CN109957588A

CN109957588A - 一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基

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Publication number: CN109957588A
Application number: CN201910351695.0A
Authority: CN
Inventors: 王蕾; 张兴娟; 夏思毅
Original assignee: Jiangsu Chunziyu Biotechnology Development Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Birch Forest Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-28
Filing date: 2019-04-28
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2039-04-28
Also published as: CN109957588B

Abstract

本发明公开了一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，该培养基由一定浓度的以下组分组成：NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、K₂HPO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、KI、H₃BO₃、ZnSO₄·7H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、柠檬酸铁、肌醇、牛磺酸、甘氨酸、天冬酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素E、辅酶R、蔗糖、甘露糖、玉米醇溶蛋白、6‑BA、2，4‑D、烯腺嘌呤、二环己基碳二亚胺、羟基酪醇、花生四烯酸、硫氢化钠、甘草提取液。本发明的培养基根据太子参悬浮细胞的生长代谢特点，优化了基本组分，调整了植物激素配比，提高了碳源浓度，并添加多种营养物质、诱导子、抗氧化剂、植物提取液来提升培养效果，使太子参悬浮细胞的生长量和多糖含量显著提高，具有良好的推广前景。

Description

一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基

技术领域

本发明涉及一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，属于细胞培养技术领域。

背景技术

太子参又名孩儿参、童参，是石竹科孩儿参属的一种多年生草本植物，其干燥块根是《中国药典》（第五版）中收载的常用补益类中药，具有益气健脾、生津润肺之功效，临床常用于治疗脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴和肺燥干咳等。民间常用作强壮滋补品，尤其用于治疗小儿脾虚而食欲不振。现代医学研究表明，太子参具有抗疲劳、抗应激、增强机体免疫、延长寿命、镇咳、抗病毒等作用，在治疗和降低肝脏病、心脑血管病、糖尿病、哮喘病、肠胃道疾病、***疾病、肿瘤和白血病等常见病、多发病方面具有广阔的应用前景，是集保健、预防、治疗和营养为一体的新型高科技生物医疗保健品。药用植物中的多糖类物质具备多种生理活性和较高的药用价值，可以视为滋养补益类中药的重要质量评定指标。国内外通过对太子参药用成分的***分析，目前已分离出多糖、环肽、氨基酸、皂苷、黄酮、微量元素等多种类型生物活性成分，其中多糖是含量最高的活性成分。

野生太子参分布广泛，近些年来，随着太子参功能性保健品、食品的开发问世，以及太子参在临床上的大量使用，野生资源日渐减少，原药材市场需求量逐年加大，药材价格也随之攀升，人工栽培种植已成为太子参商品药材的主要来源，不少地区如江苏、福建、山东、安徽、贵州、湖南、江西等省都建立了太子参规范种植基地。但是在太子参的人工栽培种植过程中往往存在着一些问题，如太子参的生长周期较长，易受季节、气候、病虫害的影响；不同产地的太子参其药效成分含量差异显著，导致市场上太子参药材品质参差不齐；太子参大面积生产多采用无性繁殖，易感染病毒病（花叶病），严重影响太子参的产量和质量。

植物细胞培养技术是以离体植物细胞或原生质体为对象，以细胞量扩增和目标代谢产物累积为目的的培养工艺。采用植物细胞培养技术生产植物有效成分，具有高效、迅速和季节限制性小及保护生态环境等优点，是解决药材资源问题的有效途径之一。但植物细胞培养的弊端之一是有效成分的含量不稳定，这主要是由于大多数有效成分均为次生代谢产物，其在细胞阶段合成表现不强，因此制约了其商业化生产的进程。就太子参而言，关于其愈伤组织和悬浮细胞培养已经有学者进行了研究，但是在现有的悬浮培养体系下，无论是太子参细胞的生长量还是太子参多糖的积累都处于较低水平，未取得理想的效果。

在植物细胞的培养过程中，培养基是影响植物细胞生长和次生代谢产物合成的重要因素之一，对于以获得特定代谢产物为目的的植物细胞培养而言，培养基往往是影响培养效率的关键因素。在培养基中添加一些诱导子是提高植物细胞中次生代谢产物含量的有效方法。本研究团队在现有技术的基础上，通过不断的试验，摸索出了本发明的诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，对于实现太子参细胞大规模培养和次级代谢产物的商业化生产具有较大的现实意义和实用价值。

发明内容

为了获得太子参高产细胞系，实现太子参细胞大规模培养和次级代谢产物的商业化生产，本发明提供了一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，其特征在于，该培养基的各组分及浓度为：NH₄NO₃818~840mg/L，KNO₃1800~2000mg/L，KH₂PO₄ 138~150mg/L，K₂HPO₄ 123~141mg/L，MgSO₄·7H₂O 177~193mg/L，CaCl₂·2H₂O 136~156mg/L，KI 0.76~0.82mg/L，H₃BO₃6.0~6.6mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.5~4.0mg/L，MnSO₄·4H₂O 18.5~20.5mg/L， CuSO₄·5H₂O0.12~0.18mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.23~0.27mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，柠檬酸铁40~44mg/L，肌醇130~150mg/L，牛磺酸3.5~3.9mg/L，甘氨酸2.3~3.0mg/L，天冬酰胺3.4~3.8mg/L，维生素B1 0.22~0.26mg/L，维生素B6 0.85~0.95mg/L，维生素E 1.2~1.4mg/L，辅酶R0.44~0.52mg/L，蔗糖27~33g/L，甘露糖21~25g/L，玉米醇溶蛋白14~16mg/L，6-BA 0.25~0.35mg/L，2，4-D 0.8~1.2mg/L，烯腺嘌呤0.46~0.54mg/L，二环己基碳二亚胺3.8~4.2mmol/L，羟基酪醇0.7~1.0mg/L，花生四烯酸 2.5~3.5mg/L，硫氢化钠90~110μmol/L，甘草提取液25~30mL/L。

所述培养基的pH值为5.5~5.9。

所述甘草提取液的制备方法为：将甘草新鲜植株洗净干燥后，研磨成粒度为80~100目的粉末，将粉末与体积分数为70%的乙醇按重量比1:5混合，于60℃、300W条件下超声水浴85min，过滤，取滤液，得到甘草提取液。

所述培养基用于太子参悬浮细胞的培养。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：

本发明的液体培养基是根据太子参悬浮细胞的生长代谢特点，经过大量实验筛选得到组分及其浓度。该培养基优化了基本组分，如适当降低NH₄NO₃、Ca²⁺离子浓度，提高磷酸盐浓度，使用柠檬酸铁作为铁盐，在蔗糖的基础上又添加甘露糖作为碳源，使碳源浓度提高，形成高糖培养环境；调整了6-BA、2，4-D、烯腺嘌呤三种植物激素的配比；添加了多种营养物质、诱导子、抗氧化剂和植物提取液如牛磺酸、天冬酰胺、维生素E、辅酶R、玉米醇溶蛋白、二环己基碳二亚胺、羟基酪醇、花生四烯酸、硫氢化钠以及甘草提取液。通过这些因素的综合作用来提升培养效果，使太子参悬浮细胞的生长量和多糖含量显著提高，为太子参悬浮细胞大规模培养、太子参多糖商业化生产奠定基础。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，该培养基的各组分及浓度为：NH₄NO₃829mg/L，KNO₃1900mg/L，KH₂PO₄ 144mg/L，K₂HPO₄ 132mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，CaCl₂·2H₂O 146mg/L，KI 0.79mg/L，H₃BO₃6.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.75mg/L，MnSO₄·4H₂O19.5mg/L， CuSO₄·5H₂O 0.15mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，柠檬酸铁42mg/L，肌醇140mg/L，牛磺酸3.7mg/L，甘氨酸2.7mg/L，天冬酰胺3.6mg/L，维生素B10.24mg/L，维生素B6 0.9mg/L，维生素E 1.3mg/L，辅酶R 0.48mg/L，蔗糖30g/L，甘露糖23g/L，玉米醇溶蛋白15mg/L，6-BA 0.2mg/L，2，4-D 1.0mg/L，烯腺嘌呤0.5mg/L，二环己基碳二亚胺4.0mmol/L，羟基酪醇0.85mg/L，花生四烯酸 3.0mg/L，硫氢化钠100μmol/L，甘草提取液28mL/L；pH值为5.7；其中甘草提取液的制备方法为：将甘草新鲜植株洗净干燥后，研磨成粒度为80~100目的粉末，将粉末与体积分数为70%的乙醇按重量比1:5混合，于60℃、300W条件下超声水浴85min，过滤，取滤液，得到甘草提取液。

太子参悬浮细胞培养方法参照文献《太子参愈伤组织培养及悬浮细胞系建立的研究》中的方法：以太子参无菌苗的幼嫩叶片作为外植体，接种于MS+0.2mg/L BA+2.0mg/L 2，4-D培养基上诱导产生愈伤组织，将愈伤组织转接到MS+0.2mg/L BA+1.0mg/L 2，4-D培养基上进行多次继代增殖，将增殖所得的生长均匀、质地松散、淡黄色半透明状的愈伤组织转移到本发明的液体培养基中进行振荡悬浮培养，建立悬浮细胞系，培养条件为25℃、暗培养，摇床转速为120r/min，培养30d时收获太子参悬浮细胞。

细胞干重增殖倍数测定方法：将悬浮细胞培养液倒入布氏漏斗，经真空抽滤除去培养基，去离子水淋洗细胞3次，持续抽滤至无滤液，然后置于50℃烘干至恒重，称重为细胞干重。细胞干重增殖倍数=（收获时细胞干重-接种时细胞干重）/接种时细胞干重。

太子参多糖含量测定方法：将烘干至恒重的细胞粉碎，称取0.2g粉末，加20mL 80%乙醇，90℃水浴回流1h，重复1次，趁热抽滤，滤渣用热80%乙醇洗涤；挥干溶剂后，滤渣连同滤纸置于烧瓶中，加20mL蒸馏水，100℃水浴浸提1h，趁热过滤，滤渣重复提取1次，合并滤液，离心分离，上清液置于100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；取0.1mL供试品溶液，加入1.9mL 蒸馏水、1.0mL苯酚试液、5.0mL 98%浓硫酸，混匀后于490nm处测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算多糖含量。

实施例2

玉米醇溶蛋白对太子参细胞生长及多糖含量的影响：按照实施例1中的培养基组分及浓度制备液体培养基，其中将添加的玉米醇溶蛋白的浓度设置为5、10、15、20mg/L，以未添加玉米醇溶蛋白作为对照，比较不同玉米醇溶蛋白浓度下的太子参悬浮细胞干重增殖倍数和多糖含量，结果见表1。

由表1可见，添加试验浓度范围内的玉米醇溶蛋白均能有效促进太子参细胞生长和多糖的合成；随着玉米醇溶蛋白浓度的增加，细胞干重增殖倍数逐渐增大，但多糖含量在玉米醇溶蛋白浓度为15mg/L时达到最大值，为138.22mg/g，因此选择15mg/L作为玉米醇溶蛋白的最适浓度。

实施例3

二环己基碳二亚胺对太子参细胞生长及多糖含量的影响：按照实施例1中的培养基组分及浓度制备液体培养基，其中将添加的二环己基碳二亚胺的浓度设置为2.0、4.0、6.0、8.0mmol/L，以未添加二环己基碳二亚胺作为对照，比较不同二环己基碳二亚胺浓度下的太子参悬浮细胞干重增殖倍数和多糖含量，结果见表2。

二环己基碳二亚胺能够促进NO的合成，NO是一种气体生物信号分子，广泛参与植物细胞生长代谢过程，影响次生代谢产物合成基因的表达。由表2可见，随着二环己基碳二亚胺浓度的增加，细胞干重增殖倍数先增大后减小，当二环己基碳二亚胺浓度为4.0mmol/L时，细胞干重增殖倍数达到6.21倍，为最大值；多糖含量的变化趋势与细胞干重一致，当二环己基碳二亚胺浓度为4.0mmol/L时，多糖含量达到132.66 mg/g，也达到最大值，因此选择4.0mmol/L为二环己基碳二亚胺的最适浓度。

实施例4

花生四烯酸对太子参细胞生长及多糖含量的影响：按照实施例1中的培养基组分及浓度制备液体培养基，其中将添加的花生四烯酸的浓度设置为1.0、3.0、5.0、7.0mg/L，以未添加花生四烯酸作为对照，比较不同花生四烯酸浓度下的太子参悬浮细胞干重增殖倍数和多糖含量，结果见表3。

花生四烯酸属于不饱和脂肪酸类的诱导子，在细胞内作为第二信使直接或间接调节信号转导，从而影响细胞代谢活动。由表3可见，随着花生四烯酸浓度的增加，细胞干重增殖倍数先增大后减小，当花生四烯酸浓度为3.0mg/L时，细胞干重增殖倍数达到6.35倍，为最大值；多糖含量的变化趋势与细胞干重一致，当花生四烯酸浓度为3.0mg/L时，多糖含量达到139.60mg/g，也达到最大值，因此选择3.0mg/L 为花生四烯酸的最适浓度。

实施例5

硫氢化钠对太子参细胞生长及太子参多糖积累的影响：按照实施例1中的培养基组分及浓度制备液体培养基，其中将添加的硫氢化钠的浓度设置为50、100、150、200μmol/L，以未添加硫氢化钠作为对照，比较不同硫氢化钠浓度下的太子参悬浮细胞干重增殖倍数和多糖含量，结果见表4。

硫氢化钠是H₂S供体，H₂S也是一种生物信号分子，同样对植物细胞的生长代谢过程有着调控作用，影响着次生代谢产物合成基因的表达，但H₂S以及硫氢化钠有毒性，对植物细胞也存在着毒害作用。由表4可见，随着硫氢化钠浓度的逐渐增加，细胞干重增殖倍数逐渐减小，说明添加硫氢化钠对太子参悬浮细胞的生长具有一定的抑制作用；而与对照组相比，添加不同浓度的硫氢化钠都能促进细胞内多糖的积累，当添加的硫氢化钠浓度为100μmol/L时，多糖含量为142.07mg/g，达到最大值，随着硫氢化钠浓度的进一步增加，对多糖积累的促进作用逐渐减弱，因此较低浓度的硫氢化钠更有利于太子参细胞中多糖的积累，选择100μmol/L作为硫氢化钠的最适浓度。

实施例6

为了比较本发明的培养基与现有技术的差异，采用文献《太子参愈伤组织培养及悬浮细胞系建立的研究》中的液体悬浮培养基（MS+0.2mg/L BA+1.0mg/L 2，4-D1.0+1.0mg/LKT，pH值5.8）作为对照，将实施例1中增殖所得的愈伤组织转移到该培养基中进行振荡悬浮培养，建立悬浮细胞系，培养条件为25℃、暗培养，摇床转速为120r/min，培养30d时收获太子参悬浮细胞，测定细胞干重增殖倍数和多糖含量，结果见表5。

从表5可知，使用本发明的培养基对太子参悬浮细胞进行培养，其细胞干重增殖倍数和多糖含量分别为6.33倍和139.15mg/g，显著高于使用对照培养基的4.88倍和96.27mg/g，表明本发明的培养基具有更好的培养效果，有利于太子参悬浮细胞的生长量积累和多糖合成。本发明的培养基是经过大量实验筛选得到的最优组合，本发明的培养基通过优化基本组分，提高碳源浓度，形成高糖培养环境，调整植物激素配比，添加多种营养物质、诱导子、抗氧化剂和植物提取液如牛磺酸、天冬酰胺、维生素E、辅酶R、玉米醇溶蛋白、二环己基碳二亚胺、羟基酪醇、花生四烯酸、硫氢化钠以及甘草提取液等手段来提升培养效果，具有良好的推广前景。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims

1.一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，其特征在于，该培养基的各组分及浓度为：NH₄NO₃818~840mg/L，KNO₃1800~2000mg/L，KH₂PO₄ 138~150mg/L，K₂HPO₄ 123~141mg/L，MgSO₄·7H₂O 177~193mg/L，CaCl₂·2H₂O 136~156mg/L，KI 0.76~0.82mg/L，H₃BO₃6.0~6.6mg/L，ZnSO₄·7H₂O 3.5~4.0mg/L，MnSO₄·4H₂O 18.5~20.5mg/L， CuSO₄·5H₂O0.12~0.18mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.23~0.27mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，柠檬酸铁40~44mg/L，肌醇130~150mg/L，牛磺酸3.5~3.9mg/L，甘氨酸2.3~3.0mg/L，天冬酰胺3.4~3.8mg/L，维生素B1 0.22~0.26mg/L，维生素B6 0.85~0.95mg/L，维生素E 1.2~1.4mg/L，辅酶R0.44~0.52mg/L，蔗糖27~33g/L，甘露糖21~25g/L，玉米醇溶蛋白14~16mg/L，6-BA 0.25~0.35mg/L，2，4-D 0.8~1.2mg/L，烯腺嘌呤0.46~0.54mg/L，二环己基碳二亚胺3.8~4.2mmol/L，羟基酪醇0.7~1.0mg/L，花生四烯酸 2.5~3.5mg/L，硫氢化钠90~110μmol/L，甘草提取液25~30mL/L。

2.根据权利要求1所述的一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为5.5~5.9。

3.根据权利要求1所述的一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，其特征在于，所述甘草提取液的制备方法为：将甘草新鲜植株洗净干燥后，研磨成粒度为80~100目的粉末，将粉末与体积分数为70%的乙醇按重量比1:5混合，于60℃、300W条件下超声水浴85min，过滤，取滤液，得到甘草提取液。

4.根据权利要求1所述的一种诱导太子参细胞高产太子参多糖的液体培养基，其特征在于，所述培养基用于太子参悬浮细胞的培养。