CN109913492B - 一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，具体涉及抑制双生病毒侵染的方法领域，具体包括以下步骤：步骤一、选取患有双生病毒的植物；步骤二、在此植物中过量表达PEPR2，同时，外源施加AtPep1小肽，协同激活抗病毒的机制。本发明利用植物来源的基因与小肽协同作用的方法，提高植物对双生病毒的抗性，解决了双生病毒对我国的农作物生产造成严重危害的问题，在AtPep1小肽作用下，PEPR2对BSCTV所编码的C4蛋白的调控作用，开发了一种特异可控的植物抗病方法，由于C4是多种双生病毒中具有保守序列的致病因子，该技术可以应用于其他双生病毒种类，以提高未来农作物的抗病毒能力。

Description

一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒 侵染的方法

技术领域

本发明涉及抑制双生病毒侵染的方法技术领域，更具体地说，本发明涉及一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法。

背景技术

双生病毒(Geminivirus)是一类具有广泛宿主的植物DNA病毒，许多重要的农作物都受其威胁。我国多个省份的粮食和经济作物上已先后发现双生病毒，对农业生产造成危害。因此，深入研究双生病毒与植物的互作关系，对防治病害，提高农作物产量，保障农业生产的发展有着重要意义。

双生病毒具有单链DNA基因组，只编码少数几个蛋白，通过侵染宿主细胞以及与宿主细胞进行互作，完成其生活周期。双生病毒经昆虫媒介进入植物宿主细胞后，病毒DNA在核内进行大量复制，进而通过细胞内和细胞间移动，迁移至植株的其它部位，形成***性侵染，从而产生病症。甜菜严重曲顶病毒(BSCTV,beet severe curly top virus)是双生病毒的一个种，可以感染模式植物拟南芥和本氏烟草，因此常作为植物与双生病毒互作研究的代表种。

大部分的双生病毒都编码保守的C4蛋白(某些种中称为AC4、AL4或者L4)，而且在多种双生病毒研究中已经证明C4是主要的病症决定因子。当BSCTV的C4基因缺失时，其病毒致病性显著降低；而外源过量表达BSCTV的C4时，可促进植物的细胞***，形成愈伤组织，产生类似于病毒侵染的表型。已有的研究表明C4蛋白可能与植物的激素信号转导和细胞周期调控相关，进而影响宿主的正常发育。但是，关于C4蛋白在植物细胞内的具体调节机制还不清楚，更缺少通过干扰C4功能以抑制病毒侵染的方法。

AtPeps小肽依赖的信号传导是植物激活免疫反应的重要通路，但目前关于该途径的研究集中在真菌和细菌病害，而关于这条通路在植物与病毒互作中的功能还未见报道。AtPeps是一类植物编码的小肽，由八个PROPEP基因编码的前体蛋白产生，由于这些小肽的序列接近，因此大部分的研究都利用AtPep1作为例子。AtPeps通过识别植物细胞质膜上的类受体激酶PEPR1和PEPR2，启动下游的信号转导机制。之前的研究表明AtPep1与PEPR1或PEPR2的结合可以导致这些受体激酶以内吞的形式，由细胞质膜运输到胞内。本发明中，申请人首次发现拟南芥的PEPR2蛋白可以促进BSCTV的C4蛋白内吞定位，以影响其在植物病症决定中的功能，进而抑制双生病毒侵染(未发表)。

与本发明相关的现有技术一

现有技术一的技术方案：

本发明是利用PEPR2过量表达和AtPep1小肽施加相结合的方法，通过影响病症决定因子C4在植物细胞内的定位，抑制双生病毒BSCTV的侵染。相近的技术可见国家发明专利《GDU3基因的一种新用途》(CN101775397B)(具体方案可参看该专利内容)，该技术也是利用过量表达拟南芥来源的基因抵御BSCTV的侵染。该发明主要通过将拟南芥来源的基因LSB1/GDU3过量表达，增强了植物对BSCTV的抗性，该LSB1/GDU3基因的新用途可用于减少BSCTV造成的农业损失。

现有技术一的缺点：

该技术的主要问题在于：过量表达LSB1/GDU3基因本身组成型持续性地激活了植物的抗病通路，而抗病信号的持续积累导致正常条件下植物生长发育受到影响；同时，该方法的抵抗病毒作用机制不明，在应用过程中可能导致其他未知的副作用。与该技术相比，本发明利用的抵抗病毒通路，需要在同时表达PEPR2和施加AtPep1小肽时才激活，从而产生对BSCTV的抗性，因此，可在有病毒侵染风险的条件下再添加AtPep1小肽；同时，本发明发现了AtPep1和PEPR2通过共同调控病症决定因子C4蛋白的定位而影响其功能的机制，是一个更加特异、可控的抗病方式。

另外，现有有效防治双生病毒的技术较少，主要是利用过量表达或敲减植物基因激活相关信号通路以提高对病毒的抗性，以及通过针对病毒DNA的基因编辑以破坏侵染过程；其中过量表达和敲减植物基因主要通过组成型地激活水杨酸等广泛性抗病通路，或者通过影响植物细胞周期控制病毒的复制，因此，在提高抗病能力的同时，对植物本身的生长发育也可能产生影响；针对病毒DNA的基因编辑技术虽然特异性地破坏病毒本身结构的完整性，但已有的研究表明，目前该技术可能存在脱靶的现象，有可能对植物本身的基因组产生影响。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，通过利用植物来源的基因与小肽协同作用的方法，提高植物对双生病毒的抗性，有利于农业安全生产，解决了双生病毒对我国的农作物生产造成严重危害的问题，在AtPep1小肽作用下，PEPR2对BSCTV所编码的C4蛋白的调控作用，开发了一种特异可控的植物抗病方法，由于C4是多种双生病毒中具有保守序列的致病因子，该技术可以应用于其他双生病毒种类，以提高未来农作物的抗病毒能力，解决了现有技术中使用过量表达和敲减植物基因方法对植物生长发育造成的问题，以及可能存在脱靶的现象，对植物本身的基因组产生影响的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，具体包括以下步骤：

步骤一、在植物中过量表达PEPR2，同时，外源施加AtPep1小肽，协同激活抗病毒的机制。

在一个优选地实施方式中，所述PEPR2基因和PEPR2蛋白均来源于拟南芥。

在一个优选地实施方式中，所述AtPep1来源于拟南芥的激发子小肽。

在一个优选地实施方式中，所述步骤一中双生病毒具体可为甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)，所述甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)编码的致病因子为C4，即BSCTV C4。

本发明的技术效果和优点：

1、本发明利用植物来源的基因与小肽协同作用的方法，提高植物对双生病毒的抗性，有利于农业安全生产，解决了双生病毒对我国的农作物生产造成严重危害的问题；

2、本发明利用在AtPep1小肽作用下，PEPR2对BSCTV所编码的C4蛋白的调控作用，开发了一种特异可控的植物抗病方法，由于C4是多种双生病毒中具有保守序列的致病因子，该技术可以应用于其他双生病毒种类，以提高未来农作物的抗病毒能力，解决了现有技术中使用过量表达和敲减植物基因方法对植物生长发育造成的问题，以及可能存在脱靶的现象，对植物本身的基因组产生影响的问题；

3、本发明利用不同类型的植物表达载体对拟南芥的PEPR2基因进行过量表达都可能具有效果，同时，可以利用pCanG-PEPR2-MYC的拟南芥或其他宿主植物的转基因植株，通过外源施加AtPep1小肽，提高多种植物对BSCTV及其他双生病毒的抗性；

4、本发明从各个层面证明PEPR2过量表达与AtPep1的联合使用可以影响双生病毒BSCTV的致病因子C4蛋白的亚细胞定位、致病功能以及双生病毒侵染；由于单独的PEPR2过量表达或者AtPep1施加并不能有效抑制病毒侵染，因此可以通过在特定时间和空间内对过量表达PEPR2的植物进行AtPep1处理，实现在不持续激活植物抗病途径的同时，通过外源小肽施加对植物抗病毒能力进行提升，避免了其他组成型持续激活抗病途径技术的缺点，同时由于本发明是通过AtPep1-PEPR2特异性地识别以抑制C4蛋白活性，机理更为清楚，有利于避免其他副作用的影响。

附图说明

图1为本发明的实施例2中PEPR2和AtPep1协同作用在抗病毒侵染中的实验结果图。

图2为本发明的实施例2中PEPR2和AtPep1影响C4蛋白在植物愈伤组织诱导方面的实验结果图。

图3为本发明的实施例2中PEPR2和AtPep1协同影响双生病毒BSCTV对植物的侵染的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

根据图1-2所示的一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，具体包括以下步骤：

步骤一、选取患有双生病毒的植物；

步骤二、在此植物中过量表达PEPR2，同时，外源施加AtPep1小肽，协同激活抗病毒的机制。

所述PEPR2基因来源于拟南芥，所述PEPR2基因在编码区3267bp处的基因序列具体为TTTCAGTCTTGAGCTCTAATCTCAAATGAGGAATCTTGGGTTACTCGAAATTACTCTGCTTTGCTCTCTCTTTGTCTATTTCCGTATAGATTCTGTCTCTAGTTTAAACTCAGATGGTTTGGCTTTACTCTCGCTTCTCAAGCACTTTGATAAAGTCCCACTTGAAGTAGCTTCGACGTGGAAGGAGAACACATCTGAAACCACTCCATGTAATAATAACTGGTTTGGTGTCATTTGTGATCTTTCTGGTAATGTCGTCGAGACCCTTAATTTGTCTGCTTCTGGGCTTTCAGGCCAATTAGGTTCTGAAATTGGGGAGCTTAAGAGCTTGGTCACATTGGATCTCAGTCTTAACAGTTTCTCTGGTTTATTGCCTTCCACTTTAGGAAACTGTACTTCACTTGAGTATTTGGATTTGTCTAACAATGATTTTTCTGGAGAAGTTCCTGATATTTTTGGTAGCTTGCAGAATTTGACGTTTCTGTATCTTGATCGCAATAATCTTAGTGGTCTCATTCCTGCAAGTGTTGGTGGGTTGATAGAGCTCGTAGATCTGAGGATGTCATATAATAACTTGTCTGGTACCATTCCAGAGTTGCTTGGGAACTGTAGTAAGCTGGAATATCTGGCTTTGAACAACAACAAGTTAAATGGTTCTTTGCCAGCAAGTCTCTATCTACTCGAGAATCTTGGTGAGCTATTTGTCAGTAACAACAGCCTTGGAGGGAGGCTTCATTTTGGTTCTAGCAACTGCAAGAAATTGGTTTCTTTAGATCTCTCGTTCAATGATTTCCAAGGCGGTGTTCCACCTGAGATAGGCAACTGCAGTAGCCTTCACTCTTTAGTCATGGTGAAATGCAACTTGACAGGTACAATCCCATCATCAATGGGTATGTTGAGAAAGGTTTCGGTTATTGACCTTTCCGATAATCGTCTCTCGGGGAATATCCCTCAAGAGCTTGGGAACTGCAGCAGCTTGGAAACCTTGAAGCTGAACGACAACCAGCTCCAAGGCGAGATACCACCTGCATTGAGTAAGCTAAAGAAGCTACAAAGCCTGGAGCTTTTTTTTAATAAGCTGTCCGGTGAGATTCCTATTGGCATATGGAAGATTCAGAGTCTGACACAGATGCTCGTTTATAACAACACTCTCACCGGGGAACTACCAGTTGAAGTAACTCAGCTGAAGCACCTTAAGAAGCTTACACTGTTTAACAACGGCTTTTATGGAGATATACCAATGAGTTTAGGCCTGAATCGAAGCTTAGAGGAGGTGGACCTTCTTGGTAACCGTTTTACAGGGGAGATACCACCCCATCTCTGCCATGGACAGAAGTTGAGATTGTTCATCTTGGGTTCTAATCAGCTTCATGGTAAGATACCAGCGTCTATTCGTCAGTGTAAGACCCTTGAGCGAGTCAGACTTGAAGATAACAAACTTTCAGGTGTTCTTCCGGAATTCCCTGAGAGTCTTAGTCTTTCCTATGTGAACCTCGGAAGCAATAGCTTTGAAGGATCCATCCCGCGCAGCTTGGGAAGCTGTAAAAATCTCTTGACTATTGACCTTTCTCAAAACAAACTCACGGGTCTGATACCTCCAGAACTGGGAAATCTGCAAAGCCTTGGACTGTTGAACCTTTCACATAATTATCTGGAAGGTCCTCTGCCATCCCAGCTATCAGGCTGTGCGAGACTTCTGTATTTTGATGTTGGATCCAACTCATTGAACGGTTCTATTCCATCAAGCTTCAGAAGCTGGAAAAGCTTGTCCACTTTAGTTCTCAGTGACAATAATTTTCTAGGAGCTATTCCACAGTTCTTGGCAGAGCTTGACCGACTCTCAGATCTGCGGATAGCTCGAAATGCTTTTGGAGGTAAGATTCCTTCCTCGGTTGGCTTGTTGAAGAGTCTACGCTATGGCTTAGACCTCAGTGCGAACGTATTTACGGGTGAGATTCCAACCACACTGGGGGCTCTTATCAATCTTGAACGTCTCAACATATCCAACAACAAGTTGACAGGGCCTTTATCGGTTCTTCAAAGTCTTAAGTCATTGAATCAAGTTGACGTCTCGTATAATCAGTTCACGGGTCCAATACCCGTAAATCTGTTATCAAATTCTTCAAAGTTTTCTGGAAATCCAGACCTCTGCATTCAAGCTTCTTACTCAGTGAGTGCCATAATCCGCAAAGAGTTTAAATCTTGCAAAGGTCAAGTCAAACTTAGCACGTGGAAGATCGCCCTTATAGCAGCTGGGTCCTCACTATCCGTATTGGCTTTGCTTTTTGCTCTCTTTTTGGTTTTATGCCGGTGCAAAAGAGGAACCAAGACAGAAGATGCTAATATCCTCGCAGAGGAAGGTCTGTCCTTGTTGCTGAACAAAGTTCTAGCAGCCACTGACAATCTAGATGACAAGTACATCATTGGAAGAGGAGCTCATGGAGTTGTTTACAGAGCTTCTTTAGGATCAGGCGAAGAATACGCCGTGAAGAAACTCATCTTTGCGGAACACATTCGCGCAAACCAAAATATGAAGCGGGAGATCGAAACAATCGGGCTAGTCAGGCACAGAAATCTCATTCGGTTAGAAAGATTTTGGATGAGGAAAGAAGATGGCTTAATGCTGTATCAGTACATGCCCAATGGAAGCCTACACGACGTTTTGCACAGAGGTAATCAAGGAGAAGCAGTTCTTGACTGGTCTGCACGGTTCAACATAGCCCTTGGGATTTCACATGGACTGGCGTATTTACATCATGATTGTCATCCACCAATAATTCACCGCGACATCAAACCAGAGAACATACTCATGGACTCGGATATGGAGCCTCACATTGGAGATTTCGGATTGGCTCGGATTCTAGATGACTCAACAGTTTCAACGGCCACTGTTACTGGCACAACTGGGTACATTGCACCAGAAAATGCGTACAAGACGGTGAGGAGCAAGGAATCAGATGTTTACAGTTATGGAGTTGTTTTGCTCGAGCTGGTAACAGGAAAGAGAGCACTGGACAGATCTTTCCCGGAAGATATCAACATTGTGAGCTGGGTCAGATCTGTATTAAGCAGCTACGAGGATGAAGACGATACTGCTGGTCCAATCGTTGATCCAAAACTTGTGGATGAGCTTCTGGATACGAAGCTCAGGGAACAAGCAATCCAAGTCACAGACTTGGCTCTTAGATGTACAGACAAGAGGCCGGAGAACAGACCATCGATGAGAGATGTGGTGAAAGATTTGACTGATTTGGAAAGTTTTGTAAGAAGCACTTCGGGTTCAGTTCACTAG；

所述PEPR2蛋白来源于拟南芥，所述PEPR2蛋白在编码区1088aa处的蛋白序列具体为MRNLGLLEITLLCSLFVYFRIDSVSSLNSDGLALLSLLKHFDKVPLEVASTWKENTSETTPCNNNWFGVICDLSGNVVETLNLSASGLSGQLGSEIGELKSLVTLDLSLNSFSGLLPSTLGNCTSLEYLDLSNNDFSGEVPDIFGSLQNLTFLYLDRNNLSGLIPASVGGLIELVDLRMSYNNLSGTIPELLGNCSKLEYLALNNNKLNGSLPASLYLLENLGELFVSNNSLGGRLHFGSSNCKKLVSLDLSFNDFQGGVPPEIGNCSSLHSLVMVKCNLTGTIPSSMGMLRKVSVIDLSDNRLSGNIPQELGNCSSLETLKLNDNQLQGEIPPALSKLKKLQSLELFFNKLSGEIPIGIWKIQSLTQMLVYNNTLTGELPVEVTQLKHLKKLTLFNNGFYGDIPMSLGLNRSLEEVDLLGNRFTGEIPPHLCHGQKLRLFILGSNQLHGKIPASIRQCKTLERVRLEDNKLSGVLPEFPESLSLSYVNLGSNSFEGSIPRSLGSCKNLLTIDLSQNKLTGLIPPELGNLQSLGLLNLSHNYLEGPLPSQLSGCARLLYFDVGSNSLNGSIPSSFRSWKSLSTLVLSDNNFLGAIPQFLAELDRLSDLRIARNAFGGKIPSSVGLLKSLRYGLDLSANVFTGEIPTTLGALINLERLNISNNKLTGPLSVLQSLKSLNQVDVSYNQFTGPIPVNLLSNSSKFSGNPDLCIQASYSVSAIIRKEFKSCKGQVKLSTWKIALIAAGSSLSVLALLFALFLVLCRCKRGTKTEDANILAEEGLSLLLNKVLAATDNLDDKYIIGRGAHGVVYRASLGSGEEYAVKKLIFAEHIRANQNMKREIETIGLVRHRNLIRLERFWMRKEDGLMLYQYMPNGSLHDVLHRGNQGEAVLDWSARFNIALGISHGLAYLHHDCHPPIIHRDIKPENILMDSDMEPHIGDFGLARILDDSTVSTATVTGTTGYIAPENAYKTVRSKESDVYSYGVVLLELVTGKRALDRSFPEDINIVSWVRSVLSSYEDEDDTAGPIVDPKLVDELLDTKLREQAIQVTDLALRCTDKRPENRPSMRDVVKDLTDLESFVRSTSGSVH；

所述AtPep1来源于拟南芥的激发子小肽，所述AtPep1蛋白在编码区23aa处的蛋白序列具体为ATKVKAKQRGKEKVSSGRPGQHN；

所述步骤一中双生病毒具体可为甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)，所述甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)编码的致病因子为C4，即BSCTV C4；

所述BSCTV C4基因在编码区264bp处的基因序列具体为ATGAAAATGGGGAACCACATCTGCATGCCCTTATTCAATTCGAAGGAAAAGTCCAGATCCGTAATGCCCGTTACTTCGATCTGCAACATCGAAGTACCAGCAAACAATTCCACTGCAATATTCAGGGAGCTAAATCCAGTTCCGACGTCAAGTCCTACGTCTCAAAGGACGGAGATCACATCGACTGGGGTGAATTTCAGGTCGATGGAAGATCTGCACGCGGAGGTCAACAGACGGCTAATGATGCTGCAGCAGAGGCATTA；

所述BSCTV C4蛋白在编码区87aa处的蛋白序列具体为MKMGNHICMPLFNSKEKSRSVMPVTSICNIEVPANNSTAIFRELNPVPTSSPTSQRTEITSTGVNFRSMEDLHAEVNRRLMMLQQRH。

实验证明，在AtPep1小肽的处理条件下，过量表达PEPR2可以促进BSCTV的致病因子C4蛋白内吞，通过影响C4的功能抑制病毒的侵染，利用本发明的PEPR2和AtPep1协同提高植物对双生病毒抗性的方法对农业生产具有重要的意义。

实施例2：

PEPR2和AtPep1协同作用在抗病毒侵染中的应用

1)PEPR2和AtPep1协同影响BSCTV编码的C4蛋白在植物细胞内的定位

前期通过酵母双杂交筛选发现拟南芥Arabidopsis thaliana编码的PEPR2蛋白可以与BSCTV的C4蛋白相互作用(目前未发表)，因此分析PEPR2及其对应的小肽AtPep1对C4蛋白在植物细胞内定位的影响，具体操作步骤如下：

S101、以拟南芥cDNA为模板，通过PCR的方法(所用引物信息如下：PEPR2-F引物：5’-ACTACTAGTTTTCAGTCTCTTGAGCTCTAATCT-3’，由于PEPR2编码区的5’端存在高级结构，将该引物设计在临近起始密码子的5’非编码区；PEPR2-R引物：5’-AGTGTCGACAGTGAACTGAACCCGAAGTGCTTC-3’)，扩增PEPR2基因序列为在编码区3267bp处的基因序列；

S102、然后将PEPR2基因克隆到pCanG-MYC(在pCambia1300载体基础上加上MYC标签，该载体在植物中是卡那霉素抗性；可以利用其他商用植物过表达载体进行类似构建)，与MYC蛋白标签融合，构建重组表达载体pCanG-PEPR2-MYC；

S103、同时，以BSCTV(ATCC PVMC-6；以前称为BCTV-CFH株，这个菌株将线性化的BSCTV的双链DNA保存在质粒pCFH上)为模板，利用PCR的方法(所用引物信息如下：C4-GFP-F引物:5’-AGTCCATGGTGATGAAAATGGGGAACCAC-3’；C4-GFP-R引物:5’-AGTAAGCTTGATGCCTCTGCTGCAGCATCATTAG-3’)，扩增BSCTV的C4基因，连接到pCambia1300-GFP(在pCambia1300载体基础上增加GFP，CAMBIA，Canberra，Australia；可以采用其他商用带荧光标签的载体进行类似构建)，获得重组表达载体pCambia1300-C4-GFP；

S104、将上述两种重组质粒分别转化农杆菌EHA105，获得重组菌；

S105、将培养的重组菌，通过注射的方法，在本氏烟草Nicotiana benthamiana叶片中共同过量表达C4-GFP和PEPR2-MYC；同时以C4-GFP和pCanG-MYC空载体农杆菌共注射作为对照样品；

S106、在农杆菌注射48小时之后，收集烟草叶片，分别注射终浓度100nM的AtPep1小肽(氨基酸序列为ATKVKAKQRGKEKVSSGRPGQHN)；

S107、利用激光共聚焦显微镜检测GFP荧光信号，分析C4-GFP蛋白在烟草细胞中的定位；

S108、AtPep1小肽处理0小时和30分钟的情况下，空载体对照样品中C4-GFP在烟草细胞质膜上的定位并未改变(见附图1A)；而在过量表达PEPR2-MYC的样品中，在没有处理AtPep1的情况下，C4-GFP的定位有少量变化；当用AtPep1处理30分钟时，C4-GFP发生明显的内吞现象(见附图1B)。

图1A、1B中，每个四个图的左上角是GFP荧光信号，右上角是叶绿素自发荧光对照，左下角是明场细胞轮廓，右下角是上述信号叠加图。

上述结果表明PEPR2和AtPep1的协同作用促进了C4蛋白的亚细胞定位变化，由于之前的研究表明，C4在细胞质膜上的定位对其致病性至关重要，因此，该途径可能影响C4在双生病毒侵染中的功能。

2)PEPR2和AtPep1影响C4蛋白在植物愈伤组织诱导方面的能力

由于之前的研究表明C4基因的组成型表达导致拟南芥形成愈伤组织，无法获得转基因植物，因此前期研究已通过将C4构建于***诱导型表达载体pER8中，通过遗传转化获得pER8-C4拟南芥植株(该种子来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员实验室，可用于衡量本发明所用技术对BSCTV病症决定因子C4的抑制效果)；

正常培养条件下，该植物可以正常生长；当施加***诱导C4基因表达时，该植物形成愈伤组织；因此，可根据诱导产生愈伤组织的能力分析C4蛋白活性；

为了研究PEPR2和AtPep1对C4功能的影响，具体研究步骤如下：

S101、将上述的pCanG-PEPR2-MYC和pCanG-MYC空载体(对照)质粒，转化到农杆菌EHA105，获得重组菌；

S102、将培养的重组菌，利用花滴染法转化pER8-C4的纯合体植株，通过自交分别获得pCanG-PEPR2-MYC/pER8-C4和pCanG-MYC/pER8-C4植株的纯合体后代，通过PEPR2的表达量鉴定，选取2条独立的PEPR2过表达拟南芥株系，用于后续分析；

S103、将上述植物的种子铺在含有2μM***的MS培养基(不加或者加入终浓度100nM的上述AtPep1小肽)上进行萌发，萌发后1周对植物表型进行分析；

S104、在不含AtPep1小肽的条件下，与pCanG-MYC空载体相比，过量表达PEPR2-MYC对C4功能的影响不大；在加入100nM的上述AtPep1小肽的条件下，C4产生的愈伤组织的能力完全被抑制(见附图2A)，图2A为萌发后1周时拍取的植物照片；

S105、当上述植物在相应的培养基上生长3周时，在体式显微镜下进行比较：在不含AtPep1的条件下，pCanG-PEPR2-MYC略微抑制了C4愈伤组织的形成(愈伤组织体积较小)；在加入100nM的上述AtPep1小肽的条件下，C4诱导愈伤组织形成的功能完全消失(见附图2B)，图2B为萌发后3周时拍取的植物照片。

上述结果表明，在PEPR2过量表达的情况下，AtPep1小肽的施加抑制了C4蛋白诱导愈伤组织(病症决定)的能力。

3)PEPR2和AtPep1协同影响双生病毒BSCTV对植物的侵染

由于上述结果表明同时过量表达PEPR2和施加AtPep1可抑制C4的功能，而且C4是BSCTV侵染过程中的致病因子，因此，分析PEPR2和AtPep1对BSCTV侵染的影响，具体操作步骤如下：

S101、将BSCTV的侵染性质粒(pCambia1300-BSCTV1.8copy；来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员实验室)转化进入农杆菌EHA105菌株，得到得到重组农杆菌EHA105-BSCTV；

S102、同时将上述的pCanG-PEPR2-MYC及pCanG-MYC(对照)质粒也分别转化农杆菌EHA105；

S103、将以上农杆菌分别悬浮在10mM MgCl2溶液中，将pCanG-MYC和pCanG-PEPR2-MYC菌液分别与EHA105-BSCTV菌液混合，获得两种菌液，菌液1：pCanG-PEPR2-MYC(浓度为OD600＝1)/BSCTV(浓度为OD600＝0.01)和菌液2：pCanG-MYC(浓度为OD600＝1)/BSCTV(浓度为OD600＝0.01)；

S104、放置3小时后，以农杆菌注射的方法，将上述菌液注射进本氏烟草叶片；

S105、在添加AtPep1的处理中，将AtPep1稀释于10mM的MgCl2溶液中，以同样的方法注射到烟草叶片中；

S106、烟草继续生长两周之后，观察茎端的卷叶和扭曲病症；

S107、对照植物(pCanG-MYC，不加AtPep1)出现严重的曲顶症状；而单独过量表达PEPR2或单独施加AtPep1也并不足以抑制BSCTV的侵染病症；同时叶片中过量表达PEPR2和施加AtPep1的烟草没有出现明显病症(见附图3A，3B)；

S108、通过收集上述处理植物的茎端组织，利用CTAB法提取DNA，利用上述的C4引物，通过PCR扩增C4基因(以C4基因作为检测BSCTV基因组的代表性片段)，以检测植物顶端BSCTV的积累情况，烟草的ACTIN基因作为内参，与其他样品相比，PEPR2过量表达和AtPep1的协同处理的样品中，BSCTV的DNA积累明显降低(见附图3C)。

上述实验结果表明本方法增强了植物对双生病毒的抵抗能力。

本技术方案从各个层面证明PEPR2过量表达与AtPep1的联合使用可以影响双生病毒BSCTV的致病因子C4蛋白的亚细胞定位、致病功能以及双生病毒侵染；

由于单独的PEPR2过量表达或者AtPep1施加并不能有效抑制病毒侵染，因此可以通过在特定时间和空间内对过量表达PEPR2的植物进行AtPep1处理，实现在不持续激活植物抗病途径的同时，通过外源小肽施加对植物抗病毒能力进行提升，避免了其他组成型持续激活抗病途径技术的缺点；

同时，由于本技术方案是通过AtPep1-PEPR2特异性地识别以抑制C4蛋白活性，机理更为清楚，有利于避免其他副作用的影响；

由于C4蛋白序列在多种双生病毒间具有保守性，本技术方案可能对其他类型双生病毒病害防治也具有效果。

本技术方案中，利用不同类型的植物表达载体对拟南芥的PEPR2基因进行过量表达都可能具有效果，同时，可以利用pCanG-PEPR2-MYC的拟南芥或其他宿主植物的转基因植株，通过外源施加AtPep1小肽，提高多种植物对BSCTV及其他双生病毒的抗性；

另外，对于未患病的植物也可以使用上述方法进行预防。

最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

步骤一、选取患有双生病毒的植物；

步骤二、在此植物中过量表达PEPR2，同时，外源施加AtPep1小肽，协同激活抗病毒的机制。

2.根据权利要求1所述的一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，其特征在于：所述PEPR2基因和PEPR2蛋白均来源于拟南芥。

3.根据权利要求1所述的一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，其特征在于：所述AtPep1来源于拟南芥的激发子小肽。

4.根据权利要求1所述的一种拟南芥PEPR2蛋白和AtPep1小肽协同作用抑制双生病毒侵染的方法，其特征在于：所述步骤一中双生病毒具体可为甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)，所述甜菜严重曲顶病毒(BSCTV)编码的致病因子为C4，即BSCTV C4。

Images