CN109943513A - 一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用,涉及基因工程及发酵工程领域,所述基因工程菌表达包含聚酮合成酶基因phlD1和rop基因的重组质粒。本发明提供的基因工程菌用于发酵生产间苯三酚,不仅PG产量提高、生产成本降低,还降低了原有pNEW表达载体的漏表达水平。此结果为PG生物合成提供技术支持,也为生物合成其他化学品在选择诱导表达***时提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程领域,具体涉及一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
间苯三酚(简称PG)是一种应用广泛的大宗化学品,是复制和纺织品染色工艺中的有用化学品,也是药物,食品添加剂和化妆品生产的通用前体,因此其在国内外的需求量很大。目前合成间苯三酚的方法包括化学合成法和生物合成法,传统的化学合成法生产技术落后,环境污染严重,产品质量跟不上医药产业的发展。生物法合成间苯三酚具有绿色、安全、低成本等优势,已成为间苯三酚合成的发展方向。
目前,生物法合成间苯三酚已取得很多重要进展。Achkar等人发现在大肠杆菌BL21(DE3)中只表达来源于荧光假单胞菌的phlD基因即可生产PG(Jihane Achkar,Xian M,Huimin ZhaoA,et al.Biosynthesis of Phloroglucinol[J].Journal of the AmericanChemical Society,2005,127(15):5332-5333.)。zha等人通过敲除大肠杆菌BL21(DE3)的乙酸和乙醇形成基因ackA-pta和adhE,并采用IPTG诱导的pRSFDuet-1载体或pACYCDuet-1载体过表达来源于谷氨酸棒杆菌的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和大肠杆菌自身的乙酰辅酶A合成酶(ACS),分别促使乙酸生成乙酰辅酶A,乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A,从而提高间苯三酚产量(Zha W,Rubinpitel S B,Shao Z,et al.Improving cellular malonyl-CoAlevel in Escherichia coli via metabolic engineering.[J].MetabolicEngineering, 2009,11(3):192-198.)。之后CaoYj通过采用IPTG诱导的pET30a载体或pACYC载体过表达多重抗性激活因子marA基因和乙酰辅酶A羧化酶ACC,使间苯三酚产量有较大的提高(Yujin Cao,Xinglin Jiang,Rubing Zhang,Mo Xian.Improvedphloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011, 91:1545–1552.)。Rao等人以IPTG诱导的pET28a或pACYCDuet-1为载体,对phlD基因进行定向进化,提高了PhlD酶的热稳定性,使PG含量较野生型提高了30%(Rao G. Directed evolution of phloroglucinol synthase PhlD withincreased stability for phloroglucinol production[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2013,97(13):5861-5867.)。然而,已有研究中绝大多数是利用IPTG进行诱导表达PG合成相关基因。由于IPTG价格昂贵,将增加间苯三酚生产成本,从而限制生物法间苯三酚的产业化和推广应用。此外,目前PG 产量仍然较低,若想将PG进行工业化生产,PG的产量仍需要进一步提高。
ChoiY J等人构建的pNEW表达载体以cumate作为诱导剂,具有成本低,用量少的特点,所以为研究者所关注(Choi Y J,Morel L,Teffanie Leet al.Novel,Versatile, and Tightly Regulated Expression System for Escherichia coliStrains[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(15):5058-5066.)。但是pNEW表达载漏表达较严重,而且用pNEW载体合成学品的实例较少,所以限制了pNEW表达载体的应用。
发明内容
为了解决PG产量低及生产成本高的问题,本发明提供一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用。
首先,本发明提供一种提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,所述基因工程菌表达包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒。
优选的,所述包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒中还包含控制拷贝数的rop基因。
优选的,所述包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒中还包含T5启动子、CymOoperator、T7终止子、lacI基因。
优选的,所述rop基因来源于pET28a载体,GeneBank ID为ATU32939.1;所述聚酮合成酶基因phlD1来源于荧光假单胞菌,GeneBank ID为11830552;所述CymO operator 来自Pseudomonas putida F1,GenBank:MH101728.1。
优选的,宿主菌为大肠杆菌,包括但不限于E.coliBL21(DE3)、DH5α、JM109、Top10及DH10B等。
第二,本发明还提供上述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的构建方法,包括以下步骤:
1)构建包含rop基因和聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒pNEW-phlD1-rop;
2)将步骤1)构建的pNEW-phlD1-rop转化入宿主菌,得到提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌。
所述方法具体为:
1)在pNEW载体上添加控制拷贝数的rop基因,并过表达聚酮合成酶基因phlD1,获得重组质粒pNEW-phlD1-rop;
2)将所得重组质粒pNEW-phlD1-rop导入到宿主菌即E.coliBL21(DE3)、DH5α、JM109、Top10或DH10B的感受态细胞中,获得提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌。
步骤1)进一步具体为:将pNEW载体的操纵区域替换实验室已有重组质粒 pET28a-phlD1的操纵区域,获得重组质粒pNEW-phlD1-norop,在重组质粒 pNEW-phlD-norop上添加控制拷贝数的rop基因后,获得重组质粒pNEW-phlD1-rop。
优选的,所述重组质粒pNEW-phlD1-rop中还包含T5启动子、CymO operator、T7 终止子、lacI基因;所述rop基因来源于pET28a载体,GeneBank ID为ATU32939.1;所述聚酮合成酶基因phlD1来源于荧光假单胞菌,GeneBank ID为11830552;所述CymO operator来自Pseudomonas putida F1,GenBank:MH101728.1。
第三,本发明还提供上述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的应用,所述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌通过摇瓶培养生产间苯三酚。
具体包括以下步骤:
(1)将含有所述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的种子液按照接种量为培养基体积的1%-2%接种于培养基,培养温度为30-37℃,搅拌速度为220rpm,pH6.0-8.0,培养至OD600为0.6-0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L,加入终浓度为24g/L的葡萄糖作为底物,分批补料发酵18h后结束培养;
(2)将步骤(1)得到的培养液进行离心取上清,上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1-3次; (3)合并(2)中所述萃取产物,减压蒸馏浓缩,所得固体粉末即为间苯三酚。
有益效果
本发明利用新诱导剂cumate诱导的pNEW表达载体过表达phlD1基因,并在原有pNEW表达载体上添加了控制质粒拷贝数的rop基因,新诱导剂的使用不仅PG产量提高,使生产成本降低,还降低了原有pNEW表达载体的漏表达水平。此结果为PG生物合成提供技术支持,也为生物合成其他化学品在选择诱导表达***时提供参考。
具体来说,本发明具有以下优点:
1.cuamte的价格是IPTG的1/3,最佳用量是IPTG的1/7,所以用cumate的成本是IPTG 的1/21。
2.在摇瓶水平,用pNEW表达载体生产的PG的产量是pET28a表达载体生产的PG 产量的2倍。
3.在原有pNEW表达载体上添加控制质粒拷贝数的rop基因,不仅使PG产量增加了15%,还使PhlD蛋白的漏表达水平降低了一半。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称:
间苯三酚(Phloroglucinol):PG
异丙基硫代半乳糖苷:IPTG
聚酮合成酶基因:phlD1
大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli):E.coli
“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后,在生物体中超过原有水平表达,可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
附图说明
图1 pET28a-phlD1重组质粒结构示意图;
图2 pNEW-phlD1-rop重组质粒结构示意图;
图3 pNEW-phlD1-norop重组质粒示意图。
具体实施方式
下面通过实例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明,均为常规技术。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明,均可从商业途径获得。所用无缝克隆的同源重组酶均购自诺唯赞生物技术公司,质粒提取及胶回收
所用试剂盒购自美国OMEGA公司,操作步骤按照产品说明书进行;所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方:
1)LB培养基:酵母粉5g/L,NaCl 10g/L,蛋白胨10g/L,接种时补加卡那霉素 50μg/mL。
2)发酵培养基K2HPO4·3H2O 9.8g/L,Citric acid·H2O 2.1g/L,柠檬酸铁铵0.3g/L, (NH4)2SO43.0g/L,葡萄糖24g/L,MgSO4·7H2O 0.4g/L,1000×微量元素 ((NH4)6Mo7O24·4H2O 3.7g/L;ZnSO4·7H2O 2.9g/L;H3BO324.7g/L;CuSO4·5H2O 2.5g/L; MnCl2·4H2O 15.8g/L),卡那霉素50μg/mL。
其中:K2HPO4·3H2O 9.8g/L,Citric acid·H2O 2.1g/L,柠檬酸铁铵0.3g/L,(NH4)2SO4 3.0g/L混合后调至pH 7.0,121℃,20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L,115℃, 20min单独灭菌,MgSO4·7H2O储液为200g/L,121℃,20min单独灭菌,1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌,转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、MgSO4·7H2O、1000×微量元素储液及抗生素。
实施例1构建重组质粒
a.构建pNEW-phlD1-norop重组质粒作为对照,具体过程如下:
1.以5’ATTGCACGAACCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTTCT 3’
和5’GGGCCCGGGATCCGAT 3’为引物,以pUC57-pNEW为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出pNEW载体的操纵区域的核酸片段,命名为pNEW-fragment1,并在5’端和3’端分别引入同源臂;
2.以5’ACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAA3’和5’
ATTGCACGAACCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCCATGGCTTCT3’为引物,以 pET28a-phlD1为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出线性pET28a-phlD1(不包括操纵区域的核酸片段,不含rop基因),命名为pET28a-phlD1-fragment1,并在5’端和3’端分别引入同源臂,其同源臂同pNEW-fragment1的同源臂;
3.在诺唯赞的无缝克隆试剂盒中的重组酶exnase的作用下,利用同源臂完成pNEW-fragment1和pET28a-phlD1-fragment1的连接,构建出pNEW-phlD1-norop。
PCR体系:
PCR扩增条件:
无缝克隆的反应体系如下:
反应条件:50℃,30min后,降至4℃或迅速置于冰上冷却,得到重组产物。下一步将重组产物转入克隆载体。
4.买自TAKARA的E.coli BL21(DE3)的感受态细胞,将重组质粒pNEW-phlD1-norop通过热激法共同转化至上述制备的感受态细胞。
实施例2制备可提高间苯三酚(PG)生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌
1)构建pNEW-phlD1-rop重组质粒,具体过程如下:
1.以5’ATTGCACGAACCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTTCT 3’
和5’TGATGCCTCCGTGTAAGGGGTGTCTAGCGCTTGAATTTCGCGT 3’为引物,以pUC57-pNEW为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出pNEW载体的操纵区域的核酸片段,命名为pNEW-fragment2,并在5’端和3’端分别引入同源臂pNEW-fragment1 和pNEW-fragment2的3’的同源臂不同;
2.以5’CCCCTTACACGGAGGCATCAGTGAC 3’和5’
ATTGCACGAACCTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCCATGGCTTCT 3’为引物,以pET28a-phlD1为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增出线性pET28a-phlD1(不包括操纵区域的核酸片段,含rop基因),命名为pET28a-phlD1-fragment2,并在5’端和3’端分别引入同源臂,其同源臂同pNEW-fragment2;
3.在诺唯赞的无缝克隆试剂盒中的重组酶exnase的作用下,利用同源臂完成pNEW-fragment2和pET28a-phlD1-fragment2的连接,构建出pNEW-phlD1-rop。
PCR体系:
PCR扩增条件:
无缝克隆的反应体系如下:
反应条件:50℃,30min后,降至4℃或迅速置于冰上冷却,得到重组产物。下一步将重组产物转入克隆载体。
2)买自TAKARA的E.coli BL21(DE3)的感受态细胞,将重组质粒pNEW-phlD1-rop通过热激法共同转化至上述制备的感受态细胞。
pET28a-phlD1质粒构建方法依照文献(Cao Y,Jiang X,Zhang R,et al.Improvedphloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2011,91(6):1545-1552.)。
实施例3利用基因工程菌株发酵生产间苯三酚
1、摇瓶发酵实验
1)一级种子液的培养:在LB种子液培养基中分别接种固体LB平板上的实施例1 和实施例2制备得到的3个重组菌株单菌落,并加入终浓度为50μg/mL卡那霉素,37℃生长12h,得到一级种子液。
2)将步骤1)得到的一级种子液分别按1.6%(wt)接种量转接至250mL发酵摇瓶中,含50mL发酵培养基,转接种子液时各补加200g/L的MgSO4·7H2O 100μL、500 g/L葡萄糖2.4mL、1000×微量元素母液50μL(1000×微量元素母液的配制: (NH4)6MoO24·4H2O 0.37g;ZnSO4·7H2O 0.29g;H3BO42.47g;CuSO4·5H2O 0.25g; MuCl2·4H2O 1.58g;用蒸馏水定容到100mL)、终浓度50μg/mL卡那霉素(对照菌株不加卡那霉素),每种菌株设定3个平行对照,37℃、180rpm培养。
3)细胞OD600达到0.6-1.0间加入终浓度200μmol/L的IPTG或cumate诱导。
4)诱导后,37℃、180rpm继续培养24h后收集菌液,离心取上清,测定间苯三酚含量。3个菌株的质粒差异及培养条件差异如表1:
表1 3个菌株的质粒差异及培养条件差异
2、间苯三酚的含量检测
间苯三酚(PG)浓度测定:肉桂醛显色法与HPLC。
采用反Weisner检测法(Wenjuan Zha,Sheryl B.Rubin-Pitel,HuiminZhao.Exploiting genetic diversity by directed evolution:molecular breeding oftype III polyketide synthases improves productivity[J].Molecular BioSystems,2008,4(3):246-248.)测定发酵液中间苯三酚的含量,其原理是根据间苯三酚与肉桂醛的显色反应,具体步骤如下:
1)配制10mg/L的肉桂醛显色液(肉桂醛直接溶解于体积比1:3的浓盐酸/乙醇溶液中)。
2)向1.5mL离心管中加入1mL肉桂醛显色液,再加入5μL发酵液上清,颠倒混匀,室温放置15min。
3)用10mm光径比色杯读取OD446值,OD446值在2h内稳定;
4)绘制间苯三酚标准曲线,根据标准曲线计算间苯三酚含量。
HPLC:高效液相色谱。检测方法:Eclipse Plus C18柱,流动相为乙腈:ddH2O=1:1,流速为0.25mL/min,检测波长为230nm,柱温30℃。
根据本实施例操作步骤,在摇瓶水平,诱导培养18h后,BL21(DE3)/pET28a-phlD1菌株的PG产量为0.2g/L,BL21(DE3)/pNEW-phlD1-rop或 BL21(DE3)/pNEW-phlD1-norop的产量分别为0.38g/L和0.35g/L。在摇瓶水平上 BL21(DE3)/pNEW-phlD1-rop或BL21(DE3)/pNEW-phlD1-norop的产量比 BL21(DE3)/pET28a-phlD1的PG产量高2倍左右,而BL21(DE3)/pNEW-phlD1-rop的PG 产量比BL21(DE3)/pNEW-phlD1-norop间苯三酚浓度提高了约15%。HPLC检测结果与肉桂醛显色法的结果相同。
同时,用HPLC检测在不加诱导剂的情况下,3个菌株的漏表达情况。在不加诱导剂的情况下,BL21(DE3)/pET28a-phlD1的PG产量是0.027g/L,BL21(DE3)/pNEW-phlD1-rop 的PG产量是0.048g/L,BL21(DE3)/pNEW-phlD1-norop的PG产量是0.074g/L。由此可以看出,在pNEW载体上添加控制质粒拷贝数的rop基因可以减少泄露表达。
实施例4检测cumate的最适终浓度
1.摇瓶发酵实验
1)一级种子液的培养:在LB种子液培养基中接种固体LB平板上的实施例1和实施例2制备得到的重组菌株单菌落,并加入终浓度为50μg/mL卡那霉素,37℃生长 8-12h。
2)将步骤1)得到的一级种子液分别按1.6%(wt)接种量转接至250mL发酵摇瓶中,含50mL发酵培养基,转接种子液时各补加200g/L的MgSO4·7H2O 100μL、 500g/L葡萄糖2mL、1000×微量元素50μL、终浓度50μg/mL卡那霉素(对照菌株不加卡那霉素),每种菌株设定3个平行对照,37℃、180rpm培养。
3)细胞OD600达到0.6-0.8时,添加cumate,使其终浓度分别保持在 0,10,30,50,100,200μM。
4)诱导后,37℃、180rpm继续培养24h后收集菌液,离心取上清,测定间苯三酚含量。
2.检测间苯三酚的浓度
间苯三酚的含量测定同实施例3
从摇瓶发酵实验的结果中可以看出,cumate的最适终浓度是0.03mM,而IPTG的最适终浓度是0.2mM,所以cumate的最适终浓度是IPTG的1/7。此外,cumate的价格是 54元/5g,IPTG的价格是128元/5g,所以cumate的价格是IPTG的1/3。因此,总体来说,使用cuamte的成本是使用IPTG成本的1/21。
实施例5质粒pNEW-phlD1-rop在其他感受态细胞表达
1.买自全式金生物技术有限公司的E.coli DH5α,JM109,Top的感受态细胞,将重组质粒pNEW-phlD1-rop通过热激法共同转化至上述制备的感受态细胞。
2.一级种子液的培养:在LB种子液培养基中接种固体LB平板上的实施例1制备得到的重组菌株单菌落,并加入终浓度为50μg/mL卡那霉素,37℃生长8-12h。
3.将步骤2得到的一级种子液分别按1.6%(wt)接种量转接至250mL发酵摇瓶中,含50mL LB培养基,转接种子液时各补加终浓度50μg/mL卡那霉素,每种菌株设定3 个平行对照,37℃、180rpm培养。
3)细胞OD600达到0.6-0.8时,添加cumate,使其终浓度分别保持在200μM。
4)诱导后,30℃、180rpm继续培养24h后收集菌液,离心取上清,测定间苯三酚含量。
2.检测间苯三酚的浓度
间苯三酚的含量测定同实施例3
重组质粒pNEW-phlD1-rop在E.coli DH5α,JM109,Top10的PG产量如表2:
表2 pNEW-phlD1-rop在DH5α,JM109 and Top10的PG产量
从摇瓶发酵实验的结果中可以看出,重组质粒pNEW-phlD1-rop在DH5α,JM109 andTop10中均可产PG,只是在不同宿主的PG产量有差异。DH5α/pNEW-phlD1-rop和 Top10/pNEW-phlD1-rop的PG产量相差不大,而JM109/pNEW-phlD1-rop的PG产量较低,是DH5α/pNEW-phlD1-rop或Top10/pNEW-phlD1-rop的62%。
本实施例所列数据为多次重复试验的平均数值。虽然本发明已经公开了示例性示范方案,但是本领域人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (10)
1.一种提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,其特征在于:所述基因工程菌表达包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,其特征在于:所述包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒中还包含控制拷贝数的rop基因。
3.根据权利要求2所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,其特征在于:所述包含聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒中还包含T5启动子、CymOoperator、T7终止子、lacI基因。
4.根据权利要求3所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,其特征在于:所述rop基因来源于pET28a载体,GeneBank ID为ATU32939.1;所述聚酮合成酶基因phlD1来源于荧光假单胞菌,GeneBank ID为11830552;所述CymO operator来自Pseudomonas putida F1,GenBank:MH101728.1。
5.根据权利要求4所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌,其特征在于:宿主菌为大肠杆菌。
6.一种权利要求1-6任一项所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)构建包含rop基因和聚酮合成酶基因phlD1的重组质粒pNEW-phlD1-rop;
2)将步骤1)构建的pNEW-phlD1-rop转化入宿主菌,得到提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述方法具体为:
1)在pNEW载体上添加控制拷贝数的rop基因,并过表达聚酮合成酶基因phlD1,获得重组质粒pNEW-phlD1-rop;
2)将所得重组质粒pNEW-phlD1-rop导入到宿主菌即E.coliBL21(DE3)、DH5α、JM109、Top10或DH10B的感受态细胞中,获得提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌。
8.根据权利要求7所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述重组质粒pNEW-phlD1-rop中还包含T5启动子、CymO operator、T7终止子、lacI基因;所述rop基因来源于pET28a载体,GeneBank ID为ATU32939.1;所述聚酮合成酶基因phlD1来源于荧光假单胞菌,GeneBank ID为11830552;所述CymO operator来自Pseudomonas putida F1,GenBank:MH101728.1。
9.一种权利要求1-6任一项所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的应用,其特征在于:所述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌通过摇瓶培养生产间苯三酚。
10.根据权利要求9所述的提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的应用,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将含有所述提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌的种子液按照接种量为培养基体积的1%-2%接种于培养基,培养温度为30-37℃,搅拌速度为220rpm,pH6.0-8.0,培养至OD600为0.6-0.8,然后加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L,加入终浓度为24g/L的葡萄糖作为底物,分批补料发酵18h后结束培养;
(2)将步骤(1)得到的培养液进行离心取上清,上清采用等体积的乙酸乙酯萃取1-3次;
(3)合并(2)中所述萃取产物,减压蒸馏浓缩,所得固体粉末即为间苯三酚。
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CN201910250966.3A CN109943513A (zh) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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CN201910250966.3A CN109943513A (zh) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 一种可提高间苯三酚生物合成产量并降低生产成本的基因工程菌及其构建方法与应用 |
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- 2019-03-29 CN CN201910250966.3A patent/CN109943513A/zh active Pending
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