CN109913407B

CN109913407B - 脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用

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Publication number: CN109913407B
Application number: CN201910133482.0A
Authority: CN
Inventors: 刘艳宁; 楼国华; 郑敏
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: CN109913407A

Abstract

本发明提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。所述脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：(1)将脂肪来源的间充质干细胞稀释后进行挤出，得到挤出液；(2)将所述挤出液置于梯度分离液中进行离心，无刹车降速，得到分层的混合液，所述分层的混合液包括上层组分、中间层组分和下层组分；(3)收集中间层组分，混入脂肪来源间充质干细胞外泌体，离心，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞类外泌体。本发明的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法制得的类外泌体，其制备量远高于传统外泌体；所述的类外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果。

Description

脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。

背景技术

随着干细胞治疗研究的进展，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已在肝脏疾病治疗的基础研究和临床实验中均取得了肯定的疗效。MSCs的主要来源有骨髓、脐血、脂肪组织、滑膜等。我们从脂肪组织中也分离培养得到间充质干细胞(AMSC)，且其性质与骨髓来源的间充质干细胞相似，且脂肪中MSC频率是骨髓中含量的近100倍。脂肪组织来源丰富，供者不适度低，不受伦理限制，并且在体外经诱导可分化为肝细胞。我们已在多种肝脏疾病模型中证实脂肪组织来源的MSC(AMSC)具有肝病治疗作用，可有效缓解肝脏炎症，改善肝脏生化和病理指标，因此AMSCs具有极大的肝脏损伤的细胞治疗潜力。

但目前多数MSC的临床研究还处于临床I/II期阶段。究其原因，细胞制备周期长、费用高、不易保存、潜在成瘤风险、肺部毛细血管截留所致输注毒性等限制因素，导致了MSC临床应用发展缓慢。越来越多的研究显示，除分化为特定组织细胞外，MSC的疗效主要来源于其旁分泌作用。其分泌的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)——微囊泡(microvesicles，MVs，直径0.1-1mm)和外泌体(exosomes，直径40-100nm)通过介导细胞间信号沟通和旁分泌因子传递而在MSCs的组织再生和免疫调控功能中发挥关键作用。MSCs来源的外泌体(MSCs-Exo)已在心血管、肾脏、肺部、神经***等疾病治疗中表现出显著疗效。由于外泌体较之MSCs本身，其免疫原性更低，稳定性更好、保存方便，无输注毒性，因此MSCs-Exo在临床治疗应用中更具优势。

目前，MSCs-Exo已在包括肝纤维化、急性肝衰竭、药物性肝炎、自身免疫性肝炎等在内的多种肝病动物模型中显示出了令人鼓舞的疗效。不过虽然脂肪来源间充质干细胞外泌体AMSC-Exo在安全性及稳定性方面更具优势，但同等疗效下其需要量远超AMSCs移植量，达到较好疗效的单只小鼠的AMSC-Exo输注量需要小鼠近1/3的脂肪组织。虽然可以通过基因改造修饰等方式提高AMSC-Exo的疗效，但因涉及基因操作，所以其在临床应用上可能存在潜在的不确定因素。而传统的外泌体制备技术，包括超离、超滤、磁珠免疫、PEG沉淀法等，仍难以实现外泌体的大量制备。因此，其临床应用推广尚有赖于通过改进其制备技术，提升其制备量，而满足临床治疗剂量所需。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，至少包括如下步骤：

(1)将脂肪来源的间充质干细胞稀释后进行挤出，得到挤出液；

(2)将所述挤出液置于梯度分离液中进行离心，无刹车降速，得到分层的混合液，所述分层的混合液包括上层组分、中间层组分和下层组分；

(3)收集中间层组分，混入脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-Exo)，离心，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞类外泌体(AMSC-miExo)。

本发明第二方面提供一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体，采用前述制备方法制成。

本发明第三方面提供前述脂肪来源间充质干细胞类外泌体在制备肝病治疗药物中的应用，优选的，所述肝病选自急慢性肝损伤、病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝衰竭、肝纤维化和肝硬化中的一种或多种。

本发明第四方面提供前述脂肪来源间充质干细胞类外泌体在制备具有以下任一种或多种作用的制剂中的用途：(1)促进巨噬细胞自噬；(2)降低血清ALT、AST水平；(3)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶及坏死性凋亡通路相关分子表达；(4)降低血清IL-1β、IL-33和HMGB1水平；(5)降低肝衰竭死亡率；(6)降低血清TG、TC；(7)减少肝细胞脂肪变性比例；(8)减少肝组织炎性细胞浸润；(9)降低血清ALT、AST水平；(10)降低血清HA、P-III-P、ALT和AST水平；(11)减少肝细胞变性；(12)降低胶原纤维沉积和肝组织炎性细胞浸润；(13)减少肝组织炎症信号通路相关蛋白表达；(14)降低LPS刺激所导致的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-33、TNF-α和HMGB1的分泌；(15)降低PI阳性的细胞比例；(16)下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。

如上所述，本发明的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法及应用，具有以下有益效果：

1.相同AMSC细胞数下，其制备量远高于传统外泌体；

2.相同AMSC细胞数下，其总蛋白浓度远高于传统外泌体；

3.相同剂量下，所述的类外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果；

4.有效治疗剂量下，制备类外泌体所需AMSC细胞数可少至制备传统外泌体的10％。

附图说明

图1：AMSC类外泌体(AMSC-miExo)得率：

左：1×10⁷的AMSC细胞制备所得AMSC-miExo和AMSC-Exo的颗粒数；右：1×10⁷的AMSC细胞制备所得AMSC-miExo和AMSC-Exo的量(按蛋白量计算)。**P＜0.01。

图2：AMSC-miExo对巨噬细胞表型的影响：

低剂量条件下，AMSC-miExo能显著影响巨噬细胞表型相关分子mRNA表达水平，而AMSC-Exo几无作用。ns无统计学差异，**P＜0.01。

图3：AMSC-miExo对巨噬细胞自噬和线粒体自噬的影响：

低剂量条件下，AMSC-miExo能显著促进巨噬细胞自噬及线粒体自噬，而AMSC-Exo几无作用。ns无统计学差异，*P＜0.05，**P＜0.01。

图4：AMSC-miExo对巨噬细胞程序性坏死的影响：

低剂量条件下，AMSC-miExo能显著抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞程序性坏死(坏死性凋亡)，而AMSC-Exo几无作用。ns无统计学差异，**P＜0.01。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明提供的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，至少包括如下步骤：

在一种实施方式中，对所述脂肪来源的间充质干细胞进行稀释的试剂选自生理盐水、PBS、D-PBS、Hanks、D-Hanks、HEPES缓冲液、Earle平衡盐溶液(EBSS)中的一种或多种。

所述脂肪来源的间充质干细胞稀释后的细胞浓度为2×10⁵-1×10⁸cells/mL，可选的，为5×10⁶cells/mL。

在一种实施方式中，步骤(1)中，挤出时所述脂肪来源的间充质干细胞依次通过孔径为2-10μm、0.8-1.5μm、300-600nm和150-250nm的挤出膜。

可选的，步骤(1)中，挤出时所述脂肪来源的间充质干细胞依次通过孔径为5μm、1μm、400nm和200nm的挤出膜。

在一种实施方式中，步骤(1)中，利用聚碳酸酯膜过滤器进行挤出。

在一种实施方式中，步骤(2)中，所述梯度分离液的浓度梯度为42-63％和6-17％。

可选的，步骤(2)中，所述梯度分离液的浓度梯度为50％和10％。

可选的，所述梯度分离液选自OptiPrep。

在一种实施方式中，步骤(2)中，离心的条件为3-25℃，80 000-200 000g，2-12h。

可选的，步骤(2)中，离心的条件为4℃，100000g，3h。

在一种实施方式中，步骤(3)中，离心的条件为3-25℃，80 000-200 000g，1-12h。

可选的，步骤(3)中，离心的条件为4℃，100000g，3h。

在一种实施方式中，步骤(3)中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：

a.对脂肪来源的间充质干细胞进行培养，当脂肪来源的间充质干细胞增殖到80％融合时，进行消化、传代，收集第3-8代脂肪来源的间充质干细胞；

b.将不含外泌体血清的培养基加入到所述第3-8代脂肪来源的间充质干细胞中，进行培养，收集细胞上清；

c.采用超速离心法对所述细胞上清进行处理，得到所述脂肪来源间充质干细胞外泌体。

在一种实施方式中，所述超速离心法包括如下步骤：

1)对所述细胞上清进行离心，离心条件为4℃，300g，10分钟，得到上清液1和沉淀1；

2)对上清液1进行离心，离心条件为4℃，2 000g，10分钟，得到上清液2和沉淀2；

3)对上清液2进行离心，离心条件为4℃，10 000g，30分钟，得到上清液3和沉淀3；

4)对上清液3进行离心，离心条件为4℃，100 000-200 000g，70分钟，得到上清液4和沉淀4；

5)用PBS重悬沉淀4后进行离心，离心条件为4℃，100 000-200 000g，70分钟，得到上清液5和沉淀5；所述沉淀5即为所述脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-Exo)。

本发明提供的脂肪来源间充质干细胞类外泌体，采用前述制备方法制成。

本发明提供前述脂肪来源间充质干细胞类外泌体在制备肝病治疗药物中的应用。优选的，所述肝病选自急慢性肝损伤、病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝衰竭、肝纤维化和肝硬化中的一种或多种。

本发明还公开了AMSC-miExo在制备肝病治疗药物中有以下优势：

在相同外泌体剂量(浓度)及制备所需AMSC细胞数条件下，较之传统AMSC-Exo，AMSC-miExo具备以下作用中的任一项或多项：可更为有效地(1)降低血清ALT、AST水平；(2)降低血清炎症因子水平；(3)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死程度；(4)减少肝细胞脂肪变性，减少肝组织炎性细胞浸润；(5)延缓及阻滞肝纤维化，促进肝脏病理恢复；(6)下调肝脏炎症通路；(7)调控巨噬细胞表型；(8)抑制巨噬细胞炎症因子分泌；(9)促进巨噬细胞自噬；(10)促进巨噬细胞线粒体自噬；(11)减少巨噬细胞程序性坏死(坏死性凋亡)。优选地，所述肝脏炎症性疾病包括但不限于肝损伤、肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化。

AMSC-miExo药物制剂的有效剂量可低至5mg/kg(较之传统AMSC-Exo降低约4倍)；达到有效治疗剂量的AMSC-miExo，制备其所需的AMSCs细胞数，较之制备传统AMSC-Exo可缩减至近10％。因而可极大减少制备类外泌体制剂所需的供体细胞量，提升其在肝病临床治疗中的应用潜能。

通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与AMSC-miExo相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

本发明还提供前述脂肪来源间充质干细胞类外泌体在制备具有以下任一种或多种作用的制剂中的用途：(1)促进巨噬细胞自噬；(2)降低血清ALT、AST水平；(3)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶及坏死性凋亡通路相关分子表达；(4)降低血清IL-1β、IL-33和HMGB1水平；(5)降低肝衰竭死亡率；(6)降低血清TG、TC；(7)减少肝细胞脂肪变性比例；(8)减少肝组织炎性细胞浸润；(9)降低血清HA、P-III-P；(10)减少肝细胞变性；(11)降低胶原纤维沉积；(12)减少肝组织炎症信号通路相关蛋白表达；(13)降低LPS刺激所导致的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-33、TNF-α和HMGB1的分泌；(14)降低PI阳性的细胞比例；(15)下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

缩写说明：AMSC-miExo：脂肪来源间充质干细胞类外泌体

AMSC-Exo：脂肪来源间充质干细胞外泌体

实施例1 AMSC-miExo制备分别采用1×10⁷的AMSC细胞进行AMSC-miExo和AMSC-Exo制备：

按专利ZL 201310390760.3中提到的方法制备脂肪来源的间充质干细胞(AMSCs)，AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代的AMSCs，将3～8代的AMSCs行换液培养，该培养液(培养液包括如下组分：无酚红DMEM低糖培养基，1mM的L-谷氨酰胺，1％的非必需氨基酸，1％的青链霉素，溶剂为水)中添加不含外泌体的血清。以该培养液培养48h后，收集细胞上清，采用超速离心法制备AMSC-Exo。同时用细胞刮收集AMSCs，PBS洗涤后，制备细胞悬液(5×10⁶cells/mL)。然后用Avanti Polar Lipids公司的Mini-extruder设备进行类外泌体的制备：细胞悬液通过5μm、1μm、400nm和200nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器(Whatman)进行逐级挤出；用50％和10％的OptiPrep(Axis-Shield)配制密度梯度溶液，然后将挤出液置于OptiPrep梯度溶液中进行超速离心(4度，100000g，3h)；无刹车缓慢降速后，收集中间层组分再次超速离心(4度，100000g，3h)，所得沉淀即为AMSC-miExo。

制备后采用NTA分析其粒径和数目；采用电镜分析其大小；采用CD63、CD9的Western Blot检测其表型分子；采用Bradford reagent分析其蛋白浓度。

结果显示，AMSC-Exo粒径117.6±29.8nm，AMSC-miExo粒径127.6±37.5nm，两者具有类似的大小；并且均表达exosome的标志物CD63和CD9分子；1×10⁷的AMSCs可制备0.74×10⁹的AMSC-Exo，可制备3.43×10⁹的AMSC-miExo，AMSC-miExo颗粒数可达AMSC-Exo的4倍有余(相同细胞数条件下)；蛋白定量结果表明，1×10⁷的AMSCs可制备1.28±0.24mg总蛋白量的AMSC-Exo，可制备7.49±1.41mg总蛋白量的AMSC-miExo，相同细胞数条件下，AMSC-miExo蛋白量可达AMSC-Exo的近6倍。

实施例2 AMSC-miExo对小鼠急性肝衰模型的疗效

C57小鼠腹腔注射LPS/GalN(10μg/kg的LPS+400mg/kg的D-GalN)建立半致死量的急性肝衰竭模型。造模后即刻尾静脉输注梯度剂量(5mg/kg、20mg/kg)的AMSC-miExo和AMSC-Exo，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。造模6h后，处死小鼠并收集血清、肝组织等进行肝功能、肝脏病理、炎症因子、肝组织程坏死性凋亡等检测。血清ALT、AST检测分别采用FUJI DRI-CHEM Slide GFP/ALT-PIII和GOT/AST-PIII试剂盒，用DRI-CHEM 4000ie(FUJIFILM)测定。肝脏病理采用HE检测。血清炎症因子采用相应ELISA试剂盒进行检测。肝组织坏死性凋亡采用Western Blot检测相关分子(p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL)水平。

结果显示，相同常规剂量条件下(20mg/kg)，AMSC-miExo对小鼠急性肝损伤的疗效显著优于AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平(表1)；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶及坏死性凋亡通路相关分子表达；降低血清IL-1β、IL-33和HMGB1水平(表2)。并且在低剂量条件下(5mg/kg)，AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-miExo输注仍能明显改善肝功能、肝脏病理。

表1

注：数值为MEAN±SE；a—同剂量的AMSC-Exo与AMSC-miExo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。

表2

分别采用2×10⁷的AMSC细胞，参照实施例1进行AMSC-miExo和AMSC-Exo制备，然后分别尾静脉输注上述LPS/GalN诱导的急性肝衰竭模型(每组3只，即每只输注1×10⁷细胞所得exosome的1/3量)，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。结果显示，该剂量条件下，AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-miExo输注则能明显改善肝功能、肝脏病理。并且，采用2×10⁶的AMSC细胞制备所得AMSC-miExo，按上述方案输注急性肝衰竭模型后仍能明显改善肝功能、肝脏病理。表明在有效治疗剂量条件下，制备类外泌体所需AMSC细胞数可少至制备传统外泌体的10％。

C57小鼠腹腔注射LPS/GalN(30μg/kg的LPS+800mg/kg的D-GalN)建立致死剂量的急性肝衰模型。造模后即刻尾静脉输注梯度剂量(5mg/kg、20mg/kg)的AMSC-miExo和AMSC-Exo，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，每组10只小鼠。造模6h后，观察小鼠死亡率。Vehicle组死亡率达100％，AMSC-Exo(5mg/kg)治疗组死亡率也为100％，AMSC-Exo(20mg/kg)和AMSC-miExo(5mg/kg)治疗组的死亡率均为70％，AMSC-miExo(20mg/kg)治疗组的死亡率仅20％。可见AMSC-miExo可有效降低肝衰竭死亡率，达到相似疗效的剂量仅需AMSC-Exo组的1/4。

在APAP、CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤模型中，同样显示AMSC-miExo具有更好的疗效，并且其发挥疗效的有效剂量远低于AMSC-Exo。

实施例3 AMSC-miExo对小鼠脂肪肝模型的疗效

小鼠采用胆碱蛋氨酸缺乏饲料(methionine-choline deficient，MCD)喂养建立脂肪肝模型，梯度剂量(5mg/kg、20mg/kg)的AMSC-miExo和AMSC-Exo分别尾静脉输注C57小鼠，每周注射2次；并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。8周后处死小鼠，收集血清和肝组织，进行生化指标、肝脏病理等分析检测。血清ALT、AST及肝脏病理检测同实施例2。甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)采用全自动生化仪分析。结果显示，相同常规剂量下(20mg/kg)，AMSC-miExo对小鼠非酒精性脂肪肝的疗效显著优于AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清TG、TC(表3)；减少肝细胞脂肪变性比例，减少肝组织炎性细胞浸润；降低血清ALT、AST水平(表4)。并且在低剂量条件下(5mg/kg)，AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-miExo仍能明显改善生化指标及肝脏病理。

表3

表4

实施例4 AMSC-miExo对小鼠肝纤维化模型的疗效

C57小鼠，采用浓度50％(体积百分比浓度，即CCl₄：橄榄油＝1:1)CCl₄，按1ml/kg进行腹腔注射，每周2次，共6周造模成功。于CCl₄第四次注射后24h，尾静脉输注梯度剂量(5mg/kg、20mg/kg)的AMSC-miExo和AMSC-Exo，每周注射2次；并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。造模6周后处死小鼠，收集血清和肝组织，进行生化指标、肝脏病理、Western Blot等分析检测。血清ALT、AST及肝脏病理检测同实施例2，血清透明质酸(hyaluronic acid,HA)和III型前胶原肽(procollagen III-N-peptide,P-III-P)采用放射免疫法检测。结果显示，相同常规剂量下(20mg/kg)，AMSC-miExo抗肝纤维化的疗效显著优于AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清HA、P-III-P、ALT和AST水平(表5)；减少肝细胞变性，降低胶原纤维沉积和肝组织炎性细胞浸润；减少肝组织炎症信号通路(如NLRP3炎性小体、NF-κB信号通路、Jak/Stat信号通路等)相关蛋白表达。并且在低剂量条件下(5mg/kg)，AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-miExo仍能明显改善生化指标及肝脏病理。

表5

实施例5 AMSC-miExo对巨噬细胞表型和功能的调控作用

AMSC-miExo调控巨噬细胞表型：

巨噬细胞RAW264.7中分别加入等浓度(5μg/mL)的AMSC-miExo和天然AMSC-Exo，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，24h后收集细胞，进行巨噬细胞表型相关分子的qPCR分析。结果显示，相同浓度条件下，AMSC-miExo较之AMSC-Exo，能更为显著地上调巨噬细胞M2表型相关分子Arg1和Fizz-1的表达，而下调M1表型相关分子CD86和iNOS的表达(图2)。

AMSC-miExo调控巨噬细胞炎性因子分泌：

巨噬细胞RAW264.7中分别加入等浓度(5μg/mL)的AMSC-miExo和天然AMSC-Exo处理24h，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)；再以LPS(100ng/mL)刺激12h，然后采用ELISA检测细胞上清IL-1β、TNF-α、IL-33和HMGB1水平。结果显示，相同浓度条件下，AMSC-miExo较之AMSC-Exo，能更为显著地降低LPS刺激所导致的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-33、TNF-α和HMGB1的分泌。

AMSC-miExo促进巨噬细胞自噬和线粒体自噬：

巨噬细胞RAW264.7中分别加入等浓度(5μg/mL)的AMSC-miExo和天然AMSC-Exo，24h后收集细胞，进行细胞自噬和线粒体自噬相关分子的Western Blot检测，WB条带采用ChemiScope Western Blot Imaging System(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。结果显示，相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Exo，能更为显著地促进巨噬细胞自噬和线粒体自噬，具体表现为上调自噬相关分子LC3Ⅱ/Ⅰ比例，下调p62水平，上调Atg5水平，同时上调线粒体自噬相关分子PARKIN和PINK1水平(图3)。

在经PMA诱导的THP-1或U937来源的巨噬细胞中加入AMSC-miExo和天然AMSC-Exo，同样也具有上述效应。

AMSC-miExo抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞程序性坏死

U937细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，分别加入等浓度(5μg/mL)的AMSC-miExo和天然AMSC-Exo预处理24h，再以TNF-α/zVAD诱导细胞坏死。作用2h后收集细胞，进行细胞坏死相关分子的Western Blot检测，WB条带采用ChemiScope Western Blot Imaging System(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。并在作用6h后收集细胞，进行PI流式检测。结果显示，相同浓度条件下，AMSC-XIST-Exo较之AMSC-Exo，能更为显著地抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞坏死，具体表现为降低PI阳性的细胞比例，下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例(图4)。

实施例6

本发明还参照实施例1，对其他方法制了AMSC-miExo，并参照实施例2-5进行表征。

方法1、与实施例1的区别在于，制备的细胞悬液浓度为(2×10⁵cells/mL)。然后用Avanti Polar Lipids公司的Mini-extruder设备进行类外泌体的制备：细胞悬液通过2μm、0.8μm、300nm和150nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器(Whatman)进行逐级挤出；用42％和6％的OptiPrep(Axis-Shield)配制密度梯度溶液，然后将挤出液置于OptiPrep梯度溶液中进行超速离心(3℃，80 000g，12h)；无刹车缓慢降速后，收集中间层组分再次超速离心(3℃，80000g，12h)，所得沉淀即为AMSC-miExo。其余皆相同。

方法2、与实施例1的区别在于，制备的细胞悬液浓度为1×10⁸cells/mL)。然后用Avanti Polar Lipids公司的Mini-extruder设备进行类外泌体的制备：细胞悬液通过10μm、1.5μm、600nm和250nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器(Whatman)进行逐级挤出；用63％和17％的OptiPrep(Axis-Shield)配制密度梯度溶液，然后将挤出液置于OptiPrep梯度溶液中进行超速离心(25℃，200 000g，2h)；无刹车缓慢降速后，收集中间层组分再次超速离心(25℃，200 000g，1h)，所得沉淀即为AMSC-miExo。其余皆相同。

方法3、与实施例1的区别在于，制备的细胞悬液浓度为3×10⁷cells/mL)。然后用Avanti Polar Lipids公司的Mini-extruder设备进行类外泌体的制备：细胞悬液通过8μm、1.2μm、500nm和180nm孔径的聚碳酸酯膜过滤器(Whatman)进行逐级挤出；用55％和12％的OptiPrep(Axis-Shield)配制密度梯度溶液，然后将挤出液置于OptiPrep梯度溶液中进行超速离心(10℃，120 000g，6h)；无刹车缓慢降速后，收集中间层组分再次超速离心(10℃，120 000g，6h)，所得沉淀即为AMSC-miExo。其余皆相同。

参照实施例2-5对方法1-3得到的AMSC-miExo分别进行表征，结果均表明，采用以上方法，相同AMSC细胞数下，其制备量远高于传统外泌体；相同AMSC细胞数下，其总蛋白浓度远高于传统外泌体；相同剂量下，所述的类外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果；有效治疗剂量下，制备类外泌体所需AMSC细胞数可少至制备传统外泌体的10％。并均具有以下作用：(1)促进巨噬细胞自噬；(2)降低血清ALT、AST水平；(3)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶及坏死性凋亡通路相关分子表达；(4)降低血清IL-1β、IL-33和HMGB1水平；(5)降低肝衰竭死亡率；(6)降低血清TG、TC；(7)减少肝细胞脂肪变性比例；(8)减少肝组织炎性细胞浸润；(9)降低血清HA、P-III-P；(10)减少肝细胞变性；(11)降低胶原纤维沉积；(12)减少肝组织炎症信号通路相关蛋白表达；(13)降低LPS刺激所导致的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-33、TNF-α和HMGB1的分泌；(14)降低PI阳性的细胞比例；(15)下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法至少包括如下步骤：

(1)将脂肪来源的间充质干细胞稀释后进行挤出，得到挤出液，挤出时所述脂肪来源的间充质干细胞依次通过孔径为2-10μm、0.8-1.5μm、300-600nm和150-250nm的挤出膜；

(2)将所述挤出液置于梯度分离液中进行离心，离心的条件为3-25℃，80 000-200000g，2-12h，无刹车降速，得到分层的混合液，所述分层的混合液包括上层组分、中间层组分和下层组分；所述梯度分离液的浓度梯度为42-63％和6-17％；所述梯度分离液选自OptiPrep；

(3)收集中间层组分，混入脂肪来源间充质干细胞外泌体，离心，离心的条件为3-25℃，80 000-200 000g，1-12h，所得沉淀即为脂肪来源间充质干细胞类外泌体。

2.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，挤出时所述脂肪来源的间充质干细胞依次通过孔径为5μm、1μm、400nm和200nm的挤出膜。

3.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，利用聚碳酸酯膜过滤器进行挤出。

4.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述梯度分离液的浓度梯度为50％和10％。

5.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于：还包括以下特征中的一项或多项：

1)步骤(2)中，离心的条件为4℃，100000g，3h；

2)步骤(3)中，离心的条件为4℃，100000g，3h。

6.根据权利要求1所述的脂肪来源间充质干细胞类外泌体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述脂肪来源间充质干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：

b.将含血清的培养基加入到所述第3-8代脂肪来源的间充质干细胞中，进行培养，所述培养基中的血清不含外泌体，收集细胞上清；

7.如权利要求1-6任一所述的方法制备的脂肪来源间充质干细胞类外泌体在制备肝病治疗药物中的应用，所述肝病选自急慢性肝损伤、病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、肝衰竭、肝纤维化和肝硬化中的一种或多种。