CN109913397B - 产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物和使用该微生物制备5′-黄苷一磷酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及产生5′‑黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物和使用该微生物产生5′‑黄苷一磷酸的方法。

Description

产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物和使用该微生物 制备5′-黄苷一磷酸的方法
技术领域
本公开内容涉及产生5′-黄苷一磷酸的微生物和使用该微生物制备5′-黄苷一磷酸的方法。
背景技术
5′-黄苷一磷酸(XMP)不仅在动物和植物中作为核酸生物合成和代谢***的中间体具有生理学意义，而且具有多种用途：食品、药物和多种医疗用途。特别是，当与谷氨酸一钠(MSG)一起使用时，在增强风味方面存在协同效应。因此，XMP是作为调味品引起关注的基于核酸的风味增强剂之一。
此外，5′-黄苷一磷酸是嘌呤核苷酸生物合成代谢的中间体，并且是产生5′-鸟苷一磷酸(GMP)的重要原料。制备具有高商业价值并且影响增加味觉强度的鸟苷一磷酸的公知方法是微生物的发酵，该方法涉及产生5′-黄苷一磷酸并将其酶促转化为5′-鸟苷一磷酸。由于该方法是最经济的，因此5′-黄苷一磷酸存在与5′-鸟苷一磷酸差不多的需求。
已知的制备5′-黄苷一磷酸的方法有：(1)化学合成，(2)脱氨基制备5′-黄苷一磷酸，(3)通过在培养基中加入黄嘌呤作为前体而发酵产生，(4)产生5′-黄苷一磷酸的微生物的突变菌株的直接发酵等。在这些方法中，通过突变微生物菌株直接发酵产生5′-黄苷一磷酸在经济上是最有利的。然而，仍然需要研究以高产率产生5′-黄苷一磷酸的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明人为开发能够以高产率产生5′-黄苷一磷酸的微生物进行了大量努力，结果他们发现，当特定蛋白质的活性增强时，5′-黄苷一磷酸的产率增加，从而完成了本公开内容。
[技术方案]
本公开内容的一个目的是提供产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性得到增强。
本公开内容的另一个目的是提供使用该微生物产生5′-黄苷一磷酸的方法。
[有益效果]
本公开内容的棒状杆菌属的微生物具有增强的输出5′-黄苷一磷酸的蛋白质活性，从而增加了5′-黄苷一磷酸的产量，并且这可以有助于显著降低5′-黄苷一磷酸的生产成本。
具体实施方式
在下文中，更详细地描述了本公开内容。同时，本公开内容中公开的每个描述和示例性实施方案可以应用于其他描述和示例性实施方案。即，本公开内容中公开的各种要素的所有组合落入本公开内容的范围内。另外，本公开内容的范围不能被解释为受以下具体描述的限制。
作为实现上述目的的一个方面，本公开内容提供了产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性得到增强。
本文所用的术语“5′-黄苷一磷酸”是指被称为5′-黄苷酸、黄苷等的化合物。在本公开内容中，5′-黄苷一磷酸可与“XMP”互换使用。
本文所用的术语“包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质”是指内源地存在于棒状杆菌属的微生物中的蛋白质，该蛋白质由从该微生物输出5′-黄苷一磷酸的主要协助超家族转运蛋白(MFS转运蛋白)基因进行编码。具体地，该蛋白质可以是包含氨基酸序列SEQ IDNO：2的MFS转运蛋白，该MFS转运蛋白内源地存在于棒状杆菌属的微生物中。此外，该蛋白质可以是由氨基酸序列SEQ ID NO：2组成或构成的蛋白质，但不限于此。本公开内容中的MFS转运蛋白可称为“xmpE”或“xmpE蛋白”。
只要本文所用的“包含特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白质”与包含相同SEQ IDNO的蛋白质具有相同的或一致的活性，其可包括在氨基酸序列末端的前面添加不改变蛋白质功能的序列；自然发生的突变；或其沉默突变。显而易见的是，蛋白质具有这种序列添加或突变的情况也包括在本公开内容的范围内。
此外，本公开内容的蛋白质可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但也包含与SEQID NO：2具有至少60％同源性或一致性的氨基酸序列。包含与SEQ ID NO：2具有至少60％同源性或一致性的氨基酸序列的蛋白质可以是包含与SEQ ID NO：2具有至少60％，特别是70％，更特别是80％，甚至更特别是83％、84％、85％、88％、90％、93％、95％或97％同源性或一致性的氨基酸序列的蛋白质。具有同源性或一致性的氨基酸序列可以将具有100％一致性的氨基酸序列排除在所述范围之外或者可以是具有小于100％的一致性的氨基酸序列。显然，即使部分序列发生了氨基酸序列的缺失、修饰、置换或添加，只要作为具有序列同源性或一致性的序列的氨基酸序列基本上与SEQ ID NO：2具有相同或一致的生物学活性，则该氨基酸序列包括在本发明的范围内。
另外，可以从已知的数据库如NCBI GenBank获得编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的基因的核苷酸序列，但不限于此。具体地，包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质可以由包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的基因、以及由核苷酸序列SEQ ID NO：1组成或构成的基因编码，但不限于此。
此外，核苷酸序列SEQ ID NO：1不仅可以包括SEQ ID NO：1的核苷酸序列本身，还可以包括与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性或一致性的核苷酸序列。
具体地，任何能够编码与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性或一致性的氨基酸序列的核苷酸序列包括在本公开内容的范围内，而所述蛋白质可以由包含与SEQ ID NO：1具有至少80％，特别是83％、84％、85％、88％、90％、93％、95％或97％同源性或一致性的核苷酸序列的基因编码。然而，显而易见的是，本公开内容的范围内包括但不限于这样的核苷酸序列：只要其编码的蛋白质与包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质具有一致的活性。
另外，显而易见的是，由于遗传密码简并性，可翻译成包含相同氨基酸序列的蛋白质或与其具有同源性或一致性的蛋白质的多核苷酸可包括在本公开内容的范围内。此外，可以包括但不限于可以通过在严格条件下使全部或部分核苷酸序列与其互补序列杂交而由已知的基因序列进行制备的探针，该已知的基因序列例如为编码具有包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性的蛋白质的任何序列。“严格条件”是指使多核苷酸之间能够进行特异性杂交的条件。在参考文献中详细描述了这些条件(J.Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press，ColdSpring Harbor，New York，1989)；例如，使具有至少40％、特别是85％、特别是90％、更特别是95％、更特别是97％、尤其特别是99％的高同源性或一致性的基因杂交并且使具有较低同源性或一致性的基因不杂交的条件；或常规Southern杂交的条件，即在相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS，特别是60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，更特别是68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的温度和盐浓度下洗涤一次，特别是洗涤两次至三次。尽管根据严格程度，杂交可能存在碱基之间的错配，但是要求两个核酸具有彼此互补的序列。本文所用的术语“互补”用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开内容还可以包括不仅与基本上相似的核酸序列互补还与整个序列互补的单独核酸片段。
具体地，可以使用杂交条件检测具有同源性或一致性的多核苷酸，该杂交条件包括Tm值为55℃的杂交步骤和上述条件。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且Tm值可以由本领域技术人员适当地调整。
多核苷酸杂交的适当的严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且变量在相应的技术领域中是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
本文所用的术语“同源性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的一致性程度，并且可以用百分比表示。在本说明书中，与给定的氨基酸序列或多核苷酸序列具有相同或相似活性的同源性序列可以用“％同源性”表示。
本文所用的术语“一致性”是指氨基酸或核苷酸序列之间的序列相关性程度，并且在一些情况下，它可以通过这些序列之间的匹配来确定。
术语“同源性”和“一致性”通常彼此互换使用。
可以通过标准比对算法并同时使用由所用的程序建立的默认空位罚分来确定保守多核苷酸或多肽的序列同源性或一致性。基本上，在中度或高度严格程度下，通常预期同源或一致的多核苷酸或多肽与所有的或目标的多核苷酸或多肽的全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％杂交。还考虑了含有代替杂交多肽中的密码子的简并密码子的多核苷酸。
可以使用已知的计算机算法如使用默认参数的“FASTA”程序(例如，Pearson等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)来确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性或一致性。或者，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来确定，该算法在EMBOSS程序包的Needleman程序中执行(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)(优选地，5.0.0版本或更高版本)。包括GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，[S.][F.，]等人，J MOLEC BIOL 215]：403(1990)；Guide to Huge Computers，MartinJ.Bishop，[编]Academic Press，San Diego，1994，和[CARILLO ETA/.](1988)SIAM JApplied Math 48：1073)。例如，可以使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定同源性或一致性。
可以通过比较公布的序列信息(例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math(1981)2：482)，例如，使用Needleman等人(1970)，J Mol Biol.48：443中公开的GAP计算机程序来确定多核苷酸或多肽的同源性或一致性。总之，GAP程序将同源性或一致性定义为通过将相似比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的符号的总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)一元比较矩阵(包含一致时为1和不一致时为0的值)和Gribskov等人(1986)，Nucl.Acids Res.14：6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，第353至358页，1979中所公开的；(2)每个空位罚分为3.0且每个空位中的每个符号额外罚分0.10(或，空位开放罚分为10且空位延伸罚分为0.5)；和(3)末端空位无罚分。因此，本文所用的术语“同源性”或“一致性”是指多肽或多核苷酸之间的相关性。
本公开内容中产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物可以使包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性增强。
包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性增强可以与xmpE的活性增强或由包含核苷酸序列SEQ ID NO：1的基因编码的蛋白质的活性增强互换使用。
本文所用的术语“包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的活性增强”是指与其亲本菌株相比蛋白质的表达增强或与未修饰的菌株相比包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质的表达增强；在相同的表达量下其活性增强；或其活性和表达增强。该术语还指蛋白质的活性与其内源活性相比增强，并且与亲本菌株或其未修饰菌株相比xmpE的表达或活性增强。
在本公开内容中，可以通过应用本领域已知的各种方法来实现蛋白质活性的增强。例如，可以通过增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、增强启动子活性、起始密码子的置换或其组合来实现活性的增强；具体而言，1)增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数；2)修饰表达调节因子(启动子、操纵子等)的序列，以增加多核苷酸的表达；3)修饰染色体上的基因(起始密码子等)的序列，以增强蛋白质的活性，或其组合，但不限于此。
具体地，可以通过应用本领域已知的各种方法来实现修饰表达调节因子序列的方法，以使蛋白质的活性增强。例如，可以通过在调节序列中引入缺失、***或非保守或保守置换、或其组合的修饰；或者用具有更高活性的核苷酸序列置换所述核苷酸序列来进行修饰以增强表达调节因子序列的活性。表达调节因子包括启动子、增强子、操纵子、核糖体结合位点以及调节转录终止和翻译终止的序列，但不限于此。
此外，可以通过在序列中引入缺失、***或非保守或保守置换、或其组合的修饰；或者用具有更高活性的基因序列置换所述基因序列来进行用于修饰基因序列的方法，但不限于此。
在具体的示例性实施方案中，可以通过增加xmpE的拷贝数；用另一种具有增强活性的启动子置换xmpE的启动子；置换xmpE的起始密码子；或其组合来实现蛋白质活性的增强。
本文所用的术语“载体”是指包含编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列以在合适的宿主中表达目标蛋白的DNA构建体，该目标蛋白可操作地连接至适当的调控序列。调控序列可以包括能够起始转录的启动子、控制转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录终止和翻译终止的序列。载体可以转染到合适的宿主中，然后可以独立于宿主基因组进行复制或运作，并且可以整合到基因组本身中。
本文所用的术语“转化”是指将包含编码目标蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白质可在宿主细胞中表达。只要它可以在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸可以整合到并置于宿主细胞的染色体中或者位于染色体外。此外，多核苷酸包括编码目标蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸可以被引入宿主细胞并在其中表达，则可以以任何形式引入多核苷酸。例如，可以以表达组件的形式将多核苷酸引入宿主细胞中，该表达组件是包含其自主表达所需的所有元件的多核苷酸构建体。表达组件可以包含与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达组件可以是可自我复制的表达载体的形式。另外，多核苷酸可以原样引入宿主细胞中，并且可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。
本文所用的术语“产生5′-黄苷一磷酸的微生物”或“具有产生5′-黄苷一磷酸的能力的微生物”是指天然具有产生5′-黄苷一磷酸的能力的微生物或不具有产生5′-黄苷一磷酸的能力的亲本菌株被赋予了产生5′-黄苷一磷酸的能力的微生物。具体地，该微生物可以是具有产生5′-黄苷一磷酸的能力的微生物，其中包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质或xmpE蛋白的活性得到增强。
此外，考虑到本公开内容的目的，由于输出5′-黄苷一磷酸的能力的增强，微生物产生5′-黄苷一磷酸的能力得到改善/增强。
具体地，术语“产生……的能力”和“输出……能力”可以互换使用。此外，微生物可以与“输出5′-黄苷一磷酸的微生物”或“具有输出5′-黄苷一磷酸的能力的微生物”互换使用。它可以指天然具有输出5′-黄苷一磷酸的能力的微生物或不具有输出5′-黄苷一磷酸的能力的亲本菌株被赋予了输出5′-黄苷一磷酸的能力的微生物。
具体地，产生5′-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物可以是停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)；更具体地可以是停滞棒状杆菌，但不限于此。
另一方面，本公开内容提供了产生5′-黄苷一磷酸的方法，其包括在培养基中培养棒状杆菌属的微生物；以及从微生物或培养基中回收5′-黄苷一磷酸。
本发明的微生物和5′-黄苷一磷酸与前述相同。
本公开内容中的棒状杆菌属微生物可以是停滞棒状杆菌，但不限于此。
对于本公开内容的方法，可以使用本领域已知的任何培养条件和方法来培养棒状杆菌属的微生物。
本文所用的术语“培养”是指在适度人工控制的环境条件下进行的微生物培养。本公开内容的培养过程可以根据本领域已知的合适培养基和培养条件进行。此外，培养方法包括分批培养、连续培养和补料分批培养；具体地，可以连续进行分批过程或补料分批过程或重复补料分批过程的培养，但培养方法不限于此。
用于培养的培养基应以适当的方式满足特定菌株的要求。用于棒状杆菌属微生物的培养基是本领域已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriology by theAmerican Society for Bacteriology，Washington D.C.，USA，1981)。
具体地，可用于培养基的糖源包括糖类和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等；油类和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等；甘油；醇类，如乙醇；以及有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用，但不限于此。
可使用的碳源可以是粗蔗糖或葡萄糖、或含有大量蔗糖的糖蜜；具体而言，可以是纯化的葡萄糖，但不限于此。可以使用其他各种碳源。
可以使用的氮源包括蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或作为混合物使用，但不限于此。
可以使用的磷酸盐源包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
此外，培养基可以含有金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。除了上述材料之外，还可以使用必需的生长物质，例如氨基酸和维生素。培养基中也可以使用适当的前体。上述原料可以以适当的方式分批或连续地添加到培养箱中。
培养基的pH可以以适当的方式通过使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨来调节；或者使用酸性化合物如磷酸和硫酸来调节。另外，可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫形成。可以将氧气或含氧气体(例如空气)注入培养基中以维持好氧条件。
具体地，培养温度通常为30℃至37℃，更具体地为32℃至33℃。可以连续培养直至获得所需量的5′-黄苷一磷酸，而具体地可以持续进行40小时至120小时。
可以通过例如离心、过滤、离子交换色谱法、结晶等本领域已知的常规方法从培养物中分离5′-黄苷一磷酸。例如，可以对培养物进行低速离心以除去生物质，然后，可以通过离子交换色谱法分离所得上清液。然而，分离不限于此。
回收步骤还可以包括纯化过程。
发明的实施方式
在下文中，通过参考以下示例性实施例将更详细地描述本公开内容。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本公开内容不旨在受这些实施例的限制。
实施例1：输出5′-黄苷一磷酸(XMP)的蛋白的发现
为了鉴定参与XMP输出的棒状杆菌的膜蛋白，制备了停滞棒状杆菌(ATCC6872)的基因组DNA文库。使用Intron公司的G-spin Total DNA Extraction Minin Kit(目录号17045)，根据其中提供的方案提取ATCC6872菌株(即野生型停滞棒状杆菌)的基因组DNA。使用提取的基因组DNA作为模板制备膜蛋白文库。
为了研究哪种蛋白质具有输出功能，将制备的基因组DNA文库导入用作亲本菌株的韩国专利第10-2011-0105662号中的棒状杆菌KCCM-10530菌株中。
然后将XMP另外加入至含有1.7％琼脂的基本培养基中以建立使KCCM-10530菌株显示出生长抑制的筛选条件。通过电穿孔将ATCC6872菌株的膜蛋白的基因组文库质粒转化到KCCM-10530菌株中，并选择在向培养基中加入过量XMP的条件下正常生长的菌落。从所选择的菌落中获得质粒，并通过核苷酸序列分析方法来分析其核苷酸序列。在上述实验中鉴定了一种膜蛋白，该膜蛋白参与在加入过量XMP的条件下解除生长抑制的过程。
证实棒状杆菌膜蛋白具有核苷酸序列SEQ ID NO：1和氨基酸序列SEQ ID NO：2(NCBI GenBank：NZ_CP014279.1，WP_066795121，MFS转运蛋白)。该膜蛋白被称为MFS转运蛋白，但其功能尚未明确鉴定。此外，还不知道其具有输出XMP的功能。在本公开内容中，该膜蛋白被命名为“xmpE”。
实施例2：xmpE的鉴定
实施例2-1：xmpE缺陷型载体的制备
制备缺陷型载体以确认当从产生XMP的菌株中删除在实施例1中鉴定的、参与解除由XMP导致的生长抑制的蛋白质xmpE时，输出XMP的能力是否降低。
使用作为亲本菌株的ATCC6872菌株的基因组DNA进行PCR以获得用于载体制备的基因片段。具体地，使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4对xmpE进行PCR。基于在美国国立卫生研究院(NIH)GenBank(NCBI Genbank：NZ_CP014279.1)中登记的停滞棒状杆菌(ATCC6872)基因及其相关的核苷酸序列的信息制备所使用的引物。
PCR在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个如下循环：94℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃聚合1分钟。然后在72℃下进行最终聚合5分钟。当使用引物SEQ ID NO：3和SEQID NO：4扩增xmpE基因片段时，获得约1.0kbp的多核苷酸模板。使用T载体(Solgent)克隆所获得的基因片段以得到TOPO-ΔxmpE载体。
实施例2-2：xmpE缺陷型菌株的制备
通过电穿孔(使用根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的转化方法)将实施例2-1中制备的载体转化到KCCM-10530菌株中，并从含有25mg/L卡那霉素的培养基中筛选由于同源序列重组而使载体***到染色体上的菌株。将筛选出的xmpE缺陷型菌株命名为“KCCM-10530_ΔxmpE”，并评估其产生XMP的能力。
将亲本菌株停滞棒状杆菌KCCM-10530和菌株KCCM-10530_ΔxmpE接种到包含下述3mL种子培养基的14mL管中，并在30℃下以170rpm振荡培养24小时。然后，将0.7mL量的种子培养物加入到含有32mL的以下产生培养基(24mL主培养基+8mL附加无菌培养基)的相应250mL带挡板三角烧瓶中，然后在30℃下以170rpm振荡培养72小时。进行HPLC分析以测量培养完成后产生的XMP的量。培养基的构成和培养基中XMP浓度的结果如下所示。
XMP基本培养基
2％葡萄糖、0.3％硫酸钠、0.1％磷酸二氢钾、0.3％磷酸氢二钾、0.3％硫酸镁、10mg/L氯化钙、10mg/L硫酸铁、1mg/L硫酸锌、3.6mg/L氯化锰、20mg/L L-半胱氨酸、10mg/L泛酸钙、5mg/L盐酸硫胺素、30μg/L生物素、20mg/L腺嘌呤、20mg/L鸟嘌呤，pH7.3
XMP营养培养基
1％蛋白胨、0.5％牛肉膏、0.25％氯化钠、1％酵母膏、0.3％尿素、50mg/L腺嘌呤、50mg/L鸟嘌呤、2％琼脂，pH 7.2
XMP瓶装种子培养基
20g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨、10g/L酵母膏、2.5g/L氯化钠、3g/L尿素、150mg/L腺嘌呤、150mg/L鸟嘌呤，pH7.0
XMP瓶装产生培养基(主培养基)
50g/L葡萄糖、10g/L硫酸镁、100mg/L氯化钙、20mg/L硫酸铁、10mg/L硫酸锰、10mg/L硫酸锌、0.Smg/L硫酸铜、20mg/L组氨酸、15mg/L半胱氨酸、15mg/Lβ-丙氨酸、100μg/L生物素、5mg/L硫胺素、50mg/L腺嘌呤、25mg/L鸟嘌呤、5mg/L烟酸，pH 7.0
XMP瓶装产生培养基(附加无菌培养基)
18e/L磷酸二氢钾、42g/L磷酸氢二钾、7g/L尿素、5g/L硫酸铵
[表1]
菌株号 XMP(g/L) 产率(％)
KCCM-10530 11.8 23.6
KCCM-10530-ΔxmpE 1.6 3.2
比较亲本菌株KCCM-10530和xmpE缺陷型菌株KCCM-10530-ΔxmpE的培养基中的XMP浓度；结果如上表1所示，在相同条件下，与亲本菌株相比，KCCM-10530-ΔxmpE菌株的XMP浓度降低至少约10g/L。
因此，证实xmpE是参与XMP输出的蛋白质。
实施例3：xmpE蛋白活性的增强
根据实施例，菌株中xmpE蛋白的活性得到增强，并检查了具有增强的xmpE活性的菌株是否增加了其产生/输出XMP的能力。
实施例3-1：xmpE拷贝数的增加
实施例3-1-1：制备xmpE拷贝数增加的载体
为了确认当被预测与XMP输出能力有关的xmpE的活性增强时，输出XMP的能力是否增加，制备了用于增强xmpE基因表达的载体。使用增加拷贝数的方法作为增强方法，进行以下实验。
使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备载体的基因片段。具体地，使用引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6扩增xmpE基因以包含xmpE基因的上游484bp。用限制性内切酶XbaI和SpeI处理扩增的xmpE基因片段。在pDZ载体的XbaI位点(韩国专利第10-0924065号和国际公开第2008-033001号)进行克隆以制备pDZ-xmpE载体。然后使用引物对SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7对xmpE基因进行PCR以制备含有两个拷贝的载体。用DNA限制性内切酶SpeI切割如此获得的每个DNA片段，并克隆到用DNA限制性内切酶XbaI切割的pDZ-xmpE载体中以制备载体。含有两个拷贝的xmpE基因的载体命名为“pDZ-xmpEX2”。
实施例3-1-2：评估xmpE拷贝数增加的菌株产生XMP的能力
通过电穿孔(使用根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的转化方法)将实施例3-1-1中制备的pDZ-xmpEX2载体转化到KCCM-10530菌株中，并从含有25mg/L卡那霉素的培养基中筛选由于同源序列重组而使载体***到染色体上的菌株。通过将筛选出的初代菌株进行二次杂交来筛选***了目标基因的菌株。通过使用引物对SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9进行PCR来确认最终转化的菌株中成功***了基因。将筛选出的xmpE拷贝数增加的菌株命名为“KCCM-10530-xmpEX2”，并评估其产生XMP的能力。为了测量菌株产生XMP的能力，使用与实施例2-2中相同的方法。进行HPLC分析以测量培养完成后产生的XMP的量，结果如下表2所示。
[表2]
菌株号 XMP(g/L) 产率(％)
KCCM-10530 11.8 23.6
KCCM-10530-xmpEX2 13.1 26.1
比较亲本菌株停滞棒状杆菌KCCM-10530和xmpE拷贝数增加的KCCM-10530-xmpEX2菌株的培养基中的XMP浓度；结果如上表2所示，KCCM-10530-xmpEX2菌株的XMP浓度增加了1.3g/L，这表明在相同条件下与亲本菌株相比浓度增加约11％。
这可以被理解为非常有意义的结果，通过该结果证实，所产生的XMP量的增加是由于xmpE蛋白活性的增强导致的。
实施例3-2：通过置换启动子增强xmpE的表达
实施例3-2-1：制备置换了xmpE启动子的载体
为了确认当被预测与XMP输出能力有关的xmpE的活性增强时，输出XMP的能力是否增加，制备了xmpE基因的启动子被能够使蛋白大量表达的启动子置换的载体。使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备载体的基因片段。
使用在韩国专利第10-0620092号中报道的在停滞棒状杆菌中使蛋白大量表达的Pcj7作为启动子。
为了扩增Pcj7基因的片段，使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板，使用引物对SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。分别使用引物对SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；以及引物对SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15，通过PCR扩增每个xmpE基因。PCR反应在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个如下循环：94℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃聚合1分钟。然后在72℃下进行最终聚合5分钟。使用三个扩增的基因片段Pcj7、xmpE-1和xmpE-2作为模板，通过进行重叠聚合酶链反应获得2.3kbp的多核苷酸模板。用限制性内切酶XbaI切割获得的基因片段，并用T4连接酶将切割的基因片段克隆到用XbaI切割的线性pDZ载体中以制备“pDZ-Pcj7/xmpE”载体。
实施例3-2-2：制备置换了xmpE启动子的菌株并评估其产生XMP的能力
通过电穿孔(使用根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的转化方法)将实施例3-2-1中制备的pDZ-Pcj7/xmpE载体转化到KCCM-10530菌株中，并从含有25mg/L卡那霉素的培养基中筛选由于同源序列重组而使载体***到染色体上的菌株。通过将筛选出的初代菌株进行二次杂交来筛选目标基因表达得到增强的菌株。使用引物对SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17进行PCR以确认最终转化的菌株中成功***了基因启动子。将xmpE启动子被更强的启动子置换的菌株命名为“KCCM-10530-Pcj7/xmpE”，并评估其产生XMP的能力。
为了测量菌株产生XMP的能力，使用与实施例2-2中相同的方法。进行HPLC分析以测量培养完成后产生的XMP的量，结果如下表3所示。
[表3]
Figure BSA0000170378570000141
Figure BSA0000170378570000151
比较亲本菌株停滞棒状杆菌KCCM-10530和由于更强的启动子而增强xmpE表达的KCCM-10530-Pcj7/xmpE菌株的培养基中的XMP浓度；结果如上表3所示，KCCM-10530-Pcj7/xmpE菌株的XMP浓度增加了0.7g/L，这表明在相同条件下与亲本菌株相比浓度增加约6％。
这可以被理解为非常有意义的结果，通过该结果证实，所产生的XMP量的增加是由于xmpE蛋白活性的增强导致的。
实施例3-3：xmpE起始密码子的置换
实施例3-3-1：制备置换了xmpE起始密码子的载体
为了确认当被预测与XMP分泌能力有关的xmpE蛋白的表达增强时，分泌XMP的能力是否增加，制备了起始密码子gtg被置换成atg的载体。使用ATCC6872菌株的基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于制备载体的基因片段。为了制备起始密码子gtg被置换成atg的载体，分别使用引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19以及引物对SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21获得两个基因片段A和B。PCR反应在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个如下循环：94℃变性30秒、52℃退火30秒、72℃聚合1分钟。然后在72℃下进行最终聚合5分钟。结果，分别获得了A和B的约0.7kbp和1kbp多核苷酸片段。使用这两个片段作为模板，使用引物对SEQID NO：18和SEQ ID NO：21进行PCR，以获得约1.7kbp的PCR产物(下文称为“g1a片段”)。聚合反应在以下条件下进行：94℃变性5分钟；25个如下循环：94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃聚合120秒。然后在72℃下进行最终聚合7分钟。
用限制性内切酶XbaI切割获得的基因片段，并用T4连接酶将切割的基因片段克隆到用XbaI切割的线性pDZ载体中以制备“pDZ-xmpE(g1a)”载体。
实施例3-3-2：制备置换了xmpE起始密码子的菌株并评估其产生XMP的能力
通过电穿孔(使用根据Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545的转化方法)将实施例3-3-1中制备的pDZ-xmpE(g1a)载体转化到KCCM-10530菌株中，并从含有25mg/L卡那霉素的培养基中筛选由于同源序列重组而使载体***到染色体上的菌株。通过将筛选出的初代菌株进行二次杂交来筛选目标基因表达得到增强的菌株。使用引物对SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：21通过PCR来确认最终转化的菌株中成功置换了xmpE起始密码子，然后用核苷酸序列分析方法分析经置换的核苷酸序列。将筛选出的xmpE起始密码子被置换成atg的菌株命名为CJX1662，并评估其产生XMP的能力。
为了测量菌株产生XMP的能力，使用与实施例2-2中相同的方法。进行HPLC分析以测量培养完成后产生的XMP的量，结果如下表4所示。
[表4]
菌株号 XMP(g/L) 产率(％)
KCCM-10530 11.8 23.6
CJX1662 14.1 28.2
比较亲本菌株停滞棒状杆菌KCCM-10530和置换了xmpE起始密码子的CJX1662菌株的培养基中的XMP浓度；结果如上表4所示，CJX1662菌株的XMP浓度增加了2.3g/L，这表明在相同条件下与亲本菌株相比浓度增加约20％。
这可以被理解为非常有意义的结果，通过该结果证实，所产生的XMP量的增加是由于xmpE蛋白活性的增强导致的。
此外，上述制备的CJX1662菌株根据布达佩斯条约于2018年4月11日保藏在国际保藏机构韩国微生物培养中心(KCCM)，登记号为KCCM12248P。
实施例3-4：基于野生型产生XMP的细胞系制备具有增强的xmpE活性的菌株
实施例3-4-1：基于野生型产生XMP的细胞系制备具有增强的xmpE活性的菌株
通过减弱野生型ATCC6872菌株中属于XMP分解途径的腺苷酸琥珀酸合成酶和XMP脱氢酶的活性来制备具有产生XMP能力的菌株。为了减弱这两种酶的活性，制备了其中分别编码这两种酶的基因purA和guaA的核苷酸序列的第一个核苷酸“a”被置换成“t”的菌株。更具体地，将通过减弱ATCC6872菌株中这两个基因的表达而制备的菌株命名为CJX1663。
通过电穿孔将实施例3-3-1中制备的pDZ-xmpE(g1a)载体转化到所制备的CJX1663菌株中，并从含有25mg/L卡那霉素的培养基中筛选由于同源序列重组而使载体***到染色体上的菌株。通过将筛选出的初代菌株进行二次杂交来筛选目标基因表达得到的菌株。使用引物对SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21进行PCR来确认最终转化的菌株中成功置换了xmpE起始密码子。
将筛选出的xmpE起始密码子被置换成atg的菌株命名为“CJX1663_xmpE(g1a)”，并评估其产生XMP的能力。
进行HPLC分析以测量培养完成后产生的XMP的量，结果如下表5所示。
[表5]
菌株号 XMP(g/L) 产率(％)
CJX1663 2.1 4.2
CJX1663_xmpE(g1a) 2.8 5.6
比较亲本菌株停滞棒状杆菌CJX1663和置换了xmpE起始密码子的CJX1663_xmpE(g1a)菌株的培养基中的XMP浓度；结果如上表5所示，CJX1663_xmpE(g1a)菌株的XMP浓度为2.8g/L，这表明在相同条件下与亲本菌株相比浓度增加约33％。
结果证实了通过增强输出5′-黄苷一磷酸的本公开内容的蛋白质(xmpE)的活性，可以提高XMP产生率。
同时，本公开内容中使用的引物序列如表6所示。
[表6]
SEQ ID NO 序列
3 GTCAAACTCTTTACGCCGACG
4 CGACAACACCAACAGATACTGC
5 ATGCTCTAGACTAGATCTTCTCGACGGGCAG
6 ATGATACTAGTCCTTGGGGACTTCGCGTGTCG
7 ATGATACTAGTCTAGATCTTCTCGACGGGCAG
8 TTCGGCTCAGCATTTTCCAC
9 CAATAGTGGTCGCGATGACG
10 GCAGTAAGGAGAATCAGAAACATCCCAGCGCTACTA
11 ACCTCTTCGGTTGTGTGCACGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG
12 ATGCTCTAGATCCAGTGTGGTTAAGAAGTCG
13 CGCTGGGATGTTTCTGATTCTCCTTACTGCAGT
14 GTACCCAACGAAAGGAAACACTCGTGCACACAACCGAAGAGGT
15 ATGCTCTAGATTATTGAGCCAGAACCATGG
16 CTAGATCTTCTCGACGGGCAG
17 CAATAGTGGTCGCGATGACG
18 ATGCTCTAGATCCAGTGTGGTTAAGAAGTCG
19 GACCTCTTCGGTTGTGTGCATGATTCTCCTTACTGCAGTTA
20 TAACTGCAGTAAGGAGAATCATGCACACAACCGAAGAGGTC
21 ATGCTCTAGACTCGCTCTTGTCGACAACAC
本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本公开内容的精神或基本特征的情况下，本公开内容可以以其他特定形式实施。在这方面，所描述的实施方案在所有方面应被视为仅是说明性的而非限制性的。因此，本公开内容的范围由所附权利要求而不是由前面的描述所指定。等同于权利要求的含义和范围内的所有变化包含在本公开内容的范围内。
Figure 1
Figure ISA0000170378580000021
Figure ISA0000170378580000031
Figure ISA0000170378580000041
Figure ISA0000170378580000051
Figure ISA0000170378580000061

Claims (6)

1.一种产生5'-黄苷一磷酸的棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物，其中由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的活性得到增强。
2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述蛋白质由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成的基因编码。
3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中活性的增强通过增加编码所述蛋白质的多核苷酸的拷贝数、增强启动子活性、置换起始密码子或其组合来实现。
4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属的微生物，其中所述产生5'-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物是停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)。
5.一种产生5'-黄苷一磷酸的方法，其包括：
在培养基中培养权利要求1至4中任一项所述的棒状杆菌属的微生物；和
从所述微生物或所述培养基中回收5'-黄苷一磷酸。
6.根据权利要求5所述的产生5'-黄苷一磷酸的方法，其中所述产生5'-黄苷一磷酸的棒状杆菌属的微生物是停滞棒状杆菌。
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