3IgG2 1.34E+06 1.62E-04 1.18E-10 5.36
PL2#3IgG4 1.26E+06 2.93E-04 2.39E-10 2.64
实施例3
抗体PL3的抗-PD-L1变异体的结合亲和性与动力学
抗体先导物PL3使用于活体外噬菌体展示为基础的亲和性成熟试验以制造具有改良的结合表现的额外克隆。首先，CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H1/CDR-H2/CDR-H3(着重于6个CDR)核酸库由PCR产生、克隆至噬菌体展示载体，然后转化为大肠杆菌TG1或SS320细胞以产生噬菌体库。以偶合至经链霉亲合素包被的磁性
Figure GDA0002062456120000551
M-280(Thermo FisherScientific#11205D)的生物素化hPD-L1-His筛选三次后，经由ELISA筛选20个Fab克隆，并发现二个Fab(亦即，#1及#7)较亲代PL3具有较佳结合表现。进一步的动力学特征由表面等离子共振(SPR)使用PL3#1及PL3#7的全长IgG进行测量，且发现具有相当于或较佳于PD-L1参照抗体的结合表现。
下文表8显示于L2、L3及H1、H3区具有突变的PL3变异体的氨基酸序列。表9显示结合动力学与解离动力学，以及由表面电浆共振(SPR)所测量的PL3变异体相较于抗-PD-L1参照抗体的计算亲和性(kD)。此结果亦显示P3#1及PL3#7的不同人类IgG同型体中的动力学比较。相对于参照抗-PD-L1抗体，对于PL3变异体的亲和性改良显示于表9。所有数据表示重复二次进行的二个独立的试验。
这些数据显示，PL3变异体中，PL3#7对于人类PD-L1-His具有稍微较佳的结合亲和性。PL3#7的不同同型体对于人类PD-L1-His显示类似的结合亲和性。L1序列分别为SEQ IDNOS 120,120与120，依照出现顺序。L2序列分别为SEQ ID NOS 121,122与121依照出现顺序。L3序列分别为SEQ ID NOS 123,124与125，依照出现顺序。H1序列分别为SEQ ID NOS53,108,与75，依照出现顺序。H2序列分别为SEQ ID NOS 126,126与126，依照出现顺序。H3序列分别为SEQ ID NOS 61,109与78，依照出现顺序。
表8
Figure GDA0002062456120000561
Figure GDA0002062456120000562
表9
Figure GDA0002062456120000563
克隆PL3#7，其具有远优于亲代PL3的亲和性，进一步使用于活体外噬菌体展示为基础的亲和性成熟试验以制得具有改良的结合表现的额外克隆。首先，CDR-L1/CDR-L2/CDR-L3/CDR-H2/CDR-H3(着重于5个CDR)核酸库由PCR制备、克隆至噬菌体展示载体，然后转化为大肠杆菌TG1或SS320细胞以产生噬菌体库。以偶合至经链霉亲合素包被的磁性
Figure GDA0002062456120000573
M-280(Thermo Fisher Scientific#11205D)的生物素化hPD-L1-His筛选三次后，经由ELISA筛选57个Fab克隆，以及发现三个Fab(亦即，19、43及54)较亲代PL3#7具有较佳结合表现。进一步的动力学特征由生物层干涉技术方案(bio-layer interferometryapproach)(ForteBio Octet RED 96)使用PL3#7-19、PL3#7-43及PL3#7-54的全长IgG进行测量，且发现具有相当于或较佳于PD-L1参照抗体的结合表现。
下文表10显示于L1(分别为SEQ ID NOS 120,127,128与129，依照出现顺序)、L2(分别为SEQ ID NOS 121,130,131与132，依照出现顺序)、L3(分别为SEQ ID NOS 125,133,134与125，依照出现顺序)及H2(分别为SEQ ID NOS 126,126,126与135，依照出现顺序)、H3(分别为SEQ ID NOS 78,79,80与80，依照出现顺序)需具有突变的PL3#7变异体的氨基酸序列。H1序列分别揭示为SEQ ID NOS 75,75,75与75，依照出现顺序。
表10
Figure GDA0002062456120000571
Figure GDA0002062456120000572
PL3#7变异体的亲和性及动力学由生物层干涉技术方案使用Octet RED96(ForteBio)***利用链霉亲合素(SA)传感器于25℃且于1000rpm的振荡速度测量。简明地，黑色96-孔盘(plate)以含有200μL/孔的用于亲和性测定所需要的试剂的柱来制备。一般而言，首先将Octet SA传感器置于含有1×动力学缓冲液(Kinetics Buffer)(PBS、0.1％BSA、0.02％Tween-20，pH 7.4)的孔180秒以建立基线。然后将传感器转移至含有10μg/mL生物素化PL3#7变异体(抗体:生物素之1:1比例，利用EZ-
Figure GDA0002062456120000581
NHS-PEG4-生物素，Thermo FisherScientific#21329)的孔300秒以负载SA被覆尖端。然后传感器于再生缓冲液(Regeneration Buffer)(10mM甘氨酸，pH 1.5)中培养3×5秒，每次于1×动力学缓冲液中培养5秒来再生。再生于每次结合/解离循环的测量前重复。然后将传感器置于新鲜的1×动力学缓冲液持续180秒以建立基线。然后传感器于含有hPD-L1-His的孔中培养5分钟测量结合，接着转移至含有1×动力学缓冲液的孔持续10分钟，以测量解离。动力学(ka、kd及KD)由自hPD-L1_ECD-His从38.28nM至1.42nM(对于一浓度的一结合/解离循环)的1:3梯度稀释物以1:1Langmuir结合模型所获得数据的整体拟合(global fitting)四次结合/解离循环所测量。所有数据利用Octet数据分析软件版本9.0分析以及表示重复两次进行的二个独立的试验。
表11显示结合及解离动力学，与使用生物层干涉技术方案由ForteBio OctetRED96(Menlo Park,CA,USA)机器所测量的PL3#7变异体相较于参照抗-PD-L1抗体的计算亲和性。相对于参照抗-PD-L1抗体的PL3#7变异体的亲和性的改良显示于表11。所有数据表示重复两次进行的二个独立的试验。显示于表11的数据显示PL3#7-19、PL3#7-43及PL3#7-54相较于亲代PL3#7具有较佳的结合亲和性。
表11
平均(N＝2) ka[1/(M·s)] kd[1/s] <![CDATA[K<sub>D</sub>[M]]]> 相对于ref-1的改良
抗-PD-L1ref-1(mtIgG1) 2.07E+05 5.37E-04 2.46E-09 1.00
抗-PD-L1ref-2(IgG2) 2.91E+05 1.54E-04 5.20E-10
PL2#3mtIgG1 2.21E+05 5.61E-04 2.46E-09 1.00
PL3#7mtIgG1 2.98E+05 3.05E-04 1.09E-09 2.26
PL3#7-19mtIgG1 4.19E+05 2.01E-04 5.38E-10 4.57
PL3#7-43mtIgG1 3.30E+05 1.03E-04 3.13E-10 7.86
PL3#7-54mtIgG1 3.07E+05 2.28E-04 7.72E-10 3.19
因此，具有优异的较高亲和性以及优异功能性活性的PL2顶级变异体(PL2#3)、PL3顶变异体(PL3#7)以及PL3#7顶变异体(PL3#7-19、-43、-54)由活体外噬菌体展示为基础的亲和性成熟试验制备。一般而言，使用经偶合至经链霉亲合素包被的磁性
Figure GDA0002062456120000582
M-280的生物素化hPD-L1-His进行三次筛选。顶级变异体的Fab经由ELISA筛选且经克隆至人类IgG1Fc骨架的N297A突变体以成为全长抗体。该等抗-PD-L1顶变异体的轻链(LC)及重链(HC)的氨基酸序列比对显示于第11A-11B图。所述抗-PD-L1顶变异体的LC及HC中的互补决定区(CDR)标示为粗体及下加底线文字。
实施例4
抗-PD-L1抗体结合至重组人类PD-L1/Fc融合蛋白质与经活化的CD3+T细胞
进行ELISA检测以评估经选择的抗体对重组人类PD-L1/Fc融合蛋白质的结合。每孔15ng的人类PD-L1/Fc蛋白质被覆于96-孔EIA微孔盘于4℃隔夜。以5％脱脂乳阻断后，添加经梯度稀释的抗体且于室温培养1小时。移除未结合的抗体且以PBST将孔清洗二次。对孔添加HRP-偶联的二次抗体，以及接着培养，洗除过剩的二次抗体。对孔添加TMB，以及接着培养，终止反应，且HRP活性由监测于450nm吸收的增加来测量。
人类T细胞系使用MagniSortTM人类T细胞富含试剂盒(eBioscience)自PBMC分离。经分离的T细胞由5μg/mL的植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)活化3日以刺激PD-L1表达。收集经活化的T细胞且培养于具有人类Fc阻断剂(eBioscience)的FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS)中，于4℃20分钟。通过于FACS缓冲液中培养经活化T细胞与经梯度稀释的抗体来评估抗-PD-L1单克隆抗体的结合。细胞以流动缓冲液清洗且结合以经FITC标记的兔抗-人类IgG Fcγ抗体检测。细胞以针对闸控(gating)CD3-阳性T细胞的小鼠抗-人类CD3 PE-Cy7(eBioscience)来染色。使用Cytomics FC500(Beckmen Coulter公司)进行流式细胞分析。
因此，经选择的抗-PD-L1抗体由ELISA测试其对重组人类PD-L1蛋白质的结合以及通过流式细胞仪测试其对活化CD3+T细胞的结合。抗-PD-L1参照及抗-PD-L1参照抗体分别使用作为阳性及阴性对照。第2A及2B图显示所有经选择的抗-PD-L1抗体可结合人类PD-L1重组蛋白质及表达PD-L1的T细胞。
实施例5
通过抗-PD-L1抗体阻断PD-1结合至PD-L1
表达PD-L1的CHO-S细胞悬浮于FACS缓冲液(具有4％FBS的PBS)。添加各种浓度的测试抗体至细胞悬浮物(3.5E5细胞/孔)且于4℃培养30分钟。洗除未结合抗体且添加经生物素标记的PD-1-Fc融合蛋白质，于4℃培养30分钟。清洗细胞后以链霉亲合素-PE于4℃染色30分钟。使用Cytomics FC500(Beckmen Coulter公司)进行流式细胞分析。
经选择的抗-PD-L1抗体使用流式细胞术检定测试其阻断PD-1至表达PD-L1的CHO-S细胞的结合的能力。抗-PD-L1参照抗体及阿瓦斯汀(Avastin)分别使用作为阳性及阴性对照。显示于第3图的数据显示当通过染色的平均荧光强度(mean fluorescent intensity,MFI)测量时，所有经选择的抗-PD-L1单克隆抗体阻断PD-1对经PD-L1转染的CHO-S细胞的结合。
实施例6
抗-PD-L1抗体于混合白细胞反应(Mixed Leukocyte Reaction,MLR)中对于细胞因子产生及T细胞增殖的效果
应用混合白细胞反应以显现阻断PD-L1/PD-1途径对于淋巴球效应子细胞的效果。检测中的T细胞测试于抗-PD-L1抗体的存在或不存在下的增殖及IFN-γ或IL-23分泌。
人类T细胞使用Lympho-kwik T(One Lamda公司)自PBMC纯化。经分离的T细胞悬浮于PBS且以1μM的CFSE于室温标记10分钟。以完全培养基(具有10％FBS的RPMI-1640)清洗细胞后，经CFSE标记的T细胞以1E6细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基。
异体树状细胞自PBMC制备。经分离的PBMC与200U/mL的重组人类IL-3(eBioscience)培养过夜，使得单核细胞/巨噬细胞群附在盘上。移除未贴附细胞，盘以完全培养基清洗二次。然后盘上细胞于含有200U/mL的人类IL-4(eBioscience)及200U/mL的人类GM/CSF(eBioscience)的完全培养基中培养6日。于第6日添加TNF-α(100U/mL)至培养物且培养过夜，测量单核细胞衍生的树状细胞。成熟的DC经胰蛋白处理，收集且以1E5细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基。
每个反应含有10E5经CFSE标记的T细胞及10E4异体树状细胞，总体积为200μl。各培养物中添加不同浓度的抗体。无抗体或抗-VEGF抗体(Avastin)作为阴性对照。抗-PD-1参照或抗-PD-L1参照抗体作为阳性对照。细胞于37℃培养5日。于第5日，由各培养物取100μl培养基进行细胞因子测量。细胞因子的水平使用人类IFN-γ或IL-2ELISA MAXTM Deluxe试剂盒(BioLegend)测量。收集细胞并通过流式细胞术分析T细胞增殖。
显示于第4A-4B图的数据指示所有经选择的抗-PD-L1抗体于混合白细胞反应检测中，增强IFN-γ分泌以及促进T细胞增殖。抗-PD-L1及抗-PD-1参照抗体作为阳性对照。阿瓦斯汀(抗-VEGF)作为阴性对照。第4A图显示TFN-γ分泌的条状图，以及第4B图显示于抗体的指定浓度的CD3+T细胞增殖的条状图。
再者，于MLR中通过抗-PD-L1抗体PL2亲代及变异体所诱发的IL-2分泌显示于第6A图，以及MLR中于指定浓度的抗-PD-L1抗体PL3亲代抗体及变异体所诱发的IL-2分泌显示于第6B图。所述数据指示经选择的PL2变异体PL2-3/3(PL2#3)及PL3变异体(PL3#7)相较于亲代抗体对刺激T细胞活化显示优异的功效。
此外，于混合白细胞反应(MLR)中的抗-PD-L1抗体PL2#3、PL3#7及PL3#7变异体的不同IgG型的功效显示于第8A-8D图以及第12A-12B图。显示由所述抗-PD-l1抗体所诱发的IFN-γ及IL-2分泌的条状图呈现于第8A、8B及12A图。第8C图显示于各种浓度的抗-PD-L1抗体PL2#3、PL3#7的CD4+T细胞增殖的条状图，以及第8D及12B图显示于指定浓度的所述三种抗-PD-L1抗体的CD8+T细胞增殖的条状图。第12A及12B图特别指示抗-PD-L1抗体PL3#7变异体，例如，PL3#7-19、-43及-54，于IFN-γ分泌及CD8+T细胞增殖的增强显示优异活性。
实施例7
PL2及PL3抗-PD-L1抗体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制
抗-人类PD-L1抗体的活体内活性通过免疫受损的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重合并免疫缺陷)小鼠于异种移植小鼠模型中研究。小鼠皮下植入表达人类PD-L1及人类PBMC或抗原-特异性T细胞的人类癌细胞株。对小鼠以人类黑色素瘤细胞株A375或人类NSCLC细胞株NCI-H292给予抗体的腹腔剂量。抗体的效果于肿瘤生长至2000mm3肿瘤体积或显著的肿瘤坏死进行观察。
为了制造抗原-特异性T细胞，使用
Figure GDA0002062456120000611
人类T细胞富集试剂盒(eBioscience)由健康捐赠者的PBMC分离T细胞。经分离的T细胞系与经丝裂霉素-C处理的A375细胞与rhIL-2(50IU/mL)共培养10至14日以富集抗原-特异性T细胞。人类PBMC使用
Figure GDA0002062456120000612
-0177(Sigma-Aldrich)自健康捐赠者的全血分离。
A375及抗原-特异性T细胞以指定的效应子-对-目标(E:T)比例于皮下给药前即刻混合。NCI-H292细胞以指定的E:T比例与新鲜的人类PBMC混合且皮下接种至小鼠。测试物的第1剂量系于癌/效应子细胞的植入后2小时腹腔给药。小鼠以抗体每周处理二次持续3至5周。每周二次观察各个动物的肿瘤的形成。肿瘤由卡尺测量；肿瘤体积(V)使用下式计算:
V(mm3)＝0.5(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)
小鼠(n＝4/群)以人类黑色素细胞株A375及抗原-特异性T细胞的混合物(T细胞:癌细胞＝1:100)皮下植入。测试抗体自第0日每周二次腹腔注射至小鼠。于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中测试所有抗-PD-L1先导物的活体内功效。经PL2及PL3处理的小鼠的肿瘤生长曲线显示于第5A及5B图。数据显示PL2及PL3于活体内显著地抑制A375肿瘤生长。
再者，抗PD-L1抗体PL2及PL3顶级变异体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性显示于第7A及7B图。数据指示PL2#3IgG2于剂量30mg/kg及10mg/kg抑制A375肿瘤生长。PL3#7IgG2仅于剂量30mg/kg抑制A375生长。
此外，各种PL2#3及PL3#7IgG同型体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性显示于第9A(PL2#3)及9B(PL3#7)图。数据显示抗-PD-L1抗体PL2#3的突变的IgG1及IgG4型于剂量20mg/kg显示较佳的抗肿瘤效果。抗-PD-L1抗体PL3#7的野生型IgG1、突变的IgG1、以及IgG2于剂量30mg/kg抑制A375肿瘤生长。基于这些数据，突变体IgG(N297A)选择做为Fc骨架。
抗-PD-L1抗体PL2#3及PL3#7的突变体于A375/抗原-特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性显示于第15A-15B图。小鼠(n＝4/群)以人类黑色素细胞株A375及抗原-特异性T细胞的混合物(T细胞:癌细胞＝1:100)皮下植入。PL2#3及PL3#7测试抗体突变体自第0日每周二次腹腔注射至小鼠。经单克隆抗体处理的小鼠的肿瘤生长曲线显示于第15A图。第31日的个别肿瘤体积呈现于第15B图。数据显示PL2#3mtIgG1于A375(黑色素瘤)/抗原-特异性T细胞模型中于剂量20mg/kg及1mg/kg显示抗肿瘤活性；以及PL3#7-43于剂量20mg/kg显示优异的抗肿瘤活性。
实施例8
抗-PD-L1抗体突变体于hPD1 KI小鼠中的肿瘤生长抑制活性
抗-人类PD-L1抗体的活体内活性于人类PD-L1敲入C57BL/6小鼠(hPD1 KI小鼠)中研究。小鼠经人类PD-L1转染的小鼠MC38癌细胞皮下接种(每小鼠5E5细胞)。当肿瘤体积接近约86mm3时开始抗体处理。处理前对各试验组分配6只小鼠。动物接受抗-PD-L1抗体每周二次持续3周的剂量。每周二次对各个动物观察肿瘤的形成。肿瘤由卡尺测量以及肿瘤体积(V)使用下式计算:
V(mm3)＝0.5(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。
人类PD-L1敲入(hPD1 KI)小鼠(n＝6/群)以MC38-huPD-L1(经人类PD-L1转染的MC38)细胞皮下植入。当肿瘤体积接近约86mm3时开始抗体处理。测试抗体:PL2#3-mtIgG1及PL3#7-mtIgG1，腹腔注射至小鼠每周二次持续3周。显示于第10图的数据指示PL2#3-mtIgG1及PL3#7-mtIgG1的抗肿瘤活性可相当于抗-PD-L1参照抗体阿特珠单抗(Atezolizumab)类似物的抗肿瘤活性。
实施例9
抗-PD-L1抗体对PD-L1表达细胞的细胞表面的结合
使用
Figure GDA0002062456120000621
人类T细胞富集试剂盒(eBioscience)由PBMC分离人类T细胞。经分离的T细胞由5μg/mL的植物血凝素(PHA)活化6日以刺激PD-L1表现。收集经活化的T细胞且于具有人类Fc阻断剂(eBioscience)的FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS)中，于4℃培养20分钟。移除阻断剂后，T细胞悬浮于FACS缓冲液以用于染色过程。肿瘤细胞(A375及NCI-H292)由胰蛋白酶处理细胞而自培养盘收集且以FACS缓冲液清洗二次以用于细胞染色。
抗-PD-L1单克隆抗体的结合通过将细胞与经梯度稀释的抗-PD-L1单克隆抗体于FACS缓冲液(具有2％FBS的PBS)中培养。细胞以流动缓冲液清洗二次，结合以经生物素标记的兔抗-人类IgG Fcγ抗体及链霉亲合素-PE检测。使用Cytomics FC 500(BeckmenCoulter公司)进行流式细胞分析。
13A-13C图显示PL2#3及PL3#7变异体对PD-L1表达细胞的细胞表面的结合:经活化T细胞(第13A图)、A375人类黑色素瘤细胞株(第13B图)及NCI-H292人类NSCLC细胞株(第13C图)。抗-PD-L1参照抗体及HLX01(抗-CD20单克隆抗体)分别使用作为阳性及阴性对照。对于经活化T细胞的结合活性的排序为:PL2#3 mtIgG1>PL3#7-54 mtIgG1>PL3#7-43 mtIgG1>PL3#7-19 mtIgG1。对于A375人类黑色素瘤细胞的结合活性的排序为:PL3#7-54 mtIgG1>PL2#3 mtIgG1>PL3#7-43 mtIgG1>PL3#7-19 mtIgG1。对于NCI-H292人类NSCLC细胞的结合活性的排序为:PL3#7-54 mtIgG1≧PL2#3 mtIgG1＝PL3#7-43 mtIgG1≧PL3#7-19 mtIgG1。数据结论为所有PL3#7变异体及P2#3结合至PD-L1表达细胞表面。
实施例10
抗-PD-L1抗体变异体于NCI-H292/PBMC异种移植模型的肿瘤生长抑制活性
抗-人类PD-L1抗体的活体内活性使用免疫受损NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重合并免疫缺陷)小鼠于异种移植模型中研究。癌细胞及经分离的人类PBMC以指定的效应子-对-目标(E:T)比例于皮下给药前即刻混合。各小鼠以癌细胞与人类PBMC的混合物于两侧接种。测试对象的第一剂量于癌/效应子细胞的植入后2小时腹腔给药。动物接受每周二次测试抗体的剂量持续3至4周。每周二次于各个动物观察肿瘤的形成。肿瘤由卡尺测量以及肿瘤体积(V)使用下式计算:
V(mm3)＝0.5(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。
小鼠(n＝4/群)以人类NSCLC细胞株NCI-H292及新鲜经分离的人类PBMC的混合物(癌细胞(T):PBMC(E)＝3:1)皮下植入。抗-PD-L1抗体自第0日每周两次腹腔注射至小鼠。肿瘤曲线示于第14A图。于第28日的各肿瘤体积显示于第14B图。这些数据显示当添加效应子细胞(PBMC)时，所有测试的抗PD-L1抗体变异体抑制肿瘤生长。变异体PL2#3、PL3#7-19及PL3#7-43显示类似的活体内肿瘤生长抑制药效，其较优异于PL3#7-54变异体及参照抗-PD-L1抗体。抗
-PD-L1单克隆抗体的抗癌效果通过免疫细胞。
实施例11
抗-人类PD-L1单克隆抗体对小鼠黑色素瘤细胞的交叉结合
抗-PD-l1单克隆抗体的结合通过将A375黑色素瘤细胞(1.5E5细胞/测试)与经梯度稀释的抗体于FACS缓冲液中培养而予以评估。细胞以流动缓冲液清洗且以FITC-标记的兔抗-人类IgG Fcγ抗体检测结合。使用Cytomics FC 500(Beckmen Coulter公司)进行流式细胞分析。
PL2#3及PL3#7变异体由流式细胞术测试对于小鼠PD-L1表达的黑色素瘤细胞(B16-F10)的结合。抗-PD-L1参照抗体分别使用作为阳性及阴性对照。显示于第16图的数据指示PL3#7-43及PL3#7-54交叉结合至小鼠PD-L1，而PL2#3及PL3#7-19变异体与小鼠黑色素瘤细胞不具有显著的交叉反应性。
实施例12
抗-PD-L1变异体的食蟹猴PD-L1交叉结合
由Sino Biological公司购入重组食蟹猴PD-L1_ECD Fc-融合蛋白质。PD-L1_ECD/Fc(每孔9ng)通过于4℃培养过夜固定化至96-孔检测盘。使用PBS中的5％脱脂乳于室温一小时阻断非特异性结合位点。以PBST清洗盘三次后，将指定浓度的抗-PD-L1抗体与HLX01(阴性对照)与固定的蛋白质于室温培养一小时。以PBST清洗盘三次，之后以于PBS稀释1/1000的过氧化酶标记的山羊抗-人类IgG F(ab)’2(Jackson ImmunoResearchLaboratories)于室温培养一小时。清洗后，使用TMB(eBioscience)使盘显色。由VarioskanLUX微孔盘读值仪(Thermo Scientific)读取于波长450nm的吸收。
P2#3及PL3#7变异体通过ELISA测试对重组食蟹猴PD-L1_ECD Fc-融合蛋白质的结合。HLX01(抗-CD20单克隆抗体)作为阴性对照。显示于第17图的数据指示PL2#3及PL3#7变异体与食蟹猴PD-L1交叉反应。
实施例13
构筑去糖基化PL3#7-19变异体及PL3#7-43变异体
PL3#7-19及PL3#7-43为衍生自PL3#7的二个主要变异体但需要进行进一步的突变以去除非期望的L-CDR2区中的N-糖基化位点。N-糖基化发生于序列段(sequon)N-X-S/T。由于亲代PL3#7-19及PL3#7-43中的N-糖基化位点经编码为N-S-T及N-R-S，所述工程的进行通过将第二S/T由N突变为PL3#7中的相同者或类似氨基酸，亦即，对于PL3#7-19及PL3#-43分别将N-S-T与N-R-S突变为N-S-N/Q及N-R-P(亦即，PL3#7-19去糖基1、去糖基3及PL3#7-43去糖基1)，或通过将N-X-S/T序列段直接突变N为Q，亦即，对于PL3#7-19及PL3#7-43分别突变N-S-T与N-R-S为Q-S-T及Q-R-S(亦即，PL3#7-19去糖基2及PL3#7-43去糖基2)。之后，以液相色谱-质谱(LC-MS)及SDS-PAGE(数据未显示)证实L-CDR2的N糖基化位点的移除。
PL3#7-19变异体及PL3#7-43变异体的去糖基化版本的轻链可变区的氨基酸序列比对显示于第18图。列出的这些去糖基化变异体的轻链的序列比对以及CDR(互补决定区)标示为粗体及下加底线文字。所述重链未改变且与其亲代变异体相同(此处未显示序列比对)。所述去糖基化变异体对于人类PD-L1的结合活性以后续试验中的流式细胞术及Octet予以测定。
实施例14
去糖基化PL3#7-19变异体及PL3#7-46变异体的全细胞结合
测试的去糖基化变异体的结合通过将PD-L1表达的CHO-S细胞(2E5细胞/孔)与经梯度稀释的抗体于FACS缓冲液(具有％FBS的PBS)于4℃培养30分钟而予以评估。这些细胞以流动缓冲液清洗且之后以抗-人类IgG Fc-FITC(1:500x)于4℃染色30分钟以检测结合于细胞表面的抗体。使用CytoFlex(Beckmen Coulter公司)进行流式细胞分析。
PL3#7-19变异体及PL3#7-43变异体的去糖基化版本的全细胞结合显示于第19(A)及(B)图。PL3#7-19及PL3#7-43为两个首要变异体但需要工程化以移除L-CDR2区内的非期望的N-糖基化位点(参照上述实施例13)。所得的对于PL3#7-19的三个去糖基化变异体(亦即，PL3#7-19去糖基1、去糖基2、去糖基3)以及对于PL3#7-13的二个去糖基化变异体(亦即，PL3#7-46去糖基1、去糖基2)对于经PD-L1转染的CHO-S细胞的全细胞结合活性以流式细胞术测定。此处所测试的所有去糖基化抗体变异***于人类IgG1Fc骨架的N2978突变体中。使用内部(in-house)抗-PD-1抗体(亦即，HLX10)作为阴性对照。
显示于第19(A)及(B)图的数据指示去糖基化PL3#7-19及PL3#7-43变异体的全细胞结合活性不受L-CDR2区中N-糖基化位点的去除而影响。
实施例15
PL3#7-19去糖基1及PL3#7-43去糖基2于混合白细胞反应中的IgG同型体PL3#7-19去糖基1及PL3#7-43去糖基2的不同IgG同型体的功效使用混合白细胞反应(MLR)检测而予以测定，以及结果示于第20(A)及(B)图。HLX04及HLX20(PL2#3)分别使用作为阴性及阳性对照。条状图显示由测试抗体所诱发的IFN-γ(第20A图)及IL-2分泌(第20B图)。
如同去糖基化的PL3#7-19mtIgG1及PL3#7-43meIgG1，去糖基化PL3#7-19及PL3#7-43的mtIgG1及IgG4同型体显著地增强MLR中的细胞因子分泌。PL3#7-19去糖基1及PL3#7-43去糖基1的野生型IgG1显示较低的细胞因子释放的增强，其可能是由于野生型IgG1对于T细胞的潜在ADCC效果。
实施例16
去糖基化PL3#7-19及PL3#7-43变异体于A375/抗原特异性T细胞异种移植模型中的肿瘤生长抑制活性
小鼠(n＝5/群)皮下植入人类黑色素瘤细胞株A375及抗原-特异性T细胞的混合物(T细胞:癌细胞＝1:100)。测试抗体自第0日每周二次腹腔注射至小鼠。以去糖基化PL3#7-19及PL3#7-13变异体处理的小鼠的肿瘤生长分别显示于第21A及21C图。第28日的各肿瘤体积呈现于第21B及21D图。所有数据点为平均±SEM。
显示于所述图的数据指示PL3#7-19去糖基1mtIgG1及IgG4变异体，以及PL3#7-43去糖基2wtIgG1的抗肿瘤功效，于A375/抗原特异性T细胞异种移植模型中可与HLX20(PL2#3)之抗肿瘤功效相比较。
实施例17
抗-PD-L1单克隆抗体与抗-VEGF单克隆抗体于NSCLC异种移植小鼠模型中的肿瘤生长抑制活性
抗-人类PD-L1抗体活体内活性使用免疫受损NOD/SCID(非肥胖糖尿病/严重合并免疫缺陷)小鼠于异种移植模型中研究。癌细胞与经分离人类PBMC以指定的效应子-对-目标(E:T)比例于皮下给药前即刻混合。各小鼠与癌细胞与人类PBMC的混合物于两侧接种。各试验组分派四只动物。测试对象的第一剂量于癌/效应子细胞的植入后于第1日腹腔给药。每周二次于各个动物观察肿瘤形成。肿瘤由卡尺测量以及肿瘤体积(V)使用下式计算:
V(mm3)＝0.5(长度(mm)×宽度(mm)×宽度(mm)/2)。
小鼠(n＝5/群)皮下植入人类NSCLC细胞NCI-H292以及新鲜经分离的人类PBMC的混合物(癌细胞:PBMC＝3:1)。抗-PD-L1(PL2#3)及抗-VEGF(HLX04)抗体自第1日每周二次腹腔注射至小鼠。肿瘤生长曲线示于第22A图。第21日的个别肿瘤体积呈现于第22B图。所有数据点为平均±SEM。
数据说明组合抗-PD-L1单克隆抗体，PL2#3，与抗-VEGF单克隆抗体，HLX04，相较于单独使用试剂，更为有效地抑制NCI-H292异种移植(xenograft)的肿瘤生长。
实施例18
去糖基化PL3#7-19及PL3#7-43变异体的平恒解离常数(KD)的测定
N-糖基化发生于序列段N-X-S/T。因此，于亲代PL3#7-19及PL3#7-43中的N-糖基化位点位于L-CDR2。通过序列段库的S/T突变为与PL3#7为相同或类似氨基酸(亦即，PL3#7-19去糖基1、去糖基3以及PL3#7-43去糖基1)，或直接突变糖基化的N为Q(亦即，PL3#7-19去糖基3及PL3#7-43去糖基2)，来进行N-糖基化位点的移除。除了被工程化排除N糖基化的L-CDR2之外，去糖基化变异体的L-CDR1、L-CDR3、及H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3区皆保留无变化。于此所测试的所有去糖基化变异体经克隆至人类IgG Fc骨架的N297A突变体以与亲代PL3#7-19及PL3#7-43变异体并列比较。
去糖基化抗-PD-L1变异体(亦即PL3#7-19去糖基1、去糖基2、去糖基3以及PL3#7-43去糖基1、去糖基2)亲和性及动力学由生物层干涉方法测量，使用Octet RED96(ForteBio)***利用AHC抗-人类-Fc捕捉传感器于25℃，1000rpm的振荡速度测量。简明地，黑色96-孔盘以含有200μL/孔的用于亲和性测定所需要的试剂的管柱制备。一般而言，Octet抗-人类-Fc传感器首先置于含有1×动力学缓冲液(PBS、0.1％BSA、0.02％Tween-20，pH 7.4)的孔180秒以建立基线。然后将传感器转移至含有10μg/mL抗-PD-L1变异体的孔600秒以负载抗-人类-Fc尖端。然后将传感器置于新鲜的1×动力学缓冲液180秒以建立基线。然后培养传感器于含有hPD-L1-His的孔中3分钟测量结合，接着转移至含有1×动力学缓冲液的孔持续10分钟，以测量解离。然后传感器每次于再生缓冲液(10mM甘氨酸，pH1.5)中培养3×5秒，接着于1×动力学缓冲液培养5秒而再生。测定各结合/解离循环的之前重复再生。动力学(ka、kd及KD)通过对四个结合/解离循环所测量数据的整体拟合测定，所述数据来自从21.3nM至0.79nM(对于一浓度之一缔合/解离循环)的1:3梯度稀释的具有1:1Langmuir结合模型的hPD-L1–His的。所有数据利用Octet数据分析软件版本9.0分析，表示重复两次进行的二个独立的试验。
表12显示通过ForteBio Octet RED96机器(Menlo Park,CA,USA)使用生物层干涉方法所测量的去糖基化变异体的结合、解离动力学及计算的亲和性(KD)。相对于L-CDR2中具有N-糖基化位点的亲代变异体，去糖基化变异体的亲和性倍数差异显示于表12。所有数据表示重复两次进行的二个独立的试验。这些数据显示去糖基化变异体具有非常类似于亲代PL3#7-19及PL3#7-43的结合亲和性。亲和性不受L-CDR2中的N-糖基化位点移除的影响。
表12
平均(N＝2) ka[1/(M·s)] kd[1/s] <![CDATA[K<sub>D</sub>[M]]]> 倍数差异
PL3#7-19亲代mtIgG1 3.28E+05 2.07E-04 6.19E-10 1.00
PL3#7-19去糖基1mtIgG1 3.84E+05 1.62E-04 4.17E-10 1.48
PL3#7-19去糖基2mtIgG1 4.15E+05 1.51E-04 3.69E-10 1.68
PL3#7-19去糖基3mtIgG1 5.06E+05 1.76E-04 3.56E-10 1.74
Average(N＝2) ka[1/(M·s)] kd[1/s] <![CDATA[K<sub>D</sub>[M]]]> 倍数差异
PL3#7-43亲代mtIgG1 6.28E+05 2.12E-04 3.45E-10 1.00
PL3#7-43去糖基1mtIgG1 6.12E+05 2.71E-04 4.39E-10 0.79
PL3#7-43去糖基2mtIgG1 6.00E+05 2.38E-04 3.95E-10 0.87
前述实施例仅用于说明目的，不以任何方式意图限制本发明的范畴。除了本文所示以及所述以外的本发明的各种修改，为所属技术领域中具有通常知识者根据前文叙述明显可知，且落入本申请专利范围的范畴。
具体实施例列表
本发明所提供的具体例包括，但不限于:
1.一种抗-PD-L1抗体(PL1)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR-H3。
2.一种抗-PD-L1抗体(PL2)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的CDR-H3。
3.一种抗-PD-L1抗体(PL3)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
4.一种抗-PD-L1抗体(PL6)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的CDR-H3。
5.一种抗-PD-L1抗体(PL8)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-H3。
6.一种抗-PD-L1抗体(PL12)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及
(3)包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的CDR-H3。
7.一种抗-PD-L1抗体(PL15)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-H3。
8.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL2#3)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-H3。
9.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL3#7)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的CDR-H3。
10.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL3#7-19)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-H3。
11.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL3#7-43)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列的CDR-H3。
12.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL3#7-54)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的CDR-H3。
13.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL2#4)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-H3。
14.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL2#5)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的CDR-H3。
15.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL2#39)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H3。
16.一种抗-PD-L1抗体变异体(PL3#1)，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L1；
(2)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-L2；及
(3)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-H1；
(2)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR-H2；及(3)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-H3。
17.如具体例10的抗-PD-L1抗体变异体，其中，该抗-PD-L1抗体变异体包含CDR-L2，该CDR-L2于N-糖基化位点包含一或多个突变。
18.如具体例11的抗-PD-L1抗体变异体，其中，该抗-PD-L1抗体变异体包含CDR-L2，该CDR-L2于N-糖基化位点包含一或多个突变。
19.一种具体例1至18中任一者的抗-PD-L1抗体或其变异体或其抗原结合片段，其中，该抗原结合片段选自:Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv(scFv)、Fv片段、双功能抗体、及线性抗体。
20.如具体例1至19中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，其中，该抗体为多特异性抗体。
21.如具体例1至20中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，其接合至治疗剂。
22.如具体例1至21中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，其接合至标记。
23.如具体例22的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，其中，该标记选自:放射同位素、荧光染剂及酶。
24.一种经分离的核酸分子，其编码具体例1至19中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体、或其抗原结合片段。
25.一种表达载体，其编码具体例24的核酸分子。
26.一种细胞，其包含具体例25的表达载体。
27.一种制造抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段的方法，该方法包含培养具体例26的细胞，以及自该细胞培养物回收抗体。
28.一种组合物，其包含具体例1至23中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，以及医药可接受载体。
29.一种于来自患者的样品中检测PD-L1的方法，该方法通过将具体例1至20中任一者的抗-PD-L1抗体、其变异体或其抗原结合片段，接触该样品，以及检测结合至PD-L1蛋白质的抗-PD-L1抗体。
30.如具体例29的方法，其中，该抗-PD-L1抗体、其变异体、或其抗原结合片段使用免疫组织化学检测(IHC)或使用于ELISA检测。
31.一种于个体治疗癌症的方法，包含对个体投与有效量的具体例28的组合物。
32.如具体例31的方法，其中，该癌症选自:黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤(cHL)、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌(NPC)、胆管癌、直肠癌、乳癌、子***、甲状腺癌及唾腺癌。
33.如具体例31的方法，其中，该个体进一步投与选自下述的治疗剂:抗肿瘤剂、化疗剂、生长抑制剂及细胞毒性剂。
34.如具体例31的方法，其中，该个体系进一步投与放射疗法。
序列列表
SEQ ID NO:1(PL1_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:2(PL2_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:3(PL3_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:4(PL6_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:5(PL8_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:6(PL12_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:7(PL15_LCAA序列,参见第1A图)
SEQ ID NO:8(PL1_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:9(PL2_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:10(PL3_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:11(PL6_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:12(PL8_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:13(PL12_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:14(PL15_HCAA序列,参见第1B图)
SEQ ID NO:15(PL2#3_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGAGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTACGTCGGGTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGAGATATGGCGGAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:16(PL2#3_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYIESSYVGWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCEIWRSGLGGVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:17(PL2#3_VHnt序列)
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCACAAGCAGGTGCTTTTGATCGATGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:18(PL2#3_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPQAGAFDRWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:19(PL3#7_VL nt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:20(PL3#7_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSARVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:21(PL3#7_VHnt序列)
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATAGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGGATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:22(PL3#7_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWIGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:23(PL3#7-19_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCACGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:24(PL3#7-19_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSTRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:25(PL3#7-19_VHnt序列)
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATGTGTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:26(PL3#7-19_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYAFGAFDVWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:27(PL3#7-43_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGTCTTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:28(PL3#7-43_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRSSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:29(PL3#7-43_VHnt序列)
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGACCGGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:30(PL3#7-43_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRPGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:31(PL3#7-54_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGCAGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:32(PL3#7-54_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGQGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYANSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSARVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:33(PL3#7-54_VHnt序列)
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAGATTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGACCGGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:34(PL3#7-54_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIADYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRPGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:35(CDR-L1 of PL1_LC):TGSSSNVGAGYDVH
SEQ ID NO:36(CDR-L1 of PL2_LC):SGSSS.YIESSYVS
SEQ ID NO:37(CDR-L1 of PL3_LC):TGSSSNIGAGYDVH
SEQ ID NO:37(CDR-L1 of PL6_LC):TGSSSNIGAGYDVH
SEQ ID NO:38(CDR-L1 of PL8_LC):QGDSLRSYYVS
SEQ ID NO:39(CDR-L1 of PL12_LC):TRSSSNIGAGHDVH
SEQ ID NO:40(CDR-L1 of PL15_LC):TGYSSNIGAGYDVH
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL1_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:42(CDR-L2 of PL2_LC):DDDMRPS
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL3_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL6_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:43(CDR-L2 of PL8_LC):GKNNRPS
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL12_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL15_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:44(CDR-L3 of PL1_LC):QSYDSSLSGWV
SEQ ID NO:45(CDR-L3 of PL2_LC):EIWDSGLGGV
SEQ ID NO:46(CDR-L3 of PL3_LC):QSYDSSLSAPVV
SEQ ID NO:47(CDR-L3 of PL6_LC):QSYDSSLSGGV
SEQ ID NO:48(CDR-L3 of PL8_LC):NSRDSTGNLLRV
SEQ ID NO:49(CDR-L3 of PL12_LC):QSYDSSLTGVV
SEQ ID NO:50(CDR-L3 of PL15_LC):QSYDNSLSVSV
SEQ ID NO:51(CDR-H1 of PL1_HC):SYAIS
SEQ ID NO:52(CDR-H1 of PL2_HC):SYTMN
SEQ ID NO:53(CDR-H1 of PL3_HC):SYTIS
SEQ ID NO:54(CDR-H1 of PL6_HC):SYTIN
SEQ ID NO:51(CDR-H1 of PL8_HC):SYAIS
SEQ ID NO:51(CDR-H1 of PL12_HC):SYAIS
SEQ ID NO:53(CDR-H1 of PL15_HC):SYTIS
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL1_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:56(CDR-H2 of PL2_HC):SISSGSDYLYYADSVKG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL3_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:57(CDR-H2 of PL6_HC):KIIPILGIADYAQMFKG
SEQ ID NO:58(CDR-H2 of PL8_HC):RIIPIFGTANYAQKFQG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL12_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL15_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:59(CDR-H3 of PL1_HC):EGSSGWLGVLDY
SEQ ID NO:60(CDR-H3 of PL2_HC):NELRWYPQAGAFDI
SEQ ID NO:61(CDR-H3 of PL3_HC):SRDGYSFGAFDI
SEQ ID NO:62(CDR-H3 of PL6_HC):GGYVGYLNAFDI
SEQ ID NO:63(CDR-H3 of PL8_HC):EGVLDAFDI
SEQ ID NO:64(CDR-H3 of PL12_HC):GIGSYSFGAFDI
SEQ ID NO:61(CDR-H3 of PL15_HC):SRDGYSFGAFDI
SEQ ID NO:65(CDR-L1 of PL2#3_LC):SGSSSYIESSYVG
SEQ ID NO:37(CDR-L1 of PL3#7_LC):TGSSSNIGAGYDVH
SEQ ID NO:66(CDR-L1 of PL3#7-19_LC):TGSSSNIGGGYDVH
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SEQ ID NO:42(CDR-L2 of PL2#3_LC):DDDMRPS
SEQ ID NO:41(CDR-L2 of PL3#7_LC):GNSNRPS
SEQ ID NO:68(CDR-L2 of PL3#7-19_LC):GNSTRPS
SEQ ID NO:69(CDR-L2 of PL3#7-43_LC):GNSNRSS
SEQ ID NO:70(CDR-L2 of PL3#7-54_LC):ANSNRPS
SEQ ID NO:71(CDR-L3 of PL2#3_LC):EIWRSGLGGV
SEQ ID NO:72(CDR-L3 of PL3#7_LC):QTYDSSLSARVV
SEQ ID NO:73(CDR-L3 of PL3#7-19_LC):QTYDSSLSATVV
SEQ ID NO:74(CDR-L3 of PL3#7-43_LC):QTYDSSGSARVV
SEQ ID NO:72(CDR-L3 of PL3#7-54_LC):QTYDSSLSARVV
SEQ ID NO:52(CDR-H1 of PL2#3_HC):SYTMN
SEQ ID NO:75(CDR-H1 of PL3#7_HC):SYPIS
SEQ ID NO:75(CDR-H1 of PL3#7-19_HC):SYPIS
SEQ ID NO:75(CDR-H1 of PL3#7-43_HC):SYPIS
SEQ ID NO:75(CDR-H1 of PL3#7-54_HC):SYPIS
SEQ ID NO:56(CDR-H2 of PL2#3_HC):SISSGSDYLYYADSVKG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL3#7_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL3#7-19_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL3#7-43_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:76(CDR-H2 of PL3#7-54_HC):RIIPILGIADYAQKFQG
SEQ ID NO:77(CDR-H3 of PL2#3_HC):NELRWYPQAGAFDR
SEQ ID NO:78(CDR-H3 of PL3#7_HC):SRDGYAFGAFDI
SEQ ID NO:79(CDR-H3 of PL3#7-19_HC):SRDGYAFGAFDV
SEQ ID NO:80(CDR-H3of PL3#7-43_HC):SRPGYAFGAFDI
SEQ ID NO:81(CDR-H3of PL3#7-54_HC):SRPGYAFGAFDI
SEQ ID NO:82(PL2#4_VL nt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAGTTAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTATGTCTCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCAAGATATGGGATAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:83(PL2#4_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGVSSYIESSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCKIWDSGLGGVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:84(PL2#4_VHnt序列)
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCACTTGCAGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:85(PL2#4_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPLAGAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:86(PL2#5_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCAGTGGAAGCAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTATGTCTCATGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGAGATATGGGATAGCCGGCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:87(PL2#5_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYIESSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCEIWDSRLGGVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:88(PL2#5_VHnt序列)
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCATTTGCAGGTGCTTTTGATATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:89(PL2#5_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPFAGAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:90(PL2#39_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCTACATTACGAGTTCTTATGTCTCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCAAGATATGGGATAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:91(PL2#39_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYITSSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCKIWDSGLGGVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:92(PL2#39_VHnt序列)
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCAAAGGCAGGTGCTTTTGATATATGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:93(PL2#39_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPKAGAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:94(CDR-L1 of PL2#4_LC):SGVSSYIESSYVS
SEQ ID NO:97(CDR-L1 of PL2#5_LC):SGSSSYIESSYVS
SEQ ID NO:100(CDR-L1 of PL2#39_LC):SGSSSYITSSYVS
SEQ ID NO:42(CDR-L2 of PL2#4_LC):DDDMRPS
SEQ ID NO:42(CDR-L2 of PL2#5_LC):DDDMRPS
SEQ ID NO:42(CDR-L2 of PL2#39_LC):DDDMRPS
SEQ ID NO:95(CDR-L3 of PL2#4_LC):KIWDSGLGGV
SEQ ID NO:98(CDR-L3 of PL2#5_LC):EIWDSRLGGV
SEQ ID NO:95(CDR-L3 of PL2#39_LC):KIWDSGLGGV
SEQ ID NO:52(CDR-H1 of PL2#4_HC):SYTMN
SEQ ID NO:52(CDR-H1 of PL2#5_HC):SYTMN
SEQ ID NO:52(CDR-H1 of PL2#39_HC):SYTMN
SEQ ID NO:56(CDR-H2 of PL2#4_HC):SISSGSDYLYYADSVKG
SEQ ID NO:56(CDR-H2 of PL2#5_HC):SISSGSDYLYYADSVKG
SEQ ID NO:56(CDR-H2 of PL2#39_HC):SISSGSDYLYYADSVKG
SEQ ID NO:96(CDR-H3 of PL2#4_HC):NELRWYPLAGAFDI
SEQ ID NO:99(CDR-H3 of PL2#5_HC):NELRWYPFAGAFDI
SEQ ID NO:101(CDR-H3 of PL2#39_HC):NELRWYPKAGAFDI
SEQ ID NO:102(PL3#1_VLnt序列)
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACCTATGACAGCAGCCTGAGTCGTCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:103(PL3#1_VLAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSRPVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:104(PL3#1_VHnt序列)
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATAGGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACAGTGTGGGTGCTTTTGATTCGTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
SEQ ID NO:105(PL3#1_VHAA序列(Underscore:Kabat defined CDRs))
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYRISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYSVGAFDSWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:37(CDR-L1 of PL3#1_LC):TGSSSNIGAGYDVH
SEQ ID NO:106(CDR-L2 of PL3#1_LC):GNSRRPS
SEQ ID NO:107(CDR-L3 of PL3#1_LC):QTYDSSLSRPVV
SEQ ID NO:108(CDR-H1 of PL3#1_HC):SYRIS
SEQ ID NO:55(CDR-H2 of PL3#1_HC):RIIPILGIANYAQKFQG
SEQ ID NO:109(CDR-H3 of PL3#1_HC):SRDGYSVGAFDS
SEQ ID NO:110(PL3#7-19去糖基1_VLnt序列(下加底线:L-CDR2))
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:111(PL3#7-19deglyco1_VLAA序列(下加底线:Kabat定义CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:112(PL3#7-19去糖基2_VLnt序列(下加底线:L-CDR2))
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCAGAGCACGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:113(PL3#7-19去糖基2_VLAA序列(下加底线:Kabat定义CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSTRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:114(PL3#7-19去糖基3_VLnt序列(下加底线:L-CDR2))
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCCAACGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:115(PL3#7-19去糖基3_VLAA序列(下加底线:Kabat定义CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:116(PL3#7-43去糖基1_VLnt序列(下加底线:L-CDR2))
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:117(PL3#7-43去糖基1_VLAA序列(下加底线:Kabat定义CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO:118(PL3#7-43去糖基2_VLnt序列(下加底线:L-CDR2))
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCCAACGGTCTTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO:119(PL3#7-43去糖基2_VLAA序列(下加底线:Kabat定义CDRs))
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSQRSSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL

Claims (27)

1.一种抗-PD-L1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 65的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(2) SEQ ID NO: 42的氨基酸序列所示的CDR-L2；及
(3)SEQ ID NO: 71的氨基酸序列所示的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 52的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(2) SEQ ID NO: 56的氨基酸序列所示的CDR-H2；及
(3) SEQ ID NO: 77的氨基酸序列所示的CDR-H3。
2.一种抗-PD-L1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 66的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(2) SEQ ID NO: 68的氨基酸序列所示的CDR-L2；及
(3) SEQ ID NO: 73的氨基酸序列所示的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 75的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(2) SEQ ID NO: 55的氨基酸序列所示的CDR-H2；及
(3) SEQ ID NO: 79的氨基酸序列所示的CDR-H3。
3.一种抗-PD-L1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 35的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(2) SEQ ID NO: 69的氨基酸序列所示的CDR-L2；及
(3) SEQ ID NO: 74的氨基酸序列所示的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 75的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(2) SEQ ID NO: 55的氨基酸序列所示的CDR-H2；及
(3) SEQ ID NO: 80的氨基酸序列所示的CDR-H3。
4.一种抗-PD-L1抗体，包含轻链(LC)可变区序列，该轻链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 67的氨基酸序列所示的CDR-L1；
(2) SEQ ID NO: 70的氨基酸序列所示的CDR-L2；及
(3) SEQ ID NO: 72的氨基酸序列所示的CDR-L3；
以及重链(HC)可变区序列，该重链可变区序列包含:
(1) SEQ ID NO: 75的氨基酸序列所示的CDR-H1；
(2) SEQ ID NO: 76的氨基酸序列所示的CDR-H2；及
(3) SEQ ID NO: 81的氨基酸序列所示的CDR-H3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-L1抗体的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自: Fab、Fab’、F(ab)’2、单链Fv (scFv)、Fv片段、双功能抗体、及线性抗体。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为多特异性抗体。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段与标记物结合。
8.根据权利要求7所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述标记物选自: 放射同位素、荧光染剂及酶。
9.一种偶联物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段和治疗剂。
10.根据权利要求9所述的偶联物，其中所述治疗剂是抗肿瘤剂。
11.根据权利要求9所述的偶联物，其中所述治疗剂是化疗剂。
12.根据权利要求9所述的偶联物，其中所述治疗剂是生长抑制剂。
13.根据权利要求9所述的偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂。
14.一种经分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段。
15.一种表达载体，其编码根据权利要求14所述的核酸分子。
16.一种细胞，其包含根据权利要求15所述的表达载体。
17.一种产生抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养根据权利要求16所述的细胞，以及从所述细胞的培养物回收该抗体。
18.一种组合物，包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段或偶联物，以及医药可接受载体。
19.根据权利要求1至6中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于在来自患者的样品中检测PD-L1的方法，该方法将根据权利要求1至6中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段，接触所述样品，并检测结合至PD-L1蛋白质的抗-PD-L1抗体。
20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段使用免疫组织化学检测(IHC)或使用于ELISA检测。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段或偶联物在制备用于对个体治疗癌症的药物中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述癌症选自: 黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、泌尿上皮癌、三阴性乳腺癌、胃癌、典型何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤原发性纵膈B细胞淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、肺癌、食道癌、鼻咽癌、胆管癌、直肠癌、乳癌、子***、甲状腺癌及唾液腺癌。
23.根据权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述药物与抗肿瘤剂组合。
24.根据权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述药物与化疗剂组合。
25.根据权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述药物与生长抑制剂组合。
26.根据权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述药物与细胞毒性剂组合。
27.根据权利要求21或22所述的用途，其特征在于，所述药物与放射疗法组合。
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