DNA聚合酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中,DNA聚合酶及其制备方法。
背景技术
DNA聚合酶以单链DNA为模板来合成互补DNA链。DNA聚合酶可将游离核苷酸加入新形成链的3'端,使新链在5'-3'方向延伸。
高保真DNA聚合酶是一种具有3'-5'DNA外切活性的DNA聚合酶,可利用单链DNA为引物,以DNA为模板进行DNA合成反应。当合成过程中掺入与模板不匹配的碱基时,可利用其3'-5'DNA外切活性将错配的碱基切除,然后重新掺入正确的碱基,因此具有校读(proof-reading)活性,即保真性。
来源于Thermococcus kodakaraensis(KOD)的KOD聚合酶是一种具有耐热性的高保真DNA聚合酶,DNA合成出错率约为7.6×10-6,比Taq酶的保真性高4倍,但与高保真PCR反应的使用需求相比仍有较大差距。同时由于存在3'-5'DNA外切的校读活性,因此其DNA延伸速度较低(约1000bp/min)。
为改进高保真DNA聚合酶性能,现有技术提供了以下方案:1、置换或加入其他的结构域:如将KOD聚合酶的DNA聚合结构域置换为Pfu聚合酶的DNA聚合结构域以提高其聚合活性(见专利US9023633.B2),如加入Sso7结构域以提高延伸性(见专利US8445249.B2);2、突变:有利的突变可增强酶的相关性能。
但上述方案中:新加入的结构域有可能影响原始酶的结构,因此其融合得到的新蛋白的性能并不是简单两者相加的结果,并且只能针对聚合酶的一种性能进行改变,难以对聚合酶的整体性能(保真性,扩增性、延伸速度等)进行提升。而现有的突变很难筛选出具有叠加效应的突变位点,对酶的性能改造有限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高KOD聚合酶在PCR中的延伸速度、保真性和PCR产物产量。为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种具有DNA聚合酶活性由KOD聚合酶突变得到的蛋白质,所述蛋白质为将序列表中序列1所示氨基酸序列中的第1025、681、1462、1347、357和1256位中的任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部进行突变得到的蛋白质。
所述蛋白质可为将序列表中序列1所示的氨基酸序列进行如下任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部的突变得到的蛋白质:
A1)将序列1的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、精氨酸残基或亮氨酸残基;
A2)将序列1的第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基;
A3)将序列1的第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基、苯丙氨酸残基或甘氨酸残基;
A4)将序列1的第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基或赖氨酸残基;
A5)将序列1的第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基、甲硫氨酸残基或谷氨酸残基;
A6)将序列1的第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基。
所述蛋白质具体可为下述B1)、B2)、B3)或B4):
B1)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质;
B2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质;
B3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为精氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为苯丙氨酸残基、第357位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基和第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的蛋白质;
B4)将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为亮氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为甘氨酸残基、第1347位的甘氨酸残基突变为赖氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的蛋白质。
为了使所述蛋白质便于纯化,可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 |
残基 |
序列 |
Poly-Arg |
5-6(通常为5个) |
RRRRR |
Poly-His |
2-10(通常为6个) |
HHHHHH |
FLAG |
8 |
DYKDDDDK |
Strep-tag II |
8 |
WSHPQFEK |
c-myc |
10 |
EQKLISEEDL |
本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料,所述生物材料为下述C1)-C5)中的任一种:
C1)编码所述蛋白质的核酸分子;
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒;
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体;
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物;
C5)含有C1)所述核酸分子的细胞系、或含有C2)所述表达盒的细胞系。
C1)所述核酸分子可为将序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子进行突变得到的核酸分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明的所述蛋白质的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸,只要编码所述蛋白质且具有所述蛋白质功能,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码所述蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列具有75%或更高,或85%或更高,或90%或更高,或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(%)表示,其可以用来评价相关序列之间的同一性。
C1)所述核酸分子具体可为将序列表中序列2所示的DNA序列进行如下任一个、任两个、任三个、任四个、任五个或全部的突变得到的核酸分子:
D1)将序列1的第1025位的色氨酸编码DNA突变为甘氨酸编码DNA、精氨酸编码DNA或亮氨酸编码DNA;
D2)将序列1的第681位的精氨酸编码DNA突变为赖氨酸编码DNA;
D3)将序列1的第1462位的赖氨酸编码DNA突变为丝氨酸编码DNA、苯丙氨酸编码DNA或甘氨酸编码DNA;
D4)将序列1的第1347位的甘氨酸编码DNA突变为苏氨酸编码DNA或赖氨酸编码DNA;
D5)将序列1的第357位的亮氨酸编码DNA突变为丙氨酸编码DNA、甲硫氨酸编码DNA或谷氨酸编码DNA;
D6)将序列1的第1256位的亮氨酸编码DNA突变为缬氨酸编码DNA。
进一步,编码B1)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A,第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A,第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为C,第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子;
编码B2)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为C、第1071位的C突变为A,第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A,第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A,第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的核酸分子;
编码B3)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为A、第1071位的C突变为G,第3073位的T突变为C,第3766位的C突变为G、第3768的C突变为A,第4384位的A突变为T、第4385位的A突变为T、第4386位的G突变为C得到的核酸分子;
编码B4)所述蛋白质的核酸分子可为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为A、第1071位的C突变为A,第3073位的T突变为C、第3074位的G突变为T,第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为A,第4384位的A突变为G、第4385位的A突变为G得到的核酸分子。
上述生物材料中,C2)所述的含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒(所述蛋白质基因表达盒),是指能够在宿主细胞中表达所述蛋白质的DNA,该DNA不但可包括启动所述蛋白质基因转录的启动子,还可包括终止所述蛋白质基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述蛋白质基因表达盒的重组载体。
上述生物材料中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。
所述重组载体可为在所述载体的多克隆位点***所述编码所述蛋白质的核酸分子得到的重组载体。在本发明的实施例中,所述重组载体具体为将pET-28a的XhoI及NcoI识别序列间的DNA片段替换为所述编码所述蛋白质的核酸分子得到的表达所述蛋白质的重组载体。
上述生物材料中,所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中,细菌可为大肠杆菌,如大肠杆菌BL21(DE3)。
在本发明的实施例中,所述重组微生物具体向大肠杆菌BL21(DE3)中导入所述重组载体得到的微生物。
上述生物材料中,所述转基因细胞系可包括繁殖材料,也可不包括繁殖材料。
本发明还提供了所述蛋白质的制备方法,所述方法包括:将所述蛋白质的编码基因导入生物细胞中,使所述编码基因得到表达,得到所述蛋白质。
上述方法中,所述将所述蛋白质的编码基因导入生物细胞可为将含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述生物细胞中,得到重组细胞。
所述蛋白质的编码基因具体可为上文中C1)所述核酸分子。
所述重组表达载体可为将所述蛋白质的编码基因导入表达载体中得到重组载体。所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-28a。
上述方法中,所述生物细胞可为微生物、动物细胞或植物细胞。所述微生物具体可为大肠杆菌,如大肠杆菌BL21(DE3)。
上述方法中,所述使所述蛋白质的编码基因表达具体可为培养所述重组细胞,得到培养物,使所述重组细胞中的所述蛋白质的编码基因得到表达。
上述方法还可包括从所述培养物中纯化所述蛋白质。
本发明还提供了用于体外DNA合成,DNA扩增,或,DNA测序的试剂或试剂盒,所述试剂或试剂盒包含所述蛋白质。
本发明还提供了下述任一应用:
E1)所述蛋白质在作为DNA聚合酶中的应用;
E2)所述生物材料在制备DNA聚合酶中的应用;
E3)所述蛋白质在DNA聚合反应中的应用;
E4)所述蛋白质在制备聚合酶链式反应产品中的应用;
E5)所述生物材料在聚合酶链式反应中的应用;
E6)所述生物材料在制备聚合酶链式反应产品中的应用;
E7)所述蛋白质的制备方法在制备DNA聚合反应产品中的应用。
实验证明,本发明的蛋白质在作为DNA聚合酶时,与KOD聚合酶相比,其延伸速度、保真性与PCR扩增产物量中的两种性能或三种性能都得到了显著提升,表明,本发明的蛋白质可作为改进的DNA聚合酶进行应用。
附图说明
图1为各KOD聚合酶突变体在不同延伸时间下的产物大小。其中,M为DNA分子量标准,单位为bp。
图2为PCR扩增产物量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中,如无特殊说明,序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸,末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
延伸速度:是指在PCR反应中DNA聚合酶延伸DNA的平均速度。
保真性:即DNA聚合酶在PCR反应中延伸DNA的精确度,通常通过出错率(掺入不正确的核苷酸,即并不是以模板依赖性方式加入的核苷酸的频率)来测定。高保真性是指出错率低于8×10-7(例如,低于5×10-7、4×10-7、2.5×10-7)。
实施例1、DNA聚合酶的制备及活性检测
一、DNA聚合酶的制备
以序列表中序列1所示的野生型KOD聚合酶(Thermococcus kodakarensis)的氨基酸序列为基础,用大肠杆菌偏好密码子对其核酸序列进行优化,得到如序列表中序列2所示的野生型KOD聚合酶编码基因。
通过对序列2进行突变,得到四种突变DNA序列,将这四种突变DNA序列编码的突变KOD聚合酶分别记为KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#。
KOD_Mu_1#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第1347位的甘氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的DNA聚合酶;KOD_Mu_1#的编码序列为将序列2的第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A,第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A,第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为C,第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的DNA序列,记为KOD_Mu_1#编码基因。
KOD_Mu_2#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为甘氨酸残基、第681位的精氨酸残基突变为赖氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的DNA聚合酶;KOD_Mu_2#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为C、第1071位的C突变为A,第2041位的C突变为A、第2042位的G突变为A,第3073位的T突变为G、第3075位的G突变为A,第4385位的A突变为G、第4386位的G突变为C得到的DNA序列,记为KOD_Mu_2#编码基因。
KOD_Mu_3#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为精氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为苯丙氨酸残基、第357位的亮氨酸残基突变为甲硫氨酸残基和第1256位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的DNA聚合酶;KOD_Mu_3#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为A、第1071位的C突变为G,第3073位的T突变为C,第3766位的C突变为G、第3768的C突变为A,第4384位的A突变为T、第4385位的A突变为T、第4386位的G突变为C得到的DNA序列,记为KOD_Mu_3#编码基因。
KOD_Mu_4#为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中的第1025位的色氨酸残基突变为亮氨酸残基、第1462位的赖氨酸残基突变为甘氨酸残基、第1347位的甘氨酸残基突变为赖氨酸残基和第357位的亮氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的DNA聚合酶;KOD_Mu_4#的编码序列为将序列2的第1069位的C突变为G、第1070位的T突变为A、第1071位的C突变为A,第3073位的T突变为C、第3074位的G突变为T,第4039位的G突变为A、第4040位的G突变为A,第4384位的A突变为G、第4385位的A突变为G得到的DNA序列,记为KOD_Mu_4#编码基因。
二、DNA聚合酶的性能检测
1、重组载体的构建
将pET-28a原核表达载体(MerckMillipore产品)的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为野生型KOD聚合酶编码基因,得到重组载体,将该重组载体命名为pET-KOD,pET-KOD能表达野生型KOD聚合酶。
将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_1#编码基因,得到重组载体,将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_1#,pET-KOD_Mu_1#能表达步骤一的KOD_Mu_1#。
将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_2#编码基因,得到重组载体,将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_2#,pET-KOD_Mu_2#能表达步骤一的KOD_Mu_2#。
将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_3#编码基因,得到重组载体,将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_3#,pET-KOD_Mu_3#能表达步骤一的KOD_Mu_3#。
将pET-28a原核表达载体的XhoI及NcoI识别序列间的DNA序列替换为步骤一的KOD_Mu_4#编码基因,得到重组载体,将该重组载体命名为pET-KOD_Mu_4#,pET-KOD_Mu_4#能表达步骤一的KOD_Mu_4#。
2、酶液的制备
将步骤1的5个重组载体pET-KOD、pET-KOD_Mu_1#、pET-KOD_Mu_2#、pET-KOD_Mu_3#和pET-KOD_Mu_4#分别导入BL21(DE3)细胞,将得到的重组菌分别命名为BL21-pET-KOD、BL21-pET-KOD_Mu_1#、BL21-pET-KOD_Mu_2#、BL21-pET-KOD_Mu_3#和BL21-pET-KOD_Mu_4#。将这五种重组菌分别按照如下制备酶液,并将pET-28a原核表达载体导入BL21(DE3)细胞得到的重组菌作为对照:
将重组菌接种至100mL LB培养基中37℃培养8hr,然后加入在培养液中的浓度为0.1mM的IPTG,18℃继续培养16hr。离心收集菌体,用5mL裂解液(50mM Tris、300mMNaCl、5%甘油、pH8.0)重悬菌体,超声裂解菌体得到裂解液,将裂解液离心分离得到上清液。将上清液75℃加热10min,然后离心去除沉淀,然后向该上清液中加入等体积甘油并混合均匀,-20℃保存,即得到KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液。
3、DNA聚合酶活性检测
1)延伸速度
以M13mp18ssDNA为模板、FAM(羟基荧光素)标记的M13F为引物检测KOD聚合酶及其突变体的DNA聚合酶延伸性能,反应体系如表2:
表2、反应体系
M13mp18ssDNA(TAKARA#3518 0.2μg/μL) |
0.669pmoL |
FAM-M13F Primer(1pmol/μL) |
0.75μL |
10×KOD buffer |
3μL |
dNTP(2.5mM)(TianGen) |
3μL |
步骤2得到的酶液(每个反应体系一种) |
3μL |
ddH<sub>2</sub>O |
补至30μL |
其中,FAM-M13F Primer:5’FAM-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’;10×KOD buffer由溶质和溶剂组成,溶剂为水,溶质及其浓度分别为20mM Tris、50mM NaCl、120mM Na2SO4和1g/L Tween-20,pH7.4。
按照表2的反应体系的配比,每种酶液配置一种总体系为5μL的反应体系,然后添加1μL 0.1M EDTA(MDBio),冰上放置,作为NC(阴性对照)组。
按照表2配置各个酶液的反应体系,每种酶液5个反应体系,进行PCR扩增,作为实验组。
将实验组进行PCR扩增,PCR反应程序为:95℃3min、50℃3min、72℃延伸,在延伸时间分别为10s、20s、30s、60s和90s时分别从取出一个反应体系并向取出的反应体系中添加1μL 0.1M EDTA。
反应结束后,将所有体系进行1%碱性琼脂糖电泳,typhoon9400FAM通道扫描,结果见图1。根据图1的结果,统计各酶在各时间点时扩增的DNA的长度,见表3。
结果显示,在延伸时间为10s时,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#及KOD_Mu_4#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比显著提高,延伸速度为10bp/秒~100bp/秒。
在延伸时间为20s时,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比,分别提高了7.0、6.5、2.7倍。
在延伸时间为30s时,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比,分别提高了6.6、6.6、2.8倍。
在延伸时间为60s时,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比,分别提高了5.0、4.3、1.6倍,KOD_Mu_1#及KOD_Mu_2#的延伸速度达到4000~4500bp/min。
在延伸时间为90s时,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#及KOD_Mu_3#的DNA延伸速度与KOD聚合酶相比,分别提高了3.0、3.0、1.2倍。
2)保真性
A)pUC19质粒用NdeI(Thermo scientific)酶切,Klenow酶(Thermo scientific)补平,再用HindIII酶切(Thermo scientific),胶回收(将lacZ-α及MSC(多克隆位点)序列区切走,保留lac启动子序列区),去磷酸化酶SAP(NEW England BioLabs)处理回收后片段,使末端去磷酸化。
a)NdeI酶切:酶切体系37℃温育2hr后,65℃温育20min以灭活NdeI酶。NdeI酶切体系如下表所示:
pUC19质粒 |
30μg |
NdeI |
2μL |
10*Cutsmart buffer(NEB) |
3μL |
ddH<sub>2</sub>O |
补至30μL |
b)Klenow酶补平
灭活NdeI酶后,在a)步骤的体系中加入2.5μL dNTP(2.5mM)及1μL 5U/μL Klenow,37℃温育30min,再65℃温育20min灭活Klenow酶,乙醇沉淀纯化产物。
c)HindIII酶切
向乙醇沉淀纯化产物中加入2μL 10*NEB buffer 2.1,2μL HindIII,1μL ddH2O,经37℃温育2hr后,65℃温育20min以灭活HindIII酶。
d)回收纯化
1%胶回收纯化步骤c)得到的酶切产物,ddH2O溶解纯化产物。
e)SAP去磷酸化
步骤d)得到的纯化产物去磷酸化处理,将去磷酸化体系37℃温育30min后,65℃温育5min以灭活SAP,得到去磷酸化产物,即pUC19载体骨架。SAP去磷酸化体系如下:
步骤d)得到的纯化产物 |
30μL |
10*NEB Cutsmart |
4μL |
SAP(虾碱性磷酸酶) |
2μL |
ddH<sub>2</sub>O |
补至40μL |
B)利用LacZ上游引物和LacZ下游引物从BL21(DE3)中扩增完整的lacZ片段,将序列正确的lacZ片段与pUC19载体骨架相连,将序列正确的重组载体命名为lacZ-pUC19。
LacZ上游引物序列为:5'-GCATAAGCTTGACCATGATTACGGA-3'(下划线为HindIII的识别序列)
LacZ下游引物序列为:5'-TTATTTTTGACACCAGACCAACTGG-3'
C)以1ng lacZ-pUC19为模板,利用LacZ上游引物和LacZ下游引物PCR扩增lacZ片段,所用DNA聚合酶分别为步骤2的KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液,每种反应体系一种酶液,所用反应体系与反应条件为如下:
PCR体系
PCR程序
将得到的PCR产物纯化,测定产物浓度,计算d值(2d=产物量/模板量,d=log2 (产物量/模板量))。
D)将步骤C)得到的PCR产物中加入DpnI及HindIII进行酶切,胶回收酶切产物,然后序列正确的酶切产物与步骤A)酶切后的pUC19质粒连接,转化DH5α感受态细胞,涂含IPTG与Xgal以及Amp的培养板,37℃倒置培养过夜。第二天取出后在4℃放置2hr。统计白斑数及菌落总数。计算Mf值=(白斑数/总菌落数),ER值(出错率)=Mf/(d×3029),其中d为步骤C中的d值。KOD聚合酶及KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#的出错率见表4。
表4、DNA聚合酶的出错率
DNA聚合酶 |
KOD_Mu_1# |
KOD_Mu_2# |
KOD_Mu_3# |
KOD_Mu_4# |
KOD聚合酶 |
出错率 |
4.7×10<sup>-7</sup> |
2.1×10<sup>-7</sup> |
3.7×10<sup>-7</sup> |
7.8×10<sup>-7</sup> |
2.4×10<sup>-6</sup> |
从上表可见,4个突变KOD聚合酶的PCR出错率均低于KOD聚合酶,KOD_Mu_1#的出错率比KOD聚合酶下降了80%,KOD_Mu_2#下降了91%,KOD_Mu_3#下降了84%,
KOD_Mu_4#下降了67%,且4个突变KOD聚合酶的出错率均低于8.0×10-7,与KOD聚合酶相比,出错率至少降低了65%以上。
3)扩增性测试
以0.1ng步骤2)的lacZ-pUC19为模板,利用LacZ上游引物和LacZ下游引物PCR扩增lacZ片段,所用DNA聚合酶分别为步骤2的KOD酶液、KOD_Mu_1#酶液、KOD_Mu_2#酶液、KOD_Mu_3#酶液和KOD_Mu_4#酶液以及对照酶液,每种反应体系一种酶液,所用反应体系同步骤1),反应条件同2)保真性测试中的PCR反应条件,PCR扩增循环数均设置两种,为25和30。
将得到的各PCR产物经纯化后,测定产物DNA的量,结果见图2。从图2结果可见,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#、KOD_Mu_3#和KOD_Mu_4#得到的PCR产物量比KOD聚合酶均有明显提高,其扩增性均优于野生型KOD聚合酶。KOD_Mu_3#与KOD聚合酶相比,扩增性基本持平,但其保真性能有提升。
具体的,KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#和KOD_Mu_4#在PCR扩增循环数为25时,PCR产物量分别提高了196%、66%、129%。KOD_Mu_1#、KOD_Mu_2#和KOD_Mu_4#在PCR扩增循环数为30时,PCR产物量分别提高了182%、53%、44%。
<110> 广州市锐博生物科技有限公司、广州锐康医学检验所有限公司
<120> DNA聚合酶及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1671
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr
50 55 60
Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val
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Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu
275 280 285
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Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
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Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr
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420 425 430
Val Leu Gly Ile Asp Gly Trp Gln Arg Val Arg Lys Val Trp Glu Tyr
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450 455 460
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Arg Asp Ser Leu Ala Lys Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys
485 490 495
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500 505 510
Asn Ile Pro Glu Glu Glu Val Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Leu
515 520 525
Leu Ala Glu Gly Thr Leu Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser
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Ser Arg Lys Lys Arg Arg Ile Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr
545 550 555 560
Ile Gly Lys Asp Glu Glu Glu Phe Arg Asp Arg Ile Thr Tyr Ile Phe
565 570 575
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Asn Ala Val Thr Leu Lys Val Ala Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys Val
595 600 605
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610 615 620
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Ile Val Ala Thr Gln Gly Thr Lys Asn Glu Trp Lys Ile Lys Leu Val
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785 790 795 800
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805 810 815
Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp
820 825 830
Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile
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Leu Ala Asn Ser Ile Leu Pro Glu Glu Trp Leu Pro Val Leu Glu Glu
850 855 860
Gly Glu Val His Phe Val Arg Ile Gly Glu Leu Ile Asp Arg Met Met
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Ala Glu Leu Lys Arg Val Lys Ala Leu Ile Arg His Asp Tyr Ser Gly
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Ser Gly His Ser Leu Phe Ser Val Arg Asn Gly Glu Leu Val Glu Val
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965 970 975
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980 985 990
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Arg Trp Ile Phe Gly Glu Glu Lys Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg
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1040 1045 1050
Ile Gly Tyr Glu Val Leu Asp Trp Asp Ser Leu Lys Asn Tyr Arg
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Pro Lys Gly Val Arg Leu Ala Phe Leu Glu Gly Tyr Phe Ile Gly
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Gly Val Ser Ala Val Lys Leu Gly His Asp Ser Gly Val Tyr Arg
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1670
<210> 2
<211> 5016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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