CN109929791A - 一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109929791A CN109929791A CN201910301799.0A CN201910301799A CN109929791A CN 109929791 A CN109929791 A CN 109929791A CN 201910301799 A CN201910301799 A CN 201910301799A CN 109929791 A CN109929791 A CN 109929791A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucosamine
- gene
- escherichia coli
- seq
- coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用，属于遗传工程技术领域。以大肠杆菌作为宿主表达，通过敲除大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB基因，获得重组大肠杆菌，并将重组大肠杆菌应用于氨基葡萄糖的生产中，实现了阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径；并通过过量表达氨基葡萄糖合成酶编码基因、氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，加强了氨基葡萄糖的合成途径，从而提高氨基葡萄糖的产量。
Description
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
糖工业是食品行业的基础工业，又是造纸、化工、发酵、医药、建材等多种产品的原料工业，在国民经济中占有十分重要的地位。功能糖及其衍生物是健康产业的重要组成部分，是食品生物技术领域的朝阳产业，近几年来产业发展迅猛。氨基葡萄糖(Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose，GlcN)，又称氨基葡糖、葡萄糖胺或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。目前，GlcN相关的化合物一般包括：氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖硫酸盐以及乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)。其中，GlcN分子式为C6H13O5N，俗称氨基糖。GlcN几乎存在于所有有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分，在细胞内可由6-磷酸葡萄糖氨基化生成。
GlcN及其衍生物在医药、食品、化妆品等方面均有十分广泛的应用，GlcN的主要生产方法有甲壳素水解法、酶生物转化法和微生物发酵法。甲壳素水解法在生产中存在原料来源受限、易造成环境污染和过敏反应，难于实现工业化生产；酶生物转化法相比与甲壳素水解法，对环境污染太小，但是存在反应时间长，效率低的问题；微生物转化法避开了前两种方法存在的确定，并且效率高，成为现在生产GlcN的主要方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种积累氨基普通糖的重组大肠杆菌。本发明的另一个目的是一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌的应用。经过改造后的大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行氨糖生产，并且其产量也有显著提升。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，敲除所述大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB基因，阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径，提高氨基葡萄糖的产量。
进一步的，作为宿主的大肠杆菌，是大肠杆菌W3110，或者敲除了乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE大肠杆菌W3110、或者敲除了甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ大肠杆菌W3110、或者敲除了脱乙酰基酶基因nagA大肠杆菌W3110，或者敲除了脱氨基酶基因nagB大肠杆菌W3110。
进一步的，将氨基葡萄糖合成途径中的氨基葡萄糖合成酶编码基因GlmS，克隆到表达载体pTargetF，然后转化大肠杆菌，通过改变代谢途径，实现氨基葡萄糖的积累。
进一步的，将氨基葡萄糖合成途径中的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，克隆到表达载体pTargetF，然后转化大肠杆菌，通过改变代谢途径，实现氨基葡萄糖的积累。
进一步的，在pGEM-T-GlmS质粒上对GlmS基因进行定点突变，将64位氨基酸-谷氨酸-替换为谷氨酰胺。
一种构建积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)克隆乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因、甘露糖磷酸转运子编码基因、脱乙酰基酶基因、脱氨基酶基因，连接到重组表达质粒上；
(2)将上述重组表达载体转化大肠杆菌，得到积累氨基葡萄糖重组大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110、大肠杆菌W3110ΔnagE、大肠杆菌W3110ΔnagEΔmanXYZ、大肠杆菌W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA和大肠杆菌W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB。
一种应用上述重组大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，将200rpm转速在37℃在培养箱中培养过夜，得到菌株种子液；将种子液接种至装有发酵培养基的摇瓶中，摇瓶以180rpm的转速在30℃的培养箱中培养48h。
进一步的，所述种子液培养基为LB培养基。
进一步的，所述发酵培养基的配方：葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸钙30g/L、L-苏氨酸0.2g/L、Thiamine 0.1mg/L、MgSO41g/L、FeSO40.5mg/L、MnSO45mg/L和ZnSO45mg/L。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
(1)本发明提供一种积累氨基葡萄糖的大肠杆菌及其应用，经过改造后的大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行氨糖生产，并且其产量也有显著提升。
(2)本发明通过敲除大肠杆菌氨基葡萄糖合成途径中的基因，实现了阻断产物氨基葡萄糖由胞外到胞内的运输途径，实现了氨基葡萄糖的积累。
(3)本发明通过过量表达GlcN-6-P合酶和氨基葡萄糖乙酰化酶，可以减轻产物的反馈抑制，加强了氨基葡萄糖的合成途径，提高了氨基葡萄糖的产量。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。如本文所使用的，术语“增强”指的是增加由对应的多核苷酸编码的酶的活性。可以通过基因的过表达或替换基因组上该基因的表达调控序列(启动子替换等)。
实施例1
基于野生型大肠杆菌菌株的代谢改造
(1)nagE基因的敲除
为了阻断nagE以实现氨基葡萄糖输入系的部分失活，使其减少氨基葡萄糖的摄入，因此对野生型菌株中的nagE基因进行了敲除。
通过CRISPR-Cas9***(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)编辑野生型大肠杆菌Escherichiacoli W3110(购自大肠杆菌菌种保藏中心CGSC)基因组中编码L-蛋氨酸运输***的nagE基因。通过PCR使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物，以及pTargetF载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)作为模板构建能够表达靶定目的基因metI的sgRNA的pTarget-ΔnagE突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔnagE载体。
<SEQ ID NO.1>
<SEQ ID NO.2>
通过PCR使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物，以大肠杆菌Escherichia coliW3110基因组为模板扩增得到nagE基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
按同样的方法使用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物扩增得到nagE基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
将回收的两个DNA片段使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。
将pTarget-ΔnagE载体和回收的DNA片段一同电转化至Escherichia coli W3110菌株，其已经转化有pCas9载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。
<SEQ ID NO.3>
<SEQ ID NO.4>
<SEQ ID NO.5>
<SEQ ID NO.6>
为了电穿孔，转化有pCas9载体的Escherichia coli W3110菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-***糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃下培养过夜。挑取单菌落作为模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物进行PCR，并且通过观察到在1.0％电泳检测中存在1000bp的DNA条带确认nagE基因的缺失。
将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔnagE载体。然后将已经去除pTarget-ΔnagE载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。如此构建的菌株命名为W3110ΔnagE。
<SEQ ID NO.7>
<SEQ ID NO.8>
(2)manXYZ基因的敲除
通过CRISPR-Cas9***(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)编辑W3110ΔnagE菌株基因组中manXYZ基因。通过PCR使用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物，以及pTargetF载体(AEM(2015)，81(7)：2506-14)作为模板构建能够表达靶定目的基因manXYZ的sgRNA的pTarget-ΔmanXYZ突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔmanXYZ载体。
<SEQ ID NO.9>
<SEQ ID NO.10>
通过PCR使用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12的引物，以大肠杆菌Escherichiacoli W3110基因组为模板扩增得到manXYZ基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14的引物扩增得到manXYZ基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
将回收的两个DNA片段使用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.14的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。将pTarget-ΔmanXYZ载体和回收的DNA片段一同电转化至Escherichia coli W3110ΔnagE菌株，其已经转化有pCas9载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。
<SEQ ID NO.11>
<SEQ ID NO.12>
<SEQ ID NO.13>
<SEQ ID NO.14>
为了电穿孔，转化有pCas9载体的Escherichia coli W3110ΔnagE菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-***糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃下培养过夜。挑取单菌落作为模板，以SEQ ID NO.15和SEQID NO.16的引物进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测中存在1000bp的DNA条带确认manXYZ基因的缺失。
将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔmanXYZ载体。然后将已经去除pTarget-ΔmanXYZ载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，etal.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。如此构建的菌株命名为W3110ΔnagEΔmanXYZ。
<SEQ ID NO.15>
<SEQ ID NO.16>
(3)nagA基因的敲除
通过CRISPR-Cas9***(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)编辑W3110ΔnagEΔmanXYZ菌株基因组中编码胱硫醚γ合成酶的metJ基因。通过PCR使用SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18的引物，以及pTargetF载体(AEM(2015)，81(7)：2506-14)作为模板构建能够表达靶定目的基因nagA的sgRNA的pTarget-ΔnagA突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔnagA载体。
<SEQ ID NO.17>
<SEQ ID NO.18>
通过PCR使用SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20的引物，以W3110ΔnagEΔmanXYZ菌株的基因组为模板扩增得到nagA基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22的引物扩增得到nagA基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
将回收的两个DNA片段使用SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.22的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。将pTarget-ΔnagA载体和回收的DNA片段一同电转化至W3110ΔnagEΔmanXYZ菌株，其已经转化有pCas9载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichia coli Genomevia the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。
<SEQ ID NO.19>
<SEQ ID NO.20>
<SEQ ID NO.21>
<SEQ ID NO.22>
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110ΔnagEΔmanXYZ菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-***糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24的引物进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测中存在1000bp的DNA条带确认nagA基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔnagA载体。然后将已经去除pTarget-ΔnagA载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，etal.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRJSPR-Cas9System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。如此构建的菌株命名为W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA。
<SEQ ID NO.23>
<SEQ ID NO.24>
(4)nagB基因的敲除
对W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株中的nagB基因进行敲除。
通过CRISPR-Cas9***(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)对W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株中的GNA1基因进行过表达改造的W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株基因组中编码高丝氨酸激酶的nagB基因进行编辑。通过PCR使用SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26的引物，以及pTargetF载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)作为模板构建能够表达靶定目的基因nagB的sgRNA的pTarget-ΔnagB突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔnagB载体。
<SEQ ID NO.33>
<SEQ ID NO.34>
通过PCR使用SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的引物，以W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)菌株的基因组为模板扩增得到nagB基因上游同源片段，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30的引物扩增得到nagB基因下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
将回收的两个DNA片段使用SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.30的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min，PCR产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段。将pTarget-ΔnagB载体和回收的DNA片段一同电转化至W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)菌株，其已经转化有pCas9载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology，2015，81(7)：2506.)。
<SEQ ID NO.27>
<SEQ ID NO.28>
<SEQ ID NO.29>
<SEQ ID NO.30>
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-***糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以SEQ IDNO.31和SEQ ID NO.32的引物进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测中存在1000bp的DNA条带确认nagB基因的缺失。将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔnagB载体。然后将已经去除pTarget-ΔnagB载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。如此构建的菌株命名为W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1(trc)。
<SEQ ID NO.31>
<SEQ ID NO.32>
实施例2
基于W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1(trc)菌株代谢改造，GNA1基因表达增强
用trc启动子序列替换GNA1基因中的原始启动子序列以达到增强GNA1基因表达目的。
通过CRISPR-Cas9***(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J]·Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)编辑W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株基因组中编码高丝氨酸脱氢酶的GNA1基因的启动子序列。通过PCR使用SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34的引物，以及pTargetF载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，et al.MultigeneEditing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)作为模板构建能够表达靶定目的基因GNA1启动子序列的sgRNA的pTarget-ΔPGNA1：：Ptrc突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，55℃15s，72℃2min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔPGNA1：：Ptrc载体。
<SEQ ID NO.33>
<SEQ ID NO.34>
通过PCR使用SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36的引物，以W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株的基因组为模板扩增得到GNA1基因启动子序列上游同源片段，GNA1基因的启动子序列信息是基于EcocycE.coli Database数据库中获得的(EcoCyc基因登记号：EG10590)，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38的引物扩增得到GNA1基因启动子序列下游同源片段，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。
将回收的两个DNA片段使用SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.38的引物进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，该基因条带中已将Ptrc启动子序列***至两同源片段之间。将pTarget-ΔPGNA1：：Ptrc载体和回收的DNA片段一同电转化至W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株，其已经转化有pCas9载体(Jiang Y，ChenB，Duan C，et al.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via theCRISPR-Cas9 System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。
<SEQ ID NO.35>
<SEQ ID NO.36>
<SEQ ID NO.37>
<SEQ ID NO.38>
为了电穿孔，转化有pCas9载体的W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM L-***糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。将电转化后的菌液涂至含有50mg/L的卡那霉素和50mg/L的盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40的引物进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测中存在700bp的DNA条带确认GNA1基因的原始启动子序列已被Ptrc启动子序列替换。
将通过此确认的菌株在含有50mg/L的卡那霉素和5mM IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔPGNA1：：Ptrc载体。然后将已经去除pTarget-ΔPGNA1：：Ptrc载体的菌株在LB培养基中在37℃下培养过夜以去除pCas载体(Jiang Y，Chen B，Duan C，etal.Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRJSPR-Cas9System[J].Applied&Environmental Microbiology，2015，81(7)：2506.)。将去除pCas载体后的菌株使用引物SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.38进行PCR扩增，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min将PCR产物进行测序验证，测序结果通过BLAST序列比对确认GNA1基因的原位启动子序列已被Ptrc启动子成功替换。构建的菌株命名为W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)。
<SEQ ID NO.39>
<SEQ ID NO.40>
实施例3
具有抗反馈抑制的GlmS基因的获得
以野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110(购自大肠杆菌菌种保藏中心CGSC)基因组作为模板，连同SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50的引物进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pGEM-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-GlmS。在pGEM-T-GlmS质粒上对GlmS基因进行定点突变，将64位氨基酸-谷氨酸-替换为谷氨酰胺(E64Q)，使用的引物为SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52，并以pGEM-T-GlmS质粒为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：98℃3min；98℃10s，55℃5s，72℃3min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L氨苄青霉素钠抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后，随机挑取单菌落进行测序分析，获得GlmS突变基因。
<SEQ ID NO.49>
<SEQ ID NO.50>
<SEQ ID NO.51>
<SEQ ID NO.52>
实施例4
GlmS解除反馈抑制基因的增强表达
以野生型大肠杆菌Escherichia coli W3110(购自大肠杆菌菌种保藏中心CGSC)基因组作为模板，连同SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56的引物进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pGEM-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pGEM-T-GlmS。
将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，涂布于含有浓度为50μg/mL氨苄青霉素钠抗性的LB平板，随机挑取阳性克隆进行测序分析。根据分析结果设计表达引物SEQ IDNO.57和SEQ ID NO.58(引物中分别具有Kpn I限制性酶切位点和Hind III限制性酶切位点)，获得1257bp的GlmS基因序列。利用Kpn I和Hind III限制性内切酶对扩增片段进行酶切处理，利用T4 DNA连接酶将该片段与用相同限制性内切酶处理的pTrc99A-GlmS11进行连接，构建表达载体pTrc99A-GlmS11-GlmS，并且命名为pA11y。
<SEQ ID NO.55>
<SEQ ID NO.56>
<SEQ ID NO.57>
<SEQ ID NO.58>
实施例5
实验菌株的构建
(1)菌株的构建
将构建的大肠杆菌菌株W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1(trc)、W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)、W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1-thrA(trc)制备成感受态细胞，并且通过化学转化法将实施例4中构建的质粒pA11y转化至上述制备的感受态细胞中，涂布于含有浓度为50μg/mL氨苄青霉素钠抗性的LB平板，得到含有pA11y质粒的三种代谢改造后的菌株。
(2)摇瓶发酵实验
对上述菌体在摇瓶中进行发酵实验测试，以比较各基因型菌株之间生产氨糖的能力。摇瓶发酵实验按如下方案进行：将每个菌株划线接种在含有50μg/mL氨苄青霉素钠抗性的LB平板上，在37℃在培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5mL的LB培养基中，并且以200rpm的转速在37℃在培养箱中培养过夜。
在500mL的摇瓶中添加20mL的表1中显示的发酵培养基，并将1mL每种菌株的种子液接种至摇瓶的培养基中。然后摇瓶以180rpm的转速在30速的培养箱中培养48小时，最终比较携带质粒的每种菌株获得氨糖的量。结果如表1所示，葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸钙30g/L、L-苏氨酸0.2g/L、Thiamine 0.1mg/L、MgSO41g/L、FeSO40.5mg/L、MnSO45mg/L和ZnSO45mg/L。
表1代谢改造菌株摇瓶发酵实验
根据表1可知，三株经过代谢改造并携带载体的W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagA-GNA1(trc)/pA11y、W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1(trc)/pA11y、W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1-thrA(trc)/pA11y菌株都具有生产氨糖的能力，可以减弱其对GlmS基因的反馈抑制作用，从而发挥该酶良好的活性。
(3)L-苏氨酸添加量实验
对L-苏氨酸营养缺陷型菌株W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1-thrA(trc)/pA11y进行了L-苏氨酸添加量的实验，在不含L-苏氨酸的发酵培养基中分别添加0～1.6g/L不同浓度梯度的L-苏氨酸，并将1mL每种菌株的种子液接种至摇瓶的培养基中。然后摇瓶以180rpm的转速在30℃的培养箱中培养48小时。最终考查W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1-thrA(trc)/pA11y菌株生产氨糖的能力。
通过外源添加L-苏氨酸的发酵实验，W3110 ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB-GNA1-thrA(trc)/pA11y菌株生产氨糖的产量水平为25g/L。对于L-苏氨酸营养缺陷型菌株来说，在没有外源添加L-苏氨酸的时候，菌株的生长受到限制，其代谢生产氨糖的能力也随之受到限制。当过量添加L-苏氨酸时，不仅不能促进菌体生长，还会对氨糖的积累起到负面的影响。
实施例6
葡萄糖浓度的检测采用SBA-40C型乳酸-葡萄糖生物传感分析仪进行分析。具体操作如下：发酵液经8000r/min离心10min，取上清液用去离子水适当稀释，使测得数据在100以内，以保持良好的线性关系。用微量注射器吸取葡萄糖溶液标准样25μL迅速注入进样口，多次进样直至显示屏数据为100且进样灯常亮，此时再吸取处理好的样品25μL，进样并记录下数据(屏幕显示数据为100时代表葡萄糖浓度为1g/L)。发酵液中的葡萄糖浓度显示数据/100×稀释倍数。
Glc NAc用HPLC方法检测，Agilent 1200，RID检测器，Alltech C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：70％乙腈，流速0.7mL/min，柱温30℃，进样体积为10μL。乙酸浓度的测定：HPLC法。色谱柱为Zorbax SB-C18 4.6mm×150mm；流动相0.1％H3PO4溶液；流速1.0mL/min；检测波长210nm；柱温30℃；进样量5μL。
在5L发酵罐上进行氨糖的发酵，发酵液初始体积为2L，葡萄糖初始浓度为27g/L，于接种后2h后以F(μset＝0.2h-1)流加300g/L的葡萄糖，从发酵10h开始，以32mL/h的流速流加300g/L的葡萄糖至发酵结束。分阶段葡萄糖流加策略发酵的实验结果：DCW在16h达到最大值20.44g/L，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖在16h时达到最高值35.10g/L和34.56g/L，而此时乙酸浓度仅为1.59g/L。与不流加葡萄糖时相比，氨基葡萄糖总产量最高值达到69.66g/L，较不流加时提高了1.59倍。氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖生产强度分别为1.46g/(L·h)和1.44g/(L·h)，较不流加时分别提高58.7％和51.6％。
实施例7
在5L发酵罐上进行氨糖的发酵，加入发酵培养基2L，控制温度为37℃，调节通气量和转速，保持溶氧分别为10％、20％、30％、40％进行发酵。
在不控制溶氧水平条件下，在5L发酵罐中进行氨基葡萄糖分批发酵，研究发现：溶氧水平在开始的8h内持续下降，于8h时达到最低值17％，此后逐渐上升，在24h达到89％。在发酵至16h，DCW、Glc N和Glc NAc浓度分别达到最高值15.48g/L，25.42g/L和27.89g/L，葡萄糖浓度持续下降，在24h达到10g/L。
通过在发酵过程中控制不同溶氧水平(10％、20％、30％、40％)，研究了其对氨基葡萄糖分批发酵的影响，并与不控制溶氧水平的发酵情况进行了对比。在溶氧水平分别为10％、20％、30％、40％DCW最高值分别为9.45，15.44，13.14和11.98g/L，说明20％的溶氧水平适合于菌体生长，在溶氧水平分别为10％、20％、30％、40％时，Glc N浓度最高值分别为18.80，25.69，25.19和21.88g/L；Glc NAc浓度最高值分别为15.30，26.01，25.11和22.48g/L。当溶氧水平从10％升高至40％时，葡萄糖平均比消耗速率从0.07h-1升高至0.11h-1；在溶氧水平为20％时，Glc N和Glc NAc的生产强度分别达到最高值1.07和1.08g/(L·h)，高于其他3种溶氧水平下Glc N和Glc NAc的最大生产强度；然而在不同溶氧水平下，乙酸的最高浓度在溶氧水平控制在40％最高，为2.03g/L，这说明控制高溶氧水平发酵时菌体将产生更多的乙酸，这不利于重组菌的生长以及外源蛋白的表达，这从高溶氧水平下DCW较低可以看出。
通过在5L发酵罐中对流加葡萄糖的浓度及流加方式的优化以及溶解氧水平的优化进一步提高菌种的生产能力。进行了溶氧水平控制的优化，在此基础上提出了分阶段溶氧水平控制策略，即在发酵的前2h内控制DO水平为20％，2-8h控制DO水平为30％，8-12h控制DO水平为40％，12-18h控制水平DO为30％，在此条件下，氨基葡萄糖的产量和生产强度较不控制溶氧时有了明显提高。
Claims (9)
1.一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，敲除大肠杆菌中氨基葡萄糖合成途径中的4个基因：乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE、甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ、脱乙酰基酶基因nagA和脱氨基酶基因nagB，提高氨基葡萄糖的产量。
2.根据权利要求1所述的积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，作为宿主的大肠杆菌，是大肠杆菌W3110，或者敲除了乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因nagE大肠杆菌W3110、或者敲除了甘露糖磷酸转运子编码基因manXYZ大肠杆菌W3110、或者敲除了脱乙酰基酶基因nagA大肠杆菌W3110，或者敲除了脱氨基酶基因nagB大肠杆菌W3110。
3.根据权利要求1或2所述的积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，将氨基葡萄糖合成途径中的氨基葡萄糖合成酶编码基因GlmS，克隆到表达载体pTargetF，然后转化大肠杆菌。
4.根据权利要求1或2所述的一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，将氨基葡萄糖合成途径中的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，克隆到表达载体pTargetF，然后转化大肠杆菌。
5.根据权利要求3所述的积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌，其特征在于，在pGEM-T-GlmS质粒上对GlmS基因进行定点突变，将64位氨基酸谷氨酸替换为谷氨酰胺。
6.一种构建权力要求1-5任一所述的积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)克隆乙酰氨基葡萄糖转运子编码基因、甘露糖磷酸转运子编码基因、脱乙酰基酶基因、脱氨基酶基因，连接到重组表达载体上；
(2)将上述重组表达载体转化大肠杆菌，得到积累氨基葡萄糖重组大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110、大肠杆菌W3110 ΔnagE、大肠杆菌W3110 ΔnagEΔmanXYZ、大肠杆菌W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagA和大肠杆菌W3110ΔnagEΔmanXYZΔnagAΔnagB。
7.一种应用权利要求1-5任一所述的重组大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌菌株在200rpm转速、37℃培养箱中培养过夜，得到菌株种子液；将种子液接种至装有发酵培养基的摇瓶中，摇瓶以180rpm的转速在30℃的培养箱中培养48h。
8.根据权利要求7所述的应用重组大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述种子液培养基为LB培养基。
9.根据权利要求7所述的应用重组大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方：葡萄糖40g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸铵17g/L、酵母粉4g/L、碳酸钙30g/L、L-苏氨酸0.2g/L、Thiamine 0.1mg/L、MgSO4 1g/L、FeSO4 0.5mg/L、MnSO4 5mg/L和ZnSO4 5mg/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910301799.0A CN109929791A (zh) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | 一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910301799.0A CN109929791A (zh) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | 一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109929791A true CN109929791A (zh) | 2019-06-25 |
Family
ID=66990053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910301799.0A Pending CN109929791A (zh) | 2019-04-15 | 2019-04-15 | 一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109929791A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564660A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-13 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 生产乳清酸的重组微生物及方法 |
| CN114107157A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 中国药科大学 | 一种生产n-乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498517A (zh) * | 2014-11-29 | 2015-04-08 | 滨州市金朗生物科技有限公司 | 一种高产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法 |
| CN108707573A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-10-26 | 天津科技大学 | 一种产生n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
| CN108949661A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-07 | 浙江工业大学 | 一种产o-琥珀酰-l-高丝氨酸重组大肠杆菌及其应用 |
-
2019
- 2019-04-15 CN CN201910301799.0A patent/CN109929791A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104498517A (zh) * | 2014-11-29 | 2015-04-08 | 滨州市金朗生物科技有限公司 | 一种高产n-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法 |
| CN108707573A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-10-26 | 天津科技大学 | 一种产生n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
| CN108949661A (zh) * | 2018-07-27 | 2018-12-07 | 浙江工业大学 | 一种产o-琥珀酰-l-高丝氨酸重组大肠杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RILEY M. ET AL: "NC_007779.1", 《GENBANK》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564660A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-13 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 生产乳清酸的重组微生物及方法 |
| CN110564660B (zh) * | 2019-09-18 | 2023-03-21 | 苏州华赛生物工程技术有限公司 | 生产乳清酸的重组微生物及方法 |
| CN114107157A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 中国药科大学 | 一种生产n-乙酰葡萄糖胺基因工程菌的构建及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104195094A (zh) | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN101381698A (zh) | 加强表达n-乙酰谷氨酸激酶的重组钝齿棒杆菌及该菌的应用 | |
| US10633658B2 (en) | Method for producing N-acetylglucosamine by co-utilizing glucose and xylose based on CRISPRi | |
| CN104004701A (zh) | 一种构建高产5-氨基乙酰丙酸大肠杆菌工程菌株的方法 | |
| CN109486734B (zh) | 一种生产软骨素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN103865869B (zh) | 一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN106434510A (zh) | 一株发酵产l‑天冬氨酸的基因工程菌 | |
| CN109402034A (zh) | 只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用 | |
| US10508279B2 (en) | Recombinant Escherichia coli for high efficiency production of fructosylated chondroitin and method for making thereof | |
| CN109929791A (zh) | 一种积累氨基葡萄糖的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN113073074B (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN110055201B (zh) | 一种高产透明质酸寡糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法 | |
| CN104894043A (zh) | 一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用 | |
| CN106635945A (zh) | 重组菌株及其制备方法和生产l‑苏氨酸的方法 | |
| CN102212499B (zh) | 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用 | |
| CN104357495B (zh) | 一种提高细胞间苯三酚合成产量的方法及应用 | |
| CN102643775A (zh) | 产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法 | |
| CN116555156B (zh) | 一种提高l-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌 | |
| CN116536237B (zh) | 改造的大肠杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用 | |
| CN116536236B (zh) | 一种重组菌及其在生产l-缬氨酸中的应用 | |
| CN114517174B (zh) | 合成三七素的工程菌和应用 | |
| CN106636251B (zh) | 一种利用枯草芽孢杆菌工程菌高产d-核糖的方法 | |
| CN117987444A (zh) | 表达盒、含其的基因工程菌及其在l-赖氨酸生产中的应用 | |
| CN116411009A (zh) | 用于制备l-赖氨酸的表达盒、基因工程菌及其应用 | |
| Zhang et al. | Whole genome sequencing analysis of cellulose-degrading bacterium DC11 and characterization of its key cellulase gene ytoP: Running Head: Characterization of strain DC11 and its key gene ytoP |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190625 |