CN109943583B - 一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，属于基因工程技术领域。具体地，包括合成具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；构建重组质粒pET20b‑BA‑pun，并进而构建基因工程菌BL21/pET20b‑BA‑pun，诱导该基因工程菌即可得到合成利巴韦林的关键酶，即嘌呤核苷磷酸化酶。利用基因工程菌合成利巴韦林，转化率高、成本低、绿色环保，在工业生产中具有重要的意义。

Description

一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法。

背景技术

利巴韦林(Ribavirin)是一种高效广谱抗病毒核苷类药物，对多种DNA和RNA病毒都有强效的抑制作用，具有疗效较高、活性较强、副作用少、不易产生耐药性等特点，被广泛应用于治疗流感、口腔疱疹、流行性出血热、病毒性肝炎等病毒疾病，具有巨大的治疗潜力和医疗用途。

利巴韦林的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶法合成三种。其中化学法研究与报道最为广泛，但由于其工艺复杂、成本高、环境污染严重等原因已被大多数生产企业淘汰。发酵法则存在生产周期长、容易污染杂菌、提取工艺复杂以及能耗高等缺点。酶法是以嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)为催化剂，以廉价底物鸟苷和TCA为原料合成利巴韦林，具有反应时间短、副产物少、产物容易分离、操作简单、环境污染少、能耗少等优点，具有较大的工业化市场前景。

嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase，PNPase，EC:2.4.2.1)是嘌呤补救途径的关键酶之一，也是合成利巴韦林的关键酶，广泛存在于原核和真核生物中。该酶可逆地催化嘌呤核苷(或脱氧核苷)C1-N键发生磷酸化，生产核糖(脱氧核糖-1-磷酸)和对应嘌呤碱基，在嘌呤核苷补救途径中具有重要作用。因此，利用微生物生产酶法制备利巴韦林中的关键酶核苷磷酸化酶成为生产利巴韦林的一个关键。

自1972年美国加州核酸研究所Witkowski等首次报道以来，国内外开始利用酶法对利巴韦林的制备进行了深入的研究。在国内，研究酶法合成利巴韦林包括有邱蔚然等利用乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)TQ-952菌株为酶源，以鸟苷和TCA为底物酶法合成利巴韦林；陈蔚梅等(02115486.4/2002)利用乙酰短杆菌ATCC39311菌株作酶源，以肌苷和TCA为底物合成利巴韦林。天津工业大学(201110158250.4/2011)利用枯草芽孢杆菌来源的嘌呤核苷磷酸化酶基因序列构建大肠杆菌的基因工程菌为酶源，以鸟苷和TCA为底物酶法合成利巴韦林.其中，培养得到的目的蛋白占菌体总蛋白的16～22％。上述研究中，酶法合成利巴韦林的转化率可达到75～85％，产物浓度达到200mmol/L，但其菌体用量多(3～5％)，底物浓度低(100-200mmol/L)，反应时间长(12～20h)，反应能耗大。一般来说，野生菌菌体中产生嘌呤核苷磷酸化酶的量相对较少，基因工程菌可以产生大量目的蛋白，从而达到降低成本的目的。

发明内容

本发明旨在通过基因工程技术，将来源于乙酰短杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶高效表达于大肠杆菌中，提高宿主菌中嘌呤核苷磷酸化酶的表达量，以提高单位菌体的酶比活。将构建的高产高活力的重组菌株用于酶法合成利巴韦林，菌体用量可减少至0.5％，底物浓度可高达400mmol/L，反应时间缩短至2h，转化率最高达到86.2％，达到高转化、低成本、绿色环保的目的，最终实现产业化。

为了完成上述目的，本发明提供了一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，包括以下步骤：

(1)制备能够表达具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌；

(2)诱导表达步骤1)所述的基因工程菌，将诱导培养得到的菌液经离心和洗涤后，收集细胞菌体；

(3)以磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺为反应底物，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀；

(4)将混合均匀后的反应体系放入摇床进行酶转化；

(5)反应结束后将反应体系置于冰水浴中冷却1，12000r/min离心5min得上清液，即为包括利巴韦林的溶液。

pun基因是来源于乙酰短杆菌ATCC954的一段编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列。

在本发明的实施方案中，其中(1)制备能够表达具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌的步骤包括：

1)合成具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；

2)将合成的pun基因片段与载体pET20b连接成重组质粒pET20b-BA-pun；

3)将重组质粒pET20b-BA-pun转化到大肠杆菌DH5α；

4)筛选阳性克隆，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun。

在本发明的实施方案中，其中(2)诱导表达步骤(1)所述的基因工程菌的步骤包括：

挑取基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun单菌落接种于含100μg/ml的Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养12h～16h；然后以2％接种量转接于含Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，18℃条件下诱导表达18h。

在本发明的实施方案中，所述磷酸钾缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0。

在本发明的实施方案中，步骤(3)中鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的摩尔比为1：1，在本发明的另一些实施方案中，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100～400mmol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100、200、300或400mmol/L。

在本发明的实施方案中，步骤(3)中细胞菌体的用量按湿重计为0.5％～5％的比例添加。

在本发明的实施方案中，细胞菌体的用量按湿重计为0.5％、1.0％、2.5％或5％的比例添加。

在本发明的一些具体实施方案中，细胞菌体的用量按湿重计为0.1％的比例添加，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100、200、300或400mmol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，细胞菌体的用量按湿重计为0.5％的比例添加，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100、200、300或400mmol/L。

在本发明的一些具体实施方案中，细胞菌体的用量按湿重计为1.0％的比例添加，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100、200、300或400mmol/L。

在本发明的另一些具体实施方案中，细胞菌体的用量按湿重计为2.5％的比例添加，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为100、200、300或400mmol/L。

在本发明的实施方案中，步骤(4)中转化的条件为：转速为300r/min，反应温度为65℃，反应时间2h～24h。

在本发明的具体实施方案中，所述反应时间为2h。

本发明的有益效果

乙酰短杆菌常被用来研究酶法合成利巴韦林，但是由于野生菌中产生的嘌呤核苷磷酸化酶量少，因此在酶反应过程中的乙酰短杆菌菌体添加量需要相对较多，而利用基因工程手段构建基因工程菌可以诱导产生大量的嘌呤核苷磷酸化酶，在酶反应中的菌体添加量大大减少，从而达到降低成本的目的。

嘌呤核苷磷酸化酶是酶法合成利巴韦林的关键且唯一的酶，因此嘌呤核苷磷酸化酶的酶活力及添加量是决定酶法合成利巴韦林效率的主要因素。本发明通过基因工程手段构建高效表达来源于乙酰短杆菌的高酶活力嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun，经诱导表达得到含有大量目的蛋白的菌体，目的蛋白占菌体总蛋白50％以上，利用该菌体进行酶促反应生成利巴韦林。同时通过对酶反应条件的深入研究，优化了酶反应的条件。基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun进行酶促反应制备利巴韦林反应时间只需2h便能达到平衡，而菌体添加量只需要0.5％。另外，在0.5％的菌体添加条件下，底物浓度提高到400mmol/L条件下酶促反应仍可在2h达到平衡。与前人的实验结果相比，本研究所构建得到的基因工程菌反应时间由24h缩短为2h，大大缩短反应时间，同时酶源用量仅需要原来的1/10，不仅大幅度降低高温反应下的能耗，同时降低了生产成本。另外，酶促反应的底物浓度由100mmol/L提高到400mmol/L，提高了4倍，且转化率仍达到75％左右。因此，本发明在工业生产中具有重要的意义。

附图说明

图1示出了本发明构建的pET20b-BA-pun质粒图。

图2示出了pET20b-BA-pun蛋白表达的SDS-PAGE蛋白电泳图，M：蛋白Marker IV；1：粗蛋白；2：上清；3：沉淀。

图3示出了乙酰短杆菌和BL21/pET20b-BA-pun合成利巴韦林过程曲线对比图。

图4示出了不同BL21/pET20b-BA-pun菌体添加量合成利巴韦林曲线。

图5示出了不同底物浓度合成利巴韦林对比柱形图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

材料

1.菌株、载体和质粒

大肠杆菌BL21菌株和载体pET20b保存于华东理工大学。来源于乙酰短杆菌ATCC954的pun基因序列通过生物信息学方法搜索得到：(SEQ ID NO:1)

ATGACAGTCAACTGGAATGAAACACGTTCGTTTTTAGAAAGCAAGATGCAGGCAAAACCGGAGATCGGATTGATTCTCGGTTCAGGACTTGGTGTCCTCGCGGATGAGATCGAAAACCCGATCGCGATTCCATACCATGAAATCCCGAACTTCCCGGTATCAACGGTCGAAGGACACGCGGGACAACTCGTCTTCGGTACTCTTGAAGGGAAACAAGTCGTTGCGATGCAAGGACGATTCCACTTCTACGAAGGATATTCGATGGATATGGTCACGTTCCCAGTCCGCGTCATGAAAGCGATCGGCGTCGAGACATTGATCGTCACGAACGCAGCTGGCGCTTGTAACGAAGCGTTCGAACCAGGTGATTTGATGTTGATCACGGATCACATCAACTTCTTCGGTACGAACCCACTGATCGGGAAGAACGTCGACGAGATGGGACCACGTTTCCCCGATATGTCGAAGCCGTATGATGCAGAATTACTTCGTCTTGCGCAAGAAACAGCGGACGAACTCGGAATTCGTGTCCGTCAAGGTGTCTACTTCGGAAACACTGGTCCAACGTATGAGACGCCAGCAGAAGTCAAGATGGCACGGATGCTCGGTGGCGACGTCGTCGGTATGTCGACGGTTCCTGAAGTCATCGTTGCCCGTCATTCCGATATGCGAGTCCTTGGGATCTCATGTGTCTCGAACATGGCAGCAGGTATTCTCGATCAACCGTTACATCATGATGAAGTCATCGAAACGACAGAACGTGTCCGGGCACACTTCCTATCACTCGTTCGCGGTTCGATCAAAAAAATG

具体来说，已知乙酰短杆菌N端有一段21个氨基酸序列，通过序列比对从乙酰短杆菌全基因组中获取嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列pun基因，共810bp。

2.培养基

固体LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0，琼脂粉12。121℃灭菌15min。

液体LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。121℃灭菌15min。

3.酶及试剂

限制性内切酶Hind III和Nde I购自New England Biolabs，pun基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。DNA抽提试剂盒购自上海基屹生物科技有限公司。氨苄青霉素(Ampicillin，下称Amp)购自上海生工生物工程有限公司，工作浓度为100μg/mL。其他试剂均为分析纯。

实施例1目的片段的合成、载体构建

1.目标片段的合成

已知乙酰短杆菌N端有一段21个氨基酸序列，通过序列比对从乙酰短杆菌全基因组中获取嘌呤核苷磷酸化酶的基因序列pun基因，共810bp(SEQ ID NO:1)。根据序列信息，往序列两端添加两个酶切位点，分别为NdeI和Hind III。将设计好的序列信息送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成。

2.重组质粒pET20b-BA-pun的构建

将全合成的嘌呤核苷磷酸化酶编码基因pun与表达载体pET20b连接，构建具有高效表达和高质粒稳定性的组成型表达载体pET20b-BA-pun。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，鉴定阳性克隆。挑取单菌落进行培养，经过质粒抽提后，进行序列测定。

结果：

全合成长度为810bp的pun基因，经测序验证序列正确。pun基因片段连接于pET20b载体上，得到重组质粒pET20b-BA-pun(图1)。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun，用于菌体培养和蛋白表达。

实施例2目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE

将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun。

诱导表达：将基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun单菌落接种于含Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养12h～16h；然后以2％接种量转接于含Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，18℃条件下诱导表达18h。

将培养完毕的菌液离心后收集菌体(10000r/min，4℃，10min)，用磷酸盐缓冲液(PB，50mmol/L，pH7.0)将菌体重复洗涤2次后，将上述菌体用磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH7.0)重悬后，作为酶法合成利巴韦林的酶源。另取部分细胞悬浮液进行冰水浴超声破碎(300w，工作3s，间歇6s，超声99次)离心(12000r/min，4℃，30min)，将上清与沉淀分离，分别进行SDS-PAGE蛋白表达分析。

SDS-PAGE蛋白电泳结果显示(图2)，相对分子量为30kDa附近有一条表达带最明显，和pET20b-BA-pun酶分子质量理论值相符合。目的蛋白大部分都在上清液中，仅有极小部分在沉淀中，说明是可溶性蛋白。BL21/pET20b-BA-pun单菌落经IPTG诱导表达后，目的蛋白表达量高，达到总蛋白的50％以上。

实施例3酶促反应制备利巴韦林

以50mmol/L，pH为7.0的磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷(GR)和1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺(TCA)为反应底物，鸟苷和TCA的摩尔比为1：1，底物在反应液中的浓度为100～400mmol/L，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀，酶源在反应液中的用量按湿重计为0.5％～5％的比例添加。将以上体系混匀后放入高温摇床进行酶转化，300r/min，65℃，反应时间2h～24h。反应结束后置于冰水浴中冷却。离心(12000r/min，4℃，5min)，取上清液测定利巴韦林的含量。

将得到的产物溶液，用流动相稀释后，通过高效液相色谱(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC)定量测定利巴韦林。

HPLC工作条件：Aglient 1200型高效液相色谱仪；可变波长紫外检测器VWD，检测波长207nm；标准型自动进样器，进样量20μl；色谱柱Agilent 1260，Eclipse XDB-C18，5μm，250mmx4.6mm；流动相中0.02mol/L Tris-HCl(pH7.4)：乙腈(色谱纯)＝98:2(V/V)；柱温25℃；流速1ml/min。以外标法定量反应上清液中的利巴韦林浓度。

根据利巴韦林转化率定义，转化率的百分比计算公式为：

将诱导表达得到的不同批次的细胞菌体作为酶源在上述条件下进行多次酶反应实验，其中底物鸟苷和TCA在反应液中的浓度为100mmol/L，酶源用量按湿重计为5％，在转速220r/min，温度65℃下反应24h。得到的产物经离心后取上清进行HPLC测定，通过计算得到转化率。测定结果中，反应为24h的利巴韦林转化率为75％～85％。

现有文献报道中，酶法合成利巴韦林的反应时间为24h左右，而反应达到平衡的具体时间未见报道，因此对以乙酰短杆菌野生菌和重组菌酶BL21/pET20b-BA-pun酶法合成利巴韦林的酶反应过程进行研究。酶反应前期分别在5min、10min、20min、30min、40min、60min、90min和120min时间点取样，之后每2h取一次样，至24h终止反应。对得到的样品进行测定，得到乙酰短杆菌和BL21/pET20b-BA-pun合成利巴韦林过程曲线对比图(图3)。

从图3中可以发现，乙酰短杆菌酶反应需要经过8h才能达到平衡。而重组菌酶反应不到2h便达到平衡。重组菌经过诱导表达后，菌体中的表达量大大提高，单位菌体的酶活性提高，使得反应速率大幅提高，酶反应时间缩短，快速达到反应平衡。

根据上述实验结果，在确定最佳反应时间的同时，分别从菌体添加量、底物浓度两个方面进行对BL21/pET20b-BA-pun酶法合成利巴韦林反应条件的优化。

分别设定0.5％、1％、2.5％、5％四个菌体添加量反应梯度，底物浓度100mmol/L，进行酶反应过程测定，最大反应时间2h，最终得到不同菌体添加量的酶法合成利巴韦林反应进程曲线(图4)。结果发现，当菌体添加量为0.5％时，酶反应在2h时便可达到平衡。而5％的菌体添加量下，100mmol/L的底物浓度下0.5h即可达到平衡。

以0.1％、0.5％、1％和2.5％菌体添加量研究不同浓度下的反应转化率，反应时间2h，底物浓度梯度分别从100mmol/L到400mmol/L，最终得到不同底物浓度酶法合成利巴韦林的对比图(图5)。对比同个菌体添加量下的不同底物浓度的转化结果，可以发现0.5％的菌体添加量条件下，即使底物浓度达到400mmol/L，反应2h后反应基本达到平衡。0.5％菌体400mmol/L底物浓度下的转化率为74.9％，1％菌体400mmol/L底物浓度下的转化率为72.6％，而2.5％菌体400mmol/L底物浓度下的转化率为79.7％。由于400mmol/L已经接近利巴韦林的饱和浓度，因此以BL21/pET20b-BA-pun做酶源进行酶反应，具有非常好转化效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 南通秋之友生物科技有限公司/华东理工大学

<120> 一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法

<130> XY-2019-1-W-012

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacagtca actggaatga aacacgttcg tttttagaaa gcaagatgca ggcaaaaccg 60

gagatcggat tgattctcgg ttcaggactt ggtgtcctcg cggatgagat cgaaaacccg 120

atcgcgattc cataccatga aatcccgaac ttcccggtat caacggtcga aggacacgcg 180

ggacaactcg tcttcggtac tcttgaaggg aaacaagtcg ttgcgatgca aggacgattc 240

cacttctacg aaggatattc gatggatatg gtcacgttcc cagtccgcgt catgaaagcg 300

atcggcgtcg agacattgat cgtcacgaac gcagctggcg cttgtaacga agcgttcgaa 360

ccaggtgatt tgatgttgat cacggatcac atcaacttct tcggtacgaa cccactgatc 420

gggaagaacg tcgacgagat gggaccacgt ttccccgata tgtcgaagcc gtatgatgca 480

gaattacttc gtcttgcgca agaaacagcg gacgaactcg gaattcgtgt ccgtcaaggt 540

gtctacttcg gaaacactgg tccaacgtat gagacgccag cagaagtcaa gatggcacgg 600

atgctcggtg gcgacgtcgt cggtatgtcg acggttcctg aagtcatcgt tgcccgtcat 660

tccgatatgc gagtccttgg gatctcatgt gtctcgaaca tggcagcagg tattctcgat 720

caaccgttac atcatgatga agtcatcgaa acgacagaac gtgtccgggc acacttccta 780

tcactcgttc gcggttcgat caaaaaaatg 810

Claims (6)

1.一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备能够表达具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌：

1)合成具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；

2)将合成的pun基因片段与载体pET20b连接成重组质粒pET20b-BA-pun；

3)将重组质粒pET20b-BA-pun转化到大肠杆菌DH5α；

4)筛选阳性克隆，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun，

(2)诱导表达步骤1)所述的基因工程菌，将诱导培养得到的菌液经离心和洗涤后，收集细胞菌体；

(3)以磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺为反应底物，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀，其中鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的摩尔比为1：1，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为400mmol/L，所述细胞菌体的用量按湿重计为0.5％～5％的比例添加；

(4)将混合均匀后的反应体系放入摇床进行酶转化，所述酶转化反应温度为65℃，反应时间2h～24h；

(5)反应结束后将反应体系置于冰水浴中冷却，12000r/min离心5min得上清液，即为包括利巴韦林的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中(2)诱导表达步骤(1)所述的基因工程菌的步骤包括：

将基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun单菌落接种于含100μg/ml的Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养12h～16h；然后以2％接种量将培养好的种子转接于含Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，18℃诱导表达18h。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述磷酸钾缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中细胞菌体的用量按湿重计为0.5％的比例添加。

5.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中酶转化的条件为：转速为300r/min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应时间为2h。

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