CN109929941A - 一种鉴定草甘膦抗性水稻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定草甘膦抗性水稻的方法。本发明提供了一种引物组合，由引物对甲和引物对乙组成；引物对甲由En‑F和En‑R组成；引物对乙由Ec‑F和Ec‑R组成；En‑F如序列3所示；En‑R如序列4所示；Ec‑F如序列5所示；Ec‑R如序列6所示。本发明还保护筛选转基因水稻En‑12和转基因水稻Ec‑8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法：以转基因水稻En‑12和转基因水稻Ec‑8为亲本的后代植株的基因组DNA为模板，分别采用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，如采用引物对甲可得到521bp产物且采用引物对乙可得到550bp产物，该后代植株为草甘膦抗性植株。本发明提供的引物组合可用于鉴定草甘膦抗性水稻，准确度高、特异性强、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定草甘膦抗性水稻的方法。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有举足轻重的地位。但是水稻的产量却受到农田面积减少、农村劳动力匮乏、水资源短缺等问题的困扰，为了解决这些问题，水稻的生产方式正在由水田插秧模式向旱地直播稻进行转变。然而旱地直播稻的产量和质量都直接受到稻田杂草的威胁，传统的除草方式主要依靠人工拔出或锄草，耗时费力、效率低并且投入成本高，化学除草方式的推广使用不仅降低了生产成本还大大提高了水稻的生产效率。
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，具有高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性等其它除草剂所不可比拟的优点，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播后处理。草甘膦是植物体内5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshiki-mate-3-phosate，EPSP)的一种类似物，它的毒性机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成EPSP，从而抑制EPSP合酶的活性导致分枝酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了生物体正常的氮代谢而使其死亡。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定草甘膦抗性水稻的方法。
本发明首先提供了一种引物组合，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物En-F和引物En-R组成；所述引物对乙由引物Ec-F和引物Ec-R组成；
所述引物En-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物En-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ec-F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ec-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的功能为如下(d1)或(d2)：
(d1)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(d2)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)制备用于鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的试剂盒；
(c2)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(c3)制备用于筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的试剂盒；
(c4)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组合；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)：
(d1)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(d2)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将每条引物进行独立包装的步骤。
本发明还保护所述引物组合或所述试剂盒的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(d2)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
本发明还保护一种鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：以转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，如果满足特定标准，该后代植株为草甘膦抗性植株；如果不满足所述特定标准，该后代植株为草甘膦感性植株；
所述特定标准为：采用引物对甲可以得到521bp的扩增产物且采用引物对乙可以得到550bp的扩增产物。
本发明还保护一种筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：以转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA为模板，分别采用所述引物组合中的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲可以得到521bp的扩增产物且采用引物对乙可以得到550bp的扩增产物，该后代植株即为筛选出来的草甘膦抗性植株。
本发明还保护一种鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法：检测转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA中是否具有片段甲和片段乙；如果满足特定标准，该后代植株为草甘膦抗性植株；如果不满足所述特定标准，该后代植株为草甘膦感性植株；
所述特定标准为：基因组DNA中同时具有片段甲和片段乙；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护一种筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：检测转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA中是否具有片段甲和片段乙；如果基因组DNA中同时具有片段甲和片段乙，该后代植株即为筛选出来的草甘膦抗性水稻；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护片段甲和片段乙；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
采用所述引物对甲进行PCR扩增时，反应体系具体可为：0.5μl Taq Polymerase溶液、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、5.0μl dNTP溶液、1μl En-F溶液、1μl En-R溶液、1μl模板溶液(DNA含量约为100ng)，用灭菌ddH2O补足至50μl。Taq Polymerase溶液中，TaqPolymerase浓度为5U/μl。dNTP溶液中，dNTP浓度为2.5mM。En-F溶液中，En-F浓度为10.0μM。En-R溶液中，En-R浓度为10.0μM。
采用所述引物对甲进行PCR扩增时，反应程序具体可为：95℃预变性4min；95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸1min，30个循环；72℃扩增10min。
采用所述引物对乙进行PCR扩增时，反应体系具体可为：0.5μl Taq Polymerase溶液、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、5.0μl dNTP溶液、1μl Ec-F溶液、1μl Ec-R溶液、1μl模板溶液(DNA含量约为100ng)，用灭菌ddH2O补足至50μl。Taq Polymerase溶液中，TaqPolymerase浓度为5U/μl。dNTP溶液中，dNTP浓度为2.5mM。Ec-F溶液中，Ec-F浓度为10.0μM。Ec-R溶液中，Ec-R浓度为10.0μM。
采用所述引物对乙进行PCR扩增时，反应程序具体可为：95℃预变性4min；95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸1min，30个循环；72℃扩增10min。
以上任一所述转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代具体可为：
转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代具体可为如下F2代植株：
(1)转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8进行杂交，获得的种子为F1代种子；
(2)F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子；
(3)F2代种子长成的植株为F2代植株。
转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代具体可为如下F3代植株：
(1)转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8进行杂交，获得的种子为F1代种子；
(2)F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子；
(3)F2代种子长成的植株为F2代植株，F2代植株自交，获得的种子为F3代种子
(4)F3代种子长成的植株为F3代植株。
转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代具体可为如下F2代植株：
(1)以转基因水稻En-12为父本，以转基因水稻Ec-8为母本进行杂交，获得的种子为F1代种子；
(2)F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子；
(3)F2代种子长成的植株为F2代植株。
转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代具体可为如下F3代植株：
(1)以转基因水稻En-12为父本，以转基因水稻Ec-8为母本进行杂交，获得的种子为F1代种子；
(2)F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子；
(3)F2代种子长成的植株为F2代植株，F2代植株自交，获得的种子为F3代种子；
(4)F3代种子长成的植株为F3代植株。
本发明提供的引物组合可用于鉴定草甘膦抗性水稻，准确度高、特异性强、灵敏度高。
附图说明
图1为某一转基因水稻En-12、某一En/Ec植株、中花11、转基因水稻Ec-8在步骤3中的电泳图。
图2为某一转基因水稻Ec-8、某一En/Ec植株、中花11、某一转基因水稻En-12在步骤3中的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8：记载于“靳茜.利用基因拆分技术限控转基因漂流的研究.中国农业科学院,博士论文,2012”一文，公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得。
农达草甘膦(有效成分为41％的草甘膦异丙胺盐水剂)：美国孟山都公司产品，中化国际(控股)股份有限公司代理，农药登记号：PD73-88。2000ppm草甘膦溶液的制备方法：将2ml农达草甘膦加入到408ml水中，混匀，得到2000ppm草甘膦溶液。
实施例1、分子标记序列的发现以及引物的设计
一、获得多代种子
1、在花期，以转基因水稻En-12为父本，以转基因水稻Ec-8为母本进行杂交，获得的种子为F1代种子。
2、F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子。
3、F2代种子长成的植株为F2代植株。
二、草甘膦抗性鉴定
待测植株分别为：转基因水稻En-12、转基因水稻Ec-8、F2代植株。
检测草甘膦抗性的方法：当植株生长的3-5叶期时，喷施2000ppm草甘膦溶液，14天后观察，如果植株未死亡、该植株为草甘膦抗性植株，如果植株死亡、该植株为草甘膦感性植株。
三、序列分析
对步骤二中的所有待测植株进行进行序列分析，发现了两个特异片段，片段甲和片段乙。片段甲如序列表的序列1所示。片段乙如序列表的序列2所示。
部分F2代植株为草甘膦抗性植株，所有草甘膦抗性植株的基因组中都同时存在片段甲和片段乙。
所有转基因水稻En-12均为草甘膦感性植株，其基因组中仅存在片段甲、不存在片段乙。
所有转基因水稻Ec-8均为草甘膦感性植株，其基因组中仅存在片段乙、不存在片段甲。
四、设计引物
根据序列分析的结果，设计用于鉴定片段甲的引物对，命名为引物对甲，由引物En-F和引物En-R组成，靶序列为521bp。
En-F(序列表的序列3)：5’-ACGAAAGACAGAAAGGAAGATTACTA-3’；
En-R(序列表的序列4)：5’-AAGCAATACGCATTAGGGTTCCTATA-3’。
根据序列分析的结果，设计用于鉴定片段乙的引物对，命名为引物对乙，由引物Ec-F和引物Ec-R组成，靶序列为550bp。
Ec-F(序列表的序列5)：5’-CTTTAAGTGAAGCGCTTATGATTCA-3’；
Ec-R(序列表的序列6)：5’-ATCTATGTTACTAGATCGGGAATTCGT-3’。
实施例2、方法的建立
一、获得各代植株
1、在花期，以转基因水稻En-12为父本，以转基因水稻Ec-8为母本进行杂交，获得的种子为F1代种子。
2、F1代种子长成的植株为F1代植株，F1代植株自交，获得的种子为F2代种子。
3、F2代种子长成的植株为F2代植株，F2代植株自交，获得的种子为F3代种子。
4、F3代种子长成的植株为F3代植株。
二、检测植株的基因型
待测植株为：20株转基因水稻En-12、20株转基因水稻Ec-8、20株F1代植株、390株F2代植株、抽样检测的500株F3代植株。水稻品种中花11作为待测水稻的阴性对照品，进行平行试验。水作为待测水稻的空白对照品。
1、取待测植株的叶片，提取基因组DNA，然后用水稀释，得到模板溶液。
2、取步骤1得到的模板溶液，采用实施例1设计的引物对甲进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系：0.5μl Taq Polymerase溶液、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、5.0μl dNTP溶液、1μl En-F溶液、1μl En-R溶液、1μl模板溶液(DNA含量约为100ng)，用灭菌ddH2O补足至50μl。Taq Polymerase溶液中，Taq Polymerase浓度为5U/μl。dNTP溶液中，dNTP浓度为2.5mM。En-F溶液中，En-F浓度为10.0μM。En-R溶液中，En-R浓度为10.0μM。
PCR扩增的反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸1min，30个循环；72℃扩增10min。
3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶。转基因水稻En-12的PCR扩增产物均显示特异性扩增条带，F1代植株的PCR扩增产物均显示特异性扩增条带，部分F2代植株的PCR扩增产物显示特异性扩增条带，部分F3代植株的PCR扩增产物显示特异性扩增条带。经测序，各个特异性扩增条带均为521bp。转基因水稻Ec-8、部分F2代植株以及部分F3代植株没有实现有效的PCR扩增，无任何条带显示。
4、取步骤1得到的模板溶液，采用实施例1设计的引物对乙进行PCR扩增。
PCR扩增的反应体系：0.5μl Taq Polymerase溶液、5.0μl 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)、5.0μl dNTP溶液、1μl Ec-F溶液、1μl Ec-R溶液、1μl模板溶液(DNA含量约为100ng)，用灭菌ddH2O补足至50μl。Taq Polymerase溶液中，Taq Polymerase浓度为5U/μl。dNTP溶液中，dNTP浓度为2.5mM。Ec-F溶液中，Ec-F浓度为10.0μM。Ec-R溶液中，Ec-R浓度为10.0μM。
PCR扩增的反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30sec、52℃退火30sec、72℃延伸1min，30个循环；72℃扩增10min。
5、将步骤4得到的PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶。转基因水稻Ec-8的PCR扩增产物均显示特异性扩增条带，F1代植株的PCR扩增产物均显示特异性扩增条带，部分F2代植株的PCR扩增产物显示特异性扩增条带，部分F3代植株的PCR扩增产物显示特异性扩增条带。经测序，各个特异性扩增条带均为550bp。转基因水稻En-12、部分F2代植株以及部分F3代植株没有实现有效的PCR扩增，无任何条带显示。
综合上述步骤的结果：20株转基因水稻En-12，在步骤3中PCR扩增产物均显示521bp特异条带，在步骤5中均未实现有效的PCR扩增(均不显示550bp特异条带)，将其基因型命名为甲基因型。20株转基因水稻Ec-8，在步骤5中PCR扩增产物均显示550bp特异条带，在步骤3中均未实现有效的PCR扩增(均不显示521bp特异条带)，将其基因型命名为乙基因型。20株F1代植株，在步骤3中PCR扩增产物均显示521bp特异条带，在步骤5中PCR扩增产物均显示550bp特异条带，将其命名为丙基因型。390株F2代植株,73株为甲基因型、73株为乙基因型、220株为丙基因型，剩余的植株在步骤3中未实现有效扩增(均不显示521bp特异条带)且在步骤5中未实现有效扩增(均不显示550bp特异条带)(将其命名为丁基因型)。抽样检测的500株F3代植株,41株为甲基因型、41株为乙基因型、195株为丙基因型，剩余植株为丁基因型。
丙基因型的植株又称为En/Ec植株。
某一转基因水稻En-12、某一En/Ec植株、中花11、转基因水稻Ec-8在步骤3中的电泳图见图1。
某一转基因水稻Ec-8、某一En/Ec植株、中花11、某一转基因水稻En-12在步骤3中的电泳图见图2。
三、检测植株的草甘膦抗性
待测植株即步骤二中的待测植株。
检测草甘膦抗性的方法：当植株生长的3-5叶期时，喷施2000ppm草甘膦溶液，14天后观察，如果植株未死亡、该植株为草甘膦抗性植株，如果植株死亡、该植株为草甘膦感性植株。
结果表明，所有丙基因型的植株均为草甘膦抗性植株，所有甲基因型的植株均为草甘膦感性植株，所有乙基因型的植株均为草甘膦感性植株，所有丁基因型的植株均为草甘膦感性植株。
实施例3、灵敏度检测
1、取实施例2中获得的En/Ec植株(F2代植株)，提取基因组DNA。该基因组DNA作为目的DNA。
2、取中花11，提取基因组DNA。该基因组DNA作为背景DNA。
3、将目的DNA和背景DNA混合，得到模板溶液。1μl模板溶液中DNA总含量约为100ng，目的DNA的含量为100个拷贝、50个拷贝、25个拷贝、15个拷贝或者10个拷贝。
4、取步骤3得到的模板溶液，采用实施例1设计的引物对甲进行PCR扩增，PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶。
PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的2。
结果表明，当体系中目的DNA的含量为15个拷贝以上时，均能检测到521bp的目标条带。
5、取步骤3得到的模板溶液，采用实施例1设计的引物对乙进行PCR扩增，PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶。
PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应程序同实施例2的步骤二的4。
结果表明，当体系中目的DNA的含量为25个拷贝以上时，均能检测到550bp的目标条带。
以上结果表明实施例2得到的引物对甲和引物对乙具有较强的灵敏度。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种鉴定草甘膦抗性水稻的方法
<130> GNCYX172265
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 884
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tcttatgccg ctgatctccc gaacatcaca ggaccgctcg atcttcgttt tatgcagttg 60
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cgccgaatta attcggggga tctggatttt agtactggat tttggtttta ggaattagaa 780
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aacacatgag cgaaacccta taggaaccct aatgcgtatt gctt 884
<210> 2
<211> 840
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gccgtggtcg gtgacacgta cggattcggt cctcgcagtt aggaaaataa tgcagcatat 60
tgttggccgt ttttcggtga acagggtatg gaaatgtggt ctctgtcaca ttcacacatc 120
agtagttcac ttggtggtgc ctttaagtga agcgcttatg attcacgctg atgtgttgca 180
gtttgtgttc aacatcaact gaatattggg taggaattaa tgtatgtgct ccatttgcca 240
caaggatttc aagtctggca agttttttgc ccgctgggtt cgtgaacagg tatggaatgg 300
ggcgtggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct 360
ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac 420
catgttggca agctgctcta gccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 480
cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 540
attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 600
cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgacatg 660
attacgaatt cccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 720
gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 780
aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa tatacatgct aaccgtactt 840
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
acgaaagaca gaaaggaaga ttacta 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aagcaatacg cattagggtt cctata 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ctttaagtga agcgcttatg attca 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atctatgtta ctagatcggg aattcgt 27
Claims (10)
1.引物组合，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由引物En-F和引物En-R组成；所述引物对乙由引物Ec-F和引物Ec-R组成；
所述引物En-F为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物En-R为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ec-F为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物Ec-R为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：
(c1)制备用于鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的试剂盒；
(c2)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(c3)制备用于筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的试剂盒；
(c4)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组合；所述试剂盒的功能为如下(d1)或(d2)：
(d1)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(d2)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将每条引物进行独立包装的步骤。
5.权利要求1所述引物组合或权利要求3所述试剂盒的应用，为如下(d1)或(d2)：
(d1)鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株；
(d2)筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株。
6.一种鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：以转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，如果满足特定标准，该后代植株为草甘膦抗性植株；如果不满足所述特定标准，该后代植株为草甘膦感性植株；
所述特定标准为：采用引物对甲可以得到521bp的扩增产物且采用引物对乙可以得到550bp的扩增产物。
7.一种筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：以转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1所述引物组合中的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲可以得到521bp的扩增产物且采用引物对乙可以得到550bp的扩增产物，该后代植株即为筛选出来的草甘膦抗性植株。
8.一种鉴定转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法：检测转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA中是否具有片段甲和片段乙；如果满足特定标准，该后代植株为草甘膦抗性植株；如果不满足所述特定标准，该后代植株为草甘膦感性植株；
所述特定标准为：基因组DNA中同时具有片段甲和片段乙；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
9.一种筛选转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代中的草甘膦抗性植株的方法，包括如下步骤：检测转基因水稻En-12和转基因水稻Ec-8为亲本的后代植株的基因组DNA中是否具有片段甲和片段乙；如果基因组DNA中同时具有片段甲和片段乙，该后代植株即为筛选出来的草甘膦抗性水稻；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
10.片段甲和片段乙；
所述片段甲为如下(e1)或(e2)或(e3)：
(e1)序列表的序列1第364-884位核苷酸所示的DNA分子；
(e2)序列表的序列1所示的DNA分子；
(e3)将(e1)或(e2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述片段乙为如下(f1)或(f2)或(f3)：
(f1)序列表的序列2第141-690位核苷酸所示的DNA分子；
(f2)序列表的序列2所示的DNA分子；
(f3)将(f1)或(f2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016007347A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide |
| CN106191218A (zh) * | 2015-05-04 | 2016-12-07 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 耐草甘膦转基因陆地棉bg2-7的检测方法及侧翼序列 |
| CN107129993A (zh) * | 2016-02-26 | 2017-09-05 | 华中农业大学 | 一种修饰的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法 |
-
2017
- 2017-12-19 CN CN201711372315.9A patent/CN109929941B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016007347A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide |
| CN106191218A (zh) * | 2015-05-04 | 2016-12-07 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 耐草甘膦转基因陆地棉bg2-7的检测方法及侧翼序列 |
| CN107129993A (zh) * | 2016-02-26 | 2017-09-05 | 华中农业大学 | 一种修饰的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| XU-JING WANG等: "The application of gene splitting technique for controlling transgene flow in rice", 《TRANSGENIC RES》 * |
| YUFENG DONG等: "Development and Event-specific Detection of Transgenic Glyphosate-resistant Rice Expressing the G2-EPSPS Gene", 《FRONTIERS IN PLANT SCIENCE》 * |
| 董玉凤: "转G2-aroA基因抗草甘膦水稻的获得及G2-EPSPS蛋白拆分重组后的草甘膦抗性分析", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 * |
| 董玉凤等: "利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究", 《作物学报》 * |
| 靳茜: "利用基因拆分技术限控转基因飘流的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)农业科技辑》 * |
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