CN109913495A - 大鼠的遗传修饰 - Google Patents

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Abstract

提供了用于制备包括大鼠胚胎干(ES)细胞的大鼠多能细胞和全能细胞的组合物和方法。提供了用于改善大鼠中遗传修饰的生殖系传递效率或频率的组合物和方法。此类方法和组合物包括了含饲养细胞层以及大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系的体外培养物，其中所述体外培养条件维持所述ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基。还提供了建立此类大鼠ES细胞系的各种方法。还提供了选择遗传修饰的大鼠ES细胞的方法，以及由本文所提供的遗传修饰的大鼠ES细胞产生转基因大鼠的各种方法。另外提供了各种试剂盒和制品。

Description

大鼠的遗传修饰
分案申请说明
本申请是申请日为2014年2月20日(进入中国国家阶段日期为2015年10月14日)、申请号为201480021152.8、发明名称为“大鼠的遗传修饰”的分案申请。
领域
本发明提供非人类多能细胞、全能细胞及胚胎干(embryonic stem，ES)细胞，特别是大鼠多能细胞、全能细胞和/或大鼠ES细胞，以及其制备方法。提供了用于制备大鼠多能细胞、全能细胞及ES细胞的方法。提供了用于靶向大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞的方法。提供了用于在大鼠细胞中实现遗传修饰的生殖系传递的方法。提供了用于衍生化、生长并维持大鼠多能细胞、全能细胞及ES细胞的培养基。
经EFS-WEB以文本文件形式提交的序列表的参考
序列表的正式文本是依照美国信息交换用标准码(American Standard Code forInformation Interchange，ASCII)与说明书一起以文本文件形式经由EFS-Web提交，文件名称是441914seqlist.txt，于2014年2月20日创建并且大小是2Kb。经由EFS-Web提交的序列表是本说明书的一部分并且通过引用整体并入本文中。
背景
大鼠已经成为众多应用，包括但不限于，药物发现方面的应用的有价值的模型。由于难以获得遗传修饰的大鼠，确切地说，难以开发出用于对大鼠进行遗传修饰，并产生可以用于遗传修饰方案(包括但不限于，在大鼠基因组中引起遗传修饰的生殖系传递的方案)中的有用大鼠细胞的方法，故大鼠的有用性略有减少。
本领域中需要可以被遗传修饰成能够通过生殖系传递该遗传修饰的大鼠细胞(例如胚胎干细胞)。本领域中需要改善在大鼠中进行遗传修饰的生殖系传递的频率。
本领域中需要能够产生F0或全供体细胞来源的F0大鼠的来自各种大鼠品系的供体大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞。本领域中还需要能够产生包含生殖系遗传修饰的大鼠的供体大鼠多能细胞、全能细胞和/或ES细胞。
发明概要
提供了用于制备包括大鼠胚胎干(ES)细胞在内的大鼠多能和/或全能细胞的组合物和方法。提供了用于改善大鼠中遗传修饰的生殖系传递效率或频率的组合物和方法。在各种方面，这些方法和组合物包括了含饲养细胞层和大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系的体外培养物，其中体外培养条件允许维持所述大鼠ES细胞的多能性。还提供了建立大鼠ES细胞系的各种方法。还提供了选择遗传修饰的大鼠ES细胞的方法，而且本文中提供了由所述遗传修饰的大鼠ES细胞产生转基因大鼠的各种方法。另外提供了各种试剂盒和制品。
非限制性实施方案如下：
1.一种选自ACI或DA的品系的分离的大鼠ES细胞，其中所述分离的大鼠ES细胞能够通过生殖系传递其基因组。
2.如实施方案1所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞源自于ACI大鼠。
3.如实施方案1或2所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞源自于Dark Agouti(DA)大鼠.2。
4.如实施方案1、2或3所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是整倍体并且能够通过所述生殖系传递靶向遗传修饰。
5.如实施方案4所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞包含至少3％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
6.如实施方案4所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞具有至少60％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
7.如实施方案1-6中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率。
8.如实施方案1-8中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮连续电穿孔之后，将靶向遗传修饰传递到子代中。
9.如实施方案1-8中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞包含一个或多个、两个或更多个，或者三个或更多个靶向遗传修饰。
10.如实施方案4-9中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述靶向遗传修饰包括***、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。
11.如实施方案9所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述靶向遗传修饰包括所述细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一处***。
12.如实施方案11所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述异源多核苷酸包含选择标记物。
13.如实施方案12所述的分离的大鼠ES细胞，其中(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；或(b)所述大鼠ES细胞包含编码所述选择标记物的多核苷酸的至少2个拷贝。
14.如实施方案12所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性。
15.如实施方案1-14中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞当涂铺于包含LIF多肽、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养物中的饲养细胞层上时，形成球状集落。
16.如实施方案1-15中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞当在体外培养时，松散地粘附于所述饲养细胞层。
17.如实施方案1-16中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞不需要旁分泌LIF信号传导来维持多能性。
18.如实施方案1-17中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。
19.如实施方案1-19中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。
20.如实施方案1-19中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞可以在包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基中传代多达至少11次，而不降低其靶向遗传修饰的靶向效率或生殖系传递效率。
21.如实施方案1-20中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。
22.如实施方案1-21中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1或其组合的一种或多种多能标记物。
23.如实施方案1-22中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物。
24.如实施方案1-23中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物。
25.如实施方案1-24中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。
26.如实施方案1-25中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述细胞表达包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合的多能标记物。
27.如实施方案1-26中任一项所述的分离的大鼠ES细胞，其中所述大鼠ES细胞以一个或多个大鼠ESC特异性基因的表达为特征，所述大鼠ESC特异性基因选自以下各物中的一种或多种：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合。
28.一种分离的大鼠ES细胞群，其中至少70％的所述大鼠ES细胞是整倍体并且当在体外涂铺于饲养细胞层上时形成球状集落。
29.如实施方案28所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞是源自于ACI大鼠。
30.如实施方案28所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞是源自于Dark Agouti(DA)大鼠。
31.如实施方案28-30中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞能够通过生殖系传递其基因组。
32.如实施方案28-31中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞具有至少3％的靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
33.如实施方案28-31中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞具有至少60％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
34.如实施方案28-31中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率。
35.如实施方案28-34中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮连续电穿孔之后，将靶向遗传修饰传递到子代中。
36.如实施方案28-35中任一项所述的分离群，其中所述大鼠ES细胞包含一个或多个、两个或更多个，或者三个或更多个靶向遗传修饰，并且可以通过所述生殖系传递所述靶向遗传修饰。
37.如实施方案36所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述靶向遗传修饰是在大鼠Rosa26基因座处。
38.如实施方案36所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述靶向遗传修饰包括***、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。
39.如实施方案36所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述靶向遗传修饰包括所述细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一处***。
40.如实施方案39所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述异源多核苷酸包含选择标记物。
41.如实施方案40所述的分离的大鼠ES细胞群，其中
(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；或
(b)所述大鼠ES细胞包含编码所述选择标记物的多核苷酸的至少2个拷贝。
42.如实施方案40所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性。
43.如实施方案28-42中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述细胞当涂铺于包含LIF多肽、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养物中在饲养细胞层上时，形成球状集落。
44.如实施方案28-43中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述细胞当在体外培养时，松散地粘附于所述饲养细胞层。
45.如实施方案28-44中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述细胞不需要旁分泌LIF信号传导来维持多能性。
46.如实施方案28-44中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。
47.如实施方案28-44中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。
48.如实施方案28-47中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞可以在包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基中传代多达至少11次，而不降低其靶向遗传修饰的靶向效率或生殖系传递效率。
49.如实施方案28-48中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。
50.如实施方案28-49中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1或其组合的一种或多种多能标记物。
51.如实施方案28-50中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物。
52.如实施方案28-51中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物。
53.如实施方案28-52中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。
54.如实施方案28-53中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞表达包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合的多能标记物。
55.如实施方案28-54中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞以一个或多个大鼠ESC特异性基因的表达为特征，所述大鼠ESC特异性基因选自以下各物中的一种或多种：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合。
56.如实施方案28-55中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述群体包含至少104个细胞。
57.如实施方案28-56中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中所述大鼠ES细胞具有一个或多个特征，所述特征包含：
a.至少90％的所述大鼠ES细胞是整倍体；
b.至少70％的所述大鼠ES细胞表达至少一种多能标记物；其中所述至少一种多能标记物包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合；
c.来自所述大鼠ES细胞群的细胞当与大鼠宿主胚胎组合时，将所述大鼠ES细胞系的基因组传递到后代中；
d.所述大鼠ES细胞当在体外培养时，松散地粘附到饲养细胞层；
e.所述大鼠ES细胞当在体外涂铺于饲养细胞层上时形成球状集落；(f)所述大鼠ES细胞当在包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂、LIF的培养基及未被遗传修饰成表达LIF的饲养细胞层中体外培养时维持多能性；
f.所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率；
g.所述大鼠ES细胞在体外维持多能性，而无需旁分泌LIF信号传导；
h.至少70％的所述大鼠ES细胞是整倍体并且当在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落；
i.所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合；
j.所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1的一种或多种分化标记物；
k.所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物；
l.所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物；和/或
m.所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。
58.如实施方案28-57中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群，其中(a)所述大鼠ES细胞源自于大鼠囊胚；(b)所述大鼠ES细胞源自于大鼠桑椹胚期胚胎；和/或(c)所述大鼠ES细胞系源自于超***的大鼠。
59.一种体外培养物，所述体外培养物包含饲养细胞层、大鼠胚胎干(ES)细胞群，以及含白血病抑制因子(LIF)、GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基，其中至少70％的所述大鼠ES细胞是整倍体并且所述大鼠ES细胞形成球状集落。
60.如实施方案59或60所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞松散地粘附于所述饲养细胞层。
61.如实施方案59、60或61所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够通过生殖系传递其基因组。
62.如实施方案59、60或61所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞源自于ACI大鼠。
63.如实施方案59、60或61所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞源自于DarkAgouti(DA)大鼠.2。
64.如实施方案59-63中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够通过所述生殖系传递靶向遗传修饰。
65.如实施方案64所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞包含至少3％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
66.如实施方案64所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞具有至少60％的所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
67.如实施方案59-66中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率。
68.如实施方案59-67中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够在一轮连续电穿孔之后，将靶向遗传修饰传递到子代中。
69.如实施方案59-68中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞包含一个或多个、两个或更多个，或者三个或更多个靶向遗传修饰。
70.如实施方案69所述的体外培养物，其中所述靶向遗传修饰包括***、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。
71.如实施方案69所述的体外培养物，其中所述靶向遗传修饰包括所述细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一处***。
72.如实施方案71所述的体外培养物，其中所述异源多核苷酸包含选择标记物。
73.如实施方案72所述的体外培养物，其中(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；或(b)所述大鼠ES细胞包含编码所述选择标记物的多核苷酸的至少2个拷贝。
74.如实施方案72所述的体外培养物，其中所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性。
75.如实施方案59-74中任一项所述的体外培养物，其中所述细胞不需要旁分泌LIF信号传导来维持多能性。
76.如实施方案59-75中任一项所述的体外培养物，其中所述细胞是雄性(XY)大鼠ES细胞。
77.如实施方案59-75中任一项所述的体外培养物，其中所述细胞是雌性(XX)大鼠ES细胞。
78.如实施方案59-77中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞可以在包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基中传代多达至少11次，而不降低其靶向遗传修饰的靶向效率或生殖系传递效率。
79.如实施方案59-78中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合。
80.如实施方案59-79中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1或其组合的一种或多种多能标记物。
81.如实施方案59-80中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物。
82.如实施方案59-81中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物。
83.如实施方案59-82中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。
84.如实施方案59-83中任一项所述的体外培养物，其中所述细胞表达包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合的多能标记物。
85.如实施方案59-84中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞以一个或多个大鼠ESC特异性基因的表达为特征，所述大鼠ESC特异性基因选自以下各物中的一种或多种：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合。
86.如实施方案59-84中任一项所述的体外培养物，其中LIF的浓度是50U/ml至150U/ml。
87.如实施方案59-85中任一项所述的体外培养物，其中LIF的浓度是100U/ml。
88.如实施方案59-87中任一项所述的体外培养物，其中所述LIF是来自小鼠或包含与SEQ ID NO:1的至少92％序列同一性。
89.如实施方案59-88中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞能够维持多能性，而无需旁分泌LIF信号传导。
90.如实施方案59-89中任一项所述的体外培养物，其中所述饲养细胞层未被遗传修饰成表达LIF。
91.如实施方案59-90中任一项所述的体外培养物，其中所述饲养细胞层包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。
92.如实施方案59-91中任一项所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂包括PD0325901。
93.如实施方案59-92中任一项所述的体外培养物，其中所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
94.如实施方案59-93中任一项所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞群源自于大鼠囊胚期胚胎或大鼠桑椹胚期胚胎。
95.如实施方案94所述的体外培养物，其中所述囊胚期或所述桑椹胚期大鼠胚胎另外包含未分化的无定形大鼠ES细胞团的生长晕。
96.如实施方案94所述的体外培养物，其中所述大鼠ES细胞群包含未分化的无定形大鼠ES细胞团的分离的生长晕。
97.一种用于产生大鼠胚胎干(ES)细胞系的方法，所述方法包括：(a)在体外培养第一饲养细胞层和桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎，其中所述桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎的透明带已经被去除，并且其中培养条件维持大鼠ES细胞的多能性并且包含具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或与SEQ ID NO:1具有至少91％序列同一性并具有LIF活性的序列，以及GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基；及(b)将未分化的无定形大鼠ES细胞团的生长晕转移到包含第二饲养细胞层的体外培养物孔中，并在包含具有所述小鼠LIF或所述小鼠LIF的活性变体的培养基的条件下培养所述生长晕，并由此维持所述大鼠ES细胞的多能性；并由此建立大鼠ES细胞系。
98.如实施方案97所述的方法，其中所述大鼠ES细胞系传代至少5次。
99.如实施方案97或98所述的方法，其中所述大鼠ES细胞系传代至少10次。
100.如实施方案97、98或99所述的方法，其中所述培养基包含约50U/ml至约150U/ml的小鼠LIF。
101.如实施方案97-100中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约100U/ml的小鼠LIF。
102.如实施方案97-101中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞层未被遗传修饰成表达LIF。
103.如实施方案97-102中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞层包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。
104.如实施方案97-103中任一项所述的方法，其中所述MEK抑制剂包括PD0325901。
105.如实施方案97-104中任一项所述的方法，其中所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
106.如实施方案97-105中任一项所述的方法，其中(a)所述大鼠ES细胞系源自于ACI大鼠或源自于Dark Agouti(DA)大鼠；(b)所述大鼠ES细胞系源自于桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎；和/或(c)所述大鼠ES细胞系源自于来自超***大鼠的桑椹胚期或囊胚期胚胎。
107.如实施方案97-106中任一项所述的方法，其中所述培养基另外包含FGF受体抑制剂、ROCK抑制剂或ALK抑制剂中的至少一种。
108.如实施方案107所述的方法，其中所述FGF受体抑制剂包括PD184352，所述ROCK抑制剂包括Y-27632，或所述ALK抑制剂包括A-83-01。
109.如实施方案97-108中任一项所述的方法，其中至少一个大鼠ES细胞具有至少3％的靶向遗传修饰的生殖系传递效率。
110.如实施方案97-109中任一项所述的方法，其中所述靶向遗传修饰的生殖系传递效率是至少60％。
111.一种选择在基因组中稳定并入异源多核苷酸的大鼠胚胎干(ES)细胞的方法，所述方法包括：(a)提供体外大鼠ES细胞群；(b)将异源多核苷酸引入至少一个大鼠ES细胞中，所述异源多核苷酸包含可操作地连接到在所述大鼠ES细胞中具有活性的启动子的选择标记物；及(c)在交替的第一培养基和第二培养基中体外培养所述大鼠ES细胞群，其中所述第一培养基包含有效量的选择剂，保持第一时间段，并且所述第二培养基不包含所述选择剂，其中所述体外培养条件足以维持多能性；由此选出所述在基因组中稳定整合入所述异源多核苷酸的大鼠ES细胞。
112.如实施方案111所述的方法，其中所述第一培养基和所述第二培养基每24小时交替。
113.如实施方案111或112所述的方法，其中所述选择标记物赋予抗生素抗性。
114.如实施方案111-113中任一项所述的方法，其中所述抗生素包含G418。
115.如实施方案111-114所述的方法，其中所述选择标记物包含新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻病菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)及单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)，或其组合。
116.如实施方案111-115中任一项所述的方法，其中(a)所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性；和/或(b)所述选择标记物的多个拷贝被稳定地并入所述大鼠ES细胞的基因组中。
117.如实施方案116所述的方法，其中所述选择标记物是不衰减的选择标记物。
118.一种用于对分离的大鼠胚胎干(ES)细胞进行遗传修饰的方法，所述方法包括将异源多核苷酸引入如实施方案1-58中任一项所述的分离的大鼠ES细胞的基因组中，以形成遗传修饰的大鼠ES细胞。
119.一种产生遗传修饰的大鼠的方法，所述方法包括：
(a)将异源多核苷酸引入如实施方案1-58中任一项所述的分离的大鼠胚胎干(ES)细胞的基因组中，形成具有遗传修饰的大鼠ES细胞；
(b)将至少一个包含所述靶向遗传修饰的大鼠ES细胞引入大鼠宿主胚胎中以产生F0胚胎；
(c)将所述F0胚胎植入***母体中；
(d)使所述F0胚胎在所述***母体中孕育到足月；及(e)鉴别出具有所述靶向遗传修饰的F0大鼠。
120.如实施方案119所述的方法，所述方法另外包括将雄性F0大鼠与野生型雌性大鼠一起繁殖，以产生对于所述靶向遗传修饰是杂合的F1子代。
121.如实施方案120所述的方法，所述方法另外包括将雄性F0大鼠与野生型雌性大鼠一起繁殖，以产生对于所述靶向遗传修饰是杂合的F1子代。
122.如实施方案119所述的方法，所述方法另外包括将所述F1子代的雄性大鼠与所述F1子代的雌性大鼠一起繁殖，以获得对于所述遗传修饰是纯合体的F2子代。
123.如实施方案119-122中任一项所述的方法，其中至少3％的具有所述遗传修饰的所述F0大鼠将所述遗传修饰传递到所述F1子代。
124.如实施方案119-123中任一项所述的方法，其中至少10％的具有所述遗传修饰的所述F0大鼠将所述遗传修饰传递到所述F1子代。
125.如实施方案119-124中任一项所述的方法，其中至少60％的具有所述遗传修饰的所述F0大鼠将所述遗传修饰传递到所述F1子代。
126.如实施方案119-125中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的大鼠ES细胞是来自与所述大鼠宿主胚胎相同的大鼠品系。
127.如实施方案119-127中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰的大鼠ES细胞是来自与所述大鼠宿主胚胎不同的大鼠品系。
128.如前述实施方案中任一项所述的分离的大鼠ES细胞群、如前述实施方案中任一项所述的体外培养物或如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述群体中的大鼠ES细胞包含：
(a)至少90％的所述大鼠ES细胞是整倍体；
(b)至少70％的所述大鼠ES细胞表达至少一种多能标记物；其中所述至少一种多能标记物包括Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合；
(c)来自所述大鼠ES细胞群的细胞当与大鼠宿主胚胎组合时，将所述大鼠ES细胞系的基因组传递到后代中；
(d)所述大鼠ES细胞当在体外培养时，松散地粘附到饲养细胞层；
(e)所述大鼠ES细胞当在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落；
(f)所述大鼠ES细胞当在包含GSK3抑制剂、MEK抑制剂、LIF的培养基及未被遗传修饰成表达LIF的饲养细胞层中体外培养时，维持多能性；
(g)所述大鼠ES细胞展现出至少2％的同源重组靶向效率；
(h)所述大鼠ES细胞在体外维持多能性，而无需旁分泌LIF信号传导；
(i)至少70％的所述大鼠ES细胞是整倍体并且当在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落；
(j)所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2、Utf1或其组合；
(k)所述大鼠ES细胞不表达选自c-Myc、Ecat1、Rexo1的一种或多种分化标记物；
(l)所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury、Bmpr2或其组合的一种或多种中胚层标记物；
(m)所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17、Sox7或其组合的一种或多种内胚层标记物；和/或
(n)所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白、Pax6或其组合的一种或多种神经标记物。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公布的复本将在提出请求并缴纳必要费用之后由专利局提供。
图1描绘了生长为致密的球状集落形式的rESC，这些集落常规地脱离并漂浮于培养皿中。
图2A-D描绘了由rESC表达的各种多能标记物：A描绘Oct-4(绿色)；B描绘Sox-2(红色)；C描绘DAPI(蓝色)；D描绘由rESC表达的多能标记物的覆盖图。
图3描绘rESC表达较低水平的碱性磷酸酶(一种多能标记物)(左图)，并且细胞系DA.2B的核型是42X,Y(右图)。进行核型分析是因为rESC常常变为四倍体；因此，通过对中期染色体分散度进行计数来对细胞系进行预筛选，然后正式对基本上具有正常计数的细胞系进行核型分析。
图4描绘了图1的rESC的近距离视图。
图5描绘了通过囊胚注射并经由生殖系传递rESC基因组来产生嵌合大鼠；使用亲本ACI.G1rESC，通过囊胚注射产生的嵌合大鼠；较高百分比的嵌合大鼠通常具有白化的鼻子。
图6描绘了由图5中标为星号(*)的ACI/SD嵌合大鼠生殖的F1鼠灰色幼崽和白化同窝仔畜。
图7中图A描绘了大鼠Rosa 26基因座靶，与小鼠中相同，该基因座在Setd5与Thumpd3基因之间，具有相同间距。图A显示了小鼠Rosa 26基因座的结构。mRosa26转录物由2或3个外显子组成。图B描绘了rRosa26基因座的结构；该大鼠基因座除含有与小鼠外显子1同源的外显子(Ex1a)外，还含有第二外显子1(Ex1b)；在大鼠中未鉴别出第三个外显子。图C描绘了靶向的rRosa26等位基因；具有5kb的同源臂各自使用来自DArESC的基因组DNA，通过PCR进行克隆；靶向的等位基因含有SA-lacZ-hUB-neo盒，代替rRosa26内含子中的117bp缺失。
图8A描绘了用X-gal处理的14周龄野生型大鼠的对照脑。该对照脑关于LacZ显示出较低水平的背景染色(背视图)。
图8B描绘了在rRosa26杂合型大鼠(14周龄)的脑中的LacZ表达。lacZ报告子在rRosa26杂合体的整个脑中广泛表达。
图8C描绘了用X-gal处理的14周龄野生型大鼠的对照心脏和胸腺(插图)。对照心脏和胸腺关于LacZ显示出较低水平的背景染色。
图8D描绘了14周龄的rRosa26杂合型大鼠的心脏和胸腺(插图)中的LacZ表达。lacZ报告子在rROSA26杂合体的整个心脏和胸腺中广泛表达。
图8E描绘了用X-gal处理的14周龄野生型大鼠的对照肺。对照肺关于LacZ显示出较低水平的背景染色。
图8F描绘了14周龄的rRosa26杂合型大鼠的肺中的LacZ表达。lacZ报告子在rRosa26杂合体的整个肺中广泛表达。
图8G和H描绘了e12.5胚胎中的LacZ表达。相较于显示较低水平背景LacZ染色的野生型对照胚胎(H)，rRosa26杂合胚胎在整个胚胎中展现LacZ报告子的广泛表达。
图8I和J描绘了e14.5胚胎中的LacZ表达。相较于显示较低水平背景LacZ染色的野生型对照胚胎(J)，rRosa26杂合型大鼠胚胎在整个胚胎中展现LacZ报告子的广泛表达。
图9A-B提供了显示ACI.G1大鼠ES细胞系的染色体数量分析的照片。
图10A-B提供了显示DA.2B大鼠ES细胞系的染色体数量分析的照片。
图11A-B提供了显示DA.C2大鼠ES细胞系的染色体数量分析的照片。
发明详述
以下将参照附图更完整地描述本发明的方法和组合物，在附图中，显示了这些方法和组合物的一些但非全部实施方案。实际上，这些方法和组合物可以通过许多不同的形式体现并且不应解释为局限于本文所陈述的实施方案；相反，提供这些实施方案以便使本公开满足适用的法律要求。整个附图中，相同的编号表示相同的元件。
本文所陈述的方法和组合物所属领域的技术人员应能想到这些方法和组合物的许多修改和其它实施方案，这些修改和实施方案具有前述说明和相关附图中所呈现的传授内容的益处。因此，应了解，这些方法和组合物不局限于所公开的具体实施方案并且修改和其它实施方案都包括在所附权利要求书的范围内。尽管本文采用了特定术语，但这些术语只是以一般性并且说明性意义使用，并不用于限制目的。
I.综述
长久以来，大鼠一直是若干生物医学研究领域，如心血管疾病、代谢、毒理学、神经生物学及行为学的优选的啮齿动物模型生物体。已经研究出数百个大鼠品系；有一些是用于复杂人类疾病，如高血压、糖尿病和癌症的优良模型。然而，在了解这些模型的遗传学方面的进展因很难以一种控制性方式修饰大鼠基因组而受到严重阻碍。通过使用位点特异性核酸内切酶，有可能在所关注基因中产生突变，但这一方法仍不太精确并且昂贵。大鼠ES细胞的靶向和生殖系传递仍是一项难以实现的任务。
本文中描述了从两个大鼠自交系分离大鼠ES细胞(rESC)。rESC是源自于DA和ACI品系。这些细胞表达多能标记物并且展现出正常的42X,Y核型。通过在囊胚期的SD宿主胚胎中进行显微注射，已经产生较高百分比的嵌合体，并且已经在两个品系中展示通过生殖系进行的rESC基因组的传递。使用质粒靶向载体，已经在ROSA26基因座的大鼠等效物中产生靶向突变，而且已经在两个品系中实现了靶向等位基因的生殖系传递。这些杂合型动物在所有组织中在所检查的所有阶段都表达lacZ。
在各种方面，为了从ACI供体ES细胞获得有利数量的雄性子代，ES细胞是源自于ACI品系。在一个实施方案中，雄性子代的量是约50％。
在各种方面，为了获得雌性占主导的子代，ES细胞是源自于DA品系。
II.大鼠胚胎干(ES)细胞
本文提供的各种组合物和方法包括来自大鼠的胚胎干(ES)细胞。干细胞是能够无限地自更新并且具有多能性的细胞群。“胚胎干细胞”或“ES细胞”包含从胚胎或胎儿获得的干细胞。本文提供的各种大鼠ES细胞可以具有任何以下特性中的一种或多种：
(a)具有生殖能力，意味着当将大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞系的基因组被传递到后代中；
(b)在至少一次靶向遗传修饰之后，具有生殖能力，意味着当将具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，在大鼠ES细胞系基因组内的靶向遗传修饰被传递到后代中；
(c)在体外具有多能性；
(d)在体外具有全能性；
(e)当在体外培养时，松散地粘附于饲养细胞层；
(f)当在体外涂铺于饲养细胞层上时，当在体外培养时形成球状集落；
(g)当在包含未被遗传修饰成表达白血病抑制因子(LIF)的饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含足够浓度的LIF；
(h)当在包含饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含小鼠LIF或者其活性变体或片段；
(i)包含分子特征，该分子特征的特征在于
i)表达一个或多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
ii)表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
iii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
iv)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
v)一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vi)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
viii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
ix)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；和/或
x)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；
xi)(i)-(x)部分中的大鼠ES细胞特异性基因的表达的任何组合；
xii)如表15中所示的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种所列多能标记物的多能标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的多能性排序一栏；
xiii)如表15中所示的至少2、3或4种所列中胚层标记物的中胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的中胚层排序一栏；
xiv)如表15中所示的至少2、3、4、5或6种所列内胚层标记物的内胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的内胚层排序一栏；
xv)如表15中所示的至少2和3种所列神经标记物的神经标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的神经排序一栏；
xvi)如表15中所示的所列滋养外胚层标记物的滋养外胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的滋养外胚层排序一栏；
xvii)一种或多种(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种)如表15中所陈述的多能标记物、中胚层标记物、内胚层标记物、神经标记物和/或滋养外胚层标记物的任何相对表达水平；
xviii)表15中所陈述的每一标记物的相对表达水平；
xix)xii-xiix中所陈述的特征的任何组合；和/或
xx)i-xiix中所陈述的特征的任何组合；
(j)具有产生F0大鼠的能力；
(k)能够传代培养并维持未分化状态；
(l)具有与正常大鼠细胞相同的染色体数量；
(m)在体外维持多能性，无需旁分泌LIF信号传导；和/或
(n)具有自更新能力，意味着其无限***，同时维持多能性。
(a)-(n)中所略述的一种或多种特征可以存在于本文所提供的分离的大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系中，其中这些大鼠ES细胞未经历靶向遗传修饰。在其它实施方案中，(a)-(n)中所略述的一种或多种特征可以存在于本文所提供的具有一个或多个靶向遗传修饰的分离的大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系中。靶向遗传修饰包括大鼠ES细胞的基因组中的变化，并且包括例如***、缺失、敲除、敲入、突变或其组合。在其它情形中，靶向遗传修饰包括将大鼠ES细胞的基因组中异源多核苷酸的至少一处***。关于此类靶向遗传修饰的进一步说明在本文中别处予以论述。
在具体实施方案中，本文提供的各种大鼠ES细胞和细胞系是具有生殖能力的，意味着当将大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞的基因组被传递到后代中。此类在后代(即，F1群)中的传递可以在大鼠ES细胞未经历靶向遗传修饰时发生。此外，具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞也具有生殖能力，意味着当将具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞的靶向遗传修饰被传递给后代(即，F1群)。因此，在各种方面，采用了本文所描述的大鼠ES细胞和方法获得来自未经历靶向遗传修饰的大鼠ES细胞以及已经历靶向遗传修饰的大鼠ES细胞的大鼠细胞基因组的高频率或高效率生殖系传递。在各种实施方案中，生殖系传递的频率高于1:600、高于1:500、高于1:400、高于1:300、高于1:200，以及高于1:100。在各种实施方案中，生殖系传递的频率超过1％，超过2％，超过3％，超过4％，超过5％，超过6％，超过7％，超过8％，超过9％，超过10％，高达约16％，超过25％，超过50％，超过60％，超过65％，超过70％，超过75％或更高百分比。在各种实施方案中，生殖系传递的频率在9％至16％范围内。在各种方面，F1代中供体rESC来源的子代的百分比是1％或更高，2％或更高，3％或更高，10％或更高，20％或更高，30％或更高，40％或更高，50％或更高，60％或更高，从3％至约10％或更高，从3％或更高至约63％，从约10％至约30％，从约10％至约50％，从约30％至约70％，从约30％至约60％，从约20％至约40％，从约20％至65％，或从约40％至70％。因此，本文所提供的未经历靶向遗传修饰的大鼠ES细胞，或者具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞都能够将其基因组传递到F1群中。
未经历靶向遗传修饰的大鼠ES细胞或具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞可以是多能和/或全能的。“多能的”或“多能性”是指干细胞具有分化成以下三个胚层中任一个的潜力：内胚层、中胚层或外胚层。细胞潜能是描述细胞分化成其它细胞类型的能力的一个通用术语。参见例如，Hans等人(2007)."The Potential of Stem Cells:An Inventory".Humanbiotechnology as Social Challenge.Ashgate Publishing,Ltd.,第28页，通过引用并入本文中。术语“全能性”或“全能的”是单一细胞***并产生生物体中的所有分化细胞的能力。参见例如，Western P(2009).Int.J.Dev.Biol.53(2–3):393–409，通过引用并入本文中。在具体实施方案中，本文所公开的各种ES细胞可以是多能的和/或全能的。
可以使用各种方法确定大鼠ES细胞是否是多能的。举例来说，可以分析ES细胞中各种多能标记物，包括但不限于，Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合的表达。有关分析这些标记物的存在或水平的各种方法，参见例如，Okamoto,K.等人,Cell,60:461-472(1990)；Scholer,H.R.等人,EMBO J.9:2185-2195(1990))；及Nanog(Mitsui,K.等人,Cell,113:631-642(2003)；Chambers,I.等人,Cell,113:643-655(2003)。另参见本文提供的图2和图3。其它多能标记物包括例如，存在包含Nanog、Klf4、Dppa2、Fgf4、Rex1、Eras、Err-β和/或Sall3的至少1、2、3、4或5种多能标记物。其它多能标记物包括例如，不存在包含T/Brachyury、Flk1、Nodal、Bmp4、Bmp2、Gata6、Sox17、Hhex1、Sox7和/或Pax6的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种多能标记物。
在具体实施方案中，这些标记物的表达和/或表达水平可以使用RT-PCR测定。各种试剂盒可用于测定碱性磷酸酶的水平和/或存在，包括例如ALP组织染色试剂盒(Sigma)和Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒I(Funakoshi)等。其它分析法包括原位杂交、免疫组织化学分析、免疫荧光分析。在具体实施方案中，大鼠ES细胞是以至少一种多能标记物的表达，包括例如Oct-4、Sox2、碱性磷酸酶或其组合，优选全部三种所述标记物的表达为特征。
本文所提供的各种大鼠ES细胞(即，未经历靶向遗传修饰的大鼠ES细胞和/或具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞)在维持于体外培养条件中时，能够维持多能性和/或全能性。因此，在一些实施方案中，本文所提供的各种大鼠ES细胞可以进行传代培养，同时仍维持未分化状态。培养大鼠ES细胞的各种方法于本文中别处进一步详细论述。
已经采用本文中别处详细论述的各种分离、纯化及培养物扩增技术，从大鼠胚胎分离出本文所提供的大鼠胚胎干细胞。如本文所使用，术语“细胞”是指个别细胞、细胞系或源自于这些细胞的培养物。“分离的”大鼠ES细胞或大鼠胚胎已经从其天然环境中取出。术语“分离的”可以指不含70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的在天然状态下与一种组分一起发现的成分。如本文所使用，大鼠ES“细胞系”包含由单个大鼠ES细胞发育而成的分离的大鼠细胞的群体，并因此，在指定细胞系内的细胞群除在繁殖期间或在靶向遗传修饰期间发生的突变或核型改变外具有均一的基因组成。举例来说，如别处所指示，所公开的大鼠ES细胞是以高水平的整倍体性为特征。尽管如此，在一些细胞系中，由于细胞系在由单个细胞繁殖时核型改变，使得整倍体性水平低于100％。此外，给定的大鼠ES细胞群可以包含103、104、10x104、10x105、10x106、10x107、10x108、10x109或10x1010个细胞，或更多细胞。一些细胞群具有足够的细胞来允许对希望修饰的细胞进行选择，但其数量未过分多到使得降低细胞系中发生突变或核型改变的可能性。举例来说，一些细胞群具有103至106个细胞。
如本文中别处所论述，提供了用于对大鼠ES细胞系进行靶向遗传修饰的各种方法。当进行这些方法时，大鼠ES细胞系内的至少一个细胞含有靶向遗传修饰。通过各种培养和/或选择技术，产生了具有一个或多个所希望的靶向遗传修饰的大鼠ES细胞系。
在具体实施方案中，大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)是整倍体，并因此其染色体数目是确切的单倍体数目倍增。在另一实施方案中，大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)是二倍体，并因此具有两组同源染色体单倍体。当提到大鼠ES细胞群，或来自给定大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)时，该给定群内至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是整倍体和/或二倍体。在其它情形中，当提到大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)时，该给定群内至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的细胞是整倍体和/或二倍体。
在又其它实施方案中，大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)具有42条染色体。当提到大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)时，该给定群内至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞具有42条染色体。在其它情形中，当提到大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)时，该给定群内至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的细胞具有42条染色体。
在其它实施方案中，本文所提供的大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)当在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落。“球状”形态是指培养物中大鼠ES细胞集落的形状，而非个别ES细胞的形状。大鼠ES细胞集落是球状的。松散地附着于饲养细胞上的集落呈圆形(具有圆形的形态)。自由漂浮的集落呈球状。大鼠ES细胞集落呈球状并且极为致密，这意味着：很难看到细胞间的边界。集落的边缘明亮并且清晰。由于这些细胞很小，故难以区别个别核(因此，这些核占据了细胞的大部分体积)。小鼠ES细胞形成伸长的集落并且较强地附着于饲养细胞。mESC形态可以随品系而变化；例如，B6集落比F1H4集落更圆并且更类似半球形，而且还比rESC长。人ES细胞集落比mESC集落更扁平并且更分散。本发明的大鼠ES集落不是扁平的，而且与人ES细胞集落不相似。
在又其它实施方案中，大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)具有圆形的形态。以下提供了关于圆形的形态量表，其中10分表示完美圆形并且1分表示椭圆形。
圆形的形态量表：
10分＝具有纵轴和垂直轴穿过结构中心并具有相等长度的结构的圆形。
9分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.9999至0.9357。
8分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.9357至0.875。
7分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.875至约0.8125。
6分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.8125至0.750。
5分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.750至0.6875。
4分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.6875至0.625。
3分＝纵轴和垂直轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.625至0.5625。
2分＝纵轴和垂直轴穿过圆形中心的一种结构，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.5625至0.523。
1分＝椭圆形定义为纵轴和垂直轴穿过结构中心，其中一条轴的长度是另一条轴长度的0.523至0.500。
在一个非限制性实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)在该给定群内有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞的圆形形态评分是10分、9分或8分。在其它实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)在给定群内有至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的细胞的圆形形态评分是10分、9分或8分。
在另一非限制性实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)在该给定群内有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞的圆形形态评分是7分、6分、5分、4分或3分。在其它非限制性实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)在给定群内有至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的细胞的圆形形态评分是7分、6分、5分、4分或3分。
在又其它实施方案中，当将大鼠ES细胞(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落。以下提供了关于球形的形态量表，其中10分表示完美球形并且1分表示三维椭圆形结构。
球状结构的形态量表：
10分＝球形是X轴和Y轴及Z轴各自穿过结构中心并具有相等长度的一种结构。
9分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个的长度的0.9999至0.9357。
8分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.9357至0.875。
7分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.875至0.8125。
6分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.8125至0.750。
5分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.750至0.6875。
4分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.6875至0.625。
3分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.625至0.5625。
2分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.5625至0.523。
1分＝X轴和Y轴及Z轴穿过结构中心的一种结构，其中一条轴的长度是其它轴中至少一个或两个的长度的0.523至0.500。
在一个非限制性实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的当将细胞在体外涂铺于饲养细胞层上形成的集落的球状形态是10分、9分或8分。在其它实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)有至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的当将细胞在体外涂铺于饲养细胞层上形成的集落的球状形态是10分、9分或8分。
在另一非限制性实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)有至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的当将细胞在体外涂铺于饲养细胞层上形成的集落的球状形态是7分、6分、5分、4分或3分。在其它实施方案中，大鼠ES细胞群或来自给定大鼠ES细胞系的细胞群(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)有至少约50％至95％、约60％至90％、约60％至95％、约60％至85％、约60％至80％、约70％至80％、约70％至85％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约100％、约80％至约95％、约80％至约90％、约90％至约100％、约90％至约99％、约90％至约98％、约90％至约97％、约90％至约95％的当将细胞在体外涂铺于饲养细胞层上形成的集落的球状形态是7分、6分、5分、4分或3分。
本文所提供的给定大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系可以是雄性(XY)大鼠ES细胞、雄性(XY)大鼠ES细胞群或雄性(XY)大鼠ES细胞系。在其它实施方案中，本文所提供的大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系可以是雌性(XX)大鼠ES细胞、雌性(XX)大鼠ES细胞群或雌性(XX)大鼠ES细胞系。任何此类大鼠ES细胞、大鼠ES细胞群或大鼠ES细胞系都可以包含如以上所描述的整倍体性和/或二倍体性。
本文所提供的各种大鼠ES细胞可以来自任何大鼠品系，包括但不限于，ACI大鼠品系、Dark Agouti(DA)大鼠品系、Wistar大鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系，或Fischer大鼠品系，如Fisher F344或Fisher F6。各种大鼠ES细胞还可以从源自于以上所述的两种或更多种品系的混合的品系获得。在一个实施方案中，大鼠ES细胞是源自于选自DA品系和ACI品系的品系。在一个具体实施方案中，大鼠ES细胞是源自于ACI品系。ACI大鼠品系是以呈黑鼠灰色，并且具有白色腹部和足部以及RT1av1单体型为特征。此类品系可从包括Harlan Laboratories在内的多种来源获得。在其它实施方案中，各种大鼠ES细胞是来自Dark Agouti(DA)大鼠品系，该品系以具有鼠灰色皮毛和RT1av1单体型为特征。此类大鼠可从包括Charles River和Harlan Laboratories在内的多种来源获得。在另一实施方案中，本文所提供的各种大鼠ES细胞是来自于自交大鼠品系。
在具体实施方案中，大鼠ES细胞是来自ACI大鼠，并且包含如本文所描述的ACI.G1大鼠ES细胞。在另一个实施方案中，大鼠ES细胞系是来自DA大鼠，并且包含如本文所描述的DA.2B大鼠ES细胞系或DA.2C大鼠ES细胞系。
本文所提供的给定大鼠ES细胞可以从处于任何大鼠胚胎发育阶段的大鼠胚胎获得。代表性大鼠胚胎发育阶段概述于下表1中。用于得到大鼠ES细胞的大鼠胚胎可以是桑椹胚期胚胎、囊胚期胚胎，或处于桑椹胚期胚胎与囊胚期胚胎之间的发育阶段的大鼠胚胎。因此，在具体实施方案中，所用大鼠胚胎是在第5期和第7期Witschi阶段，或在第5期与第7期Witschi阶段之间。在其它实施方案中，所用大鼠胚胎是处于第5期、第6期或第7期Witschi阶段。
在一个实施方案中，大鼠ES细胞是从大鼠囊胚获得。在其它实施方案中，大鼠ES细胞是从来自超***的大鼠的囊胚获得。在其它实施方案中，大鼠ES细胞是从8细胞期胚胎获得，然后在体外对其进行培养，直到其发育到桑椹胚期、囊胚期、处于第5期与第7期Witschi阶段之间的胚胎，或发育成处于第5期、第6期或第7期Witschi阶段的胚胎。此时，涂铺胚胎。桑椹胚期胚胎包含无内腔的致密的细胞球。囊胚期胚胎具有可见的内腔(囊胚腔)并且含有内细胞团(inner cell mass，ICM)。ICM细胞形成ES细胞。
表1.大鼠胚胎发育阶段
另外提供了各种大鼠ES细胞(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)，这些细胞的特征在于
大鼠ES细胞的特征在于：
i)表达一个或多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
ii)表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
iii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
iv)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
v)一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vi)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
viii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
ix)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；和/或
x)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；
xi)(i)-(x)部分中的大鼠ES细胞特异性基因的表达的任何组合；
xii)如表15中所示的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种所列多能标记物的多能标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的多能性排序一栏；
xiii)如表15中所示的至少2、3或4种所列中胚层标记物的中胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的中胚层排序一栏；
xiv)如表15中所示的至少2、3、4、5或6种所列内胚层标记物的内胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的内胚层排序一栏；
xv)如表15中所示的至少2和3种所列神经标记物的神经标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的神经排序一栏；
xvi)如表15中所示的所列滋养外胚层标记物的滋养外胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的滋养外胚层排序一栏；
xvii)一种或多种(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种)如表15中所陈述的多能标记物、中胚层标记物、内胚层标记物、神经标记物和/或滋养外胚层标记物的任何相对表达水平；
xviii)表15中所陈述的每一标记物的相对表达水平；
xix)xii-xiix中所陈述的特征的任何组合；和/或
xx)i-xiix中所陈述的特征的任何组合。
在一个实施方案中，当移植到前桑椹胚期大鼠胚胎中时，大鼠ES细胞(未经历靶向遗传修饰和/或具有靶向遗传修饰)可以构成F0代中至少90％的细胞，构成F0代中至少95％的细胞，构成F0代中至少96％的细胞，构成F0代中至少97％的细胞，构成F0代中至少98％的细胞，或构成F0代中至少99％的细胞。
III.大鼠胚胎干(ES)细胞的衍生化和繁殖
提供了用于获得本文所公开的大鼠ES细胞的各种方法。在具体实施方案中，这些方法包括(a)提供体外培养物，所述体外培养物包含饲养细胞层和分离的大鼠胚胎干(ES)细胞群；(b)在足以维持该分离的大鼠ES细胞的多能性和/或全能性的条件下进行体外培养。因此，这些方法允许大鼠ES细胞群和/或大鼠ES细胞系繁殖。
在一个实施方案中，提供了一种用于培养大鼠胚胎干细胞系的方法。这些方法包括在体外培养饲养细胞层和大鼠ES细胞系，其中培养条件维持大鼠ES细胞的多能性，并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基。所述各种方法另外包括在体外对大鼠ES细胞系的细胞进行传代和培养，其中每一后续体外培养包括在维持大鼠ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠LIF或者其活性变体或片段的培养基的条件下，在饲养细胞层上培养大鼠ES细胞。
i.培养条件
在各种方法和组合物中采用的培养基将维持大鼠ES细胞。术语“维持(maintaining/maintenance)”是指稳定保持本文所概述的大鼠ES细胞的至少一种或多种特征或表型。此类表型可以包括维持多能性和/或全能性、细胞形态、基因表达谱以及本文所描述的大鼠干细胞的其它功能特征。术语“维持”还可以涵盖干细胞的繁殖，或所培养的干细胞数量的增加。该术语另外涵盖允许干细胞保持多能性，同时干细胞可以或可以不继续***并增加数量的培养条件。
术语“饲养细胞”或“饲养细胞层”是指在体外生长并且将至少一个因子分泌到培养基中以用于支持另一所关注细胞在培养物中生长的细胞的培养物。本文中采用的饲养细胞有助于维持大鼠ES细胞的多能性，并且在具体实施方案中，有助于维持本文所描述的一种或多种其它特征或表型。可以使用各种饲养细胞，包括例如小鼠胚胎成纤维细胞，包括在妊娠期第12天与第16天之间获得的小鼠胚胎成纤维细胞。在具体实施方案中，饲养细胞层包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。
大鼠ES细胞的体外培养物另外包含有效量的白血病抑制剂因子(LIF)或其活性变体或片段。白血病抑制剂因子(LIF)属于IL-6受体家族。LIF结合到由LIF特异性亚基gp190或LIFR以及与IL-6家族的其它成员共有的亚基gp130构成的异源二聚体膜受体。LIF抑制小鼠体内胚胎干细胞的分化并且促进干细胞自更新。人LIF与小鼠LIF共有79％的序列同源性并且展现出跨物种活性。大鼠LIF(rtLIF)是含有202个氨基酸残基的22.1kDa蛋白质，其与鼠类LIF展现出91％的氨基酸序列同一性(Takahama等人，1998)。有六个可能的天冬氨酸连接的糖基化(N-糖基化)位点保留在来自各种物种的LIF多肽中，并且有一个另外的Asn150是大鼠LIF特有的。小鼠LIF的四级结构和其功能进一步详细描述于Aikawa等人(1998)Biosci.Biotechnol.Biochem.62 1318-1325；和Senturk等人(2005)Immunology ofPregnancy,Gil Mor.编辑；美国专利No.5,750,654；及D P Gearing(1987)EMBO Journal1987-12-20中，这些专利文献各自通过引用整体并入本文中。部分小鼠LIF序列在SwissProt网站上以登录号P09056报导。
小鼠LIF的活性是通过其诱导M1骨髓性白血病细胞分化的能力进行评估。比活性是1x 106个单位/毫升(目录号03-0011，来自Stemgent)和1x 107个单位/毫升(目录号03-0011-100，来自Stemgent)，其中50个单位被定义为在1ml培养基中诱导50％M1集落分化所需的小鼠LIF的量。另参见，Williams,R.L.等人(1988)Nature 336:684-687.；Metcalf,D.等人(1988)Leukemia 2:216-221；Niwa,H.等人(2009)Nature 460:118-122；Xu,J.等人(2010)Cell Biol Int.34:791-797；Fukunaga,N.等人(2010)Cell Reprogram.12:369-376；及Metcalf D.(2003)Stem Cells 21:5-14，这些文献各自通过引用整体并入本文中。“LIF的有效量”包含使体外培养物中的大鼠ES细胞保持未分化的多能状态的LIF的浓度。可以用于分析保持多能状态的细胞的各种标记物于本文中别处论述。
用于本文所提供的各种方法和组合物中的LIF多肽可以来自任何生物体，包括来自哺乳动物、啮齿动物、人类、大鼠或小鼠。在一个实施方案中，LIF多肽是来自小鼠。在又其它实施方案中，小鼠LIF多肽包含SwissProt登录号P09056中所陈述的氨基酸序列，该序列是通过引用整体并入本文中并且也陈述于SEQ ID NO:1中。
在其它实施方案中，可以使用如SEQ ID NO:1中或SwissProt登录号P09056中所陈述的小鼠LIF多肽的活性变体或片段。这些活性变体和片段(包括与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体)在本文中别处进一步详细论述。
LIF多肽或者其活性变体或片段可以通过多种方式提供到体外培养物中。在一个实施方案中，将有效量的LIF多肽或者其活性变体或片段添加到培养基中。在其它实施方案中，饲养细胞已经被遗传修饰成过表达LIF多肽或者其活性变体或片段。此类饲养细胞包括由γ照射或丝裂霉素C(mitomycin-C)处理的表达基质相关LIF的DIA-M小鼠成纤维细胞制备的饲养细胞。产生并使用此类遗传修饰的饲养细胞的方法可以见于例如，Buehr等人(2003)Biol Reprod 68:222-229；Rathjen等人(1990)Cell 621105-1115；及Buehr等人(2008)Cell 135:1287-1298，这些文献各自通过引用并入本文中。饲养细胞中表达的异源LIF可以来自与饲养细胞相同的生物体或来自与饲养细胞不同的生物体。此外，饲养细胞中表达的异源LIF可以来自与滋养层所支持的ES细胞相同或不同的生物体。
在又其它实施方案中，本文所公开的各种方法中所采用的饲养细胞未被遗传修饰成表达异源LIF多肽或者其活性变体或片段。因此，在特定实施方案中，这些方法中所采用的有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞单层未被遗传修饰成表达异源LIF多肽。
在其它实施方案中，将LIF多肽或者其活性变体或片段添加到培养基中。当将LIF添加到培养基中时，LIF可以来自任何生物体，包括来自哺乳动物、啮齿动物、人类、大鼠或小鼠。在一个实施方案中，培养基中存在的LIF是来自小鼠。在又其它实施方案中，小鼠LIF多肽包含SEQ ID NO:1中所陈述的氨基酸序列。在其它实施方案中，可以使用如SEQ ID NO:1中所陈述的小鼠LIF多肽的活性变体或片段。这些活性变体和片段(包括与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的活性变体)在本文中别处进一步详细论述。
在具体实施方案中，本文所提供的大鼠ES细胞和大鼠ES细胞系在体外维持多能性，而无需旁分泌LIF信号传导。
在具体实施方案中，培养基中存在的LIF或者其活性变体或片段是维持大鼠ES细胞的任何浓度。培养基中存在的LIF多肽或者其活性变体或片段是约25U/ml至约50U/ml、约50U/ml至约100U/ml、约100U/ml至约125U/ml、约125U/ml至约150U/ml、约150U/ml至约175U/ml、约175U/ml至约200U/ml、约200U/ml至约225U/ml、约225U/ml至约250U/ml、约250U/ml至约300U/ml,至约300U/ml至约325U/ml、约325U/ml至约350U/ml、约350U/ml至约400U/ml、约400U/ml至约425U/ml、约425U/ml至约450U/ml、约450U/ml至约475U/ml、约475U/ml至约500U/ml、约75U/ml至约500U/ml或更高。在其它实施方案中，培养基中存在的LIF多肽或者其活性变体或片段是约25U/ml至约50U/ml、约25U/ml至约100U/ml、约75U/ml至约125U/ml、约50U/ml至约150U/ml、约90U/ml至约125U/ml、约90U/ml至约110U/ml、约80U/ml至约150U/ml、约80U/ml至约125U/ml。在一个具体实施方案中，培养基中存在的LIF多肽或者其活性变体或片段是约100U/ml。
当采用小鼠LIF时，培养基中存在的小鼠LIF多肽或者其活性变体或片段是维持大鼠ES细胞的任何浓度。存在的小鼠LIF多肽或者其活性变体或片段是约25U/ml至约50U/ml、约50U/ml至约100U/ml、约100U/ml至约125U/ml、约125U/ml至约150U/ml、约150U/ml至约175U/ml、约175U/ml至约200U/ml、约200U/ml至约225U/ml、约225U/ml至约250U/ml、约250U/ml至约300U/ml,至约300U/ml至约325U/ml、约325U/ml至约350U/ml、约350U/ml至约400U/ml、约400U/ml至约425U/ml、约425U/ml至约450U/ml、约450U/ml至约475U/ml、约475U/ml至约500U/ml、约75U/ml至约500U/ml或更高。在其它实施方案中，存在的小鼠LIF多肽或者其活性变体或片段是约25U/ml至约50U/ml、约25U/ml至约100U/ml、约75U/ml至约125U/ml、约50U/ml至约150U/ml、约90U/ml至约125U/ml、约90U/ml到约110U/ml、约80U/ml到约150U/ml、约80U/ml到约125U/ml。在一个具体实施方案中，培养基中存在的小鼠LIF多肽或者其活性变体或片段是约100U/ml。
采用的培养基维持大鼠ES细胞。因此，在具体实施方案中，各种方法和组合物中采用的培养基将使细胞系中的所有或大部分(即，超过50％)的大鼠ES细胞的多能性维持至少5、10或15代时间。在一个实施方案中，培养基包含一种或多种有助于维持多能性的化合物。在一个实施方案中，培养基包含MEK路径抑制剂和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂。培养基可以另外包含有助于维持ES细胞的另外的组分，包括例如FGF受体抑制剂、ROCK抑制剂和/或ALK(TGFb受体)抑制剂。FGF受体抑制剂的非限制性实例包括PD184352。ROCK抑制剂的非限制性实例包括Y-27632，并且ALK(TGFb受体)抑制剂的非限制性实例包括A-83-01。在具体实施方案中，当解冻低温保存的rESC时，或在用胰蛋白酶解离之后再涂铺rESC时，2i培养基(表2)是在10uM ROCKi存在下使用。
在其它实施方案中，培养基包含由MEK路径抑制剂和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)抑制剂组成的抑制剂组合。
在一个非限制性实施方案中，培养基包含包括CHIR99021的GSK-3抑制剂和/或包含包括PD0325901的MEK抑制剂。在其它实施方案中，培养基包含由CHIR99021和PD0325901组成的抑制剂组合。这些化合物中任一种都可以例如从Stemgent获得。在具体实施方案中，培养基中存在的CHIR99021的浓度是约0.5μ到约3μM、约0.5μ到约3.5μM、约0.5μM到约4μM、约0.5μM到约1μM、约1μM到约1.5μM、约1.5μM到约2μM、约2μM到约2.5μM、约2.5到约3μM、3μM到约3.5μM。在其它实施方案中，培养基中存在的CHIR99021的浓度是约3μM。在其它实施方案中，培养基中存在的PD0325901的浓度是约0.4μM到约1uM、约0.4μM到约1.5uM、约0.4μM到约2μM、约0.4μM到约0.8μM、0.8μM到约1.2μM、约1.2到约1.5μM。在其它实施方案中，培养基中存在的PD0325901的浓度是约1μM。在具体实施方案中，培养基中存在的CHIR99021的浓度是约3μM并且存在的PD0325901的浓度是约1μM。
在一个非限制性实施方案中，本文所公开的各种方法和组合物中采用的培养基陈述于表2中。在本申请的上下文内，表2中所描述的培养基称为2i培养基。
表2：非限制性大鼠ES培养基
试剂 浓度
DMEM/F12基础培养基 1x(50％)
Neurobasal培养基 1x(50％)
青霉素/链霉素 1％
L-谷氨酰胺 4mM
2-巯基乙醇 0.1mM
N2补充物 1x
B27补充物 1x
LIF 100U/ml
PD0325901(MEK抑制剂). 1μM
CHIR99021(GSK抑制剂). 3μM
可以采用的另外的培养基包括以下专利文献中公开的培养基：Li等人(2008)Cell135:1299-1310；Yamamoto等人(2012)Transgenic Rats 21:743-755；Ueda等人(2008)PLoSONE 3(6):e2800；Meek等人(2010)PLoS ONE 4(12):e14225；Tong等人(2010)Nature 467:211-213；美国专利公布2012/0142092；Buehr等人(2008)Cell 135:1287-1298；Li等人(135)Cell 1299-1310，这些专利文献各自通过引用整体并入本文中。当采用此类培养基时，LIF的浓度和来源可以如本文所概述的进行修改。在具体实施方案中，各种培养基是与小鼠LIF或者其活性变体或片段组合使用，并且在甚至其它实施方案中，各种培养基包含浓度是约50U/ml到约100U/ml、约50U/ml到约150U/ml或约100U/ml的小鼠LIF或者其活性变体或片段。
对于产生ES细胞系以及对于培养并维持ES细胞系，大鼠ES细胞的培养温度典型地是在约35℃到约37.5℃下进行。在具体实施方案中，该温度是37.0℃。培养典型地是在7.5％的CO2下进行。
ii.建立大鼠ES细胞系
提供了用于产生大鼠胚胎干(ES)细胞系的方法。这些方法包括(a)在体外培养第一饲养细胞层和桑椹胚期胚胎、囊胚期胚胎或处于桑椹胚期胚胎与囊胚期胚胎之间的发育阶段的大鼠胚胎，其中大鼠胚胎的透明带已经被去除，并且其中培养条件维持大鼠ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基；及(b)将未分化的无定形大鼠ES细胞团的生长晕转移到包含第二饲养细胞层的体外培养孔中，并在维持大鼠ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠LIF或者其活性变体或片段的培养基的条件下培养该生长晕，由此建立大鼠ES细胞系。所述各种方法另外包括在体外对大鼠ES细胞系的细胞进行传代和培养，其中每一后续体外培养包括在维持大鼠ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠LIF或者其活性变体或片段的培养基的条件下，在饲养细胞层上培养大鼠ES细胞。还提供了由此类方法产生的大鼠ES细胞系。
建立具有本文所论述的各种特征的大鼠ES细胞系的方法的非限制性实例陈述于实施例3中。简单地说，从雌性大鼠的子宫冲洗出大鼠胚胎(即，桑椹胚期胚胎、囊胚期胚胎或处于桑椹胚期胚胎与囊胚期胚胎之间的发育阶段的大鼠胚胎)。在具体实施方案中，获得了囊胚或8细胞胚胎。去除透明带并且在饲养细胞(如本文中别处所论述)上培养大鼠胚胎，在具体实施方案中，包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。在维持ES大鼠细胞并由此足以维持ES细胞的多能性和/或全能性的条件下，体外培养桑椹胚期胚胎、囊胚期胚胎或处于桑椹胚期胚胎与囊胚期胚胎之间的发育阶段的大鼠胚胎的细胞。在这一阶段，可以采用各种培养基，包括以上论述的在培养基中具有LIF(包括小鼠LIF或者其活性变体或片段)的各种培养基中的任一种。
监测培养物中生长晕(未分化的无定形细胞团)的存在。一旦生长晕达到适当大小，就将给定生长晕转移到新的饲养板上并进行培养。通过使用胰蛋白酶进行酶促解离来实现转移，以便产生多个集落。这一转移常称为“第1代”。每一细胞系扩增的速度是不同的。必要时，更换培养基以便维持大鼠ES细胞的多能性或全能性。监测培养物中具有胚胎干细胞形态的集落的存在。此类形态包括以下一种或多种特征：(a)呈圆形，圆形的***升高超过饲养细胞单层；(b)细胞紧密压在一起使得难以看到细胞边界；(c)较小的细胞大小；(d)少量细胞质和变大的核；(e)当在体外涂铺于饲养细胞上时形成球状集落。一旦出现此类集落，就可以继续培养，直到达到约50％汇合。然后，将集落转移到新的饲养板上。通过使用胰蛋白酶进行酶促解离来实现转移，以便扩增集落的数量。这称为“第2代”。细胞继续在饲养细胞存在下培养，直到其达到约50％汇合，此时，细胞可以经历进一步传代以维持细胞系，或细胞系可以冷冻。另参见，Tong等人(2010)Nature 467(9):211-215；Li等人(2008)Cell135:1299-1310；及Buehr等人(2008)Cell 135:1287-1298，这些文献各自通过引用并入本文中。因此，在具体实施方案中，本文所公开的各种大鼠ES细胞、细胞系和细胞群能够传代培养并维持未分化状态。
在一个非限制性实施方案中，大鼠ES细胞的衍生化如下。第0天，对雌性小鼠实施安乐死，并且切下输卵管和子宫角，并放入含有加温的N2B27培养基的组织培养皿中。使培养基冲洗通过子宫角和输卵管以将囊胚逐入培养基中。收集囊胚并将其转移到含有KSOM+2i(1μM PD0325901，3μM CHIR99021)的胚胎培养皿中。KSOM可以购自Millipore，目录号是MR-106-D。本文提到的2i培养基包含表2中所陈述的培养基。细胞在37℃和7.5％的CO2下培养过夜。
在其它非限制性实施方案中，大鼠ES细胞是源自于8细胞胚胎或冷冻的8细胞胚胎。在室温下，细胞于M2培养基中培养10分钟，然后转移到KSOM+2i中并培养过夜。
有关大鼠ES细胞衍生化的非限制性实例如下：第1天，将空化的胚胎转移到2i培养基(表2)中并培养过夜。未空化的胚胎在KSOM+2i中继续培养。第2天，将所有剩余的胚胎转移到2i培养基中，不管这些胚胎是否已经空化。在2i培养基中继续培养过夜。第3天，在酸性台氏溶液(acid tyrode)存在下孵育胚胎以去除透明带，并在2i培养基中洗涤3次以去除酸性台氏溶液。将每个胚胎保藏在饲养板的独立孔中，其中每个孔含有有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。细胞在2i培养基中培养过夜。第4天和第5天，监测细胞涂铺的胚胎中生长晕(即，未分化的无定形细胞团)的存在。当生长晕达到涂铺胚胎的约两倍大小时，准备进行转移。每一天，去除用过的培养基并用新鲜的2i培养基更换。将生长晕转移到新的饲养孔中，并且再次去除用过的培养基，并用PBS洗涤各孔。去除PBS并添加胰蛋白酶，并且孵育约10分钟。通过添加30μl的2i培养基和10％FBS来停止胰蛋白酶反应。轻柔地解离细胞并将整个内含物转移到饲养板的孔中。这称为第1代(P1)。细胞在2i培养基中培养过夜。第5-8天，取决于每个细胞系扩增的速度，每天更换2i培养基并监测培养物中具有ESC形态的集落的存在。此类ESC形态于本文中别处详细论述。继续培养，直到集落扩增到约50％汇合。然后，用胰蛋白酶处理集落并如先前所描述在饲养孔中进行传代。这称为第2代。继续培养并监测每个细胞系，直到其达到约50％汇合。照常用胰蛋白酶处理细胞。用2i培养基+10％FBS停止胰蛋白酶。通过离心使细胞沉淀，并将细胞放入400μl的冷冻培养基(70％2i、20％FBS、10％DMSO)中。然后，可以对细胞进行冷冻。这称为第3代。
iii.维持大鼠ES细胞系并进行传代
另外提供了用于维持或培养大鼠胚胎干细胞系的方法。该方法包括在体外培养饲养细胞层和大鼠ES细胞系，其中培养条件维持大鼠胚胎干(ES)细胞的多能性，并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基。此类方法采用了如以上概述的培养基和饲养细胞层。在一个实施方案中，大鼠ES细胞系可以传代至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50次或更多次。在具体实施方案中，大鼠ES细胞可以在包含GSK3抑制剂和MEK抑制剂的培养基中传代多达至少11次，而不会降低其靶向遗传修饰的靶向效率或生殖系传递效率。
培养并监测大鼠ES细胞系。在具体实施方案中，当培养物达到约30％、40％、50％或60％汇合时，发生传代。在其它实施方案中，当培养物达到50％汇合时，发生传代。取决于每个细胞系扩增的速度，可以每24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、95或100小时发生传代。在其它实施方案中，传代之间的时间范围在24小时与96小时之间、在约30小时与50小时之间、在约25小时与75小时之间、在约50小时与96小时之间、在约25小时与75小时之间、在约35小时与85小时，或在约40小时与70小时之间。在一个实施方案中，如本文所公开的大鼠ES细胞、细胞系或细胞群具有在约24小时到约36小时范围内的倍增时间。在一个实施方案中，大鼠ES细胞的倍增时间是25小时。
各种大鼠ES细胞系当如本文所概述进行衍生化和维持时，可以具有以下任何特性中的一种或多种：
(a)具有生殖能力，意味着当将大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞系的基因组被传递到后代中；
(b)在靶向遗传修饰之后具有生殖能力，意味着当将大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞系基因组内的靶向遗传修饰被传递到后代中；
(c)在体外具有多能性；
(d)在体外具有全能性；
(e)当在体外培养时，松散地粘附于饲养细胞层；
(f)当在体外涂铺于饲养细胞层上时，当在体外培养时形成球状集落；
(g)当在包含未被遗传修饰成表达白血病抑制因子(LIF)的饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含足够浓度的LIF；
(h)当在包含饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含小鼠LIF或者其活性变体或片段；
(i)包含分子特征，该分子特征的特征在于
i)表达一个或多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
ii)表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
iii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
iv)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
v)一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vi)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
viii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
ix)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；和/或
x)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；
xi)(i)-(x)部分中的大鼠ES细胞特异性基因的表达的任何组合；
xii)如表15中所示的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种所列多能标记物的多能标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的多能性排序一栏；
xiii)如表15中所示的至少2、3或4种所列中胚层标记物的中胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的中胚层排序一栏；
xiv)如表15中所示的至少2、3、4、5或6种所列内胚层标记物的内胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的内胚层排序一栏；
xv)如表15中所示的至少2和3种所列神经标记物的神经标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的神经排序一栏；
xvi)如表15中所示的所列滋养外胚层标记物的滋养外胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的滋养外胚层排序一栏；
xvii)一种或多种(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种)如表15中所陈述的多能标记物、中胚层标记物、内胚层标记物、神经标记物和/或滋养外胚层标记物的任何相对表达水平；
xviii)表15中所陈述的每一标记物的相对表达水平；
xix)xii-xiix中所陈述的特征的任何组合；和/或
xx)i-xiix中所陈述的特征的任何组合；
(j)具有产生F0大鼠的能力；
(k)能够传代培养并维持未分化状态；
(l)具有与正常大鼠细胞相同的染色体数量；和/或
(m)在体外维持多能性，无需旁分泌LIF信号传导。
(n)具有自更新能力，意味着其无限***，同时维持多能性。
给定大鼠ES细胞系的这些特性可以存在于任一代，包括第5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50代或更多代。
因此，在一个非限制性实施方案中，提供了包含饲养细胞层以及大鼠ES细胞群的体外培养物，其中体外培养条件维持大鼠ES细胞的多能性并且包含了具有小鼠白血病抑制因子(LIF)或者其活性变体或片段的培养基。在具体实施方案中，在此类条件下培养的大鼠ES细胞使至少50％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少60％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少70％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少75％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少80％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少85％的细胞群维持多能性达至少10代时间，使至少90％的细胞群维持多能性达至少10代时间，或使至少95％的细胞群维持多能性达至少10代时间。
本文另外提供了包含本文所公开的各种大鼠ES细胞、细胞群和细胞系的体外培养物，以及用于这些各种ES细胞的培养试剂盒。举例来说，如以上所论述，在具体实施方案中，本文所提供的各种大鼠ES细胞具有以下一种或多种特征：(1)当在体外培养时，松散地粘附于饲养细胞层；(2)当在体外涂铺于饲养细胞层上时，在体外培养时，其形成球状集落；(3)当在包含未被遗传修饰成表达白血病抑制剂因子(LIF)的饲养细胞层的条件下体外培养时，其维持多能性，其中培养基包含足够浓度的LIF；和/或(4)其能够传代培养并维持未分化状态。此外，这些体外培养物中任一种的大鼠ES细胞群可以包含例如这样一种细胞群，其中该群内至少70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞是整倍体、二倍体和/或具有42条染色体。
一种在体外培养大鼠胚胎干细胞的方法包括(a)提供体外培养物，该体外培养物包含饲养细胞层和分离的大鼠胚胎干(ES)细胞群；及(b)在足以维持分离的大鼠胚胎干(ES)细胞的多能性或全能性的条件下，培养该体外培养物，并且其中大鼠ES细胞形成了松散地粘附于饲养细胞层的集落。“松散粘附”或“松散地粘附”意思指，如果培养皿静置一段时间(最少8小时)，那么一些集落会粘附于滋养层，这样使得在轻柔地移动培养皿时，这些集落可以维持粘附。在较小的孔中(在较少移动培养基的情况下)，松散粘附会更快发生。在任一情形中，都可以通过a)涡旋培养皿中的培养基或通过轻柔地横过滋养层表面抽吸培养基来移出这些集落。这些松散粘附的集落的形态仍是球形的。在此类情形中，大鼠ES细胞当在体外涂铺于饲养细胞层上时，形成球状集落。此类球状集落例如显示于图1中。
iv.试剂盒和体外培养物
本文所提供的大鼠ES细胞和大鼠ES细胞系可以包含在试剂盒或制品内。在具体实施方案中，试剂盒或制品包括本文所公开的任何大鼠ES细胞系或细胞群。该试剂盒可以另外包括维持大鼠ES细胞的任何培养基，包括维持大鼠ES细胞的多能性的培养基。此类培养基可以包含具有小鼠LIF或者其活性变体或片段的培养基，如本文中别处更详细地论述。试剂盒内的培养基可以另外包含MEK抑制剂和GSK-3抑制剂，或者，试剂盒内的培养基可以另外包含由MEK抑制剂与GSK-3抑制剂组成的抑制剂组合。在具体实施方案中，试剂盒中的培养基包含包括PD0325901的MEK抑制剂和/或包括CHIR99021的GSK-3抑制剂。本文所论述的各种培养基中的任一种都可以包含在试剂盒内。
另外提供了一种包括本文所公开的任何大鼠ES细胞系或细胞群、本文所公开的各种培养基中的任一种以及饲养细胞群的试剂盒或制品。在一个实施方案中，试剂盒或制品中的饲养细胞未被遗传修饰成表达LIF和/或饲养细胞包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。本文所公开的其它饲养细胞中的任一种都可以用于试剂盒或制品中。
IV.大鼠胚胎干(ES)细胞的遗传修饰
本文所公开的各种大鼠ES细胞和细胞系可以被修饰成含有至少一个靶向遗传修饰。因此，提供了对本文所公开的分离的大鼠胚胎干(ES)细胞进行遗传修饰的各种方法。该方法包括将靶向遗传修饰引入本文所公开的分离的大鼠ES细胞的基因组中，以形成遗传修饰的大鼠ES细胞。靶向遗传修饰可以包含对大鼠ES的基因组的任何修饰，包括例如***、缺失、敲除、敲入、突变或其组合。在一个实施方案中，靶向遗传修饰包括将异源多核苷酸***大鼠ES细胞的基因组中。如本文所使用，关于序列的“异源”是序列源自于外来物种，或者如果源自于相同物种，则其组成和/或基因组的基因座因有意识的人为干预而相对于其天然形式基本上被修饰。
在一个方面，提供了一种分离的大鼠ES细胞或大鼠ES细胞系，其能够在体外经历一种或多种遗传修饰后保持多能性，并且能够将遗传修饰的基因组传递到F1代的生殖系中。因此，大鼠ES细胞在体外经历一种或多种连续遗传修饰(例如两种、三种、四种、五种或六种，或者更多种连续遗传修饰)之后维持其多能性以发育成多种细胞类型。在其它实施方案中，在给定大鼠ES细胞中进行多种靶向遗传修饰，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 14、15或更多种靶向遗传修饰。因此，也可以将多种异源多核苷酸整合到基因组中，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 14、15或更多种。
在一个实施方案中，在经历1到15种连续遗传修饰中任一种之后，遗传修饰的大鼠ES细胞在暴露于分化培养基时能够分化成多种细胞类型。在一个实施方案中，在经历1到15种连续遗传修饰中任一种之后，遗传修饰的大鼠ES细胞能够维持在培养物中维持未分化状态。在一个实施方案中，处于未分化状态的遗传修饰并且培养的大鼠ES细胞当用作大鼠宿主胚胎中的供体细胞时，使该胚胎增殖并形成了包含一到十五种遗传修饰的囊胚。在一个实施方案中，囊胚当在适于妊娠的条件下植入***母体中时，发育成包含1到15种遗传修饰的F0大鼠子代。
用于在大鼠ES细胞的基因组内产生靶向遗传修饰的各种方法都可以使用。举例来说，在一种情形中，靶向遗传修饰采用了一种经由同源重组事件产生靶向遗传修饰的***。在其它情形中，可以使用在靶向基因组位置处产生单链或双链断裂的核酸酶试剂对大鼠ES细胞进行修饰。然后，通过非同源末端连接路径(non-homologous end joining pathway，NHEJ)修复该单链或双链断裂。此类***可用于例如产生功能遗传修饰的靶向丧失。参见例如，Tesson等人(2011)Nature Biotechnology 29:695-696，通过引用并入本文中。此类试剂包括类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNuclease，(TALEN)(WO 2010/079430；Morbitzer等人(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1:428-432；Christian等人,Genetics(2010)186:757-761；Li等人(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；及Miller等人(2011)Nature Biotechnology 29:143–148；美国专利申请No.2011/0239315A1、2011/0269234 A1、2011/0145940 A1、2003/0232410 A1、2005/0208489 A1、2005/0026157 A1、2005/0064474 A1、2006/0188987 A1及2006/0063231 A1(各自通过引用并入本文中)；锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)(US20060246567；US20080182332；US20020081614；US20030021776；WO/2002/057308A2；US20130123484；US20100291048；及WO/2011/017293A2，各自通过引用并入本文中)；大范围核酸酶(参见Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res 31:2952-62；Chevalier等人,(2002)Mol Cell 10:895-905；Gimble等人,(2003)Mol Biol 334:993-1008；Seligman等人,(2002)Nucleic Acids Res 30:3870-9；Sussman等人,(2004)J Mol Biol 342:31-41；Rosen等人,(2006)Nucleic Acids Res34:4791-800；Chames等人,(2005)Nucleic Acids Res 33:e178；Smith等人,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149；Gruen等人,(2002)Nucleic Acids Res 30:e29；Chen和Zhao,(2005)Nucleic Acids Res 33:e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；及WO2004031346)；以及CAS/CRISPER***(Mali P等人(2013)Science,2013年2月15日；339(6121):823-6；Jinek M等人,Science,2012年8月17日；337(6096):816-21；Hwang WY等人,Nat Biotechnol,2013年3月；31(3):227-9；Jiang W等人,Nat Biotechnol,2013年3月；31(3):233-9；及Cong L等人,Science,2013年2月15日；339(6121):819-23，各自通过引用并入本文中)。
在其它实施方案中，靶向基因组修饰可以通过采用同源重组靶向载体进行。在这些情形中，靶向载体包含***多核苷酸，并且另外包含侧接该***多核苷酸的上游和下游同源臂。侧接***多核苷酸的同源臂对应于靶向基因组基因座内的基因组区。为便于提及，在靶向基因组基因座内的对应基因组区在本文中称为“靶位点”。因此，在一个实施例中，靶向载体可以包含侧接对应于位于靶向基因组基因座处的第一靶位点和第二靶位点的第一同源臂和第二同源臂的第一***多核苷酸。因此，靶向载体有助于通过同源臂与细胞基因组内的对应靶位点之间发生的同源重组事件将***多核苷酸整合到靶向基因组基因座中。
如本文所使用，当同源臂和靶位点彼此共有足够水平的序列同一性以充当同源重组反应的底物时，这两个区域彼此“对应”。“同源性”意思指DNA序列与对应序列同一或共有序列同一性。给定靶位点与靶向载体上所见的对应同源臂之间的序列同一性可以是允许发生同源重组的任何程度的序列同一性。举例来说，靶向载体的同源臂(或其片段)与靶位点(或其片段)共有的序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性，由此使这些序列经历同源重组。此外，同源臂与对应靶位点之间的对应同源区域可以是足以促进在裂解的识别位点处的同源重组的任何长度。
在具体实施方案中，分离的大鼠ES细胞、细胞系或细胞群展现出至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％的同源重组效率。在一个实施方案中，采用大鼠ES细胞的同源重组效率高于4％。
在具体实施方案中，当在大鼠ES细胞中产生靶向遗传修饰时，采用选择标记物。编码选择标记物的多核苷酸可以存在于靶向载体上，该靶向载体被设计成将靶向遗传修饰引入基因组中，或者该多核苷酸可以见于单独的质粒或载体上。编码选择标记物的多核苷酸可以包含在表达盒内。此类表达盒的各种组分于本文中别处进一步详细论述。
各种选择标记物都可以用于本文所公开的方法和组合物中。此类选择标记物可以例如赋予对于抗生素如G418、潮霉素(hygromycin)、杀稻病菌素(blastocidin)、嘌呤霉素(puromycin)或新霉素(neomycin)的抗性。此类选择标记物包括新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素N-乙酰基转移酶及杀稻病菌素S脱氨酶(bsrr)。在又其它实施方案中，选择标记物可操作地连接到可诱导启动子并且该选择标记物的表达对细胞有毒。此类选择标记物的非限制性实例包括黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)。参见例如，Santerre等人(1984)Gene 30:147-56；Joyner(1999)The Practical Approach Series,293；Santerre等人(1984)Gene 30:147-56；Bernard等人(1985)Exp Cell Res 158:237-43；Giordano和McAllister(1990)Gene,88:285-8；Izumi等人(1991)Exp Cell Res 197:229-33)，各自通过引用整体并入本文中。在具体实施方案中，neoR选择性标记物是新霉素磷酸转移酶(neo)基因，参见Beck等人(1982)Gene,19:327-36，通过引用并入本文中。neoR选择标记物是美国专利No.7,205,148或6,596,541中使用的选择标记物，各专利通过引用并入本文中。
在具体实施方案中，所用选择标记物是不衰减的选择标记物。“不衰减的选择标记物”包含了保持天然多肽的活性的选择标记物，或该选择标记物当与多肽的天然形式相比较时具有增加的活性。选择标记物的活性增加可以包含活性的任何统计学上显著的增加，包括例如增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更高百分比。因此，不衰减的选择标记物当在宿主细胞中表达时将使更高百分比的宿主细胞能够在浓度比采用衰减的选择标记物时高的选择剂存在下存活。不衰减的选择标记物包括例如新霉素不衰减选择标记物。参见例如，Beck等人(1982)Gene,19:327-36，或美国专利No.7,205,148或6,596,541，各自通过引用并入本文中。
在其它情形中，当与衰减的选择标记物和/或野生型(天然)选择标记物相比较时，选择标记物活性的增加可以通过增加大鼠ES细胞的基因组内不衰减的选择标记物、衰减的选择标记物或天然选择标记物拷贝数引起。因此，给定大鼠ES细胞可以在其基因组内包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个给定选择标记物(即，不衰减的选择标记物、衰减的选择标记物或天然(野生型)选择标记物)拷贝。
所用各种选择标记物是由可操作地连接到在大鼠ES细胞中具有活性的启动子的多核苷酸编码。在具体实施方案中，选择标记物的活性增加可以由选择标记物的表达增加引起。因此，可以采用启动子来提高给定选择标记物的表达水平。所关注的启动子包括但不限于，CMV启动子、PGK启动子和CAG启动子。在一个实施方案中，使用了人泛素(hUb)启动子来表达选择标记物。参见Valenzuela等人(2003)Nature Biotechnology 21:652-659，通过引用整体并入本文中。
在一个实施方案中，在用外源核酸进行单一轮电穿孔之后，大鼠ES细胞维持其多能性以发育成多种细胞类型。在另一个实施方案中，大鼠ES细胞在用外源核酸进行第二轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第三轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第四轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第五轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第六轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第七轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第八轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第九轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第十轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第十一轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第十二轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第十三轮电穿孔之后，在用外源核酸进行第十四轮电穿孔之后和/或在用外源核酸进行第十五轮电穿孔之后，维持其多能性以发育成多种细胞类型。在其它实施方案中，大鼠ES细胞在一轮连续电穿孔(即，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多轮电穿孔)之后能够将靶向遗传修饰传递到子代中。
i.将序列引入大鼠胚胎干细胞中
本文所提供的方法包括将一个或多个多核苷酸或多肽构建体引入细胞中，所述构建体包含了产生靶向基因组修饰所需的各种组分。“引入”意思指以使得序列接近细胞内部的方式将序列(多肽或多核苷酸)呈递到细胞。本文所提供的方法与将靶向基因组整合***的任何组分引入细胞中的具体方法无关，只与多核苷酸接近至少一个细胞的内部的方法有关。用于将多核苷酸引入各种细胞类型中的方法是本领域中已知的并且包括但不限于，稳定转染法、瞬时转染法及病毒介导的方法。此类方法包括但不限于，电穿孔、细胞质内注射、病毒感染(包括腺病毒、慢病毒及逆转录病毒载体)、转染、脂质介导的转染和/或NucleofactionTM。参见例如，Stadtfeld等人(2009)Nature Methods 6(5):329-330；Yusa等人(2009)Nat.Methods 6:363-369；Woltjen等人(2009)Nature 458,766-770。此类方法包括但不限于，直接递送DNA，如通过离体转染(Wilson等人,Science,244:1344-1346,1989；Nabel和Baltimore,Nature 326:711-713,1987)，任选地存在Fugene6(Roche)或Lipofectamine(Invitrogen)；通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466及5,580,859，各自通过引用并入本文中)，包括显微注射(Harland和Weintraub,J.Cell Biol.,101:1094-1099,1985；美国专利No.5,789,215，通过引用并入本文中)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，通过引用并入本文中；Tur-Kaspa等人,Mol.Cell Biol.,6:716-718,1986；Potter等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,81:7161-7165,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,Virology,52:456-467,1973；Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987；Rippe等人,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖随后聚乙二醇(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985)；通过直接声波装载(Fechheimer等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,84:8463-8467,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982；Fraley等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979；Nicolau等人,Methods Enzymol.,149:157-176,1987；Wong等人,Gene,10:87-94,1980；Kaneda等人,Science,243:375-378,1989；Kato等人,Biol.Chem.,266:3361-3364,1991)及受体介导的转染(Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892,1988；Wu和Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987)；以及这些方法的任何组合，各自通过引用并入本文中。
在一些实施方案中，所述方法和组合物中采用的细胞具有DNA构建体稳定并入其基因组中。“稳定并入”或“稳定引入”意思指将多核苷酸引入细胞中，以使得核苷酸序列整合到细胞的基因组中并且能够被其子代继承。任何方案都可以用于稳定并入用于产生靶向基因组修饰的DNA构建体或各种组分。
转染方案以及用于将多肽或多核苷酸序列引入细胞中的方案可以不同。非限制性转染方法包括基于化学试剂的转染方法，这些方法包括使用脂质体；纳米粒子；磷酸钙(Graham等人(1973).Virology 52(2):456–67；Bacchetti等人(1977)Proc Natl Acad SciUSA 74(4):1590–4；及Kriegler,M(1991).Transfer and Expression:A LaboratoryManual.New York:W.H.Freeman and Company.第96–97页)；树状聚合物；或阳离子聚合物，如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺。非化学方法包括电穿孔、声致穿孔及光学转染。基于粒子的转染包括使用基因枪、磁体辅助转染(Bertram,J.(2006)Current PharmaceuticalBiotechnology 7,277–28)。还可以使用病毒法进行转染。
将异源多核苷酸引入大鼠ES细胞中的方法的非限制性实例如下。在电穿孔之前，使如本文所描述的大鼠ES细胞传代约24到约48。在电穿孔之前约24小时，将培养基更换成RVG2i+ROCKi(10μMY-27632)。用胰蛋白酶处理大鼠ES细胞并分离各大鼠ES细胞。使大鼠ES细胞悬浮以达到每75ul约2x 10^6到约10x 10^6个细胞的最终细胞浓度。将约75λ的大鼠ES细胞添加到约50λ含异源多核苷酸的DNA中，并添加约125λEP缓冲液。在一个非限制性实施方案中，按以下参数进行电穿孔：400V；400V；Ω；100μF。然后，在RVG2i和10μM ROCKi中培养细胞，并且可以将其转移到饲养细胞上。
ii.选出具有靶向基因组修饰的大鼠胚胎干细胞
提供了用于选择并维持在基因组中稳定并入了靶向遗传修饰的大鼠ES细胞的各种方法。在一个非限制性实施例中，当将异源多核苷酸引入大鼠ES细胞中时，该方法可以包括(a)提供体外大鼠ES细胞群；(b)将异源多核苷酸引入至少一个大鼠ES细胞中，该异源多核苷酸包含可操作地连接到在大鼠ES细胞中具有活性的启动子的选择标记物；及(c)在交替的第一培养基和第二培养基中体外培养大鼠ES细胞群，其中第一培养基包含有效量的选择剂，保持第一时间段，并且第二培养基不包含选择剂，其中体外培养条件维持多能性和全能性；并由此选出在基因组中稳定整合了异源多核苷酸的大鼠ES细胞。可以在给定群中选出具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞的各种方法都可以用于体外培养***中以使大鼠ES细胞维持多能性。因此，可以采用本文所论述的任何体外培养基和饲养细胞。
在具体实施方案中，第一培养基与第二培养基大约每5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个小时或更长时间交替。在一个具体实施方案中，第一培养基与第二培养基每24小时交替。
可以使用任何适当的选择标记物并且对应选择剂将以有效浓度存在于培养基中。此类选择标记物包括本文所论述的天然选择标记物、衰减的选择标记物或不衰减的选择标记物中的任一种。在一个实施方案中，所用选择标记物赋予对包括例如G418在内抗生素的抗性。非限制性选择标记物包含新霉素磷酸转移酶II(nptII)或潮霉素磷酸转移酶(hpt)。
选择剂的浓度应允许选出具有选择标记物的大鼠ES细胞，同时维持培养物内存在的大鼠ES细胞的多能性。当采用例如G418时，选择培养基中G418的浓度范围可以是约50ug/ml至约125ug/ml、约60ug/ml至约125ug/ml、约70ug/ml至约125ug/ml、约80ug/ml至约125ug/ml、约90ug/ml至约125ug/ml、约100ug/ml至约125ug/ml、约110ug/ml至约125ug/ml、约80ug/ml至约100ug/ml、约65ug/ml至约85ug/ml、约70ug/ml至约80ug/ml。在一个实施方案中，培养物中G418的浓度是75μg/ml。
选择用培养基使大鼠胚胎干细胞保持多能性。此类培养基在本文中别处详细描述。
选择方案可以在编码选择标记物的多核苷酸引入大鼠ES细胞的基因组中之后的任何时间起始。在具体实施方案中，选择方案是在选择标记物引入大鼠ES细胞中之后10、15、20、24、30、35、40、50、60小时或更长时间开始。在一个实施方案中，选择方案是在引入了编码选择标记物的多核苷酸之后约2天开始。
采用G418的非限制性选择方案如下。第2天(在引入了编码选择标记物的多核苷酸之后第2天)，在2i培养基和75μg/ml G418中孵育大鼠ES细胞群。第3天，在不含G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第4天，在2i培养基和75μg/ml G418中孵育大鼠ES细胞群。第5天，在不含G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第6天，在2i培养基和75μg/ml G418中孵育大鼠ES细胞群。第7天，在不含G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第8天，在不含75μg/ml G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第9天，在不含G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第10天，在2i培养基和75μg/mlG418中孵育大鼠ES细胞群。第11天，在不含G418的2i培养基中孵育大鼠ES细胞群。第12天，拣取集落用于扩增和筛选。
在选出具有选择标记物的大鼠ES细胞之后，可以对集落进行扩增。在具体实施方案中，在维持细胞多能性的培养条件中，扩增期可以是约1、2、3、4、5或更多天。在一个非限制性实施方案中，使所选集落扩增3天。在另一实施方案中，所用培养基是2i培养基。然后，可以使每个克隆传代并进一步扩增。
具有一种或多种靶向遗传修饰的大鼠ES细胞和细胞系可以具有以下任一种或多种特性：
(a)在靶向遗传修饰之后具有生殖能力，意味着当将大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中时，大鼠ES细胞系基因组内的靶向遗传修饰被传递到后代中；
(b)在体外具有多能性；
(c)在体外具有全能性；
(d)当在体外培养时，松散地粘附于饲养细胞层；
(e)当在体外涂铺于饲养细胞层上时，当在体外培养时形成球状集落；
(f)当在包含未被遗传修饰成表达白血病抑制因子(LIF)的饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含足够浓度的LIF；
(g)当在包含饲养细胞层的条件下体外培养时，维持多能性，其中培养基包含小鼠LIF或者其活性变体或片段；
(h)包含分子特征，该分子特征的特征在于
i)表达一个或多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
ii)表达至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个大鼠ES细胞特异性基因，所述大鼠ES细胞特异性基因包含粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)、miR-632或其组合；
iii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
iv)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个如表14中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
v)一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vi)至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达；
vii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
viii)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表13中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍增加；
ix)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，一个或多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；和/或
x)当与F1H4小鼠ES细胞相比较时，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个如表12中所陈述的大鼠ES细胞特异性基因的表达有至少20倍减少；
xi)(i)-(x)部分中的大鼠ES细胞特异性基因的表达的任何组合；
xii)如表15中所示的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18种所列多能标记物的多能标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的多能性排序一栏；
xiii)如表15中所示的至少2、3或4种所列中胚层标记物的中胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的中胚层排序一栏；
xiv)如表15中所示的至少2、3、4、5或6种所列内胚层标记物的内胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的内胚层排序一栏；
xv)如表15中所示的至少2和3种所列神经标记物的神经标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的神经排序一栏；
xvi)如表15中所示的所列滋养外胚层标记物的滋养外胚层标记物相对表达水平。有关相对表达水平，参见表15中的滋养外胚层排序一栏；
xvii)一种或多种(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种)如表15中所陈述的多能标记物、中胚层标记物、内胚层标记物、神经标记物和/或滋养外胚层标记物的任何相对表达水平；
xviii)表15中所陈述的每一标记物的相对表达水平；
xix)xii-xiix中所陈述的特征的任何组合；和/或
xx)i-xiix中所陈述的特征的任何组合。
(i)具有产生F0大鼠的能力；
(j)能够传代培养并维持未分化状态；
(k)具有与正常大鼠细胞相同的染色体数量；
(l)在体外维持多能性，无需旁分泌LIF信号传导；和/或
(m)具有自更新能力，意味着其无限***，同时维持多能性。
iii.表达盒
术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”及“核酸片段”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其中任选地含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的多核苷酸可以包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物的一个或多个区段。多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，包括天然存在的分子和合成类似物，及这些的任何组合。本文所提供的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹、茎-环结构等。
还提供了重组多核苷酸。术语“重组多核苷酸”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸序列的人工组合或异源组合，例如自然界中未发现的调控序列和编码序列。在其它实施方案中，重组构建体可以包含源自于不同来源的调控序列和编码序列，或源自于相同来源但以不同于自然界所见的方式布置的调控序列和编码序列。此类构建体可以独立使用或者可以结合载体一起使用。如果使用载体，那么载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。举例来说，可以使用质粒载体。成功转化、选择和繁殖宿主细胞所需并且包含本文所提供的任何分离的核酸片段的基因元件。筛选可以通过针对DNA的Southern分析、针对mRNA表达的Northern分析、针对蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来实现。
在具体实施方案中，可以将一种或多种本文所描述的组分提供于表达盒中用于在大鼠细胞中表达。表达盒可以包括可操作地连接到本文所提供的多核苷酸的5'和3'调控序列。“可操作地连接”意思指两个或更多个元件之间的功能性连接。举例来说，所关注的多核苷酸与调控序列(即，启动子)之间的可操作连接是允许所关注的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续或不连续的。可操作地连接当用于指两个蛋白质编码区的接合时，意思指这些编码区在同一阅读框内。在另一情形中，编码蛋白质的核酸序列可以可操作地连接到调控序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)，以保持适当的转录调控。表达盒可以另外含有至少一个共引入大鼠ES细胞中的所关注的另外的多核苷酸。或者，所关注的另外的多核苷酸可以提供于多个表达盒上。此类表达盒具有多个限制性位点和/或重组位点以***受调控区的转录调控的重组多核苷酸。该表达盒可以另外含有选择标记物基因。
表达盒可以在5'-3'方向上包括在哺乳动物细胞或所关注的宿主细胞中起作用的转录、转录和翻译起始区(即，启动子)、本文提供的重组多核苷酸，以及转录和翻译终止区(即，终止区)。这些调控区(即，启动子、转录调控区及翻译终止区)和/或本文提供的多核苷酸对于宿主细胞或相对于彼此可以是天然的/类似的。或者，调控区和/或本文提供的多核苷酸对于宿主细胞或相对于彼此可以是异源的。举例来说，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子是来自与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自相同/相似物种，那么其中一种或两种相对于其原始形式和/或基因组基因座基本上被修饰，或该启动子对于可操作地连接的多核苷酸来说不是天然的启动子。或者，调控区和/或本文提供的重组多核苷酸可以完全是合成的。
终止区和转录起始区可以是天然的，与可操作地连接的重组多核苷酸可以是天然的，与宿主细胞可以天然的，或者可以相对于启动子、重组多核苷酸、宿主细胞或其任何组合源自于另一来源(即，外来的或异源的)。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供呈适当取向的DNA序列。为此，可以采用适配子或连接子来接合DNA片段，或者可以涉及其它操作来提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这一目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、重新取代(例如转换和颠换)。
在本文所提供的表达盒中可以使用多种启动子。这些启动子可以基于所希望的结果进行选择。应认识到，在表达盒中使用不同启动子调节所关注多核苷酸的表达时序、位置和/或水平，可以增进不同应用。必要时，这些表达构建体还可以含有启动子调控区(例如，赋予诱导性、组成性、环境调控或发育调控，或者细胞或组织特异性/选择性表达的区域)、转录起始的起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
iv.产生带有靶向遗传修饰的F0大鼠胚胎和F1子代
本文所提供的各种方法和组合物都可以用于产生遗传修饰的大鼠。此类方法一般包括(a)将靶向遗传修饰引入本文所公开的分离的大鼠ES细胞的基因组中，以形成具有遗传修饰的大鼠ES细胞；(b)将至少一个具有遗传修饰的遗传修饰的大鼠ES细胞植入大鼠宿主胚胎中以产生F0胚胎；(c)将F0胚胎植入***母体中；(d)使F0胚胎在***母体中孕育到足月；及(e)鉴别具有遗传修饰的F0大鼠。
可以将具有遗传修饰的遗传修饰的大鼠ES细胞植入来自相同大鼠品系或来自不同大鼠品系的大鼠宿主胚胎中。举例来说，可以将遗传修饰的DA大鼠ES细胞植入DA大鼠宿主胚胎中，或者可以将其植入SD宿主胚胎、ACI宿主胚胎或其它异种大鼠宿主胚胎中。类似地，可以将遗传修饰的ACI大鼠ES细胞植入ACI大鼠宿主胚胎中，或者可以将其植入SD宿主胚胎、DA宿主胚胎或其它异种大鼠宿主胚胎中。同样，***母体可以来自与遗传修饰的大鼠细胞和/或大鼠宿主胚胎相同的大鼠品系，或者***母体可以来自与遗传修饰的大鼠细胞和/或大鼠宿主胚胎不同的大鼠品系。在一个非限制性实施方案中，遗传修饰的大鼠细胞是来自DA品系，宿主大鼠胚胎是来自SD宿主胚胎，并且***母体是来自DA品系。在另一非限制性实施方案中，遗传修饰的大鼠细胞是来自ACI品系，宿主大鼠胚胎是来自SD品系，并且***母体是来自DA品系。
在又其它实施方案中，可以使嵌合大鼠(F0)繁殖以产生对于靶向遗传修饰来说是杂合的F1子代。此外，可以使F1子代的雄性大鼠与F1子代的雌性大鼠一起繁殖以获得对于遗传修饰来说是纯合的F2子代。
本文所提供的方法和组合物允许至少1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或更高百分比的具有遗传修饰的F0F0大鼠将遗传修饰传递到F1子代。
在一些实施方案中，将具有靶向遗传修饰的大鼠ES细胞引入来自相应生物体的前桑椹胚期胚胎，例如8细胞期小鼠胚胎中。参见例如，US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754及US 2008-0078000 A1，全部通过引用整体并入本文中。在其它实施方案中，供体大鼠ES细胞可以在4细胞期植入8细胞期的宿主胚胎中。
孵育包含遗传修饰的大鼠ES细胞的大鼠胚胎，直到囊胚期，然后将其植入***母体中以产生F0。带有遗传修饰的基因组基因座的大鼠可以经由本文所描述的等位遗传修饰(modification of allele，MOA)分析法鉴别。使由遗传修饰的大鼠ES细胞得到的F0代与野生型大鼠杂交以获得F1后代。在用特定引物和/或探针进行基因分型之后，使对于遗传修饰的基因组基因座来说是纯合的F1大鼠彼此杂交以产生对于遗传修饰的基因组基因座来说是纯合的大鼠。
另外提供了一种包含内细胞团的F0大鼠胚胎，该内细胞团具有至少一个异源干细胞并且包含本文所提供的任一大鼠ES细胞。在其它实施方案中，提供了大鼠F0胚胎的子代，其中至少50％、60％、70％或更高百分比的F0子代是源自于如本文所公开的遗传修饰的大鼠ES细胞。
在一个方面，提供了一种用于产生大鼠ES细胞的方法，该方法包括从桑椹胚期大鼠胚胎、囊胚期大鼠胚胎或处于桑椹胚期胚胎与囊胚期胚胎之间的发育阶段的大鼠胚胎得到大鼠细胞，及在足以维持多能性和/或全能性的条件下培养来自大鼠胚胎的大鼠细胞。在一个实施方案中，足以维持多能性和/或全能性的条件包括2i培养基。
在一个方面，提供了一种用于产生遗传修饰的大鼠的方法，该方法包括以下步骤：用所关注的核酸序列修饰大鼠ES细胞基因组以形成修饰的大鼠ES细胞，及采用该修饰的大鼠ES细胞作为供体大鼠ES细胞，将该大鼠供体ES细胞与大鼠宿主胚胎组合，培养该供体ES细胞和大鼠宿主胚胎，及采用经过培养的宿主胚胎来产生遗传修饰的大鼠。
在一个方面，提供了一种用于产生遗传修饰的大鼠F1子代的方法，该方法包括以下步骤：用所关注的核酸序列修饰大鼠ES细胞基因组以形成修饰的大鼠ES细胞，及采用该修饰的大鼠ES细胞作为供体大鼠ES细胞，将该大鼠供体ES细胞与大鼠宿主胚胎组合，培养该供体ES细胞和大鼠宿主胚胎，及采用经过培养的宿主胚胎来产生遗传修饰的大鼠，其中该子代有约3％、约10％或更多，或约63％或更高百分比源自于该遗传修饰的供体大鼠ES细胞。
在一个实施方案中，将经过培养的宿主胚胎植入***大鼠母体中，并且使经过培养的宿主胚胎在***母体中孕育。
在一个方面，提供了一种将遗传修饰从大鼠多能细胞以高频率传递到大鼠子代的方法，该方法包括用细菌人工染色体上的所关注的核酸序列对多能大鼠细胞进行遗传修饰，以形成遗传修饰的大鼠多能细胞，及采用该遗传修饰的大鼠多能细胞和大鼠宿主胚胎在大鼠***母体中产生包含遗传修饰的子代，并任选地繁殖该子代。
在一个方面，提供了一种用于产生大鼠ES细胞的方法，其中该方法包括将冷冻的8细胞期胚胎培养到囊胚期，及从经过培养的囊胚得到大鼠细胞，以在足以维持多能性和/或全能性的条件下培养大鼠细胞。
V.变体、片段和序列同一性
本文提供了所公开的LIF多肽，特别是小鼠LIF多肽的活性变体和片段。“变体”是指基本上类似的序列。如本文所使用，“变体多肽”意欲指由天然蛋白质通过缺失(所谓的截短)天然蛋白质的N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或多个内部位点缺失和/或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而得到的多肽。变体多肽仍具有天然多肽的所希望的生物活性，也就是说，这些多肽抑制大鼠和/或小鼠胚胎干细胞的分化并且促使干细胞自更新。如本文所公开的多肽(即，SEQ ID NO:1或SwissProt登录号P09056)的变体将与参考序列典型地具有至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比的序列同一性。
术语“片段”是指包含指定数量的连续氨基酸的一部分氨基酸。在具体实施方案中，本文所公开的多肽的片段可以保持全长多肽的生物活性并因此抑制大鼠和/或小鼠胚胎干细胞的分化并促使干细胞自更新。本文所公开的多肽序列(即，SEQ ID NO:1或SwissProt登录号P09056)的片段可以包含至少10、15、25、30、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个，或至多全长蛋白质中存在的氨基酸总数的连续氨基酸。
如本文所使用，在两个多核苷酸或多肽序列的情况下，“序列同一性”或“同一性”提到当针对指定比较窗内的最大对应性进行比对时两个序列中相同的残基。当结合蛋白质使用序列同一性百分比时，应认识到，不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，并因此不改变分子的功能特性。当序列因保守取代而不同时，序列同一性百分比可以向上调整以针对取代的保守性进行校正。因此类保守取代而不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。用于作出这种调整的方式是本领域技术人员众所周知的。典型地，这涉及将保守取代作为部分而非完全错配进行评分，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，在给出相同氨基酸的评分是1并且给出非保守取代的评分是零时，给出保守取代的评分在零与1之间。举例来说，如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California)中执行，计算保守取代的评分。
如本文所使用，“序列同一性百分比”意思指通过比较在比较窗内两个最佳对准的序列所测定的值，其中对于最佳对准的的两个序列，多核苷酸序列在比较窗中的部分相较于参考序列(不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。该百分比是通过以下方式计算：测定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
除非另作规定，否则本文所提供的序列同一性/相似性值是指使用第10版GAP，使用以下参数获得的值：核苷酸序列的同一性％和相似性％使用GAP权重50和长度权重3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；氨基酸序列的同一性％和相似性％使用GAP权重8和长度权重2，以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等效程序。“等效程序”意思指对于任何两个相关序列，当与通过第10版GAP产生的相应比对相比较时，产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的比对和相同的序列同一性百分比的任何序列比较程序。
以下实施例是出于说明目的而非限制目的提供。
实施例
实施例1：大鼠ES细胞衍生化.
rESC表征.如图1中所示，rESC生长为致密的球状集落，这些集落常规地脱离并且漂浮于培养皿中(近视图，图4)。B、C、F、G：rESC表达多能标记物，包括Oct-4(图2A)和Sox2(图2B)，并且表达高水平的碱性磷酸酶(图3，左图)。细胞系DA.2B的核型是42X,Y(图3，右图)。rESC常常变为四倍体；因此，通过对中期染色体分散度进行计数来对细胞系进行预筛选，然后正式对具有基本上正常的计数的细胞系进行核型分析。
从商购获得的超***的雌性收集ACI囊胚；由商购获得的冷冻8细胞胚胎培养DA胚细胞。用酸性台氏溶液去除透明带，并将胚细胞涂铺到有丝***失活的MEF上。拣取生长晕并使用标准方法进行扩增。所有胚细胞都使用2i培养基涂铺，培养和扩增(Li等人(2008)Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts,Cell135:1299-1310；通过引用并入本文中)。
实施例2：大鼠产生
通过囊胚注射并通过生殖系传递rESC基因组来产生嵌合大鼠。使用亲本ACI.G1rESC通过囊胚显微注射产生的嵌合体示于图5中。由图5中标为星号(*)的ACI/SD嵌合体生殖的F1鼠灰色幼崽和白化同窝仔畜示于图6中。
亲本rESC的生殖系传递.通过将三个整倍体rESC系显微注射到白化SD囊胚中来评价多能性。嵌合体是通过鼠灰色毛色标识，表明rESC的贡献。对于每一细胞系，大多数嵌合体将rESC基因组传递给F1后代(表4)。
实施例3：rESC靶向：大鼠Rosa 26基因座.
与小鼠中相同，rRosa26基因座在Setd5与Thumpd3基因之间，具有相同间距。rRosa26基因座(图7，图B)不同于mRosa 26基因座(图7，图A)。mRosa26转录物由2或3个外显子组成。该大鼠基因座除与小鼠外显子1同源的外显子(Ex1a)外，还含有第2个外显子1(Ex1b)。在大鼠中未鉴别出第3个外显子。rRosa26等位基因的靶向描绘于图7(底图)中，其中5kb的同源臂各自通过PCR，使用来自DArESC的基因组DNA克隆。被靶向的等位基因含有代替rRosa26内含子中的117bp缺失的SA-lacZ-hUb-neo盒。
测定在rRosa 26基因座处的靶向效率(表5)。使用标准技术，将线性化的载体经电穿孔注入DA或ACI rESC中，并在2i培养基+G418中培养转染的集落。拣取个别集落并使用等位基因缺失(Loss of Allele，LOA)测定进行筛选(Valenzuela,D.等人(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis,Nature Biotech.21:652-660，通过引用并入本文中)。
使用靶向Rosa26rESC进行嵌合体产生和生殖系传递.将重新确定的靶向rRosa26克隆显微注射到SD囊胚中，然后使用标准技术将其转移到假孕的雌性DS接受体中。通过毛色鉴别嵌合体；雄性F0嵌合体与SD雌性一起繁殖。针对靶向Rosa26等位基因的存在对生殖系(鼠灰色)F1幼崽进行基因分型；22只鼠灰色幼崽中有九只被基因分型为在Rosa26基因座处是杂合的(表6)。
实施例3：大鼠胚胎干细胞的衍生化
超***方案，大鼠
第0天：注射孕马血清：IP，20U(0.4ml)。
第1天：无操作
第2天：(46小时后)：注射hCG，IP，50U(1ml)
-设定单一雌性配偶。
第3天：检查阴栓(plug)。对雌性戴上阴栓。这是第0.5天。
第6天(e3.5)：对雌性实施安乐死并冲洗胚胎。
ES细胞衍生化方案(超***)
第0天：
1)用CO2对雌性大鼠实施安乐死。
2)用70％乙醇拭抹腹部；使用剪刀打开腹侧体壁，暴露出内脏。
3)解剖出输卵管和子宫角，并将其放入含有加温的N2B27培养基的组织培养皿中。尽可能多地洗出血液，并且用N2B27转移到新培养皿中。
4)使用1ml注射器和钝头27g针，用培养基冲洗通过子宫角和输卵管以将囊胚逐入培养基中。
5)用口吸管收集囊胚并将其转移到含有KSOM+2i(1μM PD0325901，3μMCHIR99021)的胚胎培养皿中。KSOM是由Millipore生产的培养基。目录号是MR-106-D。
6)在37℃，7.5％CO2下培养过夜。
ES细胞衍生化方案(冷冻胚胎)
第0天：
1)将冷冻的8细胞胚胎(商购获得)解冻放入M2培养基中。在室温下培养10分钟。
2)转移到KSOM+2i中并培养过夜。
ES细胞衍生化方案(两种胚胎相同)
第1天：
1)将空化的胚胎转移到2i培养基中并培养过夜。
2)在KSOM+2i中继续培养未空化的胚胎
第2天：
1)将所有剩余胚胎转移到2i培养基中(无论其是否是空化的)。
2)培养过夜；在2i培养基中继续培养早先的胚胎。
第3天：
1)用酸性台氏溶液转移胚胎，保持30-60秒，以去除透明带。
2)在2i培养基中洗涤胚胎3次以去除酸性台氏溶液。
3)将每个胚胎保藏在96孔饲养板的独立孔中(所述含有有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层)。
4)在2i培养基中培养过夜。
第4-5天：
1)监测涂铺的胚胎中生长晕(未分化的无定形细胞团)的存在。当生长晕达到涂铺胚胎的约两倍大小时，准备转移生长晕。
2)每一天：用微量移液管去除用过的培养基并用新鲜的2i培养基更换。
3)将生长晕转移到新的饲养孔中：
a.去除用过的培养基并用PBS轻柔地洗涤孔。
b.去除PBS并添加30μl的0.05％胰蛋白酶；孵育10分钟。
c.通过添加30μl 2i+10％FBS来停止胰蛋白酶反应。
d.用微量移液管轻柔地解离细胞，并将孔中的全部内含物转移到24孔饲养板中的新孔中。这是第1代(P1)。
e.在2i培养基中培养过夜。
第5-8天：(时间选择取决于每一细胞系扩增的速度)
1)每天更换培养基(2i培养基)并监测具有ESC形态的集落的存在。
2)当出现集落时，继续培养，直到集落扩增到约50％汇合。
3)如先前一样，集落用胰蛋白酶处理并传代；涂铺于滋养层上，在6孔培养皿中每个细胞系1个孔。这是第2代(P2)。
继续进行：
1)继续喂养并监测每个细胞系，直到约50％汇合。
2)照常用胰蛋白酶处理细胞。
3)用2i+10％FBS停止胰蛋白酶；通过离心(5’，1200rpm，Beckman-Coulter台式离心机)使细胞沉淀。
4)抽吸上清液并将细胞轻柔地悬浮于400μl冷冻培养基(70％2i、20％FBS、10％DMSO)中。
5)将细胞分入2个小瓶中并在-80℃下冷冻。这是第3代(P3)。
6)对于长期储存，将小瓶转移到液氮中储存。
如下表7制备2i培养基。
材料：孕马血清***(PMSG)
人孕尿绒毛膜***(HCG)
雌性大鼠(5-12周龄)
雄性大鼠(12周至8个月大)，每笼一只
注射器/针
在6:00-18:00开灯的动物室
程序：
第1天：8:00-10:00AM
向雌性注射20IU PMSG(0.4ml)，IP
丢弃未使用的PMSG。
第3天：8:00-10:00AM(PMSG注射后48小时)
向雌性注射50IU HCG(1ml)，IP
在交配笼中，每只雄性放入一只雌性。
丢弃未使用的HCG。
第4天：8:00-10:00AM(HCG注射后24小时)
检查雌性的阴栓。
激素供应商
PMSG：Sigma#G-4877(1000IU)。再悬浮于PBS中达到50IU/ml的最终浓度[]。以1ml等分试样在-20℃下储存。
HCG：Sigma#CG-5(5000IU)。再悬浮于PBS中达到50IU/ml的最终浓度[]。以1ml等分试样在-20℃下储存。
实施例4：大鼠胚胎干细胞系的核型分析
对本文中产生的大鼠ES细胞系进行核型分析，并且结果概述于表8-11中。
表8
表9
表10
表11
实施例5：将载体经电穿孔放入大鼠胚胎干细胞中
1.在电穿孔之前24-48小时，使大鼠ES细胞传代。
2.在电穿孔之前24小时，将培养基更换成RVG2i+ROCKi(10μM Y-27632)
3.在胰蛋白酶处理之前30分钟，更换培养基。
4.将待电穿孔的DNA等分成数份。
5.使DNA在室温下加温，保持>10分钟。
6.在62℃下将DNA加热5分钟。将DNA放到冰上。
7.用胰蛋白酶处理细胞：
a.收集漂浮的集落。洗涤板以尽可能多地收集漂浮物。
b.使集落沉淀：在750rpm下3分钟。
c.用5-10ml的PBS洗涤沉淀1次，并且再离心/沉淀
d.抽吸上清液；添加500λ胰蛋白酶，0.05％+1％鸡血清。
i.在10cm板中每管汇集不超过1个集落。如果在胰蛋白酶处理期间，过多的集落堆积在管的底部，那么其会结块并且将损失大多数细胞。
e.37℃下4分钟。吸取集落若干次以使结块最少。
f.重复步骤1-2次：37℃下4分钟。
g.用500λRVG2i+10％FBS停止胰蛋白酶。
8.使细胞沉淀：在1200rpm下5分钟。
9.将细胞再悬浮于10ml PBS中。对两份20λ等分试样进行计数以确定总细胞数量。
10.使细胞沉淀(5分钟/1200rpm)；计算总细胞数量和再悬浮液的总体积以获得正确的细胞浓度(目标数量#/75μl EP缓冲液)。
11.再悬浮于最小体积的EP缓冲液中；测量总体积并用EP缓冲液调整到目标体积。电穿孔缓冲液是由Millipore销售。目录号是ES-003-D。参见Valenzuela等人(2003)NatureBiotechnology 21:652-659，其通过引用并入本文中。
12.将75λ细胞添加到50λDNA中；将125λ细胞/DNA溶液转移到BTX 48孔微孔板(cuvette)的一个孔中。
a.在同一列的空孔中填入125λEP缓冲液。
13.在BTX电转化仪中使该微孔板脉动一次：
a.设置：400V；Ω；100μF(设置可以变化)
14.将微孔板放到冰上，保持15分钟，以使其恢复。
15.将细胞移到5ml RVG2i+10μM ROCKi中。
16.向15cm板中添加20ml RVG2i+10μM ROCKi。板具有2x neoR MEF(或其它MEF，根据计划而定)。neoR选择性标记物是新霉素磷酸转移酶(neo)基因，参见Beck等人(1982)Gene,19:327-36，或美国专利No.7,205,148或6,596,541，其各自通过引用并入本文中。
17.在37℃下孵育。48小时后开始选择。
所用ROCK抑制剂是Y-27632。
实施例6：选择大鼠胚胎干细胞中的靶向遗传修饰
1.在电穿孔之前，使细胞传代24-48小时。
2.在电穿孔之前24小时，将培养基更换成RVG2i+ROCKi(10μM Y-27632)
3.在胰蛋白酶处理之前30分钟，更换培养基。
4.将待电穿孔的DNA等分成数份。
5.使DNA在室温下加温，保持>10分钟。
6.在62℃下将DNA加热5分钟。将DNA放到冰上。
7.用胰蛋白酶处理细胞：
h.收集漂浮的集落。洗涤板以尽可能多地收集漂浮物。
i.使集落沉淀：在750rpm下3分钟。
j.用5-10ml的PBS洗涤沉淀1次，并且再离心/沉淀
k.抽吸上清液；添加500λ胰蛋白酶0.05％+1％鸡血清。
i.在10cm板中每管汇集不超过1个集落。如果在胰蛋白酶处理期间，过多的集落堆积在管的底部，那么其会结块并且将损失大多数细胞。
l.37℃下4分钟。吸取集落若干次以使结块最少。
m.重复1-2次：37℃下4分钟。
n.用500λRVG2i+10％FBS停止胰蛋白酶。
8.使细胞沉淀：在1200rpm下5分钟。
9.将细胞再悬浮于10ml PBS中。对两份20λ等分试样进行计数以确定总细胞数量。
10.使细胞沉淀(5分钟/1200rpm)；计算总细胞数量和总再悬浮液的总体积以获得正确的细胞浓度(目标数量#/75μl EP缓冲液)。
11.再悬浮于最小体积的EP缓冲液中；测量总体积并用EP缓冲液调整到目标体积。
12.将75λ细胞添加到50λDNA中；将125λ细胞/DNA溶液转移到BTX 48孔微孔板的一个孔中。
a.在同一列的空孔中填入125λEP缓冲液。
13.在BTX电转化仪中使该微孔板脉动一次：
a.设置：400V；400V；Ω；100μF(设置可以变化)
14.将微孔板放到冰上，保持15分钟，以使其恢复。
15.将细胞移到5ml RVG2i+10μM ROCKi中。
16.向15cm板中添加20ml RVG2i+10μM ROCKi。板具有2x neoR MEF(或其它MEF，根据计划而定)。
17.在37℃下孵育。48小时后开始选择。
18.G418选择方案如下：
a.第2天(EP之后第2天)：在2i培养基+75μg/ml G418中孵育细胞。
b.第3天：在不含G418的2i培养基中孵育细胞
c.第4天：在2i培养基+75μg/ml G418中孵育细胞。
d.第5天：在不含G418的2i培养基中孵育细胞
e.第6天：在2i培养基+75μg/ml G418中孵育细胞。
f.第7天：在不含G418的2i培养基中孵育细胞
g.第8天：在2i培养基+75μg/ml G418中孵育细胞。
h.第9天：在不含G418的2i培养基中孵育细胞
i.第10天：在2i培养基+75μg/ml G418中孵育细胞。
j.第11天：在不含G418的2i培养基中孵育细胞
k.第12天：拣取集落以扩增用于筛选。每个集落在0.05％胰蛋白酶+1％鸡血清中解离10分钟，然后涂铺于96孔饲养板的1个孔中。
19.使集落在2i培养基中扩增3天。
20.使克隆1:1传代到新的96孔饲养板中。
21.使克隆在2i培养基中扩增3天。
22.对于每一克隆，在胰蛋白酶中解离集落。冷冻每个克隆的2/3并在-80℃下储存；将剩余1/3涂铺于层粘连蛋白板(涂有10μg/ml层粘连蛋白的96孔板)上。
23.当层粘连蛋白板汇合时，将其送到筛选实验室中进行克隆的基因分型。
实施例7.大鼠胚胎干细胞的分子特征
表13中所列的基因在大鼠ES细胞中的表达水平比相应基因在小鼠ES细胞中的表达水平高20倍。表12中所列的基因在大鼠ES细胞中的表达水平比相应基因在小鼠ES细胞中的表达水平低20倍。
生成表12和表13中的微阵列数据如下。在2i培养基中培养大鼠ES细胞(ACI.G2和DA.2B)和小鼠ES细胞(F1H4)达3代，直到汇合。在不存在饲养层的情况下，在涂有明胶的板上培养F1H4细胞。F1H4小鼠ES细胞源自于129S6/SvEvTac和C57BL/6NTac杂合胚胎(参见例如，美国专利No.7,294,754，以及Poueymirou,W.T.,Auerbach,W.,Frendewey,D.,Hickey,J.F.,Escaravage,J.M.,Esau,L.,Dore,A.T.,Stevens,S.,Adams,N.C.,Dominguez,M.G.,Gale,N.W.,Yancopoulos,G.D.,DeChiara,T.M.,Valenzuela,D.M.(2007)，通过引用整体并入本文中)。
使用以下方案制备样品：
材料包括TRIzol Reagentp；RNA裂解缓冲液(Zymo Kit)；及1.5mL的艾本多夫管(Eppendorf tube)。
1.5mL的艾本多夫管标有样品ID。在37℃的PBS中漂洗在板上生长的细胞。去除PBS并添加300ul的Trizol。使用刮刀使细胞在Trizol中破裂。在1.5mL的艾本多夫管中，将裂解的细胞收集在Trizol中。对于在悬浮液上生长的细胞，在37℃的PBS中漂洗细胞。将细胞收集在1.5mL的管中，对细胞进行短暂离心，去除PBS并添加300ul的Trizol。来回抽吸细胞以使细胞破裂。分选出样品中的101至105个细胞用于FACS，将体积浓缩到不到100uL。添加4体积的RNA裂解缓冲液并通过抽吸进行混合。对于样品，将320uL RNA裂解缓冲液添加到80uL样品中。在-20℃下储存样品。
使用RNA-Seq测量小鼠基因和大鼠基因的表达水平。利用Tophat将测序读数定位到小鼠和大鼠参考基因组，并计算小鼠和大鼠基因的RPKM(片段/千碱基外显子/100万个定位的片段)。基于基因符号选出同源基因，然后使用t检验比较小鼠与大鼠的基因表达水平。
miR-632处于大鼠ESC中最高表达的前10位，但其在小鼠ES细胞中不表达。因此，对于这些基因，没有可比较的数据。基于与其它基因相比较的表达水平以及其在胚胎发育中的已知功能，使用miR-632的表达作为大鼠ES细胞的标记物。
表12.所列基因在大鼠ES细胞中的表达水平比相应基因在小鼠ES细胞中的表达水平低20倍。
表13.所列基因在大鼠ES细胞中的表达水平比相应基因在小鼠ES细胞中的表达水平高20倍。
表14.在大鼠ES细胞的表达水平比相应基因在小鼠ES细胞中的表达水平高20倍的表13中的一小组基因
也已经开发出采用大鼠ES细胞的多能标记物/基因的另外的分子特征。表15提供了基因清单及其由RNA谱图数据得到的表达排序。mRNA是从大鼠ES细胞分离的并且将各种多能标记物的表达水平彼此相比较。所列“多能基因”是其它团体已经使用(主要在小鼠中，但也在大鼠中)作为ES细胞的标记物的基因。中胚层、内胚层和神经是以类似方式定义。“排序”是针对在实验中的表达：排序越前(第1位最高)，则表达水平越高。举例来说，Oct4排第13位意味着，在所测定的所有基因中，除12个基因外，其表达水平是较高的。本实验中的本底是低于30的任何表达值；6107个基因的表达值是30或更高。
表15.采用多能、中胚层、内胚层、神经及营养外胚层标记物/基因的大鼠ES细胞分子特征
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都是指示本发明所属领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中，其引用的程度就如同将每一个别出版物或专利申请特定并且个别地以引用的方式并入一般。除非另外从任何实施方案的上下文显而易见，否则本发明的方面、步骤或特征可以与任何其它方面、步骤或特征组合使用。提到的范围包括在该范围内的任何整数、该范围内的任何子范围。提到多个范围包括这些范围的组合。
序列表
<110> J·D·李
W·奥尔巴克
D·赫斯林
D·弗伦德维
K·V·莱
D·M·瓦伦泽拉
<120> 大鼠的遗传修饰
<130> 057766/441914
<150> US 61/767,093
<151> 2013-02-20
<160> 1
<170> 用于Windows 的FastSEQ 版本4.0
<210> 1
<211> 203
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 1
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
His Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn
20 25 30
Ala Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Gly Asn Leu Met Asn Gln
35 40 45
Ile Lys Asn Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe
50 55 60
Ile Ser Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Val Glu
65 70 75 80
Lys Leu Cys Ala Pro Asn Met Thr Asp Phe Pro Ser Phe His Gly Asn
85 90 95
Gly Thr Glu Lys Thr Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Met Val Ala Tyr
100 105 110
Leu Ser Ala Ser Leu Thr Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Val Leu Asn
115 120 125
Pro Thr Ala Val Ser Leu Gln Val Lys Leu Asn Ala Thr Ile Asp Val
130 135 140
Met Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Arg Val Gly His Val Asp Val Pro Pro Val Pro Asp His Ser Asp Lys
165 170 175
Glu Ala Phe Gln Arg Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Thr Tyr
180 185 190
Lys Gln Val Ile Ser Val Val Val Gln Ala Phe
195 200

Claims (55)

1.一种在大鼠胚胎干(ES)细胞中进行靶向遗传修饰的方法，包括：
(a)在包括含饲养细胞层和培养基的条件下培养大鼠ES细胞群，所述的饲养细胞层未被修饰成表达白血病抑制因子(LIF)，所述的培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF和抑制剂组合，所述的抑制剂由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成，其中所述的培养基不含ES细胞再生因子(ESRF)；以及
(b)将所述的大鼠ES细胞群修饰成含有所述的靶向遗传修饰，其中所述的大鼠ES细胞能够通过生殖系传递所述的靶向遗传修饰。
2.如权利要求1所述的方法，还包括产生步骤(a)中所述的大鼠ES细胞群，包括：
(i)在体外培养第一饲养细胞层和桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎，其中所述的第一饲养细胞层未被修饰成表达白血病抑制因子(LIF)，
其中所述桑椹胚期或囊胚期大鼠胚胎的透明带已经被去除，且
其中培养条件维持小鼠ES细胞的多能性，并包括培养基，所述的培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF和抑制剂组合，所述的抑制剂组合由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成，其中所述的培养基不含ESRF；
(ii)将由步骤(i)获得的、未分化的无定形大鼠ES细胞团的生长晕转移到包含未被修饰成表达LIF的第二饲养细胞层的体外培养物孔中；以及
(iii)在包含所述培养基的条件下培养所述的生长晕，所述的培养基包含50U/mL至150U/mL的LIF和所述抑制剂组合，所述的抑制剂组合由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成，其中所述的培养基不含ESRF。
3.如权利要求1或2所述的方法，还包括：
(c)将至少一种包含来自步骤(b)的所述修饰的大鼠ES细胞引入大鼠宿主胚胎中以产生F0胚胎；
(d)将所述F0胚胎植入***母体中；
(e)使所述F0胚胎在所述***母体中孕育到足月；以及
(f)鉴别出具有所述靶向遗传修饰的F0大鼠。
4.如权利要求3所述的方法，其中引入所述大鼠宿主胚胎中的所述修饰的大鼠ES细胞来自与所述大鼠宿主胚胎相同的大鼠品系。
5.如权利要求3所述的方法，其中引入所述大鼠宿主胚胎中的所述修饰的大鼠ES细胞来自与所述大鼠宿主胚胎不同的大鼠品系。
6.如权利要求3所述的方法，还包括：
(i)将包含所述靶向遗传修饰的雄性F0大鼠与野生型雌性大鼠一起繁殖，以产生对于所述靶向遗传修饰是杂合的F1子代。
7.如权利要求6所述的方法，还包含：
(j)将所述F1子代的雄性大鼠与所述F1子代的雌性大鼠一起繁殖，以获得对于所述靶向遗传修饰是纯合的F2子代。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中至少3％的具有所述靶向遗传修饰的所述F0大鼠将所述靶向遗传修饰传递到所述F1子代。
9.如权利要求8所述的方法，其中至少10％的具有所述靶向遗传修饰的所述F0大鼠将所述靶向遗传修饰传递到所述F1子代。
10.如权利要求9所述的方法，其中至少60％的具有所述靶向遗传修饰的所述F0大鼠将所述靶向遗传修饰传递到所述F1子代。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中：
(I)所述大鼠ES细胞缺乏c-Myc表达；和/或
(II)所述大鼠ES细胞具有正常的核型；和/或
(III)所述大鼠ES细胞在培养基中形成球状、自由漂浮的集落。
12.如权利要求1或2所述的方法，其中：
(I)所述大鼠ES细胞系源自于ACI大鼠或源自于Dark Agouti(DA)大鼠；和/或
(II)所述大鼠ES细胞系源自于来自超***大鼠的桑椹胚期或囊胚期胚胎。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的靶向遗传修饰包括***、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。
14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的修饰的步骤包括修饰所述大鼠ES细胞，使其包含两种或多种靶向遗传修饰，其中所述的大鼠ES细胞能够通过所述的生殖系传递所述的两种或多种靶向遗传修饰。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的大鼠ES细胞为雄性(XY)大鼠ES细胞或雌性(XX)大鼠ES细胞。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的大鼠ES细胞具有一项或多项以下特征：
(a)所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2和Utf1；
(b)所述大鼠ES细胞不表达选自Ecat1和Rexo1的一种或多种多能标记物；
(c)所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury和Bmpr2的一种或多种中胚层标记物；
(d)所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17和Sox7的一种或多种内胚层标记物；
(e)所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白和Pax6的一种或多种神经标记物；
(f)所述大鼠ES细胞表达选自Oct-4、Sox2和碱性磷酸酶的一种或多种多能标记物；
(g)所述大鼠ES细胞表达一种或多种选自以下的大鼠ESC特异性基因：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)和miR-632。
17.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的培养基包含75U/mL至125U/mL的LIF。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述的培养基包含90U/mL至110U/mL的LIF。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的培养基包含100U/mL的LIF。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述饲养细胞包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。
21.如权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基中的LIF为小鼠LIF或与SEQ ID NO:1具有至少91％序列同一性。
22.如权利要求1或2所述的方法，其中所述MEK抑制剂为PD0325901，和/或其中所述GSK-3抑制剂为CHIR99021。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述MEK抑制剂为浓度为0.8μM至1.2μM的PD0325901，所述GSK3抑制剂为浓度为2.5μM至3μM或3μM至3.5μM的CHIR99021。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述MEK抑制剂的浓度为1μM，所述GSK3抑制剂的浓度为3μM。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述培养基中的LIF的浓度为100U/mL，所述MEK抑制剂为浓度为1μM的PD0325901，所述GSK3抑制剂为浓度为3μM的CHIR99021。
26.如权利要求1或2所述的方法，其中所述培养基进一步包括DMEM/F12基础培养基和Neurobasal培养基。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述培养基包括：1x的DMEM/F12基础培养基、1x的Neurobasal培养基、1％的青霉素/链霉素、4mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的2-巯基乙醇、1x的N2补充物、1x的B27补充物、100U/mL的LIF、1μM的PD0325901以及3μM的CHIR99021。
28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述修饰的步骤包含一轮或多轮电穿孔。
29.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的靶向遗传修饰经同源重组事件产生。
30.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的靶向遗传修饰通过采用靶向载体产生，所述的靶向载体包含侧接***多核苷酸的上游和下游同源臂，其中所述的同源臂对应于靶向基因组基因座内的基因组区。
31.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的靶向遗传修饰通过使用核糖酶试剂产生，所述的核糖酶试剂在靶向基因组基因座处产生单链或双链断裂。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述的核糖酶试剂为类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或CRISPR/Cas***。
33.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的修饰的步骤包括：
(i)将异源多核苷酸引入至所述的大鼠ES细胞中，所述异源多核苷酸包含可操作地连接到在所述大鼠ES细胞中具有活性的启动子的选择标记物；及
(ii)在交替的第一培养基和第二培养基中体外培养所述大鼠ES细胞，其中所述第一培养基包含有效量的选择剂，保持第一时间段，并且所述第二培养基不包含所述选择剂，其中所述体外培养条件足以维持多能性；由此选出具有稳定整合入基因组中的异源多核苷酸的所述大鼠ES细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述第一培养基和所述第二培养基每24小时交替，且其中所述选择标记物赋予抗生素抗性。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述选择标记物包括选自新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻病菌素S脱氨酶(bsrr)的一种或多种。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述的抗生素为G418。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述的选择标记物具有一项或多项以下特征：
(a)所述选择标记物包括不衰减的选择标记物基因；
(b)所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性；及
(c)所述大鼠ES细胞包含所述选择标记物的多个拷贝，所述选择标记物的多个拷贝被稳定地整合入所述基因组中。
38.一种体外培养物，包括：
(a)饲养细胞层，其未被修饰成表达白血病抑制因子(LIF)；
(b)包含50U/mL至150U/mL的LIF以及抑制剂组合的培养基，所述的抑制剂组合由MEK抑制剂和GSK3抑制剂组成，其中所述的培养基不含ESRF；以及
(c)一个或多个大鼠ES细胞的大鼠ES细胞群，其含有靶向遗传修饰，其中所述的大鼠ES细胞能够通过生殖系传递所述的靶向遗传修饰。
39.如权利要求38所述的体外培养物，其中所述的培养基包含75U/mL至125U/mL的LIF。
40.如权利要求39所述的体外培养物，其中所述的培养基包含90U/mL至110U/mL的LIF。
41.如权利要求40所述的体外培养物，其中所述的培养基包含100U/mL的LIF。
42.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述饲养细胞层包含有丝***失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)单层。
43.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述培养基中的LIF为小鼠LIF或与SEQ ID NO:1具有至少91％序列同一性。
44.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂为PD0325901，和/或其中所述GSK3抑制剂为CHIR99021。
45.如权利要求44所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂为浓度为0.8μM至1.2μM的PD0325901，所述GSK3抑制剂为浓度为2.5μM至3μM或3μM至3.5μM的CHIR99021。
46.如权利要求45所述的体外培养物，其中所述MEK抑制剂的浓度为1μM，所述GSK3抑制剂的浓度为3μM。
47.如权利要求46所述的体外培养物，其中所述培养基中的LIF的浓度为100U/mL，所述MEK抑制剂为浓度为1μM的PD0325901，所述GSK3抑制剂为浓度为3μM的CHIR99021。
48.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述培养基进一步包括DMEM/F12基础培养基和Neurobasal培养基。
49.如权利要求48所述的体外培养物，其中所述培养基包括：1x的DMEM/F12基础培养基、1x的Neurobasal培养基、1％的青霉素/链霉素、4mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的2-巯基乙醇、1x的N2补充物、1x的B27补充物、100U/mL的LIF、1μM的PD0325901以及3μM的CHIR99021。
50.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述的靶向遗传修饰包括***、缺失、敲除、敲入、点突变或其组合。
51.如权利要求50所述的体外培养物，其中所述的大鼠ES细胞包括异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含可操作地连接到在所述大鼠ES细胞中具有活性的启动子的选择标记物，其中所述的选择标记物具有一项或多项以下特征：
(a)所述选择标记物包含可操作地连接到启动子的不衰减的选择标记物基因；
(b)所述选择标记物相较于野生型选择标记物具有增加的活性；及
(c)所述大鼠ES细胞包含所述选择标记物的多个拷贝，所述选择标记物的多个拷贝稳定地并入基因组中。
52.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中
(I)所述大鼠ES细胞缺乏c-Myc表达；和/或
(II)所述大鼠ES细胞具有正常的核型；和/或
(III)所述大鼠ES细胞在培养基中形成球状、自由漂浮的集落。
53.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中:
(a)所述大鼠ES细胞源自于ACI大鼠或源自Dark Agouti(DA)大鼠；和/或
(b)所述大鼠ES细胞源自桑椹胚期胚胎或囊胚期胚胎。
54.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述的大鼠ES细胞为雄性(XY)大鼠ES细胞或雌性(XX)大鼠ES细胞。
55.如权利要求38-41中任一项所述的体外培养物，其中所述的大鼠ES细胞具有一项或多项以下特征：
(a)所述大鼠ES细胞表达至少一种选自以下的多能标记物：Dnmt3L、Eras、Err-β、Fbxo15、Fgf4、Gdf3、Klf4、Lef1、LIF受体、Lin28、Nanog、Oct4、Sox15、Sox2和Utf1；
(b)所述大鼠ES细胞不表达选自Ecat1和Rexo1的一种或多种多能标记物；
(c)所述大鼠ES细胞不表达选自Brachyury和Bmpr2的一种或多种中胚层标记物；
(d)所述大鼠ES细胞不表达选自Gata6、Sox17和Sox7的一种或多种内胚层标记物；
(e)所述大鼠ES细胞不表达选自巢蛋白和Pax6的一种或多种神经标记物；
(f)所述大鼠ES细胞表达包括Oct-4、Sox2和碱性磷酸酶的一中或多种多能标记物；及
(g)所述大鼠ES细胞表达一个或多个大鼠ESC特异性基因，所述大鼠ESC特异性基因选自：粘附连接相关蛋白(Ajap1)、紧密连接蛋白5(Cldn5)、Cdc42鸟嘌呤核苷酸交换因子9(Arhgef9)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(Camk4)、肝配蛋白-A1(Efna1)、EPH受体A4(Epha4)、间隙连接蛋白β5(Gjb5)、***结合蛋白样1(Igfbpl1)、白细胞介素36β(Il1f8)、白细胞介素28受体α(Il28ra)、左右决定因子1(Lefty1)、白血病抑制因子受体α(Lifr)、溶血磷脂酸受体2(Lpar2)、神经元正五聚蛋白受体(Ntm)、非受体18型蛋白质酪氨酸磷酸酶(Ptpn18)、尾型同源框2(Cdx2)、III型纤连蛋白和锚蛋白重复结构域1(Fank1)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、叉头框E1(甲状腺转录因子2)(Foxe1)、含YRPW基元的多毛/增强子断裂相关蛋白2(Hey2)、淋巴样增强子结合因子1(Lef1)、Sal样蛋白3(果蝇)(Sall3)、SATB同源框1(Satb1)和miR-632。
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