CN109912683B - 一种细胞毒素分子、偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Tubulysin衍生物细胞毒素分子、其与细胞表面受体分子偶联形成的偶联物(共轭体)、偶联物合成方法、偶联物制剂以及这些偶联物在靶向治疗癌症，自免疫***疾病和感染性疾病方面的应用。

Description

一种细胞毒素分子、偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及Tubulysin衍生物类细胞毒素分子，其与细胞表面受体分子偶联形成的偶联物(共轭体)、偶联物合成方法、偶联物制剂以及偶联物在靶向治疗癌症、自免疫***疾病和感染性疾病方面的应用。
背景技术
靶向治疗癌症、免疫缺陷和感染性疾病等是目前精准医疗关注的核心。多年来许多文献报道了利用细胞表面受体结合分子作为药物输送工具与细胞毒素分子形成偶联物(共轭体)，进行靶向输送细胞毒素分子进攻各类致病细胞(Allen,T.M.and Cullis,P.R.,2004Science,303(5665),1818-22，Hu,Q.Y.,F.Berti,et al.(2016)，Chem Soc Rev 45(6):1691-1719.)。这种细胞表面受体结合分子-小分子药物偶联物可以改善传统化疗小分子药物的药代动力学和药效学，同时减少传统化学药物的在人体的毒副作用(Alley,S.C.,N.M.Okeley,et al.(2010)Curr Opin Chem Biol 14(4):529-537；Kolhe,P.,J.Khandare,et al.(2006)Biomaterials 27(4):660-669)。已有报道的作为药物输送工具的细胞表面受体结合分子有：肽分子(Yeh,C.Y,Hsiao,J.K,et al.2016Biomaterials 99,1-15；Shen,Y.A.,Liu,C.S,et al.2015,Cancer Lett.360(1):39-47；Temming,et al,BioconjugateChem.2006,17,1385-1394)；抗体(Ducry,L.(2013).Antibody-drug conjugates,NewYork,Humana Press；Springer,ISBN 9781627035408；Sela et al,in Immunoconjugates189-216(C.Vogel,ed.1987)；Ghose et al,in Targeted Drugs 1-22(E.Goldberg,ed.1983)；Diener et al,in Antibody mediated delivery systems 1-23(J.Rodwell,ed.1988)；Silverstein,Nat.Immunol.2004,5,1211–7；Fanning et al,Clin.Immunol.Immunopathol.1996,79,1–14；Ricart A.D.,et al.,Nature ClinicalPractice Oncology 2007,4,245-255；Singh R.et Rickson H.K.,TherapeuticAntibodies:Methods and Protocols,2009,525,445-467)；小分子类如叶酸(Kumar,R.,W.S.Shin,et al.(2015)Chem SocRev 44(19):6670-6683；Leamon,C.P.and P.S.Low(2001),Drug Discov Today 6(1):44-51；Lu,Y.,E.Sega,et al.(2004),Adv Drug DelivRev 56(8):1161-1176；Reddy,et al,2009,Mol.Pharm.6,1518-25)；单域抗体或抗体类似物(Wold,E.D.,J.Y.Axup,et al.(2015)，Bioconjug Chem 26(12):2311-2314)；***特异性膜抗原结合配体(PMSA)(Low,et al,WO 2009/026177A1)；钴胺素和蛋白质(Gupta,etal,Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Syst.2008,25,347-79；Petrus,et al,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,1022-8，)；糖类分子(Darbre,et al,Curr.Top.Med.Chem..2008,8,1286-93；Zhang,Y.,J.W.Chan,et al.(2015)，J ControlRelease 219:355-368)；生物活性高分子(Dhar,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.2008,105,17356-61，Chang,M.,F.Zhang,et al.(2016)，J Drug Target 24(6):475-491.)；含有抗体或蛋白分子的高分子(Rihova,B.(1995)，Folia Microbiol(Praha)40(4):367-384)；树突状聚合物(Bai,S.,C.Thomas,et al.(2006)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 23(6):437-495；Lee,et al,Nat.Biotechnol.2005,23,1517-26；Almutairi,et al；Proc.Natl.Acad.Sci.2009,106,685-90)；连接有结合配体的纳米颗粒(Ma,P.andR.J.Mumper(2013),Nano Today 8(3):313-331；Fernandes,E.,et al.(2015)，J ControlRelease 209:288-307；Liong,et al,ACS Nano,2008,19,1309-12；Medarova,et al,Nat.Med.2007,13,372-7；Javier,et al,Bioconjugate Chem.2008,19,1309-12；Sheikhpour，M.et al,2017,J.Control.Rel,253,97-109)；蛋白酶或蛋白质(例如白蛋白)(Veronese,F.M.and M.Morpurgo(1999)，Farmaco 54(8):497-516；Stehle,G.,A.Wunder,et al.(1997),Anticancer Drugs 8(9):835-844；Kratz,F.(2008),J Control Release132(3):171-183；Fiume,L.,M.Manerba,et al.(2014)Expert Opin Drug Deliv 11(8):1203-1217；Vhora,I.,S.Patil,et al.(2015),Adv Protein Chem Struct Biol 98:1-55)；脂质体(Medinai,et al,Curr.Phar.Des.2004,10,2981-9)；病毒衣壳(Flenniken,etal,Viruses Nanotechnol.2009,327,71-93),等。上述细胞表面受体结合分子中在临床成熟应用则是抗体分子。目前美国食品药品监管局(FDA)已批准4个单克隆抗体-药物偶联物分子用于靶向治疗癌症，此4个偶联物药品是Gemtuzumab ozogamicin,Brentuximabvedotin，Trastuzumab emtansine和Inotuzumab ozogamicin。
抗体-药物偶联物由三部分组成：抗体(往往是单克隆抗体)，细胞毒素分子和连接二者之间的链接体(Thomas,A.,B.A.Teicher,et al.(2016)，Lancet Oncol 17(6):e254-e262)。三者之间各具有独特的功能：抗体需要对肿瘤细胞特异性结合，细胞毒素分子需要对肿瘤细胞足够的活性和广普性，链接体需要独特的功能性-在血液循环中稳定，到达肿瘤细胞后有效释放细胞毒素分子(Chari,R.V.(2008)，Acc Chem Res 41(1):98-107)，三者合理构建才能取得良好的临床结构(Singh,S.K.,D.L.Luisi,et al.(2015)，Pharm Res 32(11):3541-3571；Hamilton,G.S.(2015)，Biologicals 43(5):318-332)。许多种类的细胞毒素已经用于与细胞结合体特别是抗体形成抗体药物共轭体(Wu,et al,Nat.Biotechnol.2005,23,1137-1146.Ricart,et al,Nat.Clin.Pract.Oncol.2007,4,245–255)。这些细胞毒素包括：卡奇霉素衍生物(Giles,et al Cancer 2003,98,2095-104；Hamann,et al,Bioconjug Chem 2002,13,47-58；Nicolaou,K.C.et al,Science 1992,256,1172-1178；Proc.Natl.Acad.Sci USA.1993,90,5881-8)；美登素衍生物(Zhao,R.etal.,J.Med.Chem.2011,54,3606-3623；Widdison,et al,J Med Chem 2006,49,4392-408；Ikeda,et al,Clin Cancer Res 2009,15,4028-37；Xie,et al,Expert Opin Biol Ther2006,6,281-91；美国专利6,441,163；6,716,821,7,276,497,7,301,019,7,303,749,7,368,565,7,411,063,7,851,432,和8,163,888)；auristatins(Sutherland,et al,J BiolChem 2006,281,10540-7；Doronina,et al,Bioconjug Chem 2006,17,114-24；美国专利7837995,7902338,7964566,7964567,7851437,7994135.)；Tubulysin类(Wipf,P.,etal.Org.Lett.,2004,6,4057–60；Pando,O.,et al.J.Am.Chem.Soc.,2011,133,7692–5；Domling,A.,et al.,Angew Chem Int Ed Engl,2006,45,7235-9；PCT/IB2012/053554)紫杉类药物衍生物(Miller,et al,J Med Chem 2004,47,4802-5；K C.Nicolaou et al.,J.Am.Chem.Soc.117,2409-20,(1995)；Ojima et al,J.Med.Chem.39:3889-3896(1996)；美国专利7,276,499；7,598,290；和7,667,054；WO 06061258),leptomycine衍生物(WO07144709),CC-1065及其类似物物(Zhao,R.,et al J.Med.Chem.2012,55,766-782；Suzawa,et al,J Control Release 2002,79,229-42；Suzawa,et al,Bioorg Med Chem2000,8,2175-84；D.Boger et al.,J.Org.Chem；66；6654-61,2001；WO 2007102069)；Amatoxin类(Moldenhauer,G.,et al,J.Natl.Cancer Inst.2012,104,622–34；A.Moshnikova,et al；Biochemistry 2013,52,1171–8；Zhao,L.,et al.,Chembiochem,2015.16(10):1420-5；Zhou,B.,et al.,Biosens Bioelectron,2015.68:189-96；WO2014/043403,US20150218220,EP 1661584，WO2017/046658)；Exatecan衍生物(一种喜树碱类分子)(Nakada,T.,T.Masuda,et al.(2016)，Bioorg Med Chem Lett 26(6):1542-1545)；剪接体抑制剂(Puthenveetil,S.,F.Loganzo,et al.(2016)，Bioconjug Chem 27(8):1880-1888)；苯(并)二卓氮(PBD)二聚体类(美国专利8,163,736；8,153,627；8,034,808；7,834,005；7,741,319；WO2015028850)；阿霉素(Trail,et al,Science 1993,261,212-5；Salehet al,J Clin Oncol 2000,18,2282-92；Yang,H.M.,and Reisfeld,R.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.85,1189-93(1988)；),以及甲氨蝶呤，长春新碱，长春碱，柔红霉素，丝裂霉素C，马法兰，和苯丁酸氮芥衍生物等等(Wang,J.,H.Xiao,et al.(2017)，TrendsBiotechnol 35(5):466-478，Puthenveetil,S.,F.Loganzo,et al.(2016)，BioconjugChem 27(8):1880-1888)。
在上述的细胞毒素化合物分子中，Tubulysin类药物由于其独特的肿瘤细胞的强效生物活性，尤其是其耐药肿瘤细胞的生物活性被受关注(Cohen,R.,D.J.Vugts,et al.(2014),Cancer Res 74(20):5700-5710；Xiangming,X.,G.K.Friestad,et al,Mini RevMed Chem 13(11):1572-1578；Pando,O.,S.Stark,et al.(2011),J Am Chem Soc 133(20):7692-7695；Shibue,T.,I.Okamoto,et al.(2011),Bioorg Med Chem Lett 21(1):431-434；Kubicek,K.,et al.(2010)Angew Chem Int Ed Engl 49(28):4809-4812；Nicolaou,K.C.,et al.(2016)J Am Chem Soc 138(5):1698-1708；Sani,M.,et al.(2017)Chemistry 23(24):5842-5850)。我们曾报道了利用Tubulysin类似物构造细胞结合分子偶联物和在靶向治疗的应用(WO2014/009774；Huang，Y.Y.et al,American SocietyNational Meeting,Med.Chem.#44,2014,Dever,CO,USA)。这里我们进一步申请由Tubulysin类分子构造的偶联物，以及用此类偶联物在靶向治疗癌症，自免疫***疾病和感染性疾病方面的应用。
发明内容
本发明提供了一类细胞毒性分子，具有式I所示的结构：
Figure GDA0001547895240000041
或者以具有式I所示结构为母体的药学上可接受的盐、水合物或水合盐；或具有式I所示结构的多晶型物，或式I所示结构的光学异构体；
所述R1、R2、R3和R4独立地选自H；C1～C8的烷基或杂烷基；C2～C8的烯烷基、炔烷基、杂环、杂环烷基；C3～C8的的环烷基、芳基、杂芳香基、芳烷基、烷基羰基；C4～C8烷基环烷基、杂烷基环烷基；
所述R5、R6、R8、R10和R11独立地选自-H或C1～C4的烷基或杂烷基；
所述R7独立地选自H、R1、-R15C(＝O)X1R16或-R15X1R16；
所述X1选自-O-、-S、-S-S、-NH、-CH2-或-NR1-；
所述R9选自-H、-OH、＝O、-OR15、-OC(＝O)R15、-OC(＝O)NHR15、-OC(＝O)R15SSR16、OP(＝O)(OR15)或OR15OP(＝O)(OR16)；
所述R12选自-R15、-OH、-SH、-NH2、-NH、-NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-R15COR16、-R15COOR16、-R15C(O)NH2、-R15C(O)NHR17、-SR16、R15S(＝O)R16、-R15P(＝O)(OR17)2、-R15OP(＝O)(OR17)2、-CH2OP(＝O)(OR17)2、-R15SO2R17、-R15X2R16、-R15C(＝O)X3；
所述X2选自-O-、-S-、-NH-、-NHNH-、-N(R15)-、-O-R15-、-S-R15-、S(＝O)-R15-或-NHR15-中的一种；
所述X3选自-OH、-SH、-NH2、-NH(R15)、-NHNH(R15)、-OR15、-S-R15、或-NR15R16中的一种；
所述R13和R14独立地选自H、-OH、-SH、-NH2、-NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-COX2、-COX2R16、-R17、-F、-Cl、-Br、-I、-SR16、-NR16R17、-N＝NR16、-N＝R16、-NO2、-SOR16R17、-SO2R16、-SO3R16、-OSO3R16、-PR16R17、-POR16R17、-PO2R16R17、-OP(O)(OR17)2、-OCH2OP(O)(OR17)2、-OC(O)OP(O)(OR17)2、-PO(OR16)(OR17)、-OP(O)(OR17)OP(O)(OR17)2、-OC(O)R17，-OC(O)NHR17；-O-(C4-C12糖苷)、-N-(C4-C12糖苷)；C1-C8烷基、杂烷基，C2-C8烯基、炔基、杂环基；C3-C8碳环基、杂环烷基、杂烷基环烷基、芳基、杂芳烷基、烷基羰基；C4-C8烷基环烷基；-NH(Aa)1～4或-CO(Aa)1～4；所述C3-C8碳环基包括环烷基；所述(Aa)1～4为1到4个相同或不同的天然的或非天然的氨基酸单位；
所述R15、R16和R17独立地选自C1-C8烷基、杂烷基，C2-C8烯基、炔基、杂环基，或C3-C8碳环基、芳基、苄基、烷基芳基、杂环烷基、杂烷基环烷基、杂芳烷基、烷基羰基，C4-C8烷基环烷基，或Na+、K+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg+、Zn2+、N+(R1)(R2)(R3)(R4)、HN+(C2H5OH)3的阳离子盐；所述C3-C8碳环基包括环烷基；
所述Y1和Y2独立地选自N或者CH；q为0或1；当q＝0，Y3不存在，Y4，Y5，Y6和Y7独立地选自CH、N，NH，O，S，或N(R1)，这样Y2，Y4，Y5，Y6和Y7一起构成吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、恶唑、咪唑，***、四唑、噻二唑、恶二唑的杂芳香环；当q＝1，Y3，Y4，Y5，Y6和Y7独立地选自CH或N，这样Y2，Y3，Y4，Y5，Y6和Y7一起构成苯环、吡啶、吡嗪、哒嗪、三嗪，四嗪的杂芳香环结构。
本发明还提供了一种细胞毒性分子，所述的基团R1、R2，R2、R3或R3、R4通过-CH2-任意连接分别与Y1原子构成环状基团，或R5、R6通过-CH2-任意连接与其相连的碳原子构成环状基团，或R11、R12通过-CH2-任意连接与其所连的碳原子和羰基构成环状基团，或R13、R14通过-CH2-任意连接与Y5和Y6原子构成环状基团；
所述环状基团选自C3-C7的环烷基、环烷烷基、环烷杂芳香基、环烷杂烷基、杂环基、杂环烷基，环烷羰基、环烷羧基、环烷酰胺基、环烷胺基、环烷氧醚基、环烷硫醚基、环烷硒醚基、芳香基、杂芳香烷基、和杂芳香基中的一种。
本发明还提供了一种细胞毒性分子,所述R1、R2、R7、R9、R12、R13和R14的未端还含有一个可同链接体或同细胞表面结合受体分子进行偶联的功能基团，所述功能基团选自SH、NH2、COOH、-O-NH2、-N3、NHNH2、-SSPy(Py是C5H4N)、-SSAr、-SSC6H4NO2、-SSC6H3(NO2)(COOH)、-SC(O)R1、-SSC6H3(NO2)2、-C(O)NH2、-C(O)H、-C(O)NHNH2、-C(O)R1-C(O)C(O)R1、-ArC(O)R1、-C(O)CH2X3、-C(O)X3、-ArCH2X3、
Figure GDA0001547895240000061
Figure GDA0001547895240000062
Figure GDA0001547895240000063
所述X3和X4独立地选自F、Cl、Br、I、-OS(O)2Ar、-OS(O)2R1、-OS(O)2CF3)、-OC6F5、-OC6FH4,-OC6F2H3,-OC6H4(NO2)、-OC6H3(NO2)2。
本发明还提供了一种以上述毒性分子为母体的偶联物，具有式II所示结构：
Figure GDA0001547895240000071
或者结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T为细胞表面受体结合分子；所述L和L’独立地为可解离的链接体；
所述-----代表L与括号内结构上的原子相连接的链接键和连接位点；
所述n为1～20的整数；所述m为1～10的整数；所述m’为0～10的整数；
当m’为0时，L’不存在；当m’不为0时，偶联物通过两个或以上的链接体连接细胞表面受体结合分子T；
所述的两个链接体别连接式II所示结构中括号内所示结构上的两个位点，或此两个链接体再通过带支链的链接体连接结II所示结构中括号内所示结构上的一个位点；
所述链接体L和L’的结构式独立地为—Ww-(Aa)r—Vv--；
所述W为延伸体，将目标结合分子单元T连接到氨基酸单元(Aa)上，若没有Aa时直接连接V；
所述单元W各自独立地包含一个自我分解的间隔体、肽单元、腙键、双硫键硫醚键、酯键、或胺键；所述w为0或者1；
所述Aa为天然氨基酸或非天然氨基酸单元；所述r为0至12的整数，所述(Aa)r为0～12个结构相同或不同的氨基酸单元；所述天然氨基酸或非天然氨基酸单元包括一肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元；
所述V为隔离体单元，所述隔离体单元独立地选自H、O、NH、S、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烯烃基、炔烃基；C3-C8芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、杂烷基环烷基、烷基羰基；C4-C8烷基环烷基；1～4个氨基酸单元或(CH2CH2O)r；所述杂环基包括杂环烷基；所述炭环基包括环烷基；所述(CH2CH2O)r的r为0～12的整数；所述v为0，1或2；
所述细胞表面受体结合分子T为任何形式的细胞结合体，包括肽或类似肽的结构：抗体，单链抗体，可以与目标细胞结合的抗体片段，单克隆抗体，单链单克隆抗体，可以与目标细胞结合的单克隆抗体片段，嵌合抗体，可以与目标细胞结合的嵌合抗体片段，功能区抗体，可以与目标细胞结合的功能区抗体片段，仿抗体的基因工程蛋白质，纤连蛋白结合体adnectin，预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)，淋巴因子，激素，维他命，生长因子，集落刺激因子，营养传送分子，转铁蛋白，细胞表面小分子配体，或连接有细胞结合体的白蛋白、高分子、或树枝高分子，表面含有细胞结合分子(结合肽、蛋白、抗体或细胞表面小分子配体)的高分子材料、蛋白、脂质体、纳米颗粒、泡馕或(病毒)微囊。
附图说明
图1.显示合成Tubulysin衍生物片段Tuv。
图2.显示显示合成Tubulysin衍生物片段。
图3.显示显示合成Tubulysin衍生物片段。
图4.显示显示合成Tubulysin衍生物片段。
图5.显示Tubulysin衍生物组分的合成。
图6.显示Tubulysin衍生物组分的合成。
图7.显示Tubulysin衍生物组分Tuv和Tup的合成。
图8.显示Tubulysin衍生物含链接体的Tup片段的合成。
图9.显示Tubulysin衍生物及其偶联物的合成。
图10.显示Tubulysin衍生物及其偶联物的合成。
图11.显示Tubulysin衍生物及其偶联物的合成。
图12.显示Tubulysin衍生物及其偶联物的合成。
图13.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图14.显示抗体--Tubulysin衍生物共轭体的合成。
图15.显示抗体--Tubulysin衍生物共轭体的合成。
图16.显示一种手性Tubulysin衍生物片段的合成。
图17.显示一种Tubulysin衍生物片段的合成。
图18.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图19.显示一种抗体-Tubulysin衍生物共轭体的合成。
图20.显示一种能共轭成键的Tubulysin衍生物的合成。
图21.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图22.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图23.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图24.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图25.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图26.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图27.显示抗体-Tubulysin衍生物的合成。
图28.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图29.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图30.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图31.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图32.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图33.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图34.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图35.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图36.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图37.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图38.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图39.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图40.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图41.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图42.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图43.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图44.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图45.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图46.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图47.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图48.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图49.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图50.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图51.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图52.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图53.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图54.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图55.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图56.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图57.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图58.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图59.显示抗体-Tubulysin衍生物及其共轭体的合成。
图60.显示Her2单抗-Tubulysin衍生物共轭体(133、129、181、317和467，药物/抗体摩尔数比DAR＝3.5-4.0)，同上市药物T-DM1对N87(胃癌)细胞动物体内疗效作用。133、129、317、467具有良好的抑制肿瘤疗效。其中133、129、467疗效好于T-DM1。
图61.显示Her2单抗-Tubulysin衍生物共轭体(365、377、385、412、444、474、480和546，药物/抗体摩尔数比DAR＝3.5-4.0)，同上市药物T-DM1对N87(胃癌)细胞动物体内疗效作用。365、377、385、412、444、474和480具有良好的抑制肿瘤疗效。其中377、385、412、444、474和480疗效优于T-DM1。
图62.显示Her2单抗-Tubulysin衍生物共轭体(506、522、564、574、695和677，药物/抗体摩尔数比DAR＝3.5-4.0)，同上市药物T-DM1对N87(胃癌)细胞动物体内疗效作用。506、522、564、574和677具有良好的抑制肿瘤疗效。其中677疗效好于T-DM1。
相关术语解释：
烷基指含有1至8个碳原子的线性或者环状直链或者支链脂肪烃。支链指在线性的烷基上有一个或者多个低级烷基，比如甲基，乙基或者丙基相连接。烷基实施例包括甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，正戊烷基，3-戊烷基，辛烷基，壬烷基，癸烷基，环戊烷基，环己烷基，2,2-二甲基丁基，2,3-二甲基丁基，2,2-二甲基戊基，2,3-二甲基戊基，3,3-二甲基戊基，2,3,4-三甲基戊基，3-甲基己基，2,2-二甲基己基，2,4-二甲基己基，2,5-二甲基己基，3,5-二甲基己基，2,4-二甲基戊基，2-甲基庚基，3-甲基庚基，正庚基，异庚基，正辛烷基和异辛烷基。C1-C8烷基既可以未被取代也可以被以下但不限于以下的一个或者多个基团取代：C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，芳基，酰基，酰氧基，酯基，-C(O)NH2,-C(O)NHR’,-C(O)N(R’)2,-NHC(O)R’,-S(O)2R’,-S(O)R’,-OH,卤素(-F,-Cl,-Br,-I)，-N3,-NH2,-NHR’,-N(R’)2及-CN；其中R’指C1-C8烷基或者芳基。
C3-C8碳环指含3,4,5,6,7,或8个碳原子的饱和或不饱和的非芳烃环状化合物。典型的C3-C8碳环包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环戊二烯基，环己基，环己烯基，1,3-环己二烯基，1,4-环己二烯基，环庚基，1,3-环庚二烯基，1,3,5-环庚三烯基，环辛基及环辛二烯基。C3-C8碳环既可以未被取代,也可以被以下但不限于以下的一个或者多个基团取代：C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，芳基，酰基，酰氧基，酯基，-C(O)NH2,-C(O)NHR’,-C(O)N(R’)2,-NHC(O)R’,-S(O)2R’,-S(O)R’,-OH,卤素(-F,-Cl,-Br,-I)，-N3,-NH2,-NHR’,-N(R’)2及-CN；其中R’是C1-C8烷基或者芳基。
C3-C8碳环基指上述C3-C8碳环上的一个氢原子被化学键所取代而产生的基团。
烯烃基指含有一个碳碳双键的直链或者支链脂肪烃，碳链上有2至8个碳原子。烯烃基的实施例包括乙烯基，丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，正戊烯基，己烯基，庚烯基和辛烯基。
炔烃基指含有一个碳碳三键的直链或者支链脂肪烃，碳链上有2至8个碳原子。炔烃基的实施例包括乙炔基，丙炔基，正丁炔基，2-丁炔基，3-甲基丁炔基，正戊炔基，己炔基，庚炔基和辛炔基。
杂烷基指含2至8个碳原子而且有1至4个碳原子被O，S或者N所取代的烷基。
芳基或者芳香基指含有一个或者多个环的由3至14个碳原子(多数的情形是6至10个碳原子)组成的芳香烃或者杂芳香烃基团。杂芳香烃基团指有一个或多个碳原子(多数的情形是1，2，3或4个碳原子)被O,N,Si,Se,P或者S(最好是O,S,N)所取代所产生的芳香烃基团。芳基或者芳香基也指一个或多个氢原子被取代的芳香烃基团，这些取代基团有：R13,F,Cl,Br,I,OR13,SR13,NR13R14,N＝NR13,N＝R13,NR13R14,NO2,SOR13R14,SO2R13,SO3R13,OSO3R13,PR13R14,POR13R14,PO2R13R14,OPO3R13R14或者PO3R13R14。其中R13和R14分别为H，烷基，烯烃基，炔烃基，杂烷基，芳基，芳烷基，羰基或者可以药用的盐。
卤素原子指氟，氯，溴，碘原子，最好是氟和氯。
杂环指含2至8个碳原子的芳香，非芳香性环或杂环的环上有1至4个碳原子被杂元素所取代。这些杂元素为O,N,S,Se和P，最好为O,N和S。可用的杂环亦可参见《The Handbookof Chemistry and Physics》,第78版,CRCPress,1997-1998,第225至226页。适合的非杂芳基包括但不限于环氧基，环氮乙烷基，环硫乙烷基，吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，环氧乙烷基，四氢呋喃基，二氧戊环基，四氢吡喃基，二氧杂环己烷基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基，吡喃基，咪唑啉基，吡咯啉基，吡唑啉基，噻唑烷基，四氢硫吡喃基，二噻烷基，硫吗啉基，二氢吡喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，二氢吡啶基，四氢嘧啶基，二氢硫吡喃基，氮杂环庚烷基以及它们与苯基生成的稠环。
杂芳基指含3至14个(最好为5至10个)原子的芳香性杂单环，二环或多环结构。例如吡咯基，吡啶基，吡唑基，噻吩基，嘧啶基，吡嗪基，四氮唑基，吲哚基，喹啉基，嘌呤基，咪唑基，噻吩基，噻唑基，苯并噻唑基，呋喃基，苯并呋喃基，1,2,4-噻二唑基，异噻唑基，三氮唑基，四氮唑基，异喹啉基，苯并噻吩基，异苯并呋喃基，吡唑基，咔唑基，苯并咪唑基，异恶唑基，N-氧吡啶基以及他们与苯基生成的稠环。
烷基，环烷基，烯烃基，炔烃基，芳基，杂芳基和杂环基等术语也指由相应的烃失去两个氢原子生成的亚烷基，环亚烷基，亚烯基，亚炔基，亚芳基，杂亚芳基和杂亚环等。
“芳烷基”指的是一个非环状的烷基自由基的一个氢原子连接的碳原子，通常是一个终端或sp3杂化的碳原子由一个芳基取代。典型的芳基烷基包括苄基，2-苯乙烷基，2-苯乙烯基，萘甲基，2-萘乙烷基，2-萘乙烯基，萘苄基，2-萘苯乙烷基等。
“杂芳烷基”指非环型烷基自由基的一个氢原子链接到一个碳原子上，通常是一个终端或sp3杂化的碳原子由一个杂芳基取代。杂芳烷基代表如2-苯并咪唑甲基，2-呋喃乙基。
“羟基保护集团”是指，甲基氧甲基醚(MOM)，2-甲基氧乙基氧甲基醚(2-MOEOM)，四氢吡喃醚，苄醚，对甲基氧苄醚，三甲基矽醚，三乙基矽醚，三异丙基矽醚，叔丁基二甲基硅醚，三苯基甲基硅醚，乙酸乙酯，含取代基的乙酸乙酯，苯甲酸酯，甲酸苄酯，氯代乙酸酯，甲氧基乙酸酯，苯氧基乙酸酯，特戊酸酯(pivaloate)，金刚烷酸酯，三甲基苯甲酸酯(mesitoate)，甲基磺酸酯和甲苯磺酸盐。
氨基酸可以是天然的和/或非自然的氨基酸，最好是α氨基酸。天然氨基酸是由基因编码的编排，它们是丙氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸和缬氨酸。非天然氨基酸是蛋白氨基酸衍生的形式。例如羟脯氨酸、羊毛硫氨酸；、2-氨基异丁酸，脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸(神经传递分子)、鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-胺基丙酸)、γ-羧基谷氨酸盐，硒代半胱氨酸(目前在许多非真核生物以及大多数真核生物中，而不是直接由DNA编码构成)、吡咯赖氨酸(仅在一些古细菌和细菌中发现的)，N-甲酰甲硫氨酸(它是细菌，线粒体和叶绿体蛋白最初的氨基酸)，5-羟基色氨酸，L-二羟基苯丙氨酸、三碘甲腺原氨酸、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)，和O-磷酸丝氨酸。氨基酸的术语还包括氨基酸类似物和近似物。类似物具有相同的H2N(R)CHCO2H天然氨基酸的结构，但R基团在天然氨基酸未发现。例如类似物包括类丝氨酸、己氨酸、蛋氨酸亚砜，和蛋氨酸甲基锍盐。优选地，类氨基酸具有与α氨基酸的常规化学结构不同的结构，但其功能类似。术语“非天然氨基酸”以“D”的立体形态、天然氨基酸的以“L”立体形态。在本专利申请中使用1～12个氨基酸时，氨基酸序列最好能被蛋白酶的识别和裂解。许多识别和切割氨基酸序列已被熟知(如Matayoshi et al.Science 247:954(1990)；Dunn et al.Meth.Enzymol.241:254(1994)；Seidah et al.Meth.Enzymol.244:175(1994)；Thornberry,Meth.Enzymol.244:615(1994)；Weber et al.Meth.Enzymol.244:595(1994)；Smith etal.Meth.Enzymol.244:412(1994)；and Bouvier et al.Meth.Enzymol.248:614(1995)，其中文献中还含带引述文献)，特别是，氨基酸序列选择为Val-Cit,Ala-Val,Ala-Lys,Gly-Lys,Ala-Ala,Val-Val,Val-Ala-Val,Lys-Lys,Ala-Asn-Val,Val-Leu-Lys,Cit-Cit,Val-Lys,Asp-Lys,Glu-Lys,Ala-Ala-Asn,Lys,Cit,Ser,和Glu的分子。
“肽”是由两个或多个氨基酸通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基以肽键(即酰胺键)结合而成。两个氨基酸以肽键相连的化合物称为二肽；三个氨基酸以肽键相连的化合物称为三肽，以此类推，三十个氨基酸以肽键相连的化合物称为三十肽。完全以天然α氨基酸构成的肽为天然肽(天然蛋白)。含有一个或多个非天然氨基酸或氨基酸类似物的肽为非天然肽(类肽化合物)。两个或以上氨基酸的肽为一个肽单元。
“糖苷”是通过其糖基键将糖基团通过其端基异构体碳键连接到另一基团的分子。糖苷可以通过O-(O-糖苷)，N-(糖胺)，S-(硫代糖苷)或C-(C-糖苷)糖苷键连接。其核心是经验公式为Cm(H2O)n(其中m可以不同于n，m和n是<36)，本文中的糖苷包括葡萄糖(葡萄糖)，果糖(levulose)阿洛糖，阿卓糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，托洛糖，半乳糖胺，葡糖胺，唾液酸，N-乙酰葡糖胺，磺基喹诺酮(6-脱氧-6-磺基-D-吡喃葡萄糖)，核糖，***糖，木糖，溶血糖，山梨醇，甘露醇，蔗糖，乳糖，麦芽糖，海藻糖，麦芽糖糊精，棉子糖，葡萄糖醛酸(葡糖苷酸)和水苏糖。糖苷可以是D型式或L型式，5个原子环状呋喃糖形式，6个原子环状吡喃糖形式，或非环形式，α-异构体(Haworth投影的碳原子下方的端基异碳的-OH)或β-异构体(在Haworth投影平面上方的端基异构碳的-OH)。其在本文中常用糖苷是单糖，二糖，多元醇或寡糖(含有3-6个糖单元)。
“抗体”，这里所用的是用在最广泛的意义上，具体涵盖完整的单克隆抗体，多克隆抗体，特异性抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体和抗体片段)，具有理想的生物活性，抗体片段的药物结合位点的必要数量的链接。一种抗体的原生形态是一个四聚体，由两个相同的免疫球蛋白链对，每对有一个轻链和重链。在每一对中，轻链和重链可变区(VL和VH)共同负责与抗原结合。轻链和重链可变区由一个框架区三高变区中断，也被称为“互补决定区”或“服务”。不断的区域可能是公认的，与免疫***的相互作用。一种抗体可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、和IgA)、大类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。抗体可以从任何合适的物种中获得。在某些方面，抗体是人或鼠的起源。抗体可以是人的，人源化的或嵌合的。
术语“特异结合”和“特异结合”意味着抗体或抗体衍生物会以高度选择性的方式与其相应的靶抗原结合，而不是与许多其他抗原结合。通常情况下，抗体或抗体具有至少约1x10-7M的亲和性衍生物结合。最好是1x10-8M到10-9M、10-10M、10-11M或10-12M结合。预定抗原的亲和力至少是两倍大于结合的非特异性抗原的亲和性(如牛血清白蛋白，酪蛋白)。
“药用”或“可以药用”指相应的化合物或化合物组成在动物或人体上不产生有害的，过敏性的或其他不良反应。
药学上可接受的辅料包括所有载体，稀释剂，助剂或者成形剂，比如防腐剂，抗氧化剂，填料，崩解剂，润湿剂，乳化剂，悬浮剂，溶剂，分散介质，涂层，抗菌剂，抗真菌剂，等渗和吸收延缓剂等等。在医药领域，在具有活性的药物成分中加入这些辅料是十分常见的做法。可以说，除非辅料与药物活性组分并不相容，在药物成分中加入辅料并不是没有道理。为取得好的结果，具有活性的辅助组分也可以被加入药物成分中。
在本发明中，可以药用的盐指本发明化合物的盐类衍生物。经过适当的修饰，本发明化合物可以形成相应的酸盐或碱盐。可以药用的盐包括常见的没有毒性的盐或季铵盐，这些盐可以用本发明化合物和相应的没有毒性的无机酸或有机酸制成。例如，用无机酸包括盐酸，氢溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸以及硝酸等和有机酸包括乙酸，丙酸，丁二酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，苯磺酸，葡萄糖醛酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，甲苯磺酸，草酸，富马酸以及乳酸等都可以做成药用盐。其它的盐包括氨基丁三醇,氨基三乙醇,甲葡胺,吡咯乙醇等铵盐以及钠，钾，钙，锌，镁等金属盐。
本发明可以药用的盐可以用常规的化学方法制成。一般地说，这些盐可以通过在本发明化合物的游离酸或碱的水溶液或有机溶液或两者的混合溶液中加入其它适当的等当量的碱或酸而形成。非水相的反应介质一般为***，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇或者乙腈。可以适用盐的列表可参见《Remington’s Pharmaceutical Sciences》,第17版.MackPublishing Company,Easton,PA,1985,第1418页.
术语“药学上可接受的盐”是指配体药物偶联物或接头药物缀合物的药学上可接受的有机或无机盐。缀合物可以含有至少一个氨基，因此可以与氨基形成酸加成盐。硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，异烟酸盐，乳酸盐，水杨酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，鞣酸盐，泛酸盐，酒石酸盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐，富马酸盐，葡萄糖酸盐，葡糖醛酸盐，糖酸盐，甲酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基双-(2-羟基萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包括另外的分子，例如乙酸根离子，琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个的带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实施例可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
短语“药学上可接受的溶剂合物”或“溶剂合物”是指一种或多种溶剂分子和配体药物偶联物或接头药物缀合物的缔合。形成药学上可接受的溶剂合物的溶剂的实施例包括但不限于水，异丙醇，乙醇，丁醇，叔丁醇，丙酮、甘油，DMSO，乙酸乙酯，甲酸，乙酸，三乙醇胺和乙醇胺。
水合物(Hydrate)指的是含有水的化合物。其中水可以以配位键与其他部分相连，如金属离子水合配体形成络合物，也可以是以共价键相结合，如水合三氯乙醛。也可以指是某些化合物与水分在一定温度、压力条件下形成的晶体或液体分子。水合物中的水是以确定的量存在的,例如无水硫酸钠Na2SO4的水合物的组成为Na2SO4·10H2O。水合物中的水有几种不同的结合方式：一种是作为配体，配位在金属离子上，称为配位结晶水；另一种则结合在阴离子上，称为阴离子结晶水。水也可以不直接与阳离子或阴离子结合而依一定比例存在于晶体内，在晶格中占据一定的部位。这种结合形式的水称为晶格水，一般含有12个水分子。有些晶形化合物也含水，但无一定比例。水合物的盐是指在此水合物基础上形成的药学上可接受的盐。
旋光异构体又称对映异构体，对掌异构物、光学异构物、镜像异构物、对映异构体或手性异构体，不能与彼此立体异构体镜像完全重叠的分子。含有一个物质含一个手性碳原子时，有两个旋光异构体，它们具有互为实物和镜像的关系，故也称对映体。对映异构体具有相等的旋光能力，但旋转方向相反，其物理和化学性质极可能相似。含有两个相同属性碳原子的分子，有3个旋光异构体。分子中当含有几个不同的手性原子时，其旋光异构体的数目为2n，n为不同手性原子的个数。等量互为旋光异构体的两种物质均匀混合，旋光性互相抵消，就组成了外消旋体。
“患者”或“受试者”的实施例包括但不限于人，大鼠，小鼠，豚鼠，猴，猪，山羊，牛，马，狗，猫，鸟和家禽。在示例性实施例中，患者或受试者是人。
“给药”是指将药物或其他药剂转移，输送，引入或运送给受试者的任何方式，包括口服，局部接触，静脉内，腹膜内，肌肉内，病灶内，鼻内，皮下或鞘内给药本发明也考虑了使用装置或器械来施用药剂，这种装置可以利用主动或被动的运输，并且可以是缓释或快速释放递送装置。
本文可以使用以下缩写，并具有指定的定义：Boc，叔丁氧基羰基；BroP，溴代三吡咯烷鏻六氟磷酸盐；CDI，1,1'-羰基二咪唑；DCC，二环己基碳二亚胺；DCE，二氯乙烷；DCM，二氯甲烷；DIAD，偶氮二羧酸二异丙酯；DIBAL-H，二异丁基氢化铝；DIPEA，二异丙基乙胺；DEPC，二氰基磷酸二乙酯；DMA，N，N-二甲基乙酰胺；DMAP，4-(N，N-二甲基氨基)吡啶；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲亚砜；DTT，二硫苏糖醇；EDC，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；ESI-MS，电喷雾质谱；HATU，O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐；HOBt，1-羟基苯并***；HPLC，高压液相色谱；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；MMP，4-甲基吗啉；PAB，对氨基苄基；PBS，磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0～7.5)；PEG，聚乙二醇；SEC，大小排阻色谱法；TCEP，三(2-羧乙基)膦；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；Val，缬氨酸。
具体实施方式
本发明提供了一类细胞毒性分子，具有式I所示的结构：
Figure GDA0001547895240000171
或者以具有式I所示结构为母体的药学上可接受的盐、水合物或水合盐；或具有式I所示结构的多晶型物，或式I所示结构的光学异构体；
所述R1、R2、R3和R4独立地选自H；C1～C8的烷基或杂烷基；C2～C8的烯烷基、炔烷基、杂环、杂环烷基；C3～C8的的环烷基、芳基、杂芳香基、芳烷基、烷基羰基；C4～C8烷基环烷基、杂烷基环烷基；
所述R5、R6、R8、R10和R11独立地选自-H或C1～C4的烷基或杂烷基；
所述R7独立地选自H、R1、-R15C(＝O)X1R16或-R15X1R16；
所述X1选自-O-、-S、-S-S、-NH、-CH2-或-NR1-；
所述R9选自-H、-OH、＝O、-OR15、-OC(＝O)R15、-OC(＝O)NHR15、-OC(＝O)R15SSR16、OP(＝O)(OR15)或OR15OP(＝O)(OR16)；
所述R12选自-R15、-OH、-SH、-NH2、-NH、-NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-R15COR16、-R15COOR16、-R15C(O)NH2、-R15C(O)NHR17、-SR16、R15S(＝O)R16、-R15P(＝O)(OR17)2、-R15OP(＝O)(OR17)2、-CH2OP(＝O)(OR17)2、-R15SO2R17、-R15X2R16、-R15C(＝O)X3；
所述X2选自-O-、-S-、-NH-、-NHNH-、-N(R15)-、-O-R15-、-S-R15-、S(＝O)-R15-或-NHR15-中的一种；
所述X3选自-OH、-SH、-NH2、-NH(R15)、-NHNH(R15)、-OR15、-S-R15、或-NR15R16中的一种；
所述R13和R14独立地选自H、-OH、-SH、-NH2、-NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-COX2、-COX2R16、-R17、-F、-Cl、-Br、-I、-SR16、-NR16R17、-N＝NR16、-N＝R16、-NO2、-SOR16R17、-SO2R16、-SO3R16、-OSO3R16、-PR16R17、-POR16R17、-PO2R16R17、-OP(O)(OR17)2、-OCH2OP(O)(OR17)2、-OC(O)OP(O)(OR17)2、-PO(OR16)(OR17)、-OP(O)(OR17)OP(O)(OR17)2、-OC(O)R17，-OC(O)NHR17；-O-(C4-C12糖苷)、-N-(C4-C12糖苷)；C1-C8烷基、杂烷基，C2-C8烯基、炔基、杂环基；C3-C8碳环基、杂环烷基、杂烷基环烷基、芳基、杂芳烷基、烷基羰基；C4-C8烷基环烷基；-NH(Aa)1～4或-CO(Aa)1～4；所述C3-C8碳环基包括环烷基；所述(Aa)1～4为1到4个相同或不同的天然的或非天然的氨基酸单位；
所述R15、R16和R17独立地选自C1-C8烷基、杂烷基，C2-C8烯基、炔基、杂环基，或C3-C8碳环基、芳基、苄基、烷基芳基、杂环烷基、杂烷基环烷基、杂芳烷基、烷基羰基，C4-C8烷基环烷基，或Na+、K+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg+、Zn2+、N+(R1)(R2)(R3)(R4)、HN+(C2H5OH)3的阳离子盐；所述C3-C8碳环基包括环烷基；
所述Y1和Y2独立地选自N或者CH；q为0或1；当q＝0，Y3不存在，Y4，Y5，Y6和Y7独立地选自CH、N，NH，O，S，或N(R1)，这样Y2，Y4，Y5，Y6和Y7一起构成吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、恶唑、咪唑，***、四唑、噻二唑、恶二唑的杂芳香环；当q＝1，Y3，Y4，Y5，Y6和Y7独立地选自CH或N，这样Y2，Y3，Y4，Y5，Y6和Y7一起构成苯环、吡啶、吡嗪、哒嗪、三嗪，四嗪的杂芳香环结构。
本发明还提供了一种细胞毒性分子，所述的基团R1、R2，R2、R3或R3、R4通过-CH2-任意连接分别与Y1原子构成环状基团，或R5、R6通过-CH2-任意连接与其相连的碳原子构成环状基团，或R11、R12通过-CH2-任意连接与其所连的碳原子和羰基构成环状基团，或R13、R14通过-CH2-任意连接与Y5和Y6原子构成环状基团；
所述环状基团选自C3-C7的环烷基、环烷烷基、环烷杂芳香基、环烷杂烷基、杂环基、杂环烷基，环烷羰基、环烷羧基、环烷酰胺基、环烷胺基、环烷氧醚基、环烷硫醚基、环烷硒醚基、芳香基、杂芳香烷基、和杂芳香基中的一种。
本发明还提供了一种细胞毒性分子，所述R1、R2、R7、R9、R12、R13和R14的未端还含有一个可同链接体或同细胞表面结合受体分子进行偶联的功能基团，所述功能基团选自SH、NH2、COOH、-O-NH2、-N3、NHNH2、-SSPy(Py是C5H4N)、-SSAr、-SSC6H4NO2、-SSC6H3(NO2)(COOH)、-SC(O)R1、-SSC6H3(NO2)2、-C(O)NH2、-C(O)H、-C(O)NHNH2、-C(O)R1-C(O)C(O)R1、-ArC(O)R1、-C(O)CH2X3、-C(O)X3、-ArCH2X3、
Figure GDA0001547895240000191
Figure GDA0001547895240000192
Figure GDA0001547895240000193
所述X3和X4独立地选自F、Cl、Br、I、-OS(O)2Ar、-OS(O)2R1、-OS(O)2CF3)、-OC6F5、-OC6FH4,-OC6F2H3,-OC6H4(NO2)、-OC6H3(NO2)2。
优选地，所述细胞毒性分子的结构具体如下：
Figure GDA0001547895240000194
Figure GDA0001547895240000201
Figure GDA0001547895240000211
Figure GDA0001547895240000221
Figure GDA0001547895240000231
Figure GDA0001547895240000241
Figure GDA0001547895240000251
Figure GDA0001547895240000261
Figure GDA0001547895240000271
Figure GDA0001547895240000281
Figure GDA0001547895240000291
所述R20选自C1-C8线性或支链烷烃、杂烷烃，C2-C8线性或支链烯烃或炔烃，C3-C8芳烃、烷基芳烃、杂环烃或杂芳烃，羰基脂-C(O)OR17，羰基胺-C(O)NR17R18；
所述Z2和Z3独立地选自H、-OH、-NH2、OR17、NHR17、COOH、COOR17、C(O)SR17、C(O)R17、C(O)NHR17、C(O)NHNHR17、C(O)NH、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、NR17CH2OP(O)(OR18)2、NR17C(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NR17PO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)R18、NR17C(O)R18、OC(O)NHR18、NR17C(O)NHR18、NR17C(O)OR18、NR17C(O)SR18、NR17C(＝NH)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12糖苷)、NR17SO2(OR18)、NR17-(C4-C12糖苷)、C1-C8烷基、C3-C8羰烷基或杂环；
所述R17和R18独立地选自H,C1～C8烷基或杂烷基；C2～C8羰烷基、烯烃基、烷羰基、炔烃基或杂环基；C3～C8芳香基、环烷基或环烷羰基；
所述R19选自H、-OH、-NH2、-OSO2(OR18)、-XCH2OP(O)(OR18)2、-XPO(OR18)2、-XC(O)OP(O)(OR18)2、-XC(O)R18、-XC(O)NHR18、C1～C8烷基或羧酸衍生物，C2～C8烯烃基、炔烃基、烷羰基或羰烷基，C3～C8芳香基、环烷基或环烷羰基；或药用盐；
所述X选自-O-、-S-、或-NH-。
本发明还提供了一种以所述具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联，具有式II所示结构:
Figure GDA0001547895240000301
或者结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T为细胞表面受体结合分子；所述L和L’独立地为可解离的链接体；
所述-----代表L与括号内结构上的原子相连接的链接键和连接位点；
所述n为1～20的整数；所述m为1～10的整数；所述m’为0～10的整数；
当m’为0时，L’不存在；当m’不为0时，偶联物通过两个或以上的链接体连接细胞表面受体结合分子T；
所述的两个链接体分别连接式II所示结构中括号内所示结构上的两个位点，或此两个链接体再通过带支链的链接体连接结式II所示结构中括号内所示结构上的一个位点；
所述链接体L和L’的结构式独立地为—Ww-(Aa)r—Vv--；
所述W为延伸体，将目标结合分子单元T连接到氨基酸单元(Aa)上，若没有Aa时直接连接V；
所述单元W各自独立地包含一个自我分解的间隔体、肽单元、腙键、双硫键硫醚键、酯键、或胺键；所述w为0或者1；
所述Aa为天然氨基酸或非天然氨基酸单元；所述r为0至12的整数，所述(Aa)r为0～12个结构相同或不同的氨基酸单元；所述天然氨基酸或非天然氨基酸单元包括一肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元；
所述V为隔离体单元，所述隔离体单元独立地选自H、O、NH、S、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烯烃基、炔烃基；C3-C8芳基、杂芳基、杂环基、碳环基、杂烷基环烷基、烷基羰基；C4-C8烷基环烷基；1～4个氨基酸单元或(CH2CH2O)r；所述杂环基包括杂环烷基；所述炭环基包括环烷基；所述(CH2CH2O)r的r为0～12的整数；所述v为0，1或2；
所述细胞表面受体结合分子T为任何形式的细胞结合体，包括肽或类似肽的结构：抗体，单链抗体，可以与目标细胞结合的抗体片段，单克隆抗体，单链单克隆抗体，可以与目标细胞结合的单克隆抗体片段，嵌合抗体，可以与目标细胞结合的嵌合抗体片段，功能区抗体，可以与目标细胞结合的功能区抗体片段，仿抗体的基因工程蛋白质，纤连蛋白结合体adnectin，预设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)，淋巴因子，激素，维他命，生长因子，集落刺激因子，营养传送分子，转铁蛋白，或连接在白蛋白，高分子，树枝高分子，表面含有细胞结合分子高分子材料，脂质体，纳米颗粒，泡馕或(病毒)微囊上的结合肽、蛋白、抗体或细胞表面小分子配体。
本发明提供了一种以式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式III所示结构：
Figure GDA0001547895240000311
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T、L、L’、m、m’和n的定义与式II相同。
优选地，所述偶联物为具有式III-01～III-19所示结构中的一种：
Figure GDA0001547895240000312
Figure GDA0001547895240000321
Figure GDA0001547895240000331
Figure GDA0001547895240000341
所述n为1-20的整数；所述p为0-100的整数；
所述mAb为细胞结合分子，所述细胞结合分子包括抗体；
所述Z2和Z3的定义和前面所述定义相同；
所述X1、R1、R2、R3定义前面所述定义相同；所述M1和M2独立地选自H+、Na+、K+、Li+、NH4 +、N(R1R2R3R4)+或NH(C2H5OH)3 +的药学上可接受应用的盐离子。
本发明提供了一种以具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式IV所示结构：
Figure GDA0001547895240000342
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T、L、m和n的定义与式II相同。
优选地，所述具有式IV所示结构的偶联物为具有式IV-01～IV-11所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000351
Figure GDA0001547895240000361
所述n为1-20的整数；p为0-100的整数；
所述mAb是细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述Z2和Z3与前面所述定义相同；
所述X1、R1、R2和R3定义与前面所述相同，
所述M1和M2独立地选自药学上可接受应用的盐离子H+、Na+、K+、Li+、NH4 +、N(R1R2R3R4)+或NH(C2H5OH)3 +。
本发明的一个细胞结合受体分子-药物偶联物(共轭体)具有下面结构式V所示:
Figure GDA0001547895240000371
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11、R12、R13、R14、Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、T、L、m和n的定义同结构式(II)相同。
R9为-O-,-OR14,-OC(O)R14,-OC(O)NHR14，-OC(O)R14SSR15,或-OP(O)(OR14)O-，其中R14和R15分别为C1～C8烷基或杂烷基，C3～C8芳基，杂芳基，杂环基，碳环基，环烷基，烷基环烷基，杂环烷基，杂烷基环烷基，杂芳烷基，羰烷基或药物盐。另外，R9也可以空缺。
优选地，所述具有式V所示结构偶联物为具有式V-01～V-18所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000372
Figure GDA0001547895240000381
Figure GDA0001547895240000391
Figure GDA0001547895240000401
所述n为1-20的整数；所述p为1-100的整数；
所述mAb是细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述X1、Y7与前面所述定义相同；
所述Z2与前面所述定义相同。
一种以具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式VI所示结构:
Figure GDA0001547895240000411
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
所述T、L、m和n的定义与式II相同。
优选地，所述具有式VI所示结构的偶联物为具有式VI-01～VI-30所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000412
Figure GDA0001547895240000421
Figure GDA0001547895240000431
Figure GDA0001547895240000441
Figure GDA0001547895240000451
所述n为1-20的整数；p为0-100的整数；
所述mAb是细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述Z2和Z3定义同前
所述X1、R1、R2、R3定义与式I中的定义相同；
所述M1和M2独立地选自药学上可接受应用的盐离子H+、Na+、K+、Li+、NH4 +、N(R1R2R3R4)+或NH(C2H5OH)3 +。
本发明提供一种具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式VII所示结构:
Figure GDA0001547895240000452
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
所述T、L、m和n的定义与同式II相同。
优选地，所述偶联物为具有式VII-01～VII-15所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000461
Figure GDA0001547895240000471
所述n为1-20的整数；所述p为1-100的整数；
所述mAb是细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述X1、Z3的定义同前。
一种以具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式VIII所示结构:
Figure GDA0001547895240000481
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T、L、m和n的定义同前。
优选地，所述具有式VIII所示结构的偶联物为具有式VII-01～VII-43所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000482
Figure GDA0001547895240000491
Figure GDA0001547895240000501
Figure GDA0001547895240000511
Figure GDA0001547895240000521
Figure GDA0001547895240000531
所述n为1-20的整数；所述p为1-100的整数；
所述mAb为细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述Z2和Z3的定义同前。
本发明提供了一种以具有式I所示结构的毒性分子为母体的偶联物，具有式IX所示结构:
Figure GDA0001547895240000541
或者此结构式药学上可接受的盐，水合物或者水合盐；或者此化合物的多晶型物；或者此结构式的光学异构体；
所述T、L、L’、m、m’和n的定义与式II相同。
优选地，所述具有式IX所示结构的偶联物为具有式IX-01～IX-28所示结构中的一种:
Figure GDA0001547895240000542
Figure GDA0001547895240000551
Figure GDA0001547895240000561
Figure GDA0001547895240000571
Figure GDA0001547895240000581
Figure GDA0001547895240000591
所述n为1-20的整数；所述p为1-100的整数；
所述mAb是细胞结合分子，所述细胞结合分子包含抗体；
所述X1、X2的定义与式I中的定义相同；
所述Z2和Z3同前面所述。
本发明所述的毒性分子以及它们与本发明的细胞结合体所形成的共轭体通过本说明书后面的例子，但不限于这些例子，以及说明书附图1-60予以展现。
作为本发明具体的一种共轭链接体，特别是可解离的链接体(L)为一段含有C,N,O,S,Si或P原子的化学链。在共轭体中，该化学链一边与细胞结合体(T)通过共价键连接，另一边与Tubulysin衍生物通过共价键链接。链接体可以有长短不一的长度，例如从2到100个原子的长度都可以。链接体上的所有原子都可以用各种适当的化学方法连接在一起，比如用成烯，亚烯，炔，醚，聚氧化烯，酯，胺，亚胺，聚胺，肼，腙，酰胺，脲，氨基脲，二肼羰，烷氧基胺，脲乙烷，氨基酸，酰氧胺或异羟肟酸等连接方式。当然，这些可解离链接体上的原子既可以是饱和的，也可以是非饱和的，可以为自由基，可以相互成环而形成二价的环结构，比如环烷烃，环醚，环胺，亚芳基和杂亚芳基等。
可解离的链接体一般指至少含有一个能在生理条件下被解离的化学键，比如对pH敏感，对酸不稳定，对碱不稳定，容易被氧化，容易被代谢，生化上不稳定，或者容易被酶解的化学键。应当说明的是，这种能使化学键断裂的生理条件并不必须是一个生物或代谢过程，常规的化学过程也应该完全可以，例如水解或取代反应。由于核内体比细胞溶质的pH更低，能在酸性条件下水解的化学键是一种很好的选择。同样的道理，考虑到肿瘤细胞内的谷胱甘肽浓度高达毫摩尔级，巯基与双硫键的交换反应也是可行的做法。
本发明的可解离链接体L的结构可以表达为：—Ww—(Aa)r—Vv—，其中—W—指延伸体，w为0或1，—Aa—为氨基酸单元，r为0至12的整数，—V—指间隔体，v为1或2。
当延伸体—Ww—存在时，它起着连接着细胞结合体(T)和氨基酸单元—Aa—或间隔体—V—(当—Aa—不存在时)的作用。延伸体W中可以包含一个能够自我分解的隔离体，多肽单元，腙键，双硫键或者硫醚键。显然，细胞结合体(T)含有一个能够与延伸体上相应功能团成键的基团。在细胞结合体上原本存在或通过化学方式产生的可连接的功能团包括但不限于：巯基，氨基，羟基，羰基，糖的羟基，以及羧基等，最好的功能团为巯基，羧基和氨基。巯基可以通过还原细胞结合体(如抗体)分子内的双硫键生成。此外，巯基也可以或者通过利用2-亚氨基硫烷(Traut试剂)或者硫内酯与细胞结合体上赖氨酸中的氨基反应生成，或者应用其他的巯基生成方法，比如先用含双硫键的链接体或硫酯修饰细胞结合体，再分别通过还原或水解生成巯基。
一些连接在T上的W的实施例见下：
Figure GDA0001547895240000601
Figure GDA0001547895240000611
Figure GDA0001547895240000621
这里R20，R21选自–C1～C9亚烃基-，-C1～C7碳环基-，-O-(-(C1～C8烷基)-，-亚芳基-，-C1～C9亚烃基-亚芳基-，-亚芳基，-C1～C9亚烃基，-C1～C9亚烃基-(C1～C8碳环基)-,-(C3～C8碳环基)-C1～C9亚烃基-，-C3～C8杂环基-，-C1～C10亚烃基-(C3～C8杂环基)-，-(C3～C8杂环基)-C1～C9亚烃基-，-(CH2CH2O)k-,-(CH(CH3)CH2O)k-以及–(CH2CH2O)k-CH2-；k为1-20之间的整数；R’和R”分别为H或CH3。
前述W和T的共价连接可以通过各种化学反应实现。
例如形成酰胺键:
Figure GDA0001547895240000622
其中延伸体单元含有一个活性反应基团E，E可以与细胞结合体上的伯胺或仲胺生成酰胺键。可行的活性反应位E包括但不限于羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和S-NHS等)，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)，酸酐，酰氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯等。
下面是用硫醚或双硫键连接的例子:
Figure GDA0001547895240000623
Figure GDA0001547895240000631
其中延伸体单元含有一个能够参与反应的巯基，它可以和细胞结合体T之间形成硫醚或双硫键。为形成双硫键，细胞结合体T上的巯基既可以通过还原其内的分子内双硫键生成，也可以通过其他化学过程修饰细胞结合体T而生成；R20,R’,R”,J,和T定义同前面或本说明书中所述。
延伸体上也可以有一个能够与醛基或酮基反应的活性基团。通过适当的化学修饰，这样的醛基或酮基可以被引入到细胞结合体T的适当位置。比如，在细胞结合体T的糖上，通过用氧化剂例如高碘酸钠氧化就可以生成醛基或酮基。再比如，抗体(或蛋白质或多肽)N端氨基酸上的胺基可以和5-磷酸吡哆醛(PLP)反应而引入酮基。这些醛基或酮基(-C＝O)可以和延伸体上的活性反应基团例如酰肼，肟，伯胺或仲胺，肼，缩氨基硫脲，肼羧酸酯或芳基肼反应，从而将二者连接在一起。
下面是用腙，肟或亚胺连接的例子：
Figure GDA0001547895240000641
其中R20和R21的定义如前所述，R25指一个氨基酸的有机取代物，或糖苷或H。
延伸体(可以含有一个隔离体V以及或一个氨基酸)可以先和细胞结合体T链接，然后再将这个细胞结合体-延伸体片段与一个Tubulysin衍生物共轭连接，连接过程可以在缓冲水溶液里进行。下面是一些按照这种方式分两步共轭连接的例子(连接在R16上的细胞毒素分子(Tubulysin衍生物)被省略)：
Figure GDA0001547895240000642
Figure GDA0001547895240000651
其中E包括但不仅限于羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和S-NHS等)，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)，酸酐，酰氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯等；R’和R”分别为H或CH3；R20，R16和Ar的定义同前；R26为H，F或NO2；J为F，Cl，Br，I，甲苯磺酸酯基(TsO)或甲磺酸酯基(MsO)；上述结构中
Figure GDA0001547895240000652
含有至少一个Tubulysin衍生物或其他药物或细胞毒素分子，结构如
Figure GDA0001547895240000653
(
Figure GDA0001547895240000654
为省略标志)；含T环状二硫结构特指细胞结合分子内二硫键。
延伸体也可以先和Tubulysin衍生物链接，然后再与细胞结合体T在pH为3-10(最好为pH 5.0-8.5)的水溶液(可含有上限至50％的有机溶剂)中共轭连接。
下面是一些按照这种方式分两步共轭连接的例子：
Figure GDA0001547895240000655
Figure GDA0001547895240000661
其中E包括但不仅限于羟基琥珀酰亚胺酯(NHS和S-NHS等)，4-硝基苯基酯，五氟苯基酯，四氟苯基酯(包括S-四氟苯基酯)，酸酐，酰氯，磺酰氯，异氰酸酯和异硫氰酸酯等；R’和R”分别为H或CH3；R20，R16和Ar的定义同前；R26为H，F或NO2；J为F，Cl，Br，I，甲苯磺酸酯基(TsO)或甲磺酸酯基(MsO)；上述结构中
Figure GDA0001547895240000662
含有至少一个Tubulysin衍生物或其他药物结构，如
Figure GDA0001547895240000663
(
Figure GDA0001547895240000664
为省略标志)。
当氨基酸单元(--Aa--)存在时，它连接延伸体和隔离体，当隔离体缺失时，它连接延伸体和Tubulysin衍生物，如果延伸体和隔离体都缺失时，它直接连接细胞结合体T和Tubulysin衍生物。--(Aa)r—可以是天然或非天然氨基酸，可以是二肽，三肽，四肽，五肽，六肽，七肽，八肽，九肽，十肽，十一肽或者十二肽单元，r为0-12之间的整数。在这里，氨基酸概括地指氨基烷基羧酸，其中烷基可以是被诸如烷基，酰基，羟烷基，巯烷基，氨烷基或羧烷基等基团所取代的烷基。天然及非天然氨基酸和多肽的结构在G.C.Barrett和D.T.Elmore所著的《Amino Acid and Peptides》(Cambridge University Press,2004)书里有很好的说明。另外，氨基酸也指贝塔氨基酸，伽马氨基酸和分子内含有甲基，苄基，羟甲基，巯甲基，羧基，羧甲基或胍基丙基等的长链氨基酸。最好的氨基酸为精胺酸，天冬酰胺酸，天冬氨酸，瓜氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，谷氨酸，亮氨酸，赖氨酸，谷氨酰胺，丝氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，酪氨酸和缬氨酸等。
本发明的氨基酸单元可以被一种或多种酶包括在肿瘤中存在的蛋白水解酶所酶解而释放出Tubulysin衍生物。在一实施说明中，它先在体内被质子化，然后成为质子化的Tubulysin衍生物。
当隔离体(-V-)存在时，它连接氨基酸单元和Tubulysin衍生物，当氨基酸单元缺失时，它连接延伸体和Tubulysin衍生物。当氨基酸单元和延伸体都缺失时，隔离体连接Tubulysin衍生物和细胞结合分子T。隔离体中可以包含一些功能团，可以用这些功能团提高共轭体的水溶性，生物传送，适宜的肾清除，摄入，吸收，生物分布，以及生物利用度。隔离体有两种基本类型：自毁灭型和非自毁灭型。非自毁灭型隔离体指在一个氨基酸单元从Tubulysin衍生物-链接体-细胞结合体中或Tubulysin衍生物-链接体中断裂特别是酶解之后，部分或全部的隔离体仍然连接在Tubulysin衍生物上。
下面是一些自毁灭型隔离体的例子：
Figure GDA0001547895240000671
可解离的链接体，Tubulysin衍生物或细胞结合体T的接入点；这里X，Y和Z3分别为NH,O或S；这里Z2为H，NH，O或S；v为0或1；Q为H,OH,C1～C6烷基，(OCH2CH2)n，F,Cl,Br,I,OR17,or SR17,NR17R18,N＝NR17,N＝R17,NR17R18,NO2,SOR17R18,SO2R17,SO3R17,OSO3R17,PR17R18,POR17R18,PO2R17R18,OPO(OR17)(OR18),OCH2PO(OR17(OR18)或糖苷，其中R17和R18分别为H，C1-C8烷基，C2-C8烯烃基，炔烃基，杂烷基，C3-C8芳基，杂环基，碳环基，环烷基，杂环烷基，杂芳烷基，烷羰基或可以药用的正离子盐。
下面是一些非自毁灭型隔离体的例子：
*(CH2CH2O)n*；
Figure GDA0001547895240000672
Figure GDA0001547895240000673
Figure GDA0001547895240000681
Figure GDA0001547895240000691
其中用(*)标记的原子是隔离体、可解离的链接体，Tubulysin衍生物或细胞结合体的接入点；Q为上面所述，m为1～10；n为1～20。
细胞结合体T可以是任何一种已知的能够与目标细胞上可以被用于治疗或改性的片段结合、络合或反应的分子。通过与特定的目标细胞结合作用，细胞结合体把Tubulysin衍生物传送到这样的目标细胞。
细胞结合体包括但不限于大分子量的蛋白，例如完整抗体(多克隆或者单克隆)；单链抗体；抗体片段如Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv[Parham,J.Immunol.131,2895-2902(1983)],Fab表达库产生的片段，抗个体遗传型的抗体(anti-Id)，CDR's，任何能与癌细胞的抗原表位、病毒抗原表位或微生物抗原表位特异结合的上述物的片段；干扰素(I,II,III型)；多肽；淋巴因子如IL-2,IL-3,IL-4,IL-6,GM-CSF,或IFN-γ；激素如胰岛素，促甲状腺激素释放激素(TRH)，黑素细胞刺激激素(MSH)，类固醇激素如雄激素，***，或促黑激素(MSH)；生长因子和集落刺激因子如表皮生长因子(EFG)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，转化生长因子(TGF)如TGFα，TGFβ，胰岛素和类胰岛素生长因子(IGF-I，IGF-II)G-CSF，M-CSF和GM-CSF[Burgess,Immunology Today,5,155-158(1984)]等；疫苗生长因子(VGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；小分子量蛋白，多肽，肽和肽激素，例如蛙皮素，胃泌激素和胃泌素释放肽；血小板源生长因子；白细胞介素和细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，白血病抑制因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和维生素如叶酸；脱辅基蛋白和醣蛋白如转铁蛋白[O’Keefe et al,J.Bio.Chem.260,932-927(1985)]；糖结合蛋白或脂蛋白如凝集素；细胞营养传送分子；以及小分子抑制剂如***特异性膜抗原(PSMA)抑制剂，小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，非肽或其它细胞结合分子或物质，例如生物活性高分子(Dhar,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.2008,105,17356-61)，树形高分子(Lee,etal,Nat.Biotechnol.2005,23,1517-26；Almutairi,et al；Proc.Natl.Acad.Sci.2009,106,685-90)，纳米颗粒(Liong,et al,ACS Nano,2008,19,1309-12；Medarova,et al,Nat.Med.2007,13,372-7；Javier,et al,Bioconjugate Chem.2008,19,1309-12)，脂质体(Medinai,et al,Curr.Phar.Des.2004,10,2981-9)，病毒衣壳(Flenniken,et al,VirusesNanotechnol.2009,327,71-93)，尤其是这些高分子或颗粒表面附着能同靶细胞进行结合的分子。一般地说，如果有合适的单克隆抗体，单克隆抗体是最好的细胞结合体。
在与Tubulysin衍生物共轭结合之前，通过使用含双功能团的交联剂修饰，细胞结合体可以先连上特定的多肽，蛋白，药物分子或其他功能性分子。这些含双功能团的交联剂可以是胺-非选择性功能团交联剂(琥珀酰亚胺(NHS)-二氮环丙烯(SDA),琥珀酰亚胺酯-叠氮化物),胺基-巯基交联剂(NHS酯-马来酰亚胺,NHS酯-吡啶二巯基，NHS酯-卤代乙酰基)，巯基-糖交联剂(马来酰亚胺-酰肼,吡啶二巯基-酰肼)，羟基-巯基交联剂(异氰酸酯-马来酰亚胺)，胺-DNA交联剂(NHS酯/补骨脂素)和胺-羧基交联剂(碳二亚胺)等。
在使用琥珀酰亚胺(NHS)-二氮环丙烯(SDA)交联剂的修饰方法中，交联剂上的NHS酯可以首先和细胞结合体骨架上的胺基反应(在pH为6-9的缓冲溶液里)，这将形成一个稳定的酰胺键。然后，通过用波长为330-370nm的长波照射，二氮环丙烯被活化并产生卡宾活性中间体，该中间体和特异性多肽、蛋白或者其他功能性分子上的胺基反应后即可完成连接。这两步反应的次序也可以改变为：先让功能性分子上的胺和交联剂上的NHS酯反应，然后再在光(330-370nm)的照射下与细胞结合体进行化学反应。琥珀酰亚胺(NHS)-二氮环丙烯(SDA)交联剂也可以是可解离式的(就像其中有双硫键存在的SDAD交联剂一样)。
Figure GDA0001547895240000711
其中
Figure GDA0001547895240000712
是细胞结合分子骨架，
Figure GDA0001547895240000713
是功能分子。
在使用NHS酯-叠氮化物交联剂的修饰方法中，交联剂上的NHS酯可以首先和细胞结合体骨架上的胺基反应(在pH6-9的缓冲溶液里)，这将形成一个稳定的酰胺键。然后，通过Huisgen叠氮-炔环加成反应，特定的多肽、蛋白质或其他功能性分子上的炔基和交联剂另一端的叠氮进行反应，并形成1,2,3-***链接体。另外，这个交联剂的NHS酯也可以先与功能性分子上的胺基反应形成稳定的酰胺键(在pH为6-9的缓冲溶液里)，然后再用结合体上的炔基与交联剂另一端的叠氮基团进行Huisgen叠氮-炔环加成反应，并形成1,2,3-***链接体。
Figure GDA0001547895240000714
上述叠氮集团也可通过抗体工程引入含叠氮的非天然氨基酸，或利用抗体工程引入糖苷，化学降解，和糖苷转移酶转移引入含叠氮的糖苷，然后进行进行Huisgen叠氮-炔环加成反应(点击化学反应)。
在使用胺基-巯基交联剂的修饰方法中，交联剂上的NHS酯可以首先和细胞结合体骨架上的胺基反应(在pH＝6～9的缓冲溶液里)，这将形成一个稳定的酰胺键。然后，在pH为4.5～8.5的条件下，特定的多肽、蛋白质或其他功能性分子上的巯基和交联剂另一端的马来酰亚胺，吡啶二巯基或卤代乙酰基反应，并形成硫醚或双硫键。这种交联反应的次序也可以根据情况改变。比如，功能性分子上的氨基也可以首先和交联剂反应生成酰胺键，然后再与细胞结合体上的巯基进行反应。再比如，在pH为4.5～7.0的条件下，功能性分子上的巯基可以先与交联剂反应形成硫醚或者双硫键，然后再在pH为6～9的条件下与细胞结合体上的氨基反应形成酰胺键。
Figure GDA0001547895240000721
在使用巯基-糖交联剂的修饰方法中，在pH为4.5～8的条件下，细胞结合体上的巯基可以首先与交联剂上的马来酰亚胺或吡啶二巯基反应形成硫醚或双硫键。然后，功能性分子上的羰基(醛或酮)再与酰肼反应生成腙键。除此以外，在pH为4.5～8的条件下，功能分子上的巯基也可以首先和交联剂反应形成硫醚或者双硫键，然后再与细胞结合体上的糖、氧化糖或者羰基(醛或酮)反应生成腙键。
Figure GDA0001547895240000722
在使用羟基-巯基交联剂的修饰方法中，在pH为6～8的条件下，细胞结合体上的巯基可以首先和交联剂上的马来酰亚胺或者吡啶二巯基反应生成硫醚或双硫键。然后，在pH为8～9的条件下，再让功能性分子上的羟基与交联剂上的异氰酸酯反应生成氨基甲酸酯。另外，功能性分子上的巯基也可以先和交联剂在pH为6～8的条件下反应生成硫醚或双硫键。然后，再与细胞结合体上的羟基在pH为8～9的条件反应生成氨基甲酸酯。
Figure GDA0001547895240000723
在使用巯基反应***联剂的直接式修饰方法中，交联剂上的巯基反应性基团可以和细胞结合体骨架上的巯基或硒基反应(在pH＝6～9的缓冲溶液里)，形成一个稳定的硫醚、硒醚键或双硫键。首先，在pH为4.5～8.5的条件下，特定的多肽、蛋白质、抗体(尤其是IgG1、Ig/2、IgG3或IgG4单抗)或其他功能性分子上的二硫基、或通过基因工程改造引入的二硫基、二硒基或硫硒基和TCEP或DTT或2-巯基乙醇发生还原反应，形成巯基或硒基基团。细胞结合分子纯化后和交联剂反应，并形成硫醚、硒醚键或双硫键。在用TCEP的还原过程中，TCEP可以无需反应体系中去除，直接同交联剂反应(或直接同交联剂一起加入体系中)，或者可以待TCEP还原反应完后加入叠氮化合物，中和过量的TCEP，然后加入交联剂进行偶联反应。此种巯基偶联反应可以单一地偶联细胞结合体上一个巯基，也可以同时对二巯基形成搭桥式的偶联反应
Figure GDA0001547895240000731
在另外实施例中，当共轭偶联体上每个连接体连接有两分子的细胞毒素分子，这些共轭体具有以下的结构通式：
Figure GDA0001547895240000732
Figure GDA0001547895240000741
其中D1和D2为细胞毒素分子或药物，独立地选结构式(I)的Tubulysin衍生物；T为靶向或结合配体，或者细胞结合分子。X1、X2、X3和X4独立地是NH、NR1、O、S、CH2、Se和NHNH；R1、R2、n和L定义如结构式(II)所述。此外当D1和D2中的任何一个结构式(I)或I-01至I-67中的Tubulysin衍生物；另外的一个细胞毒素分子或药物D可以选自可以有效治疗癌症的化学分子，例如卡奇霉素，美登素衍生物，海兔毒素(dolastatins)，CC-1065类似物，阿霉素，紫杉烷衍生物，吡咯苯二氮卓(PBD)二聚体，tomaymycin二聚体,anthramycin二聚体,indolinobenzodiazepines二聚体,imidazobenzothiadiazepines二聚体,或oxazolidinobenzodiazepines二聚体，amatoxins，indolecarboxamide,actinomycin,azaserines,bleomycins,epirubicin,eribulin,tamoxifen,idarubicin,阿里他汀(auristatins),(单甲基阿里他汀E,MMAE,MMAF,阿里他汀PYE,,阿里他汀TP,dolastatins2-AQ,6-AQ,EB(AEB),and EFP(AEFP)),duocarmycins,geldanamycins，HSP90抑制剂,centanamycin,methotrexates,噻替哌,vindesines,vincristines,hemiasterlins,nazumamides,microginins,radiosumins,streptonigtin,SN38和其衍生物，或喜树碱代谢产物,alterobactins,microsclerodermins,theonellamides,esperamicins,PNU-15968，siRNA，或分子量小于100KD的聚乙烯乙二醇(PEG)、或以上物质的组合，药学上可接受的盐和酸，或者是以上物质的衍生物。
本发明的细胞结合分子优选为抗体，主要是单克隆抗体。抗体的生产包括其在生物体内、体外的产生过程或者组合过程。抗受体肽段的的多克隆抗体的生产方法已是众所周知，如美国专利编号4,493,795(Nestor等)。制备单克隆抗体的经典方法是采用特定抗原免疫小鼠，分离得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合(Kohler,G；Milstein,C.1975Nature256:495-497)。详细的操作步骤见antibodies-A Laboratory Manual,Harlow and Lane,eds.,cold spring harbor laboratory press,new York(1988)),此方法移收入本文所引用的文献。特别地是，可通过运用目的抗原免疫小鼠，大鼠，仓鼠或者其他哺乳动物的方法来获得特殊的单克隆抗体。其中目的抗原包括：完整的细胞，从细胞中分离得到的抗原，完整的病毒，弱化的完整病毒以及病毒蛋白。采用PEG6000将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合后得到的杂交瘤，利用其对HAT的敏感性，对其进行筛选。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体通过其与特定的靶细胞受体发生免疫反应或者抑制受体活性，这在实施这项发明中起作用。
融合后得到的单克隆杂交瘤细胞可分泌针对特定抗原的单克隆抗体。目前，发明中使用的单克隆抗体，正是通过在营养丰富的培养基中培养单克隆杂交瘤细胞从而富集抗体。培养条件需确保杂交瘤细胞有足够的时间将产生的抗体分泌进入培养基中。将含抗体的培养上清收集后，通过人们所熟知的技术对抗体进行纯化。分离方法包括：蛋白A亲和层析法；阴离子交换层析法，阳离子交换层析法，疏水层析法以及分子筛层析法(特别是运用抗原交联蛋白A的亲和层析法以及分子筛层析法运用较为广泛)；离心法；沉淀法或其它标准的纯化方法
杂交瘤培养所需有效培养基以及人工合成培养基可以通过技术合成或者商业途径获取。其中，典型的人工合成培养基：DMEM(Dulbecco等Virol 8：396(1959))加入4.5mg/L葡萄糖，20mM谷氨酰胺，20％胎牛血清以及消泡剂，如：聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物
除细胞融合技术外，构建生产抗体的细胞系还可以通过其它方法，如：直接将肿瘤原性DNA转染B淋巴细胞，或者将致癌病毒基因(如：EBV又称HHV-4或KSHV)导入B淋巴细胞，详见美国专利编号.4341761；4399121；4427783；4444887；4451570；4466917；4472500；4491632；4493890.单克隆抗体还可以通过抗受体多肽或者含羧基末端的多肽来制备。详见Niman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4949-4953(1983)；Geysen等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:178-182(1985)；Lei等Biochemistry 34(20):6675-6688(1995)。通常，抗受体多肽或者多肽类似物可以单独使用或者交联免疫原性载体来作为免疫原制备抗受体多肽的单克隆抗体。
发明中作为结合分子的抗体还有其它成熟的生产方法。其中特别受关注的是生产全人源抗体的工艺方法。噬菌体展示技术通过亲和筛选从全人源抗体文库中获得与已知抗原特异性结合的全人源抗体。噬菌体展示技术本身，载体构建以及文库筛选都在文献中有详尽的记录。详见Dente等Gene.148(1):7-13(1994)；Little等Biotechnol Adv.12(3):539-55(1994)；Clackson等Nature352:264-628(1991)；Huse等Science 246：1275-1281(1989)。
运用杂交瘤技术通过其它种属(如：小鼠、兔子、羊驼)获得的单克隆抗体需对其进行人源化改造。经过改造的抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。其中，抗体的人源化较为常见的方法是互补决定域的移植与重塑。详见：美国专利编号5859205及6797492；Liu等,Immunol Rev.222:9-27(2008)；Almagro等，Front Biosci.1；13:1619-33(2008)；Lazar等MolImmunol.44(8):1986-98(2007)；Li等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(10):3557-62(2006)上述文章作为参考文献并入本文。全人源抗体也可以通过抗原免疫携带大量人免疫球蛋白轻链及重链的转基因小鼠，兔子，猴子等其它哺乳动物来制备。以小鼠为例：Xenomouse(Abgenix，Inc.),HuMab-Mouse(Medarex/BMS),VelociMouse(Regeneron),详见：美国专利编号:6596541,6207418,6150584,6111166,6075181,5922545,5661016,5545806,5436149以及5569825。人类治疗过程中，将鼠源抗体可变区基因与人源抗体恒定区基因整合构建的嵌合抗体在人体中所产生的免疫源性反应要大大低于鼠抗(Kipriyanov等，Mol Biotechnol.26:39-60(2004)；Houdebine,Curr Opin Biotechnol.13:625-9(2002)上述文章作为参考文献并入本文.此外，对抗体可变区的部分位点进行定点突变可以有效提高抗体的亲和力和特异性(Brannigan等，NatRev Mol Cell Biol.3:964-70(2002)；Adams等，J Immunol Methods.231:249-60(1999))。对抗体恒定区进行部分替换也可以有效增进其与免疫效应因子的亲和力从而增强细胞毒性作用,或者减少抗体对正常器官组织(如肝胀组织Fc-γ结合体)的亲和力，从而减少毒副作用。
对恶性细胞抗原有免疫特异性的抗体，可以通过商业途径或者一些成熟的技术方法来获得，如：化学合成或者重组表达技术。这类抗体的编码基因同样可以通过一些商业途径，如GenBank数据库或者其它类似的数据库，出版文献，或者常规的克隆测序方法来获得。
除抗体以外，多肽或者蛋白也同样可以作为结合分子来结合，阻断、进攻或通过其它方式与靶细胞表面相对应的受体或者表位相互作用。只要这些多肽或者蛋白能特异结合特定表位或其对应受体，那么它们不一定要属于免疫球蛋白家族。这些多肽也可以通过类似噬菌体展示抗体的技术来进行分离(Szardenings,J Recept Signal TransductRes.2003，23(4):307-49)。从随机的多肽文库获取的肽段与抗体及抗体片段的应用相似。多肽或蛋白分子可通过其结合分子与一些大分子或介质连接来保持其抗原结合的特异性。这些大分子及介质包括：白蛋白、聚合物、脂质体、纳米颗粒或者树状聚合物。
在癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病的治疗中，用于偶联Tubulysin衍生物的抗体举例如下(但不限于此)：3F8(抗GD2抗体)，阿巴伏单抗(抗CA-125抗体)，阿昔单抗(抗CD41抗体(整合素α-IIB)，阿达木单抗(抗-TNF-α抗体)，阿德木单抗(抗-EpCAM抗体，CD326)，阿非莫单抗(抗-TNF-α)；阿夫土珠(抗-CD20抗体)，Alacizumabpegol(抗VEGFR2抗体)，ALD518(抗-IL-6抗体)，阿仑单抗(别名：Campath，MabCampath，坎帕斯，抗CD52抗体)，阿妥莫单抗(抗CEA抗体)，Anatumomab(抗-TAG-72抗体)，Anrukinzumab(别名：IMA-638，抗-IL-13抗体)，阿泊珠单抗(抗-HLA-DR抗体)，阿西莫单抗(抗CEA抗体)，阿塞珠单抗(抗-L-选择素(CD62L)抗体，Atlizumab(别名：托珠单抗，Actemra，RoActemra，抗-IL-6受体抗体)，Atorolimumab(抗恒河猴因子抗体)，bapineuzumab(抗β-淀粉样蛋白抗体)，巴利昔单抗(舒莱，antiCD25(IL-2受体的α链)抗体，巴维昔单抗(抗磷脂酰丝氨酸抗体)，贝妥莫单抗(别名：LymphoScan，抗-CD22抗体)，贝利木单抗(别名：Benlysta，LymphoStat-B，抗BAFF抗体)，Benralizumab(抗CD125抗体)，柏替木单抗(抗CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)抗体)，贝索单抗(别名：Scintimun，抗CEA-相关抗原抗体)，贝伐单抗(别名：阿瓦斯丁，抗VEGF-A抗体)比西单抗(别名：FibriScint，抗血纤维蛋白Ⅱβ链抗体)，Bivatuzumab(抗CD44v6抗体)，blinatumomab(别名：BiTE，抗CD19抗体)，Brentuximab(CAC10，抗-CD30，TNFRSF8抗体)，Briakinumab(抗-IL-12，IL-23抗体)，康纳单抗(别名：Ilaris，抗-IL-1抗体)，Cantuzumab(别名：C242，抗CanAg抗体)，卡罗单抗，卡妥索单抗(别名：removab，抗EpCAM，抗-CD3抗体)，CC49(抗-TAG-72抗体)，Cedelizumab(抗CD4抗体)，赛妥珠单抗(别名Cimzia抗TNF-α抗体)，西妥昔单抗(别名：爱必妥，IMC-C225，抗-EGFR抗体)，西他土珠(抗-EpCAM抗体)，Cixutumumab(抗-IGF-1抗体)，克立昔单抗(抗CD4抗体)，Clivatuzumab(抗MUC1抗体)，Conatumumab(抗-TRAIL-R2抗体)，CR6261(抗A型流感血凝素抗体)，Dacetuzumab(抗-CD40抗体)，达利珠单抗(别名：赛尼哌，抗CD25(IL-2受体的α链)抗体)，Daratumumab(抗-CD38(环化ADP核糖水解酶)抗体)，，狄诺塞麦(别名：Prolia，抗RANKL抗体)，地莫单抗(抗B-淋巴瘤细胞抗体)，阿托度单抗，Dorlixizumab，Ecromeximab(抗-GD3神经节苷脂抗体)，依库丽单抗(别名：Soliris，抗-C5抗体)，埃巴单抗(抗内毒素抗体)，依决洛单抗(别名：Panorex，MAb17-1A，抗-EpCAM抗体)，依法利珠单抗(别名：Raptiva，抗LFA-1(CD11a)抗体)，依芬古单抗(别名：Mycograb，抗Hsp90抗体)，Elotuzumab(抗SLAMF7抗体)，伊斯利莫(抗IL-6抗体)，恩莫单抗(抗ICAM-1(CD54)抗体)，Epitumomab(抗episialin抗体)，依帕珠单抗(抗-CD22抗体)，Erlizumab(抗ITGB2(CD18)抗体)，Ertumaxomab(别名：Rexomun，抗HER2/neu，CD3抗体)，伊瑞西珠(别名：Abegrin，抗整合素αvβ3抗体)，艾韦单抗(抗乙型肝炎表面抗原抗体)，Fanolesomab(别名：NeutroSpec，抗CD15抗体)，法拉莫单抗(抗干扰素受体抗体)，Farletuzumab(抗叶酸受体1抗体)，Felvizumab(抗呼吸道合胞病毒抗体)，Fezakinumab(抗IL-22抗体)，Figitumumab(抗IGF-1受体抗体)，Fontolizumab(抗IFN-γ抗体)，夫瑞韦如(抗狂犬病毒糖蛋白抗体)，Fresolimumab(抗TGF-β抗体)，加利昔单抗(抗CD80抗体)，Gantenerumab(抗-β淀粉样蛋白抗体)，Gavilimomab(抗-CD147(basigin)抗体)，吉妥单抗(抗CD33抗体)，Girentuximab(抗碳酸酐酶9抗体)，Glembatumumab(别名：CR011，抗GPNMB抗体)，戈利木单抗(别名：SIMPONI，抗TNF-α抗体)，Gomiliximab(抗CD23(IgE受体)抗体)，Ibalizumab(抗CD4抗体)，替伊莫单抗(抗CD20抗体)，伊戈伏单抗(别名：Indimacis-125，抗CA-125抗体)，英西单抗(别名：Myoscint，抗心肌肌球蛋白抗体)，英夫利昔单抗(别名：英利昔单抗，抗TNF-α抗体)，Intetumumab(抗CD51抗体)，伊诺莫单抗(抗CD25(IL-2受体α链)抗体)，Inotuzumab(抗CD22抗体)，易普利姆玛(抗CD152抗体)，Iratumumab(抗CD30(TNFRSF8)抗体)，Keliximab(抗CD4抗体)，Labetuzumab(别名：CEA-Cide，抗CEA抗体)，Lebrikizumab(抗IL-13抗体)，Lemalesomab(抗NCA-90(粒细胞抗原)抗体)，乐德木单抗(抗TGFβ-2抗体)，来沙木单抗(抗TRAIL-R2抗体)，利韦单抗(抗乙型肝炎表面抗原抗体)，林妥珠单抗(抗CD33抗体)，Lucatumumab(抗CD40抗体)，鲁昔单抗(抗CD23(IgE受体)抗体)，Mapatumumab(抗TRAIL-R1抗体)，马司莫单抗(抗T-细胞受体抗体)，马妥珠单抗(抗-EGFR抗体)，美泊利单抗(别名：Bosatria，抗IL-5抗体)，Metelimumab(抗TGFβ-1抗体)，Milatuzumab(抗CD74抗体)，Minretumomab(抗TAG-72抗体)，米妥莫单抗(别名BEC-2，抗-GD3神经节苷脂抗体)，Morolimumab(抗恒河猴因子抗体)，莫维珠单抗(别名：NUMAX，抗呼吸道合胞病毒抗体)，莫罗单抗-CD3(别名：OKT3，ORTHOCLONE，抗CD3抗体)，他那可单抗(抗C242抗体)，他那莫单抗(抗5T4抗体)，那他珠单抗(别名：Tysabri，抗整合素α4抗体)，奈巴库单抗(抗内毒素抗体)，Necitumumab(抗EGFR抗体)，Nerelimomab(抗TNF-α抗体)，尼妥珠单抗(别名：Theracim，Theraloc，抗EGFR抗体)，Nofetumomab，ocrelizumab(抗CD20抗体)，奥度莫单抗(别名：Afolimomab，抗LFA-1(CD11A)抗体)，木单抗(别名：Arzerra，抗CD20抗体)，Olaratumab(抗PDGF-Rα抗体)，奥马珠单抗(别名：索雷尔，抗IgEFc区抗体)，Oportuzumab(抗EpCAM抗体)，奥戈伏单抗(别名：OvaRex，抗CA-125抗体)，Otelixizumab(抗CD3抗体)，帕吉昔单抗(抗脂磷壁酸抗体)，帕利珠单抗(别名：Synagis，Abbosynagis，抗呼吸道合胞病毒抗体)，帕尼单抗(别名：维克替比，ABX-EGF，抗-EGFR抗体)，Panobacumab(抗绿脓杆菌抗体)，Pascolizumab(抗IL-4抗体)，Pemtumomab(别名：Theragyn，抗MUC1抗体)，帕妥珠单抗(别名：OMNITARG，2C4，抗HER2/neu抗体)，培克珠单抗(抗C5抗体)，Pintumomab(抗腺癌抗原抗体)，普立昔单抗(抗CD4抗体)，普托木单抗(抗波形蛋白抗体)，PRO140(抗CCR5抗体)，Racotumomab(别名：1E10，抗-(N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc，NGNA)-神经节苷脂GM3)抗体)，瑞非韦鲁(抗狂犬病毒糖蛋白抗体)，Ramucirumab(抗VEGFR2抗体)，雷珠单抗(别名：Lucentis，抗VEGF-A抗体)，瑞西巴库(抗炭疽毒素，保护性抗原抗体)，瑞加韦单抗(抗巨细胞病毒的糖蛋白B抗体)，Reslizumab(抗IL-5抗体)，Rilotumumab(抗HGF抗体)，利妥昔单抗(别名：美罗华，Rituxanmab，抗CD20抗体)，Robatumumab(抗IGF-1受体抗体)，Rontalizumab(抗IFN-α抗体)，Rovelizumab(别名：LeukArrest，抗CD11，CD18抗体)，Ruplizumab(别名：Antova，抗CD154(CD40L)抗体)，沙妥莫单抗(抗TAG-72抗体)，司韦单抗(抗巨细胞病毒抗体)，Sibrotuzumab(抗FAP抗体)，Sifalimumab(抗IFN-α抗体)，Siltuximab(抗IL-6抗体)，Siplizumab(抗CD2抗体)，(Smart)MI95(抗CD33抗体)，Solanezumab(抗β-淀粉样蛋白抗体)，Sonepcizumab(抗神经鞘氨醇-1-磷酸抗体)，索土珠单抗(抗episialin抗体)，司他莫鲁(抗肌肉生长抑制素抗体)，硫索单抗(别名：LeukoScan，(抗-NCA-90(粒细胞抗原)抗体)))，Tacatuzumab(抗α-甲胎蛋白抗体)，他度珠单抗(抗整合素αIIbβ3抗体)，他利珠单抗(抗IgE抗体)，他尼珠(抗NGF抗体)，Taplitumomab(抗CD19抗体)，Tefibazumab(别名：Aurexis，抗聚集因子A抗体)，阿替莫单抗，Tenatumomab(抗固生蛋白C抗体)，替奈昔单抗(抗CD40抗体)，Teplizumab(抗CD3抗体)，TGN1412(抗CD28抗体)，Ticilimumab(别名：Tremelimumab(抗CTLA-4抗体)，Tigatuzumab(抗TRAIL-R2抗体)，TNX-650(抗IL-13抗体)，托珠单抗(别名Atlizumab，Actemra，RoActemra，(抗IL-6受体抗体)，Toralizumab(抗CD154(CD40L)抗体)，托西莫单抗(抗CD20抗体)，曲妥珠单抗(赫赛汀，(抗HER2/neu蛋白抗体)，Tremelimumab(抗CTLA-4抗体)，Tucotuzumabcelmoleukin(抗EpCAM抗体)，妥韦单抗(抗B型肝炎病毒抗体)，Urtoxazumab(抗大肠杆菌抗体)，优斯它单抗(别名：Stelara，抗IL-12，IL-23抗体)，伐利昔单抗(抗AOC3(VAP-1)抗体)，Vedolizumab，(抗整合素α4β7抗体)，Veltuzumab(抗CD20抗体)，维帕莫单抗(抗AOC3(VAP-1)抗体，Visilizumab(别名：Nuvion，抗CD3抗体)，Vitaxin(抗血管整合素avb3抗体)，Volociximab(抗整合素α5β1)，伏妥莫单抗(别名：HumaSPECT，抗肿瘤抗原CTAA16.88抗体)，扎妥木单抗(别名：HUMAX-EGFR，(抗EGFR抗体)，Zanolimumab(别名：HUMAX-CD4，抗CD4抗体)，Ziralimumab(抗CD147(基础免疫球蛋白)抗体)，阿佐莫单抗(抗CD5抗体)，依那西普(ENBREL)，阿法赛特(AMEVIVE)，阿巴西普
Figure GDA0001547895240000801
利纳西普(ARCALYST)，14F7[抗IRP-2(铁离子调节蛋白2)抗体]，14G2a(抗GD2神经节苷脂抗体，治疗黑色素瘤和实体瘤，fromnat.cancer inst.)，J591(抗PSMA抗体，治疗***癌，康乃尔医学院)，225.28S[抗HMW-MAA(高分子量黑色素瘤相关抗原)抗体，索林Radiofarmaci SRL(意大利米兰)治疗黑色素瘤]，COL-1(抗CEACAM3抗体，CGM1，(美国国家癌症研究院)，治疗大肠癌和胃癌)，CYT-356(
Figure GDA0001547895240000811
Figure GDA0001547895240000812
治疗***癌)，HNK20(OraVax公司，用于治疗呼吸道合胞病毒)，ImmuRAIT(来自IMMUNOMEDICS治疗非霍奇金淋巴瘤)，Lym-1(抗HLA-DR10抗体，百富勤医药，用于癌症)，MAK-195F[抗TNF抗体(又称：肿瘤坏死因子；TNFA，肿瘤坏死因子-α；TNFSF2)，阿伯特/诺尔，用于治疗败血症中毒性休克]，MEDI-500[别名：T10B9，抗CD3抗体，TRαβ(T细胞受体α/β)，复合物，MedImmune公司用于治疗移植物抗宿主病]，RINGSCAN[抗TAG72(肿瘤相关糖蛋白72抗体)，Neoprobe集团，用于治疗乳腺癌、结肠癌和直肠癌，Avicidin(抗-EpCAM抗体(上皮细胞粘附分子)，抗TACSTD1抗体(肿瘤相关钙信号转导1)，抗GA733-2(胃肠肿瘤相关蛋白2)，抗EGP-2抗体(上皮糖蛋白2)；抗KSA抗体；KS1/4抗原；M4S；肿瘤抗原17-1A；CD326，来自NeoRx公司用于治疗结肠癌，卵巢癌，***癌和非霍奇金淋巴瘤；LymphoCide(Immunomedics公司)，smartID10(ProteinDesign Labs)，Oncolym(Techniclone公司)，Allomune(BioTransplant)，抗VEGF抗体(Genentech公司)；CEAcide(Immunomedics公司)，IMC-1C11(ImClone)和西妥昔单抗(ImClone公司)。
用于结合抗原的其它抗体包括(但不仅限于此)：氨肽酶N(CD13)，膜联蛋白A1，B7-H3(CD276，各种癌症)，CA125，CA15-3(癌)，CA19-9(癌)，L6(癌)，LewisY(癌)，LewisX(癌)，甲胎蛋白(癌)，CA242，胎盘碱性磷酸酶(癌)，***特异性抗原(***癌)，***酸性磷酸酶(***)，表皮生长因子(癌)，CD2(霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤的淋巴瘤，多发性骨髓瘤)，CD3的ε(T细胞淋巴瘤，肺癌，乳腺癌，胃癌，卵巢癌，自身免疫性疾病，恶性腹水)，CD19(B细胞恶性肿瘤)，CD20(非霍奇金淋巴瘤)，CD22(白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，***性红斑狼疮)，CD30，CD33，CD37,CD38(多发性骨髓瘤)，CD40(淋巴瘤，多发性骨髓瘤，白血病)，CD51(转移性黑素瘤，肉瘤)，CD52，CD56(小细胞肺癌癌，卵巢癌，Merkel细胞癌，以及液体肿瘤，多发性骨髓瘤)，CD66e(癌症)，CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤)，CD74(多发性骨髓瘤)，CD79,CD80(淋巴瘤)CD98(癌症)，粘蛋白(癌)，CD221(实体瘤)，CD227(乳腺癌，卵巢癌)，CD262(非小细胞肺癌和其他癌)，CD309(卵巢癌)，CD326(实体瘤)，CEACAM3(大肠癌，胃癌)，CEACAM5(癌胚抗原；CEA，CD66e)(乳腺癌，结肠直肠癌和肺癌)，DLL3(Δ状-3)，DLL4(Δ状-4)，EGFR(表皮生长因子受体，各种癌症)，CTLA4(黑色素瘤)，CXCR4(CD184，血红素肿瘤，实体肿瘤)，内皮糖蛋白(CD105，实体瘤)，EPCAM(上皮细胞粘附分子，膀胱癌，头，颈，结肠，***非霍奇金淋巴瘤，和卵巢癌)，ERBB2(表皮生长因子受体2；肺癌，乳腺癌，***癌)，FCGR1(自身免疫性疾病)，FOLR(叶酸受体，卵巢癌)，GD2神经节苷脂(癌症)，G-28(一种细胞表面抗原glyvolipid，黑素瘤)，独特型GD3(癌症)，热休克蛋白(癌症)，HER1(肺，胃癌)，HER2(乳腺癌，肺癌和卵巢癌)，HLA-DR10(NHL)，HLA-DRB(非霍奇金淋巴瘤，B细胞白血病)，人绒毛膜***(癌)，IGF1R(***1受体，实体瘤，血液癌症)，IL-2受体(白细胞介素2受体，T-细胞白血病和淋巴瘤)，IL-6R(白细胞介素6受体，多发性骨髓瘤，类风湿性关节炎，Castleman病，IL6依赖性肿瘤)，整合素(素αvβ3，α5β1，α6β4，αllβ3，α5β5，αvβ5细胞附着因子，对各种癌症)，MAGE-1(癌)，MAGE-2(癌)，MAGE-3(癌)，MAGE4(癌)，抗转铁蛋白受体(癌)，P97(黑色素瘤)，MS4A1(跨膜域4亚科A成员1，非霍奇金B细胞淋巴瘤，白血病)，MUC1或MUC1-KLH(乳腺癌，卵巢癌，子***，支气管和胃肠道癌症)，MUC16(CA125)(卵巢癌)，CEA大肠)，GP100(黑色素瘤)，MART1(黑色素瘤)MPG(黑色素瘤),MS4A1(跨膜域4蛋白A，小细胞肺癌，非霍奇金淋巴瘤)，核仁，神经癌基因产物(癌),P21(癌)，抗(N-羟乙酰神经氨酸，乳腺癌，黑色素瘤的癌症)，PLAP样睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌，睾丸癌)，PSMA(***肿瘤)，PSA(***)，ROBO4，TAG72(肿瘤相关糖蛋白72，白血病，胃癌，结肠直肠癌，卵巢癌)中，T细胞的跨膜蛋白(癌症)，Tie(CD202b)，TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B，癌症)，TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B，多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，以及其他癌症，类风湿性关节炎和***性红斑狼疮)，TPBG(滋养层糖蛋白，肾细胞癌)，TRAIL-R1(肿瘤坏死凋亡诱导配体受体1，淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，大肠癌，肺癌)，VCAM-1(CD106，黑色素瘤)，血管内皮生长因子，血管内皮生长因子-A，VEGF-2(CD309)各种癌症)。通过抗体识别的一些其他的肿瘤相关抗原已审阅(Gerber等，mAbs 1:3，247-253(2009)；Novellino等，Cancer Immunol Immunother.54(3),187-207(2005)；Franke等，CancerBiother Radiopharm.2000，15，459-76)。还有许多其他的抗原是：其他不同的集群抗原(如CD1,CD1a,CD1b,CD1c,CD1d,CD1e，CD2,CD3,CD3d,CD3e,CD3g,CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD8a,CD8b,CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD11d，CD12w，CD14，CD15，CD16，CD16a,CD16b,CDw17，CD18，CD19,CD20,CD21,CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30,CD31，CD32，CD32a,CD32b,CD33,CD34，CD35，CD36，CD37，CD38,CD39,CD40,CD41，CD42，CD42a,CD42b,CD42c,CD42d,CD43，CD44，CD45，CD46，CD47，CD48，CD49b，CD49c，CD49c,CD49d,CD49f,CD50,CD51,CD52,CD53，CD54，CD55，CD56,CD57,CD58，CD59，CD60,CD60a,CD60b,CD60c,CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64,CD65,CD65s,CD66,CD66a,CD66b,CD66c,CD66d,CD66e,CD66f,CD67,CD68，CD69，CD70,CD71，CD72，CD73,CD74,CD75,CD75s,CD76,CD77,CD78,CD79，CD79a，CD79b，CD80,CD81，CD82，CD83，CD84,CD85,CD85a,CD85b,CD85c,CD85d,CD85e,CD85f,CD85g,CD85g,CD85i,CD85j,CD85k,CD85m,CD86，CD87，CD88，CD89，CD90，CD91，CD92,CD93,CD94,CD95，CD96，CD97,CD98,CD99,CD100，CD101,CD102,CD103,CD104，CD105，CD106，CD107,CD107a,CD107b,CD108,CD109，CD110,CD111，CD112,CD113,CD114,CD115，CD116，CD117,CD118,CD119,CD120，CD120a,CD120b,CD121，CD121a,CD121b,CD122，CD123,CD123a，CD124,CD125,CD126，CD127,CD128,CD129,CD130,CD131，CD132,CD133，CD134，CD135，CD136,CD137,CD138,CD139，CD140，CD140a,CD140b,CD141，CD142，CD143，CD144，CD145，CDw145,CD146,CD147，CD148，CD149,CD150，CD151，CD152，CD153,CD154，CD155，CD156，CD156a,CD156b,CD156c,CD156d,CD157,CD158，CD158a，CD158b1，CD158b2，CD158c，CD158d，CD158e1，CD158e2，CD158f2，CD158g，CD158h，CD158i，CD158j，CD158k，CD159，CD159a，CD159b，CD159c，CD160,CD161，CD162,CD163，CD164，CD165,CD166，CD167,CD167a,CD167b,CD168，CD169，CD170，CD171，CD172,CD172a,CD172b,CD172g,CD173，CD174，CD175,CD175s,CD176，CD177,CD178，CD179，CD179a，CD179b，CD180，CD181，CD182,CD183，CD184，CD185,CD186，CDw186，CD187,CD188，CD189，CD190，CD191，CD192,CD193，CD194，CD195,CD196，CD197,CD198，CD199，CDw198，CDw199，CD200，CD201，CD202,CD202(a，b)，CD203，CD203c，CD204，CD205,CD206，CD207,CD208，CD209，CD210，CDw210a，CDw210b，CD211，CD212,CD213，CD213a1，CD213a2，CD214，CD215,CD216，CD217,CD218，CD218a，CD218，CD21b9，CD220，CD221，CD222,CD223，CD224，CD225,CD226，CD227,CD228，CD229，CD230，CD231，CD232,CD233，CD234，CD235,CD235a，CD235b，CD236，CD237,CD238，CD239，CD240，CD240ce，CD240d，CD241，CD242,CD243，CD244，CD245,CD246，CD247,CD248，CD249，CD250，CD251，CD252,CD253，CD254，CD255,CD256，CD257,CD258，CD259，CD260，CD261，CD262,CD263，CD264，CD265,CD266，CD267,CD268，CD269，CD270，CD271，CD272,CD273，CD274，CD275,CD276，CD277,CD278，CD279，CD281，CD282,CD283，CD284，CD285,CD286，CD287,CD288，CD289，CD290，CD291，CD292,CD293，CD294，CD295,CD296，CD297,CD298，CD299，CD300，CD300a，CD300b，CD300c，CD301，CD302,CD303，CD304，CD305,CD306，CD307,CD307a,CD307b,CD307c,CD307d,CD307e,CD307f,CD308，CD309，CD310，CD311，CD312,CD313，CD314，CD315,CD316，CD317,CD318，CD319，CD320，CD321，CD322,CD323，CD324，CD325,CD326，CD327,CD328，CD329，CD330，CD331，CD332,CD333，CD334，CD335,CD336，CD337,CD338，CD339，CD340，CD341，CD342,CD343，CD344，CD345,CD346，CD347,CD348，CD349，CD350，CD351，CD352,CD353，CD354，CD355,CD356，CD357,CD358，CD359，CD360，CD361，CD362,CD363，CD364，CD365,CD366，CD367,CD368，CD369，CD370，CD371，CD372,CD373，CD374，CD375,CD376，CD377,CD378，CD379，CD381，CD382,CD383，CD384，CD385,CD386，CD387,CD388，或CD389)，APO2，ASLG659，BMPR1B(骨形态发生蛋白受体)，CRIPTO，膜联蛋白A1，核仁，内皮糖蛋白(CD105)，ROBO4，氨基肽酶N，CTLA-4,Δ-样3(DLL3)，Δ-样4(DLL4)，VEGFR-2(CD309)，CXCR49，CD184)，Tie2，B7-H3，WT1，MUC1，LMP2，HPV E6E7，EGFRvIII，EGFR，HER-2/neu，个体基因型，MAGE A3，P53nonmutant，NY-ESO-1，GD2，CEA，MelanA/MART1，Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34，成员2，II型钠依赖的磷转运3b)，Ras突变，gp100，p53突变体，Proteinase3(PR1)，BCR-abl，Tetratocarcinoma衍生的生长因子)，EphA受体，EphB受体，EGFR，EGFRvIII，ETBR(内皮素)，HER2/neu，HER3，HLA-DOB(MHCII类分子IA抗原)，整合素，IRTA2，MPF(MPF，MSLN，SMR，巨核细胞强化因子，间皮素)，CRIPTO，PD-1,PD-L1,Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm42015，SEMA5B，5EMAG，semaphoring 5bHlog，sdema域，七个血小板重复序列，胞浆区)，PSCA，STEAP1(6个跨膜上皮***抗原)，和STEAP2(HGNC 8639，IPCA-1，PCANP1，STAMP1，STEAP2，STMP，***)，酪氨酸酶，生存素，hTERT，肉瘤易位断点，EphA2，PAP，ML-IAP，AFP，EpCAM，ERG(TMPRSS2ETS融合基因)，NA17，PAX3，ALK，雄激素受体，细胞周期素B1，聚唾液酸，MYCN，RhoC，TRP-2，GD3，岩藻糖神经节苷脂，间皮素，PSCA，MAGE A1，sLe(a)，CYP1B1，PLAC1，GM3，BORIS，Tn，GloboH，ETV6-AML，NY-BR-1，RGS5，SART3，STn，碳酸酐酶IX，PAX5，OY-TES1，***蛋白17，LCK，HMWMAA，AKAP-4，SSX2，XAGE1，B7H3，豆荚蛋白，Tie2，Page4，VEGFR2，MAD-CT-1，FAP，PDGFR-β，MAD-CT-2，Fos蛋白相关抗原1。
另一个特殊应用是，本发明中Tubulysin衍生物-细胞结合分子的共轭体(偶联物)可按照不同的组合和方法适用于癌症治疗。这些癌症包含，并不限于，肾上腺皮质癌，直肠癌，膀胱癌，脑肿瘤(成人：脑干胶质瘤，儿童，小脑星形细胞瘤，星形细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，松果体，视觉通路和下丘脑胶质瘤)，乳腺癌，类癌肿瘤，胃肠道，未知原发癌，***，结肠癌，子宫内膜癌，食管癌，肝外胆管癌，尤文家族肿瘤(PNET)，颅外恶性生殖细胞肿瘤，眼癌，眼内黑色素瘤，胆囊癌，胃癌(胃)，生殖细胞肿瘤，性腺外，妊娠滋养细胞肿瘤，头颈部肿瘤，下咽癌，胰岛细胞癌，肾癌(肾细胞癌)，喉癌，白血病(急性淋巴细胞，急性髓细胞，慢性淋巴细胞，慢性髓细胞，多毛细胞),唇和口腔癌，肝癌，肺癌(非小细胞，小细胞，淋巴瘤(爱滋病相关，中枢神经***，皮肤T细胞，霍奇金病，非霍奇金病，恶性间皮瘤，黑色素瘤，默克尔细胞癌，原发性隐匿性鳞状颈部转移癌，多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增殖性疾病，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌(上皮细胞，生殖细胞瘤，低度恶性潜能肿瘤)，胰腺癌(外分泌，胰岛细胞癌)，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，***癌，嗜铬细胞瘤癌，垂体肿瘤，浆细胞肿瘤，***癌横纹肌肉瘤，直肠癌，肾细胞癌(肾癌)，肾盂和输尿管(移行细胞)，涎腺癌，塞扎综合症，皮肤癌，皮肤癌(皮样T细胞淋巴瘤，卡波西氏肉瘤，黑色素瘤)，小肠癌，软组织肉瘤，胃癌，睾丸癌，胸腺瘤(恶性)，甲状腺癌，尿道癌，子宫癌(肉瘤)，儿童异常肿瘤，***癌，外阴癌，肾母细胞瘤。
另一个特殊应用是,本发明中Tubulysin衍生物-细胞结合分子的共轭体(偶联物)可按照不同的组合和方法，适用于自身免疫疾病的预防和治疗。自身免疫疾病包括，但不限于,胃酸缺乏自身免疫性慢性活动性肝炎，急性播散性脑脊髓炎，急性出血性脑白质炎，阿狄森氏病，丙种球蛋白血症，斑秃，肌萎缩性侧索硬化症，强直性脊柱炎，抗肾小球基底膜/肾小管基底膜肾炎，抗磷脂综合征，抗合成酶综合征，关节炎，异位性过敏症，过敏性皮炎，自身免疫性再生障碍性贫血，自身免疫性心肌病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性内耳病，自身免疫性淋巴组织增生综合征，自身免疫性周围神经***疾病，自身免疫性胰腺炎自体免疫多内分泌症I,II,III型，自身免疫性孕酮皮炎，自身免疫性血小板减少性紫癜，自身免疫性色素层炎，巴洛病/巴洛同心性硬化，黑奇特综合征，Berger病，Bickerstaff脑干脑炎，Blau综合征，大苞性类天苞疮，巨***增生，美洲锥虫病，慢性疲劳免疫功能紊乱综合征，慢性炎症性脱髓鞘性多发神经病，慢性复发性多病灶性骨髓炎，慢性莱姆病，慢性阻塞性肺疾病，变应性肉芽肿性血管炎，瘢痕性类天疱疮，腹部疾病，耳蜗前庭综合征，冷凝集素病，补体C2缺乏症，颅动脉炎，肢端硬皮综合征，克隆氏病(一种特发性炎症性肠病)，柯兴氏症，皮肤白细胞碎裂性血管炎，恶性萎缩性丘疹病，痛性肥胖病，疱疹样皮炎，皮肌炎，1型糖尿病，弥漫性皮肤硬皮病，心肌梗塞后综合征，盘状红斑狼疮，湿疹，子宫内膜异位症，幼年特发性关节炎，嗜酸细胞性筋膜炎，嗜酸细胞性筋膜炎，结节性红斑，特发性混合性冷球蛋白血症，埃文斯综合征，渐进性骨化性纤维组织结构不良，纤维肌痛，纤维肌炎，纤维性肺泡炎，胃炎，胃肠类天疱疮，巨细胞动脉炎，肾小球肾炎，肺出血肾炎综合征，格雷夫斯氏病，格林-巴利神经根炎，桥本脑炎，淋巴瘤性甲状腺肿，溶血性贫血，过敏性紫癜多，妊娠期疱疹，化脓性汗腺炎，休斯综合症(抗磷脂抗体综合征)，低丙球蛋白血症，特发性炎性脱髓鞘疾病，特发性肺纤维化，特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)，IgA肾病(Berger病)，包涵体肌炎，发炎性脱髓鞘病变，间质性膀胱炎，肠易激综合征，幼年特发性关节炎，幼儿型类风湿性关节炎，皮肤粘膜***综合征，兰伯特肌无力综合征，白细胞***性血管炎，扁平苔藓，硬化性苔藓，线状IgA病(LAD)，肌萎缩性侧索硬化症，狼疮样肝炎，红斑狼疮，马吉德综合征，美尼尔氏综合症，显微镜下多血管炎，米勒·费希尔综合征，混合性***病，硬斑病，穆哈二氏病，韦尔斯综合征，多发性骨髓瘤，多发性硬化症，重症肌无力，肌炎，发作性睡病，视神经脊髓炎(德维克病)，神经性肌强直，眼部瘢痕性类天疱疮，眼阵挛-肌阵挛综合征，奥德氏甲状腺炎，复发性风湿病，熊猫症候群(合并链球菌感染的儿童自体免疫神经精神异常)，类肿瘤性小脑变性，阵发性睡眠性血红蛋白尿症，进行性一侧面萎缩，巴-特二氏综合征，睫状体扁平部炎，天疱疮，寻常型天疱疮，恶性贫血，静脉周围炎，POEMS综合征，结节性多动脉炎，风湿性多肌痛，多发性肌炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，进行性炎性神经病变，银屑病，银屑病关节炎，坏疽性脓皮，纯红细胞再生障碍性贫血，罗斯默森氏脑炎，雷诺病，复发性多软骨炎，莱特尔综合征，腿多动综合征，腹膜后纤维化，类风湿关节炎，类风湿发热，结节病，精神***症，施密特综合征，施尼茨勒综合征，巩膜炎，硬皮病，干燥综合征，脊椎关节病，粘血综合征，斯蒂尔病，僵人综合征，亚急性细菌性心内膜炎，Susac氏综合征，急性热性嗜中性皮肤病，西德纳姆舞蹈病，交感性眼炎，高安氏动脉炎，颞动脉炎(巨细胞动脉炎)，痛性眼肌麻痹综合征，横贯性脊髓炎，溃疡性结肠炎(一种特发性炎症性肠疾病)，未分化的***病，未分化脊柱关节病，血管炎，白癜风，韦格纳氏肉芽肿病，威尔逊氏综合征，威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在另一具体实施方案中，在用于治疗或预防自身免疫疾病的，其偶联的抗原结合分子包括，但不限于：抗弹性蛋白抗体；Abys抗上皮细胞抗体；抗基底膜IV型胶原蛋白抗体；抗核抗体；抗双链DNA抗体；抗单链DNA抗体，抗心肌磷脂抗体IgM，IgG；抗celiac(anti-celiac antibody)抗体；抗磷脂抗体IgK，IgG；抗核糖蛋白抗体；抗线粒体抗体；甲状腺抗体；微粒体抗体，T-细胞抗体；甲状腺球蛋白抗体，抗硬皮病-70抗体(anti-SCL-70)；人抗Jo抗体(anti-jo)；抗***性红斑狼疮患者自身抗体；抗干燥综合症抗体(Anti-La/SSB)；抗***性红斑狼疮抗体；抗壁细胞抗体；抗组蛋白抗体；抗核糖核蛋白抗体(anti-RNP)；中性粒细胞胞质抗体(C-ANCA)；细胞核周围抗中性粒细胞抗体(P-ANCA)；抗着丝粒抗体；抗核纤维蛋白抗体，以及抗肾小球基底膜抗体(GBM)抗体，抗神经节苷脂(Anti-ganglioside)抗体；抗桥粒芯糖蛋白3抗体(anti-Desmogein3)；抗人P62抗体；抗人sp100抗体；抗线粒体M2抗体；类风湿因子抗体；抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(anti-MCV)；抗拓扑异构酶抗体；抗中性粒细胞胞浆(CANCA)抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明中用于共轭偶联的结合分子，可以与自身免疫性疾病相关的活化淋巴细胞表达的受体或受体复合物结合。包括免疫球蛋白基因超家族成员(如CD2，CD3，CD4，CD8，CD19，CD20,CD22，CD28，CD30,CD33,CD37,CD38,CD70,CD79，CD90，CD138,CD152/CTLA-4，PD-1，PD-L1或ICOS)，TNF受体超家族成员(如CD27，CD40，CD95/Fas，CD134/OX40，CD137/4-1BB，INF-R1，TNFR-2，RANK，TACI，BCMA，骨保护素，Apo2/TRAIL-R1，TRAIL-R2，TRAIL-R3，TRAIL-R4和30APO-3)，整联蛋白，细胞因子受体，趋化因子受体，主要组织相容性蛋白，凝集素(C型，S型或I型)或补体调控蛋白。
在另一具体实施方案中，对病毒性或细菌性抗原具有免疫特异性的有用的结合体是人源的或人单克隆抗体。如本文所用术语“病毒性抗原”包括，但不限于：任何能诱发免疫反应的病毒肽段，多肽蛋白(例如，HIVgp120，HIV nef，RSV F糖蛋白，流感病毒神经氨酸酶，流感病毒血凝素，人类T淋巴细胞病毒感染调节因子tax，单疱疹病毒糖蛋白(例如，gB，gC，gD和gE)和乙型肝炎表面抗原)。如本文所用的术语“细菌性抗原”包括,但不限于:任何能诱发免疫反应的微生物肽段，多肽蛋白，糖类，多糖，脂质分子(例如，细菌，真菌，致病性原生动物，酵母多肽包括，例如，脂多糖和荚膜多糖5/8)。可用于治疗病毒性或细菌性感染的有用I型抗体包括，但不限于：帕利珠单抗，一种用于治疗RSV感染的人源的抗呼吸道合胞体病毒单克隆抗体；PRO542，一种用于治疗HIV感染的CD4融合抗体；Ostavir，一种***病毒人源性抗体；PROTVIR，一种用于治疗巨细胞病毒人源化抗体IgG.sub.1，还有抗脂多糖(anti-LPS)抗体。
本发明的结合分子——Tubulysin衍生物偶联物，可以用于治疗感染性疾病。这些传染病包括，但不限于：不动杆菌感染，放线菌病，非洲昏睡病(非洲锥虫病)，艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)，阿米巴病，微粒孢子虫病，炭疽，溶血隐秘杆菌感染，阿根廷出血热，蛔虫病，曲霉菌病，星状病毒感染，巴贝虫病，蜡样芽胞杆菌感染，细菌性肺炎，细菌性***病，类杆菌感染，小袋虫病，贝利蛔线虫感染，BK病毒感染，黑色发结节病，人芽囊原虫感染，芽生菌，玻利维亚出血热，疏螺旋体感染，肉毒中毒(和婴儿肉毒中毒)，巴西出血热，布氏杆菌病，伯霍尔德杆菌感染，布鲁里溃疡，感染杯状病毒(诺罗病毒和札幌病毒)，弯曲菌病，念珠菌感染(念珠菌病，鹅口疮)，猫抓病，蜂窝组织炎，查格斯病(美洲锥虫病)，软下疳，水痘，衣原体，肺炎衣原体感染，霍乱，着色真菌病，肝吸虫病，难辨梭状芽孢杆菌感染，球孢子菌病，科罗拉多蜱热，普通感冒(急性病毒鼻咽炎；急性鼻炎)，克雅氏病，克里米亚-刚果出血热，隐球菌病，隐孢子虫病，皮肤幼虫移行症，环孢子虫感染，囊虫病，巨细胞病毒感染，登革热，双核阿米巴病，白喉，裂头绦虫，龙线虫病，埃博拉出血热，包虫病，埃里希体病，蛲虫病(蛲虫感染)，肠球菌感染，肠病毒感染，流行性斑疹伤寒，传染性红斑(第五病)，幼儿急疹，姜片虫病，家族致命性失眠症，丝虫病，产气荚膜梭菌引起的食物中毒，非寄生阿米巴感染，梭杆菌感染，气性坏疽(梭菌性肌坏死)，地丝菌病，吉斯特曼-施特劳斯综合征，贾第虫病，马鼻疽，腭口线虫病，淋病，***，A组链球菌感染，B组链球菌感染，流感嗜血杆菌感染，手足口病(HFMD)，汉坦病毒肺综合征，幽门螺杆菌感染，溶血性尿毒综合征，出血热肾病综合征，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，戊型肝炎，单纯疱疹，组织胞浆菌病，钩虫感染，人鲍坎病毒感染，人埃文氏埃立克体病，人粒细胞无形体病，人类偏肺病毒感染，人体单核细胞埃立克体病，人***状瘤病毒感染，人副流感病毒感染，膜壳绦虫病，爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症(单一)，流感，等孢子球虫病，川崎病，角膜炎，金氏金氏杆菌感染，库鲁病，拉沙热，军团杆菌病(退伍军人协会会员病)，军团杆菌病(庞蒂亚克热)，利什曼病，麻风病，钩端螺旋体病，李氏杆菌病，莱姆病(莱姆疏螺旋体病)，淋巴丝虫病(象皮肿)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，疟疾，马尔堡出血热，麻疹，类鼻疽(惠特莫尔氏病)，脑膜炎，脑膜炎球菌病，后殖吸虫病，微孢子虫病，***，流行性腮腺炎，斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)，支原体肺炎，足菌肿，蝇蛆病，新生儿结膜炎(新生儿眼炎)，克—亚综合征(vCJD，nvCJD)，诺卡氏菌病，盘尾丝虫病(河盲症)，副球孢子菌病(南美芽生菌病)，肺吸虫病，巴氏杆菌病，头虱病(头虱)，体虱病(体虱)，阴虱病(阴虱)，***，百日咳，鼠疫，肺炎球菌感染，肺孢子虫性肺炎，肺炎，脊髓灰质炎，普氏菌感染，原发性阿米巴脑膜脑炎，进行性多病灶脑白质病，鹦鹉热，Q热，狂犬病，鼠咬热，呼吸道合胞病毒感染，鼻孢子菌病，鼻病毒感染，立克次体感染，立克次氏体，裂谷热，洛矶山斑疹热，轮状病毒感染，风疹，沙门氏菌病，SARS(严重急性呼吸***综合症)，疥疮，血吸虫病，败血症，痢疾(菌痢)，带状疱疹(带状疱疹)，天花(天花)，孢子丝菌病，葡萄球菌食物中毒，葡萄球菌感染，线虫，梅毒，绦虫病，破伤风(牙关紧闭症)，须癣，头癣，体癣，股癣，手癣，黑糠疹，足癣，甲癣，花斑癣，弓蛔虫病(眼幼虫移行症)，弓蛔虫病(内脏幼虫移行症)，弓形体病，旋毛虫病，滴虫病，鞭虫病(鞭虫感染)，肺结核，兔热病，尿素分解尿素支原体感染，委内瑞拉马脑炎，委内瑞拉出血热，病毒性肺炎，西尼罗热，白色毛结节菌病(白色毛结节菌病)，假结核菌感染，耶尔森菌病，黄热病，接合菌病。
本篇专利先前描述的抗体的结合分子可用于抗致病菌株，包括，但不限于：鲍曼不动杆菌，以色列放线菌，戈氏放线菌和丙酸丙酸盐杆菌，布氏锥虫，HIV(人类免疫缺陷病毒)，溶组织内阿米巴，无形体属，炭疽杆菌，溶血隐秘杆菌，胡宁病毒，蛔虫，曲霉属，星状病毒家庭，巴贝斯虫属，蜡样芽胞杆菌，多杆菌，类杆菌属，结肠小袋纤毛虫，贝利蛔线虫属，BK病毒，何德毛结节菌，人芽囊原虫，皮炎芽生菌，沙粒病毒，疏螺旋体属，肉毒梭菌，清风藤，布鲁菌属，通常洋葱伯克霍尔德菌和其他伯克霍尔德杆菌种，溃疡分枝杆菌，杯状病毒科家族，弯曲杆菌属，通常是白色念珠菌和其他念珠菌属，巴尔通体，A组链球菌和葡萄球菌，克氏锥虫，杜克雷嗜血杆菌，水痘带状疱疹病毒(VZV)，沙眼衣原体，肺炎衣原体，霍乱弧菌，裴氏着色霉，华支睾吸虫，难辨梭状芽孢杆菌，粗球孢子菌和Coccidioides posadasii，科罗拉多蜱热病毒，鼻病毒，冠状病毒，朊病毒克雅氏病，克里米亚-刚果出血热病毒，新型隐球菌，隐孢子虫属，猫钩虫；multiple parasites,，环孢子，猪带绦虫，巨细胞病毒，登革热病毒(DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4)虫媒病毒，脆弱双核阿米巴，白喉棒状杆菌，裂头属，麦地那龙线虫，埃博拉病毒，棘球属，埃立克体属，蛲虫，肠球菌属，肠道病毒属，普氏立克次体，细小病毒B19，人类疱疹病毒6型和人类疱疹病毒7型，布氏姜片吸虫，肝片吸虫和大片吸虫，FFI朊病毒，丝虫目超家族，产气荚膜杆菌，梭杆菌属，产气荚膜梭菌，其他梭菌属，白地霉，GSS朊病毒，肠贾第鞭毛虫，鼻疽伯克霍尔德氏菌，棘颚口线虫和刚棘颚口虫，淋病奈瑟菌，肉芽肿杆菌，化脓性链球菌，无乳链球菌，流感嗜血杆菌，肠道病毒，大多数柯萨奇A病毒和肠病毒71型，辛诺瓦病毒，幽门螺旋杆菌，大肠杆菌O157：H7，布尼亚病毒科家族，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，单纯疱疹病毒1型，单纯疱疹病毒2型，组织胞浆菌，十二指肠钩虫和美洲板口线虫，流感嗜血杆菌，人类博卡病毒，埃文氏埃立克体，无形体科，人类偏肺病毒，沙费埃里希体，人***瘤病毒，人副流感病毒，微小膜壳绦虫和缩小包膜绦虫，EB病毒，正粘病毒科，贝利等孢球虫，金氏金氏杆菌，肺炎克雷伯菌，Klebsiella ozaenas，库鲁病朊病毒，拉沙病毒，嗜肺军团菌，嗜肺军团菌，利什曼原虫属，麻风分枝杆菌和弥漫型痳疯分枝杆菌，钩端螺旋体属，李斯特菌，博氏包柔螺旋体和其他疏螺旋体属，班氏丝虫和马来丝虫，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，疟原虫属，马尔堡病毒，麻疹病毒，类鼻疽伯克氏菌，脑膜炎奈瑟菌，横川后殖吸虫，微孢子虫门，***病毒(MCV)，腮腺炎病毒，立克次体杆菌，肺炎支原体，多种细菌(马杜拉分枝菌病)和真菌(马杜拉分枝菌病)，寄生双翅目蝇蛆，沙眼衣原体和***，vCJD朊病毒，星状诺卡氏菌和其他诺卡氏菌属物种，旋盘尾丝虫，巴西芽生菌，卫氏并殖吸虫和其他并殖吸虫属，巴斯德氏菌属，虱头癣，体虱，阴虱，百日咳博德特氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，肺炎链球菌，卡氏肺囊虫，脊髓灰质炎病毒，普雷沃氏菌属，福氏耐格里阿米巴，JC病毒，鹦鹉热衣原体，立克次体，狂犬病毒，念珠状链杆菌和鼠咬热螺旋体，呼吸道合胞病毒，西伯鼻孢子虫，鼻病毒，立克次体属，螨立克次体，立夫特山谷热病毒，立氏立克次体，轮状病毒，风疹病毒，沙门氏菌属，非典型肺炎冠状病毒，疥螨，血吸虫属，志贺氏菌属，水痘带状疱疹病毒，重型天花或类天花，申克孢子丝菌，葡萄球菌属，金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，粪类圆线虫，***，绦虫属，破伤风梭菌，毛癣菌属，断发毛癣菌，发癣菌属，絮状表皮癣菌，红色毛癣菌和须癣毛癣菌，威尼克外瓶霉，毛癣菌属，马拉色菌属，犬弓首蛔虫或猫弓蛔虫，弓形虫，旋毛虫，***毛滴虫，鞭虫，结核杆菌，土拉热弗朗西丝菌，解脲支原体，委内瑞拉马脑炎病毒，霍乱弧菌，瓜纳瑞托病毒，西尼罗病毒，白色毛孢子菌，假结核耶尔森菌，小肠结肠炎耶尔森菌，黄热病毒，毛霉目(毛霉菌病)和虫霉目(虫霉菌病)，铜绿假单胞菌，胎儿弯曲杆菌(弧菌)，嗜水气单胞菌，迟缓爱德华氏菌，耶尔森菌，志贺痢疾杆菌，福氏痢疾杆菌，宋内志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，雅司螺旋体，Treponema carateneum，奋森疏螺旋体，博氏包柔螺旋体，出血性黄疸钩端螺旋体，卡氏肺囊虫，布鲁氏菌，猪布鲁氏菌，布氏杆菌，支原体属，斑疹伤寒病原体，Rickettsia tsutsugumushi，披衣菌属；病原真菌(曲霉，白色念珠菌，荚膜组织胞浆菌)；原生动物(溶组织内阿米巴，***毛滴虫，人毛滴虫，Tryoanosoma gambiense，罗得西亚锥虫，杜氏利什曼原虫，热带利什曼原虫，巴西利什曼原虫，肺囊虫肺炎，间日疟原虫，恶性疟原虫，恶性疟疾)；或蠕虫(日本血吸虫，曼氏血吸虫，埃及血吸虫和钩虫)
其他抗体作为本发明结合配体用于治疗病毒性疾病包括，但不限于：抗体作用于病原病毒的抗原包括以下例子但不限于：天花病毒，疱疹病毒，腺病毒，乳多空病毒科，肠道病毒科，细小RNA病毒科，细小病毒科，呼肠孤病毒，逆转录病毒科，流感病毒，副流感病毒，腮腺炎，麻疹，呼吸道合胞病毒，风疹，虫媒病毒，弹状病毒，沙粒病毒科，Non-A/Non-B肝炎病毒，鼻病毒，冠状病毒，轮状病毒科，肿瘤病毒[例如，乙型肝炎病毒(肝细胞癌)，人***状瘤病毒(***，***癌)，卡波西肉瘤相关疱疹病毒(卡波济氏肉瘤)，EB病毒(鼻咽癌，伯基特淋巴瘤，原发性中枢神经***淋巴瘤)，MCPyV(梅克尔细胞癌)，SV40(猿猴病毒40)，丙型肝炎病毒(肝癌)，人类嗜T淋巴细胞病毒1型(成人T细胞白血病/淋巴瘤)，免疫失调引起病毒：[如人类免疫缺陷病毒(艾滋病)]；中枢神经***病毒：[如，JCV(进行性多病灶脑白质病)，MeV(亚急性硬化性全脑炎)，LCV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎)，虫媒病毒性脑炎，正粘病毒科(可能的)(昏睡性脑炎)，RV(狂犬病)，水疱性口炎-印度病毒属，疹病毒性脑膜炎，拉姆齐·亨特综合征II型；脊髓灰质炎(小儿麻痹症，后小儿麻痹症候群)，人类嗜T淋巴细胞病毒1型(热带痉挛性截瘫)]；巨细胞病毒(巨细胞病毒性视网膜炎，HSV(疱疹性角膜炎))；心血管病病毒[如柯萨奇病毒(心包炎，心肌炎)]；呼吸***/急性鼻咽炎病毒/病毒性肺炎：[非洲淋巴细胞瘤病毒(疱疹病毒4型感染/传染性单核细胞增多)，巨细胞病毒；SARS冠状病毒(严重急性呼吸器官综合征)正粘病毒：流感病毒A/B/C(流感/禽流感)，副粘病毒：人类副流感病毒(副流感)，呼吸道合胞病毒(人类呼吸道合胞病毒)，肺病毒]；消化***病毒[MUV(腮腺炎)，巨细胞病毒(巨细胞病毒性食管炎)；腺病毒(腺病毒感染)；轮状病毒，诺如病毒，星状病毒，冠状病毒；HBV(乙肝病毒)，柯萨奇病毒，甲型肝炎(甲肝病毒)，HCV(丙型肝炎病毒)，HDV(丁型肝炎病毒)，HEV(戊型肝炎病毒)，HGV(庚型肝炎病毒)]；泌尿生殖***的病毒[如，BK病毒，MUV(腮腺炎)]。
按照更进一步的目标，本发明还包括上述共轭药物成分结合其它可行的药物载体作为癌症和自身免疫疾病的治疗药物。本发明治疗癌症和自身免疫疾病的方法包括体外，体内或间接体内疗法。体外疗法应用实施例，包括药物处理体外培养细胞，杀死除了没有表达目标抗原的细胞以外的所有细胞；或者杀死表达非想要的抗原的细胞。作为间接体内疗法的治疗方法的一个示例：在体外处理造血干细胞，杀死患病或恶性细胞后输回原患者体内。例如，临床上先通过间接体内治疗除去骨髓中的肿瘤细胞或淋巴细胞然后输回原患者来治疗癌症和自体免疫疾病，或者在移植前去除骨髓中的T细胞和其它淋巴细胞以防止移植物的免疫拮抗反应。实施方法如下：从病人或其他个体获取骨髓细胞，然后在加入本发明共轭药物的含血清培养基中37℃培养，药物浓度范围为1pM到0.1mM，培养时间为30分钟左右到96小时左右。药物具体浓度和培养时间由经验丰富的临床医生决定。培养结束后，骨髓细胞用含血清培养基洗涤后通过静脉注射输回人体内。如果病人在获取骨髓细胞和回输处理前需要接受其它治疗，比如烧蚀化疗或全身放射疗法的情况下，处理后的骨髓细胞可以保存在合格的液氮医疗设备中。
用于体内临床应用时，本发明的共轭药物将以溶液或能被无菌水溶解后注射的冻干固体(粉针)的形式提供。共轭药物在溶液或冻干固体(粉针)中的质量比可为0.01％-99％。为了制备稳定的冻干粉针，一种或多种下面的辅料加入料液中用于冻干粉针的制备。适用的辅料包括：一个或多个多元醇化合物(包括糖(还原和非还原性糖)、糖醇和糖酸类。还原性糖如果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、糖、木糖、核糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖；非还原性糖如蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖；糖醇选自甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓糖醇，苏糖醇，山梨醇和甘油；糖酸如葡萄糖酸及其盐)在配料中占0.0％-25％；缓冲试剂(如柠檬酸、丁二酸、醋酸、枸橼酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、Tris盐酸盐，酞酸或磷酸)在料液中5mM-500mM(冻干后质量比0.05％～25％)用于最终调至pH 4.5～8.5；表面活性剂(如聚山梨酯20、40、60、65、80或85；泊洛沙姆(poloxamer)-407，聚乙二醇-聚丙二醇，十二烷基硫酸钠(SDS)，月桂硫酸钠，钠辛基糖苷及类似物等)在配料中占0.0％-2.0％；抗氧化剂(如抗坏血酸和/或蛋氨酸)在配料中占0.0％-5.0％；弹性/张力调节剂(如甘露醇、山梨醇或NaCl)0.0％-10％；螯合剂如EDTA或EGTA在配料中含量0.0mM-5mM；金属配合物(如锌蛋白质复合物)在配料中占0.0％-1％；；可生物降解的聚合物，如聚酯在配料中占0.0％-1.5％；防腐剂(如苯甲醇，酚、丁醇，苄醇、烷基酯如甲基或尼泊金丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇，间甲酚，三氯叔丁醇，18碳基二甲基苄基氯化铵等等)在配料中占0.0％-5％；和/或游离氨基酸(如精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸或天冬氨酸)在配料中占0.0％-30％。配制(预装)针剂/复溶冻干针剂应控制其渗透压摩斯摩尔浓度范围225-370mOsm/L。注入/稀释生理盐水后的渗透压摩斯摩尔浓度范围应保证为285-310mOsm/L。上述药物组分溶液可以制备成预装针剂，或灌装至西林瓶后冻干成分针，或通过高效喷雾干燥制备成粉末，用于分装储存和销售。为减轻注入注射剂时人体产生疼痛，应酌加局部止痛剂。常用的止痛剂及用量：苯甲醇(1％左右)、盐酸普鲁卡因(0.2％～2.0％)、盐酸利多卡因(0.2％～2.0％)、三氯叔丁醇(0.3％～0.5％)、曲马多、***、硫酸***、氢***酮、羟氢可待酮、加巴喷丁、环苯扎林、曲唑酮、可乐定。
合适的本专利共轭药物给药方法事例如下：共轭药物每周、或每两周、或每3星期、或每4周、每月通过静脉注射一次，持续3～52星期。共轭药物单次剂量(冻干粉针通过加入注射用水复溶)通过溶解于50到500毫升的生理盐水，生理盐水中可以选择地加入人血清白蛋白(例如，0.5到1毫升的100mg/ml的浓缩人血清白蛋白)。药物剂量大概在50μg到80mg每千克体重每星期，静脉注射(每次注射10ug到200mg/kg体重)。1～52周的治疗结束后，病人可以再接受新一轮的治疗。详细的治疗方法包括给药途径，赋形剂，稀释剂，药物剂量，治疗时间等等可以由有经验的外科医生决定。
可以通过体内或间接体内的方法选择性杀死细胞群来治疗疾病的例子包括任何种类的恶性肿瘤，自体免疫疾病，移植排斥和感染(包括病毒，细菌或寄生虫)。
达到理想的生物学效果而需要的共轭药物的量，将因多个因素而各异，这些因素包括化合物的性质特点，疗效和共轭药物的生物利用度，疾病的类型，病人的种族，病人患病的状态，给药的途径，所有这些因素共同决定给药时间表和给药方式。
概括的说，本发明中的共轭药物可以通过以0.1到10％质量体积比溶解在生理缓冲液中用于非肠道给药。典型的药物剂量范围从1ug到0.1g每千克体重每周(或每2周、或每3周、或每4周)；推荐的药物剂量范围从0.01mg到50mg每千克体重每3周或者等效剂量的儿童用量。推荐的给药量取决于多个变量，包括疾病或功能紊乱的类型，病人个体的整体的健康状态，偶联药物的相对生物学活性，化合物的剂型，给药的方式(静脉注射，肌肉注射，或其它)，在选中给药方式下的药物动力学特性，以及给药的速度(单次注射或者连续滴注)和给药的时间表(在一定时间内的给药次数)。
本发明的共轭药物同样可以以单位剂量的形式给药，这里的“单位剂量”是指一个病人一次给药的剂量，单位剂量的药物可以简单方便的包装和使用，单位剂量的药物是保持物理和化学稳定的活性共轭药物本身，或者是像后面介绍的药学上可接受的混合物。典型的一天的剂量范围从0.01到100mg每千克体重。一般而言，人每周的单位剂量范围从1到3000mg。推荐的单位剂量是1.0mg到500mg，每月给药四次，或者1.0mg到500mg，每3周一次。本发明的共轭药物可以通过加入一种或多种药学上可接受的辅料，制成药物制剂。此单位剂量的药物可以用于口服给药，比如是片剂，简单的胶囊或软胶囊；或鼻内给药，比如粉末状，滴鼻剂，或喷雾剂；或者通过皮肤给药，比如软膏剂，乳膏剂，洗液，凝胶剂或喷雾剂或皮肤贴片。药剂可以方便的以单位剂量的形式给药，且以任何已知的制药方法制得，比如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21th ed.；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005年.中所述的方法。
包含本发明的化合物的药物剂型包括药物组合物首选口服或非肠道给药方式。对于口服给药剂型，如片剂，粉剂，胶囊剂，片剂(锭剂)等等可以包含一种或多种以下原料或有类似性质的其它化合物：粘合剂，比如微晶纤维素或黄耆胶；稀释剂，比如淀粉或乳糖；分散剂，比如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，比如硬脂酸镁；助流剂，比如二氧化硅胶体；甜味剂，比如蔗糖或糖精；增味剂，比如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，一般由明胶混合物选择性的与塑化剂混合，淀粉胶囊也是如此。另外，单位剂量的物理形式可以通过加入多种不同的原料而改变，例如，糖衣，虫胶或肠溶剂。其它的口服剂型如糖浆或酏剂可以含有甜味剂，防腐剂，颜料，着色剂和调味剂。另外，活性化合物可以通过不同的处理和配方，使其成为可快速溶解的剂型，缓慢释放剂型或缓释剂，其中的缓释剂是较好的剂型。片剂首选包含乳糖，玉米淀粉，硅酸镁，交联羧甲基纤维素钠，聚乙烯吡咯酮，硬脂酸镁，滑石等组合的剂型中。
非肠道给药的液体药剂包括无菌的水溶液或非水溶液，悬浮液和乳剂。液体药剂也可以含有粘合剂，缓冲液，防腐剂，螯合剂，甜味剂，调味剂和着色剂等等。非水溶剂包括乙醇，丙二醇，聚乙二醇，植物油比如橄榄油和有机脂类，比如油酸乙酯。水性溶剂包括了水，乙醇，缓冲试剂和盐的混合物，特别是，生物相容性的，可降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯聚合物或者聚乙二醇/聚丙三醇共聚物可作为控制活性药物释放的辅料。静脉注射中的赋形剂可以包括液体和营养补充物，电解质补充物，以及基于林格氏葡萄糖的辅料，以及类似的辅料。对于本发明的活性药物其它可行的非肠道给药***包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物微粒，植入式渗透泵和脂质体。
其它可行的给药方式包括吸入剂，吸入剂包括干粉剂，气雾剂和水滴剂。吸入剂可以是含有如聚氧乙烯-9-月桂醚，甘胆酸盐，脱氧胆酸盐或油质的溶液，可以通过滴鼻剂，鼻内胶体的形式给药。***药剂包括如锭剂，糖果锭剂等，可含有调味剂如蔗糖，***胶以及其它辅料如甘胆酸盐等。栓剂适合于单位剂量的形式，以固体如可可油为载体，也可以加入水杨酸。皮肤局部用药剂型，以膏药，乳剂，洗液，贴片，凝胶，喷雾剂，气雾剂或油剂为首选。凡士林，羊毛脂，聚乙二醇，醇类以及它们的混合物可以作为药物载剂。皮肤给药的剂型可以是贴片，乳剂，缓冲溶液，溶解或分散在聚合物或粘合剂中。
特别地，本发明的共轭药物可以与其它的已知或未知的治疗药物，如化疗药物，放射疗法，免疫疗法药物，自身免疫疾病药物，抗感染药物或其它抗体药物共轭药物共同作用，达到协同效果。协同药物或放射治疗可以在本发明的共轭药物给药之前或之后给药或施行。可以是在服用本发明的共轭药物之前或之后1小时，12小时，一天，一星期，二星期，三星期，一个月，也可以是几个月。
在其它的实施方式中，本发明的共轭药物和协调药物一起应用。起协同作用的药物包括但不限于:
1).化疗药物:a).烷基化试剂：比如[氮芥:(苯丁酸氮芥，环磷酰胺，异环磷酰胺，氮芥，美法仑，氯乙环磷酰胺)；亚硝基脲:(卡莫司汀，洛莫司汀)；烷基磺酸盐:(白消安,苏消安)；三氮烯类:(达卡巴嗪)；含铂化合物:(卡铂，顺铂，奥沙利铂)]；b).植物生物碱:比如[长春花生物碱:(长春碱，长春新碱，长春地辛，长春瑞滨)；紫杉烷类化合物:(紫杉醇，泰素帝)]；c).DNA拓扑异构酶抑制剂:比如[表鬼臼树脂:(9-氨基喜树碱,喜树碱，克立那托，足叶乙甙，磷酸依托泊苷，伊立替康，替尼泊甙，拓扑替康,)；丝裂霉素：(丝裂霉素C)]；d).抗代谢药物：如{[抗叶酸：二氢叶酸还原酶抑制剂：(甲氨蝶呤，三甲曲沙)；IMP脱氢酶抑制剂(霉酚酸，甲酰胺基噻唑，利巴韦林，EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲，去铁胺)]；[嘧啶类似物：尿嘧啶类似物：(5-氟尿嘧啶，去氧氟尿苷，雷替曲塞(拓优得))；胞嘧啶类似物：(阿糖胞苷，阿糖胞苷，氟达拉滨)；嘌呤类似物：(硫唑嘌呤，巯基嘌呤，鸟嘌呤)]}；e).激素类：如{受体拮抗剂：[抗***：(甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)；LHRH激动剂：(戈舍瑞林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素：(比卡鲁胺，氟他胺)]；维甲酸/三角肌：[维生素D3类似物(CB1093，EB 1089KH 1060，胆钙化醇，维生素D2)；光动力疗法：(对此，酞菁光敏剂，PC4，去甲氧甲素)；细胞因子：(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子)，人类的蛋白质含TNF域)]}f).激酶抑制剂，如bibw 2992(抗EGFR/Erb2)，伊马替尼，吉非替尼，哌加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼罗替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，颇纳替尼，凡德他尼，氟马替尼，e7080(抗VEGFR2)，莫立替尼，美迪替尼，普纳替尼(ap24534)，HQP1351，巴非替尼(INNO-406)，波舒替尼(SKI-606)，苏尼替尼，卡博替尼，沃利替尼，维莫德吉，Iniparib，鲁索利替尼，CYT387，阿西替尼，tivozanib，贝伐单抗，索拉非尼，曲妥珠单抗，西妥昔单抗，兰尼单抗，帕尼单抗，ispinesib；g).其它类：如吉西他滨，epoxomicins(例如来那度胺)，硼替佐米沙利度胺，来那度胺，，泊马度胺，托舍多特，zybrestat，PLX4032，sta-9090，Stimuvax，
allovectin-7，xegeva，Provenge，Yervoy，异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)，多巴胺能神经毒素(如1-甲基-4-苯基吡啶离子)，细胞周期抑制剂(如星形孢菌素)，放线菌素(如放线菌素D，更生霉素)，平阳霉素(如博莱霉素博莱霉素A2，B2，培洛霉素)，蒽环类抗生素(如红霉素，阿霉素(阿霉素)，伊达比星，表阿霉素，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，MDR抑制剂(如维拉帕米)，Ca2+ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，莫提诺他(MGCD0103)，belinostat，PCI-24781，恩替诺特，SB939，resminostat，givinostat，AR-42，一种，萝卜硫素，曲古抑菌素A)；毒胡萝卜素，塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，5双硫仑，salinosporamide A.
2).抗自身免疫病剂包括，但不限于:环孢素，环孢素A，硫唑嘌呤，氨基己酸，溴隐亭，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，糖皮质激素(如激素类药，倍他米松，布***，氟尼缩松，氟替卡松丙酸酯，氢化可的松，***，氟可龙丹那唑，曲安奈德，丙酸倍氯米松)，脱氢表雄酮，依那西普，羟氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康，甲氨蝶呤，霉酚酸酯，西罗莫司，他克莫司，强的松
3).抗传染病剂包括，但不限于：a).氨基糖苷类：丁胺卡那霉素，武夷霉素，庆大霉素(奈替米星，西索米星，异帕米星)，潮霉素，卡那霉素(丁胺卡那霉素，阿贝卡星，氨基去氧卡那霉素，地贝卡星，妥布霉素)新霉素(新霉素B，巴龙霉素，核糖霉素)，奈替米星，,大观霉素，链霉素，妥布霉素，甲基姿苏霉素；b).酰胺醇类：叠氮氯霉素，氯霉素，氟甲砜霉素，甲砜霉素；c).安沙霉素类：格尔德霉素，除莠霉素；d).碳青霉烯类：比阿培南，多尼培南，厄他培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，帕尼培南；e).头孢类：碳头孢烯(氯碳头孢)，头孢乙腈，头孢克洛，头孢拉定，头孢羟氨苄，头孢罗宁，头孢噻啶，头孢噻吩或头孢菌素，头孢氨苄，头孢来星，头孢孟多，头孢匹林，头孢三嗪，头孢氮氟，头孢西酮，头孢唑啉，头孢拉宗，头孢卡品，头孢达肟，头孢吡肟，头孢米诺，头孢西丁，头孢丙烯，头孢沙定，头孢替唑，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼头孢妥仑，头孢吡肟，头孢他美，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西，头孢哌酮，头孢雷特，头孢噻肟，头孢替安，头孢唑兰，头孢氨苄，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢泊肟，头孢丙烯，头孢喹肟，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢布烯，头孢噻林，头孢唑肟，头孢，头孢曲松，头孢呋辛，头孢唑喃，头霉素(头孢西丁，头孢替坦，头孢美唑)氧头孢烯(氟氧头孢，拉氧头孢)；f).糖肽：博来霉素，万古霉素(奥利万星，特拉万星)，替考拉宁(达巴万星)雷莫拉宁，达托霉素；g).甘氨酰：如替加环素；h).β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，克拉维烷(克拉维酸)；i).林可酰胺类：克林霉素，林可霉素；j).脂肽：达托霉素，A54145，钙依赖性抗生素(CDA)；k).大环内酯类：阿奇霉素，喹红霉素喹红霉素喹红霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，氟红霉素，交沙霉素，酮内酯类(泰利霉素，喹红霉素喹红霉素喹红霉素喹红霉素)麦迪霉素，美奥卡霉素，竹桃霉素，利福霉素(利福平，利福平，利福布汀，利福喷丁)，罗他霉素，罗红霉素，壮观霉素，螺旋霉素，他克莫司(FK506)，醋竹桃霉素，泰利霉素；l).单环β-内酰胺抗生素:氨曲南,替吉莫南；m).唑烷酮类：利奈唑胺；n).青霉素类：阿莫西林，氨苄西林(匹氨西林，海他西林，巴氨西林，美坦西林，酞氨西林)叠氮西林，阿洛西林，青霉素，苄星青霉素，苯氧基苄星青霉素，氯甲西林，普鲁卡因青霉素，羧苄青霉素(卡茚西林)，邻氯青霉素，双氯青霉素，先锋霉素，氟氯西林，美西林(氮卓脒青霉素双酯)，美洛西林，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，醋甲西林，青霉素，奈西林，青霉素，哌拉西林，苯丙西林，磺苄西林，替莫西林，替卡西林；o).多肽：杆菌肽，多粘菌素E，多粘菌素B；p).喹诺酮类药物：阿拉沙星，巴洛沙星，环丙沙星，克林沙星，达氟沙星，二氟沙星，依诺沙星，恩诺沙星，Floxin，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，曲伐沙星卡诺，左氧氟沙星，洛美沙星，麻保沙星，莫西沙星，那氟沙星，诺氟沙星，奥比沙星，氧氟沙星，培氟沙星，曲伐沙星，格帕沙星，西他沙星，司帕沙星，替马沙星，妥舒沙星，曲伐沙星；q).菌素：普那霉素，奎奴普丁/达福普汀)；r).磺胺类药物：磺胺米隆，百浪多息，磺胺醋酰，磺胺甲，磺胺，柳氮磺胺吡啶，磺胺异恶唑，甲氧苄氨嘧啶，甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑(复方新诺明)；s).类固醇抗菌药物：如夫西地酸；t).四环素类：强力霉素，金霉素，氯羟四环素，地美环素，赖甲环素，氯甲烯土霉素，美他环素，米诺环素，土霉素，青哌四环素，罗利环素，四环素，甘氨酰(如替加环素)；u).其他类型的抗生素：番荔枝科，胂凡纳明，细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)，Dadal/AR抑制剂(环丝氨酸)，dictyostatin，海绵内酯，艾榴塞洛素，埃博霉素，乙胺丁醇，依托泊苷，法罗培南，夫西地酸，痢特灵，异烟肼，laulimalide，甲硝唑，莫匹罗星，mycolactones，NAM合成抑制剂(如磷霉素)，呋喃妥因，紫杉醇，平板霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平(利福平)，他唑巴坦替硝唑，番荔枝内酯；
4).抗病毒的药物:a)./融合抑制剂：aplaviroc，马拉韦罗，维立韦罗，gp41的(恩夫韦)，PRO140，CD4(Ibalizumab)；b).整合酶抑制剂：拉替拉韦，埃替拉韦，globoidnan A；c).成熟抑制剂：贝韦立马，vivecon；d).神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦，扎那米韦，帕拉米韦；e).核苷和核苷酸：阿巴卡韦，阿昔洛韦，阿德福韦，氨多索韦，apricitabine，溴夫定，西多福韦克拉夫定，右艾夫他滨，去羟肌苷(DDI)，艾夫他滨，恩曲他滨(FTC)，恩替卡韦，泛昔洛韦，氟脲嘧啶(5-FU)，3'-氟取代的2'，3'-二脱氧核苷类似物(例如，3'-氟-2'，3'-二脱氧胸苷(FLT)和3'-氟-2'，3'-双脱氧(FLG)福米韦生，更昔洛韦，碘苷，拉米夫定(3TC)，L-核苷(如β-L-胸苷，β-L-2'-脱氧胞苷)，喷昔洛韦，Racivir，利巴韦林，stampidine，司他夫定(d4T的)，他利韦林(伟拉咪定)，替比夫定，替诺福韦，伐昔洛韦三氟胸苷，缬更昔洛韦，扎西他滨(DDC)，齐多夫定(AZT)；f).非核苷类：金刚烷胺，ateviridine，卡普韦林，二芳基嘧啶(依曲韦林，利匹韦林)，地拉韦啶，二十二烷醇，乙米韦林，依法韦仑，膦甲酸(磷酰基甲酸)，咪喹莫特，干扰素α，洛韦胺，洛德腺苷，他巴唑，奈韦拉平，NOV-205，聚乙二醇干扰素α，鬼臼毒素，利福平，金刚乙胺，瑞喹莫德(R-848)，醋胺金刚烷；g).蛋白酶抑制剂：安普那韦，阿扎那韦，博赛泼维，达芦那韦，福沙那韦，茚地那韦，洛匹那韦，奈非那韦，pleconaril，利托那韦，沙奎那韦，特拉匹韦(VX-950)替拉那韦；h).其他类型的抗病毒的药物：抗体酶，阿比朵尔，calanolides A，浅蓝菌素，蓝藻-N，二芳基嘧啶，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，膦甲酸钠，格瑞弗森，他利韦林(伟拉咪定)，羟基脲，KP-1461，米替福新，普来可那立，合成抑制剂，利巴韦林，seliciclib；
5).其它免疫治疗药物：如咪喹莫特，干扰素(如α，β)，粒细胞集落刺激因子，细胞因子，白细胞介素(IL-1～IL-35)，抗体(例如曲妥单抗，帕妥珠单抗，贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗，英夫利昔单抗，阿达木单抗，巴利昔单抗，达克珠单抗，奥马珠单抗，ipilimumab,Nivolumab，Pembrolizumab，BGB-A317，atezolizumab，avelumab，durvalumab)，蛋白结合药物(例如,Abraxane),一种抗体结合药物选自卡奇霉素衍生物，美登素衍生物(DM1 and DM4),CC-1065和多卡霉素小沟剂，有效的紫杉醇衍生物，阿霉素，阿里他汀抗有丝***药物偶联物，如曲妥珠单抗-DM1，Inotuzumab单抗，brentuximabvedotin，Glembatumumab vedotin，lorvotuzumab mertansine，Gemtuzumab ozogamicin，Trastuzumab emtansine，Inotuzumab ozogamicin，Sacituzumab govitecan，Anetumabravtansine，Denintuzumab mafodotin，Rovalpituzumab tesirine，Labetuzumabgovitecan，BMS-986148，AN-152LMB2，TP-38，VB4-845，Cantuzumab mertansine，AVE9633，SAR3419，CAT-8015(抗-CD22)，IMGN388，IMGN529，Mirvetuximab soravtansine(IMGN853)，Vadastuximab talirine，milatuzumab-阿霉素，Depatuxizumab mafodotin(ABT-414),AGS-16C3F，Humax-TF-ADC，TAK-264(MLN-0264)，Milatuzumab doxorubicin，Trastuzumabderuxtecan，SGN-75(抗CD70)，抗-CD22-MCC-DM1)。
在另一个具体实施例中进行治疗或预防癌症，或自身免疫性疾病，或传染病时，常采用联合用药方式。其药物组合物，包含治疗有效剂量的本专利描述通式(II)共轭物通过与其他药物如化疗、放射治疗、免疫治疗剂，自身免疫性疾病药物、抗感染药物或其他物的同时给药或先后给药进行协同有效的治疗或预防。协同剂优选自以下一种或几种药物：阿巴西普，阿比特龙乙酸酯，白蛋白紫杉醇，对乙酰氨基酚/氢可酮，CAS号为1420477-60-6的阿卡拉不儒替尼，阿达木单抗，重组人白介素-2，阿法替尼二马来酸酯，艾乐替尼，阿仑单抗，阿利维A酸，CAS号为1018448-65-1爱都曲妥单抗美登素，安非他明或安非他明/右***混合盐，阿那曲唑，蒽环类抗生素，阿立哌唑，阿扎那韦，阿特珠单抗，阿托伐他汀，CAS号为1537032-82-8的阿威单抗，阿昔替尼，CAS号为866323-14-0的贝利司他，贝伐珠单抗，蓓萨罗丁，博纳吐单抗，硼替佐米，博舒替尼，本妥昔单抗，布加替尼，布***，布***/福莫特罗，丁丙诺啡，CAS号为183133-96-2的卡巴他赛，卡博替尼，卡培他滨，卡非佐米，嵌合抗原受体工程T的细胞，塞来昔布，赛立替尼，西妥昔单抗，环孢素，西那卡塞，克唑替尼，CAS号为934660-93-2的考比替尼，达比加群，达拉菲尼，达卡巴嗪，达珠单抗，达托霉素，CAS号为945721-28-8的德瑞单抗，达贝泊汀，CAS号为206361-99-1的地瑞那韦，甲磺酸伊马替尼，达沙替尼，CAS号为173146-27-5的地尼白介素-2，CAS号为615258-49-7的地诺单抗，双丙戊酸钠，***，CAS号为138530-94-6的右兰索拉唑，哌甲酯，CAS号为1363687-32-4的地努妥昔单抗，多西环素，度洛西汀，CAS号为1428935-60-7的德威单抗，CAS号为915296-00-3的依托珠单抗，te依非莫司，替诺福韦/依法韦仑，依诺替尼，依泽替米贝，依泽替米贝/辛伐他汀，非诺贝特/非诺贝特/依诺替尼，芬戈莫德，丙酸氟替卡松，氟替卡松/沙美特罗，氟维司群，吉非替尼，格拉替雷，醋酸戈舍瑞林，伊曲替尼，伊马替尼，伊布替莫单抗，依鲁替尼，伊曲替尼，异环磷酰胺，英夫利昔单抗，依利替尼，门冬胰岛素，地特胰岛素，甘精胰岛素，赖脯胰岛素，干扰素β1a，干扰素β1b，拉帕替尼，易普利姆玛，异丙托溴铵/，利那莫利，乐伐替尼，来曲唑，左旋甲状腺素，左旋甲状腺素，利多卡因，利奈唑胺，利拉鲁肽，CAS号为608137-33-3赖氨酸***，美金刚，哌醋甲酯，美托洛尔，***，莫米松，CAS号为906805-06-9的耐昔妥单抗，CAS号为698387-09-6的来那替尼，CAS号为641571-10-0的尼罗替尼,CAS号为1038915-60-4的尼拉帕尼,CAS号为946414-94-4的纳武单抗,奥法木单抗，奥帕珠单抗，奥美沙坦，奥美沙坦，奥沙利铂，氢***，奥马珠单抗，欧米伽-3脂肪酸乙酯，奥司他韦,CAS号为1421373-65-0的奥斯替尼，盐酸羟考酮，帕瑞单抗，帕珠单抗，帕洛单抗，帕唑帕尼，PD-1抗体，PD-L1抗体，聚乙二醇干扰素α-2a，CAS号为1374853-91-4的派姆单抗，培美曲塞，培妥珠单抗，肺炎球菌缀合物疫苗，泊马度胺，普瑞巴林，***，喹硫平，雷贝拉唑，镭223氯化物，雷洛昔芬，拉替拉韦，雷莫卢单抗，雷珠单抗，瑞格菲尼，利妥昔单抗，利伐沙班，罗米地辛，罗苏伐他汀，鲁索利替尼，沙丁胺醇，CAS号为1313725-88-0的萨沃利替尼，沃利替尼，索马鲁肽，司维拉姆，西地那非，CAS号为541502-14-1司妥昔单抗，西他列汀，西他列汀/二甲双胍，索利那新，索尼德吉，索拉非尼，舒尼替尼，他克莫司，替拉莫帕明，替莫唑胺，替西罗莫司，替诺福韦/恩曲他滨，睾酮凝胶，沙利度胺，噻托溴铵，托瑞米芬，曲美替尼，曲妥珠单抗，CAS号为114899-77-3的曲贝特酊，CAS号为183204-72-0的三氟胸苷/替匹扰西，维甲酸，优特克，缬沙坦，维利帕尼，凡德他尼，威罗菲尼，CAS号为1257044-40-8的外尼韬可莱斯，伏立诺他，阿普西柏，带状疱疹疫苗，,以及它们的类似物、衍生物、药学上可接受的盐、载体、稀释剂或赋形剂，或其上面药物分子及其各种剂型的组合。
作为本发明更进一步的目标,本发明还涉及其中的抗体药物共轭体的制备过程。本发明的共轭体可以用多种该领域的熟知方法制备，例如，本发明共轭体中的Tubulysin衍生物可以按照下述方法或改进的下述方法合成。对于该领域的专业人士来说，这些改进方法都是很容易从科技文献中获得的、人所共知的、很明显的方法。特别是，这些方法在《Comprehensive Organic Transformations》(R.C.Larock著，1999，Wiley-VCH出版，第2版)一书中有很多的介绍。
在本文描述的反应过程中，有时会有必要保护可能参与反应的活性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基和羧基，以避免副反应的发生。常规保护官能团的常见使用方法可参考P.G.Wuts和T.W.Greene所著的《Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis》(2006年，Wiley-Interscience出版，第4版)。有的反应可以在适当的含有酸或碱的溶液中进行。这类反应的酸、碱和溶剂并没有特别的限制，只要没有不利的影响，任何常规的酸、碱以及溶剂都可以在这里使用。而且，这些反应可以在广泛的温度范围内进行。不过，总的来说，比较容易操作的反应温度通常在-80℃-150℃之间(在室温与100℃之间更好)。反应所需的时间同样可以有很大的变化范围，当然，这取决于多种因素，尤其是反应温度和所用溶剂的性质。一般地说，对于比较理想的反应来说，3至20小时的反应时间比较合适。
反应结束后的操作处理可以按常规方法进行。例如，可以通过把溶剂从反应体系中蒸掉的方式回收反应产物。或者，如果必要的话，在把溶剂蒸出后，可以先把剩余物倒入水中，再用与水不互溶的有机溶剂萃取。最后，在把萃取溶剂蒸走以后，就可以获得反应产物。此外，如果有更高纯度的需要，还可通过各种常见的方法进一步纯化，例如重结晶、沉降或各种色谱层析的方法。一般地说，柱层析和制备薄板层析的方法更为常用。本发明的Tubulysin衍生物及其共轭物的合成见图1-60。
在下面的实施例中，本发明的细胞结合体-Tubulysin衍生物共轭物将进一步得到更具体的描述。当然，本发明并不局限于下述实施例。
实验部分:
NMR谱图记录于Bruker 500MHz核磁仪上。化学位移(δ)以四甲基硅烷为基准(0.00ppm)按百万分之一(ppm)表示，耦合常数(J)以赫兹为单位。高分辨质谱数据WatersAcquity UPLC-MS(Xevo QTOF)或Agilent 6120LC-MS(Quadrapole)液质联用仪或上获得。氨基酸及其衍生物和预填树脂购自Merck化工国际公司、Synthetech公司、Peptides国际股份有限公司、Chembridge国际公司或Sigma–Aldrich公司。部分交联剂如NHS酯/马来酰亚胺(AMAS,BMPS,GMBS,MBS,SMCC,EMCS or Sulfo-EMCS,SMPB,SMPH,LC-SMCC,Sulfo-KMUS,SM(PEG)4,SM(PEG)6,SM(PEG)8,SM(PEG)12,SM(PEG)24)；NHS酯/吡啶二巯基(SPDP,LC-SPDPor Sulfo-LC-SPDP,SMPT,Sulfo-LC-SMPT)；NHS酯/卤代乙酰基(SIA,SBAP,SIAB or Sulfo-SIAB)；NHS酯/二氮环丙烯(SDA or Sulfo-SDA,LC-SDA or Sulfo-LC-SDA,SDAD or Sulfo-SDAD)；马来酰亚胺/酰肼(BMPH,EMCH,MPBH,KMUH)；吡啶二巯基/酰肼(PDPH)；和异氰酸酯/马来酰亚胺(PMPI)购自Thermo Fisher Scientific公司。曲妥单抗购自Genentech公司和本单位自制。所有无水溶剂皆为市售，并于氮气下保存于全密封瓶中。所有其他试剂或溶剂皆采用市售最高规格，未进一步纯化而直接使用。
实施例1化合物2的合成
Figure GDA0001547895240001041
在10-L反应釜中将二乙氧基乙腈(1.00kg,7.74mol)溶解于甲醇(6.0L)，在室温下加入(NH4)2S(48％水溶液,1.41kg,9.29mol)。釜内温度升至33℃而后又降回室温。搅拌过夜后，浓缩反应液。向残留物中加入乙酸乙酯(5L)，用饱和NaHCO3溶液(4×1.0L)洗，水相用乙酸乙酯(5×1.0L)反萃。合并有机相，用饱和食盐水(3L)洗，之后用无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗品用石油醚打浆，真空抽滤，收集固体并用石油醚洗涤。滤液浓缩后再用石油醚打浆，合并收集所得固体，总共得到1.1kg(87％产率)目标产物，为白色或亮黄色固体。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.81(d,J＝71.1Hz,2H),5.03(s,1H),3.73(dq,J＝9.4,7.1Hz,2H),3.64(dq,J＝9.4,7.0Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,6H)。
实施例2.化合物3的合成
Figure GDA0001547895240001042
在5-L三颈圆底瓶上装备一个回流冷凝管和一个恒压滴液漏斗。在其中加入分子筛
Figure GDA0001547895240001043
和硫酰胺2(350g,2.14mol)的乙醇溶液(3L),30分钟内滴入3-溴丙酮酸乙酯(纯度80％,404mL,2.57mol)。滴加过程中內温稍有上升，随后将反应液加热至回流并搅拌30分钟。将反应液冷却至室温后用硅藻土过滤除去不溶物，并用乙酸乙酯洗滤饼。滤液浓缩后的粗产物和硅胶(1.5kg)混合拌匀，通过硅胶柱(10kg)柱层析(10-20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱)纯化，得到棕色油状物，为目标化合物(509g,92％产率)。
实施例3.化合物4的合成
Figure GDA0001547895240001051
将缩醛(300g,1.16mol)的丙酮(3.0L)溶液加热至回流，在1.0小时内滴加4N HCl溶液(250mL)。TLC显示起始原料反应完全。反应液减压浓缩后分离两相。有机相加入乙酸乙酯稀释(1.5L)，并依次用饱和NaHCO3水溶液(1.0L)、水(1.0L)和食盐水(1.0L)洗,然后用无水Na2SO4干燥。合并所有的水相并用乙酸乙酯反萃，并用无水Na2SO4干燥有机相。滤出干燥剂后浓缩有机相，所得粗产品用石油醚/乙酸乙酯(5:1)溶液打浆，析出的固体经真空过滤收集，并用石油醚/乙酸乙酯(10:1)溶液洗。滤液浓缩用柱层析纯化(0-15％乙酸乙酯/石油醚)，所有固体合并，得目标产物40g(43％产率)，为白色或亮黄色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.08–10.06(m,1H),8.53–8.50(m,1H),4.49(q,J＝7.1Hz,2H),1.44(t,J＝7.1Hz,3H)。MS ESI m/z C7H8NO3S[M+H]+计算值186.01；实测值186.01。
实施例4.化合物10的合成
Figure GDA0001547895240001052
在N2保护下室温下向(S)-叔丁基亚磺酸胺(100g,0.825mol)的四氢呋喃(1L)溶液中加入Ti(OEt)4(345mL,1.82mol)和3-甲基-2-丁酮(81mL,0.825mol)。加热反应液，回流16小时后冷却至室温，然后倒入冰水(1L)。过滤并且用乙酸乙酯洗滤饼。分离滤液中的有机相，无水硫酸钠干燥后减压浓缩，其残留物减压蒸馏(15-20torr,95℃)得目标产物10(141g,90％产率)，为黄色油状物。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ2.54–2.44(m,1H),2.25(s,3H),1.17(s,9H),1.06(dd,J＝6.9,5.1Hz,6H)。MS ESI m/z C9H19NaNOS[M+Na]+计算值212.12；实测值212.11。
实施例5.化合物11的合成
Figure GDA0001547895240001053
在N2保护下，于-78℃下向二异丙胺(264mL,1.87mol)的四氢呋喃溶液中加入正丁基锂溶液(2.5M,681mL,1.70mol)。反应在30分钟内升温至0℃然后重新冷却至-78℃，向其中加入化合物10(258g,1.36mol)并用四氢呋喃(50mL)冲洗。搅拌1小时后滴加ClTi(OiPr)3(834g,3.17mol)的四氢呋喃(1.0L)溶液。滴加完成1小时后再缓慢滴入化合物4(210g,1.13mol)的四氢呋喃(500mL)溶液，耗时1小时。所得溶液在-78℃继续搅拌3小时。TLC监测反应进行完全后，用乙酸和四氢呋喃(体积比1:1,300mL)的混合液淬灭反应,而后将反应液倒入盐水(2L),用乙酸乙酯萃取(8×1L)。有机相用水和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残留物经柱层析(DCM/乙酸乙酯/石油醚2:1:2)纯化，得化合物11(298g,74％产率)，为无色油状物。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.13(s,1H),6.63(d,J＝8.2Hz,1H),5.20–5.11(m,1H),4.43(q,J＝7.0Hz,2H),3.42–3.28(m,2H),2.89(dt,J＝13.1,6.5Hz,1H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H),1.33(s,9H),1.25–1.22(m,6H)。MS ESI m/z C16H26NaN2O4S2[M+Na]+计算值397.13，实测值397.11。
实施例6.化合物7的合成
Figure GDA0001547895240001061
将化合物11(509g,1.35mol)溶于四氢呋喃(200mL)，冷却至-78℃，向其中缓慢加入Ti(OEt)4(570mL,2.72mol)，加完后搅拌1小时。然后在90分钟内分批加入NaBH4(51.3g,1.36mol)，反应在-78℃搅拌3小时。TLC监测发现起始原料仍有剩余。缓慢加入EtOH(50mL),继续搅拌1.5小时后将反应液倒入饱和食盐水(2L,含250mL HOAc)，升至室温。经过硅藻土过滤，分离有机相。水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥有机相、过滤并浓缩。残留物经柱层析(乙酸乙酯/石油醚1:1)纯化得化合物12(364g,71％产率)，为白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.10(s,1H),5.51(d,J＝5.8Hz,1H),5.23–5.15(m,1H),4.41(q,J＝7.0Hz,2H),3.48–3.40(m,1H),3.37(d,J＝8.3Hz,1H),2.29(t,J＝13.0Hz,1H),1.95–1.87(m,1H),1.73–1.67(m,1H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H),1.29(s,9H),0.93(d,J＝7.3Hz,3H),0.90(d,J＝7.2Hz,3H).MS ESI m/z计算值C16H28NaN2O4S2[M+Na]+399.15,实测值399.14.
实施例7.化合物13的合成
Figure GDA0001547895240001071
在0℃下于化合物12(600g,1.60mol)的乙醇(590mL)溶液中加入4NHCl的1，4-二氧六环(590mL)溶液。反应逐渐升至室温后搅拌2.5小时。过滤收集析出的白色固体并用乙酸乙酯洗。滤液浓缩后用乙酸乙酯打浆。合并两次获得的白色固体，共446g(90％产率).
实施例8.化合物6的合成
Figure GDA0001547895240001072
将NaN3(740g,11.4mol)溶于水(2.0L)后加入二氯甲烷(2.0L)并冷却至0℃,向该溶液中加入Tf2O(700mL,4.10mol)，历时1.5小时。加完后在0℃下继续搅拌3小时。分离出有机相，水相用二氯甲烷萃取(2×500mL)。合并有机相，用饱和NaHCO3(3×1.0L)洗。室温下将此二氯甲烷溶液加入到(L)-异亮氨酸(300g,2.28mol),碳酸钾(472g,3.42mol),五水硫酸铜(5.7g,22.8mmol)的混合甲醇/水(1：1v/v，6.0L)溶液中。加料过程中反应体系内温度会稍微升高。混合液在室温下搅拌16小时，减压蒸去溶剂，水相用浓盐酸(大约280mL)酸化至pH 6-6.5(约280mL)，然后用磷酸盐缓冲液稀释(0.25M,pH6.2,6.0L),用乙酸乙酯(6×2.0L)洗去磺酸胺副产物。水相用浓盐酸(大约400mL)酸化至pH 3后用乙酸乙酯(4×2.0L)萃取。合并有机相，饱和食盐水洗(2.0L)，无水Na2SO4干燥，过滤浓缩得产物6(320g,89％产率)，为亮黄色油状物。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ12.01(s,1H),3.82(d,J＝5.9Hz,1H),2.00(ddd,J＝10.6,8.6,5.5Hz,1H),1.54(dqd,J＝14.8,7.5,4.4Hz,1H),1.36–1.24(m,1H),1.08–0.99(m,3H),0.97–0.87(m,3H).
实施例9.化合物14的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001073
在0℃下向Azido-Ile-OH 6(3.0g,19.1mmol)的100ml正己烷溶液中加入草酰氯(7.3mL,86mmol)和DMF(1.5ml)。加完后，升至室温，继续搅拌2小时后浓缩，并加入甲苯共沸旋干待用。将化合物13(3.92g,12.7mmol)的二氯甲烷悬浊液(90mL)冷却至0℃，加入DIPEA(6.6mL,38.1mmol)后再加入上述酰氯溶液。反应逐渐升至室温并搅拌16小时，用饱和食盐水(50mL)淬灭。分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。合并有机相并干燥、过滤、浓缩。残留物经柱层析(0-30％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物14(2.5g,48％产率)，为白色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.14(s,1H),6.57(d,J＝8.9Hz,1H),4.91(d,J＝11.1Hz,1H),4.44(dd,J＝13.2,6.3Hz,2H),4.08–3.95(m,2H),2.21(dd,J＝24.4,11.5Hz,2H),1.90–1.79(m,3H),1.42(t,J＝6.6Hz,3H),1.37–1.27(m,2H),1.11(d,J＝6.4Hz,3H),1.01–0.94(m,9H).MSESI m/z计算值C18H30N5O4S[M+H]+412.19,实测值412.19.
实施例10.化合物14的合成(方法二)
将Azido-Ile-OH(6,153g,0.97mol)溶于四氢呋喃(1.5L)并冷却至0℃,依次加入NMM(214mL,1.94mol)和氯甲酸异丁酯(95mL,0.73mol)。在0℃搅拌1小时后分批加入化合物13(150g,0.49mmol)。在0℃搅拌30分钟后，逐渐升至室温并继续搅拌2小时。反应在0℃下加冰水淬灭并用乙酸乙酯萃取三遍。合并有机相用1N HCl洗,饱和NaHCO3洗和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。过滤浓缩，残留物经柱层析(0-30％乙酸乙酯/石油醚)纯化得到白色固体(140g,70％产率)。
实施例11.化合物15的合成
Figure GDA0001547895240001081
在0℃下依次向化合物14(436g,1.05mol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入咪唑(94g,1.37mmol)和三乙基氯硅烷(222mL,1.32mol)。反应液历时1小时升至室温后，继续搅拌1小时。加入饱和食盐水淬灭，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后用柱层析(15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物15(557.4g,95％产率)，为无色油状物。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.12(s,1H),6.75(d,J＝8.0Hz,1H),5.20–5.12(m,1H),4.44(q,J＝7.0Hz,2H),4.06–3.97(m,1H),3.87(d,J＝3.8Hz,1H),2.14(d,J＝3.8Hz,1H),2.01–1.91(m,3H),1.42(t,J＝7.1Hz,3H),1.34–1.25(m,2H),1.06(d,J＝6.8Hz,3H),1.00–0.93(m,18H),0.88(dd,J＝19.1,6.8Hz,6H).MS ESI m/z计算值C24H44N5O4SSi[M+H]+526.28,实测值526.28.
实施例12.化合物16合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001091
将化合物15(5.20g,9.9mmol.)的四氢呋喃(50mL)溶液冷却至-45℃，向其中加入KHMDS(1M甲苯溶液,23.8mL,23.8mmol)。在-45℃搅拌20分钟后，加入碘甲烷(1.85mL,29.7mmol)。反应逐渐升至室温，历时4.5小时。加入乙醇(10mL)淬灭反应，用乙酸乙酯(250mL)稀释并用饱和食盐水洗(100mL)。分离有机相，水相用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后用柱层析(15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物16(3.33g,63％产率)，为亮黄色油状物。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),4.95(d,J＝6.6Hz,1H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),3.56(d,J＝9.5Hz,1H),2.98(s,3H),2.27–2.06(m,4H),1.83–1.70(m,2H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H),1.29(ddd,J＝8.9,6.8,1.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(dt,J＝8.0,2.9Hz,15H),0.92(d,J＝6.6Hz,3H),0.90(d,J＝6.7Hz,3H).MS ESI m/z计算值C25H46N5O4SSi[M+H]+540.30,实测值540.30.
实施例13.化合物16的合成(方法二)
在0℃下向化合物15(408g,0.77mol)和碘甲烷(145mL,2.32mol)的四氢呋喃(4L)溶液中加入钠氢(60％,62.2g,1.55mol)。将所得的反应液在0℃搅拌过夜，而后倒入激烈搅拌的冰水饱和氯化铵(5L)溶液中。用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后用柱层析(15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化得产物16(388g,93％产率)，为亮黄色油状物。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(s,1H),4.95(d,J＝6.6Hz,1H),4.41(q,J＝7.1Hz,2H),3.56(d,J＝9.5Hz,1H),2.98(s,3H),2.27–2.06(m,4H),1.83–1.70(m,2H),1.41(t,J＝7.2Hz,3H),1.29(ddd,J＝8.9,6.8,1.6Hz,3H),1.01(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(dt,J＝8.0,2.9Hz,15H),0.92(d,J＝6.6Hz,3H),0.90(d,J＝6.7Hz,3H).MS ESI m/z计算值C25H46N5O4SSi[M+H]+540.30,实测值540.30.
实施例14.化合物22合成
Figure GDA0001547895240001101
向D-哌啶酸(10.0g,77.4mmol)的甲醇(100mL)溶液中加入甲醛(37％水溶液,30.8mL,154.8mmol)和Pd/C(10wt％,1.0g)。将该反应液在H2(1atm)环境中搅拌过夜,而后用硅藻土过滤，甲醇洗。滤液浓缩得化合物22(10.0g,90％产率)，为白色固体。
实施例15.化合物23的合成
Figure GDA0001547895240001102
向D-N-甲基哌啶酸(2.65g,18.5mmol)的乙酸乙酯(50mL)溶液中加入五氟苯酚(3.75g,20.4mmol)和DCC(4.21g,20.4mmol)。反应在室温下搅拌16小时,硅藻土过滤，用10mL乙酸乙酯洗。滤液不用进一步纯化，直接使用。
实施例16.化合物30的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001103
向五氟苯基酯23的乙酸乙酯溶液中加入干Pd/C(10wt％,300mg)和叠氮化合物16(3.33g,6.61mmol)。反应液在氢气(1atm)环境中搅拌27小时,而后用硅藻土过滤，乙酸乙酯洗。滤液旋干经柱层析(0-5％甲醇/乙酸乙酯)纯化得化合30(3.90g,86％产率)。MS ESI m/z C32H59N4O5SSi[M+H]+计算值639.39,实测值639.39.
实施例17.化合物17合成
Figure GDA0001547895240001104
向化合物16(1.01g,1.87mmol)的甲醇(15mL)溶液中滴入0.1N HCl直到pH为中性。加入Pd/C(10wt％,583mg)后将该混合溶液在H2(1atm)环境于室温搅拌16小时。滤去Pd/C，甲醇洗。滤液旋干，残留物复溶于乙酸乙酯(50mL)中,用无水Na2SO4干燥，过滤后浓缩得化合物17(900mg,94％产率)，为浅黄色油状物。
实施例18.化合物30的合成(方法二)
在室温于氮气保护下向化合物17(1.35g,2.63mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入D-N-甲基哌啶酸22(2.02g,14.1mmol)和EDCI·HCl(2.97g,15.5mmol)。搅拌17小时后，浓缩反应液，向残留物中加入15mL水并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并后的有机相经无水硫酸钠干燥、过滤和浓缩后用柱层析(乙酸乙酯/甲醇40:1)纯化得化合物30(1.12g,67％产率)，为浅黄色油状物。
实施例19.化合物31的合成
Figure GDA0001547895240001111
将化合物30(3.90g,6.1mmol)溶于乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 3:1:1,100mL)混合溶液中,室温搅拌48小时。然后浓缩，残留物经柱层析(2:98至15:85甲醇/乙酸乙酯)纯化得化合物31(2.50g,两步产率72％).MS ESI m/z C26H45N4O5S[M+H]+计算值525.30,实测值525.33.
实施例20.化合物32的合成
Figure GDA0001547895240001112
在0℃下将LiOH(0.4N,47.7mL,19.1mmol)水溶液加入化合物31(2.50g,4.76mmol)的1，4-二氧六环(47.7mL)溶液中。室温搅拌2小时后浓缩。残留物经柱层析(100％二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇/氨水80:20:1)纯化得化合物32(2.36g,99％产率)，为无定形白色固体。MS ESI m/z C24H41N4O5S[M+H]+计算值497.27,实测值497.28.
实施例21.化合物33的合成
Figure GDA0001547895240001121
在0℃下向化合物32(2.36g,4.75mmol)的吡啶(50mL)溶液中滴入乙酸酐(2.25mL,24mmol)。反应经2小时逐渐升至室温，并继续搅拌24小时。浓缩后加入1，4-二氧六环/水(v/v 1:1,10mL)混合液搅拌1小时，以破坏可能生成的酸酐。浓缩后的残留物经柱层析(100％二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇/氨水50:50:1)纯化，得化合物33(2.25g,88％产率)为无定形白色固体。MS ESI m/z C26H43N4O6S[M+H]+计算值539.28,实测值539.28.
实施例22.化合物28的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001122
向2-甲基丙氨酸(5.00g,48.5mmol,1.0eq.)与甲醛(37％水溶液,20mL,242.5mmol)的甲醇(20mL)溶液中加入Pd/C(10wt％,0.5g)。反应液在H2(100psi)环境下65℃搅拌16小时。硅藻土过滤，甲醇洗。滤液旋干得化合物28(6.00g,94％yield)，为白色固体。
实施例23.化合物28的合成(方法二)
将2-甲基丙氨酸(500g,4.85mol),甲醛(37％水溶液,1.0L,12.1mol)和甲酸(1.0L)的混合液加热至回流(80℃)。搅拌3.0小时后冷却至室温，加入6NHCl(850mL)，而后浓缩反应液。过滤收集所得的固体并用乙酸乙酯洗三遍(1.0L)。将固体溶于水(1.5L)并用4N NaOH(约1.0L)中和至pH 7。浓缩并用乙醇(2.0L)共沸以除水。残留物用甲醇(2.0L)溶解，过滤除去NaCl固体，乙酸乙酯洗。滤液浓缩后得白色固体639.2g,包含有少量NaCl，可直接使用不用进一步纯化。
实施例24.化合物29的合成
Figure GDA0001547895240001123
向化合物28(97g,0.74mol)的乙酸乙酯(1L)溶液中加入五氟苯酚(163g,0.88mol)和DIC(126mL,0.81mol)。反应室温搅拌24小时后用硅藻土过滤，用10mL乙酸乙酯洗。滤液不经进一步纯化直接使用。
实施例25.化合物38的合成
Figure GDA0001547895240001131
向上述五氟苯基酯29的乙酸乙酯溶液中加入化合物16(200g,0.37mol)和干的Pd/C(10wt％,10g)。反应液在氢气(1atm)环境中搅拌27小时。硅藻土过滤，乙酸乙酯洗。合并的有机相浓缩后经柱层析(0-5％甲醇/乙酸乙酯)纯化得化合物38(184g,79％产率).MS ESIm/z C31H58N4O5SSi[M+H]+计算值627.39,实测值627.39.
实施例26.化合物39的合成
Figure GDA0001547895240001132
将化合物38(200g,0.32mmol)溶于乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 3:1:1,638mL)混合溶液中，室温搅拌4天。反应液浓缩后用甲苯共沸带干，此步骤重复两遍后得化合物39,直接用于下一步反应。MS ESI m/z C25H45N4O5S[M+H]+计算值513.30,实测值513.30.
实施例27.化合物40的合成
Figure GDA0001547895240001133
在0℃下将氢氧化锂(0.4N,600mL,2.55mol)的水溶液加入化合物39(160g,0.319mol,1.0eq.)的甲醇(1.2L)溶液中。反应在室温搅拌2小时后浓缩。经柱层析(100％二氯甲烷至80:20:1二氯甲烷/甲醇/氨水)得化合物40(140g,两步产率91％)为无定形白色固体。MS ESI m/z C23H40N4O5S[M+H]+计算值485.27,实测值485.27.
实施例28.化合物41的合成
Figure GDA0001547895240001141
将化合物40(143g,0.30mol)和DMAP(0.36g,2.95mmol)溶于无水四氢呋喃(1.4L)与无水DMF(75mL)的混合溶液中。冷却至0℃,加入TEA(82.2mL,0.59mmol)和乙酸酐(56mL,0.59mmol)。反应逐渐升至室温并搅拌24小时。浓缩后经柱层析(5-50％甲醇/二氯甲烷)纯化得化合物41(147g,95％产率)，为无定形白色固体。MS ESI m/z C25H44N4O6S[M+H]+计算值527.28,实测值527.28.
实施例29.化合物98的合成
Figure GDA0001547895240001142
向Boc-L-酪氨酸甲酯(670g,2.27mol),碳酸钾(358g,2.5mol)和碘化钾(38g,0.227mol)的丙酮(3L)溶液中缓慢加入苄基溴(283mL,2.38mol)。回流过夜，冷却后加入水(6L)，用乙酸乙酯(5×100L)萃取。合并后的有机相用饱和食盐水(2L)洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩后经SiO2柱层析(4:1石油醚/乙酸乙酯)得白色固体98(795g,91％产率).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝7.0Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.2Hz,1H),7.04(d,J＝8.5Hz,2H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.04(s,2H),4.55(d,J＝6.9Hz,1H),3.71(s,3H),3.03(qd,J＝14.0,5.8Hz,2H),1.43(s,9H).MS ESI m/z C22H28NO5[M+H]+:计算值386.19,实测值386.19.
实施例30.化合物99的合成
Figure GDA0001547895240001143
在-78℃下向化合物98(380g,987mmol)的无水二氯甲烷(1L)溶液中缓慢滴加DIBAL(1.0M正己烷溶液,2.9L)，历时3小时。加完后用3L乙醇淬灭反应。滴加1N HCl至pH 4。所得混合液逐渐升至0℃，分出有机相，水相用乙酸乙酯(3×3L)萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，并浓缩。经石油醚/乙酸乙酯打浆得白色固体99(263g,75％产率).1HNMR(500MHz,CDCl3)δ9.65(s,1H),7.45(d,J＝7.1Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.35(t,J＝7.1Hz,1H),7.11(d,J＝8.6Hz,2H),6.95(d,J＝8.6Hz,2H),5.07(s,2H),4.42(dd,J＝12.4,6.1Hz,1H),3.09(d,J＝6.2Hz,2H),1.46(s,9H).MS ESI m/z C21H26NO4[M+H]+:计算值356.18,实测值356.19.
实施例31.化合物95的合成
Figure GDA0001547895240001151
向500mL圆底瓶中加入三苯基膦(100g,381mmol)和2-溴丙酸乙酯(100mL,762mmol)。反应液在N2保护下加热至50℃，搅拌过夜。当白色固体(PPh3)全部溶解后，大量的白色产物开始析出。经石油醚/乙酸乙酯打浆后抽滤收集白色固体，得化合物95(135g,80％产率)。MS ESI m/z C23H24O2P[M-Br]+计算值363.15,实测值363.13.
实施例32.化合物96的合成
Figure GDA0001547895240001152
在剧烈的搅拌下将化合物95(135.42g,305.7mmol)的二氯甲烷(500mL)溶液加入到10％NaOH(450mL)水溶液中。有机相立即变黄，搅拌30分钟后，TLC显示反应完全。分离出有机相，水相用二氯甲烷(2×200mL)萃取。合并后的有机相经饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后浓缩得黄色固体96(104g,94％产率)。MS ESI m/z C23H24O2P[M+H]+计算值362.14,实测值363.13。
实施例33.化合物100的合成
Figure GDA0001547895240001153
室温下向化合物99(81.4g,229mmol)的无水二氯甲烷(800mL)溶液中加入叶立德96(2.0eq.)的无水二氯甲烷(800mL)溶液，历时30分钟。反应在室温搅拌过夜后浓缩，经SiO2柱层析(6:1石油醚/乙酸乙酯)纯化后得白色固体100(63.4g,63％产率).1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.45–7.41(m,2H),7.40–7.35(m,2H),7.33(d,J＝7.2Hz,1H),7.10–7.06(m,2H),6.92–6.88(m,2H),6.50(dd,J＝8.8,1.3Hz,1H),5.04(s,2H),4.57(s,2H),4.18(q,J＝7.1Hz,2H),2.86(d,J＝8.5Hz,1H),2.72(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),1.71(d,J＝1.4Hz,3H),1.41(d,J＝2.2Hz,9H),1.28(td,J＝7.5,5.1Hz,4H).MS ESI m/z C26H33NaNO5[M+Na]+计算值462.24,实测值462.22.
实施例34.化合物101的合成
Figure GDA0001547895240001161
在氢化反应瓶中将Pd/C(1.83g,10wt％)加入到化合物100(30.2g,68.9mmol)的四氢呋喃(100mL)与甲醇(300mL)混合溶液中。混合物在1atm H2环境下振荡过夜。硅藻土过滤，滤液浓缩得化合物101(25.0g,理论产率)，为无色油状物。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.99(d,J＝7.0Hz,2H),6.72(d,J＝7.6Hz,2H),4.39(s,1H),4.18–4.04(m,2H),3.82(s,1H),2.60(dd,J＝37.2,20.9Hz,4H),1.95–1.81(m,1H),1.39(s,11H),1.24(dd,J＝9.5,4.3Hz,3H),1.13(t,J＝8.9Hz,3H).MS ESI m/z C19H31NO5[M+H]+计算值352.20,实测值352.19.
实施例35.化合物102的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001162
在室温下向化合物101(5.96g,35.9mmol)的无水二氯甲烷(200mL)溶液中加入乙酸酐(3.2mL,33.9mmol)和硝酸(65％-68％水溶液,3.5mL,50.79mmol)。室温搅拌30分钟后，TLC显示反应完全。反应液用水(3×200mL)洗,水相用二氯甲烷(3×100mL)反萃。合并的二氯甲烷相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经SiO2柱层析(5:1石油醚/乙酸乙酯)纯化得化合物102(4.18g,72％产率)，为一黄色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.49(s,1H),7.89(s,1H),7.44(d,J＝8.4Hz,1H),7.09(d,J＝8.6Hz,1H),4.32(d,J＝8.3Hz,1H),4.12(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H),3.80(s,1H),2.76(dd,J＝13.0,6.8Hz,2H),2.59(s,1H),1.88(s,1H),1.37(t,J＝8.7Hz,9H),1.25(dd,J＝13.5,6.9Hz,4H),1.16(t,J＝8.0Hz,3H).MS ESI m/z C19H28NaN2O7[M+Na]+计算值419.19,实测值419.17.
实施例36.化合物102的合成(方法二)
室温下向化合物101(15.6g,44.3mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液中加入亚硝酸叔丁酯(18.3g,177.2mol)。室温搅拌4小时后TLC显示反应完全，浓缩反应液，SiO2柱层析(3:1石油醚/乙酸乙酯)纯化后得102(14.3g,81％产率)，为一黄色固体。
实施例37.化合物103的合成
Figure GDA0001547895240001171
室温下向化合物102(15.3g,38.6mmol)的四氢呋喃(100mL)与甲醇(100mL)混合溶液中加入LiOH·H2O(16.3g,389mmol)的水溶液(190mL)。反应室温搅拌40分钟后，加水(400mL)稀释并用1N KHSO4调至pH 3-4。用乙酸乙酯(3×300mL)萃取后,有机相用饱和食盐水洗,无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩得103(14.4g,理论产率)，为一黄色固体。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.48(s,1H),7.98–7.88(m,1H),7.42(dd,J＝18.4,8.2Hz,1H),7.14–7.03(m,1H),4.48(d,J＝8.6Hz,1H),3.90(s,1H),2.82–2.53(m,3H),1.97–1.82(m,2H),1.42–1.27(m,10H),1.21(d,J＝6.7Hz,4H).MS ESI m/z C17H23N2O7[M-H]-计算值367.16,实测值367.14.
实施例38.化合物104的合成
Figure GDA0001547895240001172
在氢化反应瓶中将Pd/C(2.60g,10wt％)加入到化合物103(26.0g,70.6mmol)的甲醇(260mL)溶液中。混合物在1atm H2环境下搅拌反应过夜。硅藻土过滤，滤液浓缩得化合物104(24.0g,理论产率)，为绿色油状物。
实施例39.化合物106的合成
Figure GDA0001547895240001181
将2-溴丙酸叔丁酯(255g,1.22mol)和三苯基膦(320g,1.22mol)的干燥乙腈(1L)溶液在室温搅拌18小时。减压旋去乙腈后加入甲苯使白色固体析出。倾倒出甲苯后将白色固体溶于二氯甲烷(1L)并转移至分液漏斗。加入10％NaOH水溶液(1L)，摇晃后有机相很快变黄。分出有机相，水相用二氯甲烷(1L)反萃一次。合并二氯甲烷相，饱和食盐水(400mL)洗,无水Na2SO4干燥，过滤后浓缩得叶立德106(280g,58％)，为一黄色固体。
实施例40.化合物107的合成
Figure GDA0001547895240001182
向化合物99(450g,1.27mol)的干燥二氯甲烷(3L)溶液中加入叶立德106(546g,1.40mmol)。室温搅拌过夜。TLC监测反应完全后，经柱层析(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物107(444g，75％产率)，为一白色固体。ESIm/z C28H38NO5[M+H]+:计算值468.27,实测值468.22..
实施例41.化合物108的合成
Figure GDA0001547895240001183
将化合物107(63g，0.13mol)溶于甲醇(315mL)，加入Pd/C(10wt％,6.3g)，在氢气(1atm)环境下室温搅拌过夜。过滤除去催化剂后浓缩滤液得化合物108(45.8g，93％产率).
实施例42.化合物109的合成
Figure GDA0001547895240001184
在室温下向化合物108(390g，1.03mol)的四氢呋喃(4L)溶液中加入亚硝酸叔丁酯(1.06kg，10.3mol.)。搅拌过夜后旋去四氢呋喃,残留物经柱层析(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化得化合物109(314g,72％产率)，为一亮黄色固体。
实施例43.化合物110的合成
Figure GDA0001547895240001191
在氮气保护下向化合物109(166g,0.392mol)的乙酸乙酯(500mL)溶液中加入Pd/C(10wt％,16g)。通入氢气，真空置换三次。反应液在氢气(1atm)环境中于室温搅拌16小时。硅藻土过滤，浓缩得化合物110(146g,97％产率)，为一黄色泡沫状固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.62(d,J＝7.9Hz,1H),6.55(s,1H),6.43(d,J＝7.3Hz,1H),4.39(dd,J＝53.0,44.2Hz,1H),3.77(s,4H),2.72–2.29(m,3H),1.83–1.58(m,1H),1.40(d,J＝7.6Hz,18H),1.24(s,1H),1.06(t,J＝5.7Hz,3H).MS ESI m/z C21H35N2O5[M+H]+计算值394.25,实测值395.25.
实施例44.化合物114的合成
Figure GDA0001547895240001192
在在氮气保护下，将(S)-4-异丙基恶唑烷-2-酮(5.00g,38.7mmol)溶于无水四氢呋喃(200mL)中，降温至-78℃，30分钟内将正丁基锂(2.5M正己烷溶液,17.0mL)滴加进反应瓶中，在-78℃下反应1小时。然后滴加丙酰氯(4.0mL,42.58mmol)，滴加完毕后，在-78℃下反应1小时，薄层色谱监测反应完毕，将反应液倒入饱和食盐水溶液(250mL)中，乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机相，用1N NaOH溶液(200mL)洗涤一次，饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，用硅胶柱纯化(7:1石油醚/乙酸乙酯)得到无色油状物6.36g,产率89％。MS ESI m/z C9H16NO3[M+H]+计算值186.10,实测值186.10。
实施例45.化合物115的合成
Figure GDA0001547895240001201
在氮气保护下，将化合物114(2.00g,11.9mmol)溶于无水二氯甲烷(200mL)中，降温至0℃，将二异丙基乙基胺(2.3mL,12.9mmol)和n-Bu2BOTf(1.0M二氯甲烷溶液,12.0mL)滴加进反应瓶中，0℃下反应45分钟，再降温至-78℃，将化合物99(4.24mL,10.8mmol)的二氯甲烷溶液滴加进反应瓶中，-78℃下反应1小时，然后慢慢升温至室温并反应过夜。次日，将磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.0,100mL)加进反应瓶中，分液，水相用二氯甲烷萃取(3×50mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(200mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得粗品。将粗品溶于甲醇(100mL)中，降温至0℃，将H2O2(30％水溶液,26mL)滴入，0℃下反应3小时，旋蒸除去甲醇，加水(100mL)，用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色泡沫状固体2.7g,产率49％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(ddd,J＝24.2,14.2,7.1Hz,5H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,2H),5.02(s,2H),4.69(d,J＝9.0Hz,1H),4.45(d,J＝4.1Hz,1H),4.33(t,J＝8.4Hz,1H),4.15(d,J＝8.6Hz,1H),3.90(dd,J＝16.6,8.0Hz,1H),3.85–3.77(m,2H),2.81(d,J＝7.6Hz,2H),2.27(dd,J＝11.4,6.7Hz,1H),1.35(s,9H),0.89(dd,J＝14.3,6.9Hz,6H)。MS ESI m/z C30H41N2O7[M+H]+计算值541.28,实测值541.30。
实施例46.化合物116的合成
Figure GDA0001547895240001202
在氮气保护下，将化合物115(2.50g,4.63mmol)溶于无水四氢呋喃(46mL)中，加入二硫羰基咪唑(2.48g,13.89mmol)，回流反应过夜。次日，加水(100mL)，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(300mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到黄色泡沫状固体2.33g,产率77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(s,1H),7.67(s,1H),7.36(dt,J＝16.0,6.9Hz,6H),7.09(s,1H),7.05(d,J＝8.4Hz,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,2H),6.32(d,J＝9.5Hz,1H),5.01(s,2H),4.56–4.43(m,2H),4.32(ddd,J＝16.2,15.6,7.8Hz,3H),4.19(d,J＝8.7Hz,1H),2.96(dd,J＝14.6,4.4Hz,1H),2.49(dd,J＝14.5,10.5Hz,1H),2.29(td,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.73(s,1H),1.29(s,9H),0.91(dd,J＝13.9,6.9Hz,6H)。MS ESI m/z C34H43N4O7S[M+H]+计算值651.27,实测值651.39。
实施例47.化合物117的合成
Figure GDA0001547895240001211
在氮气保护下，将化合物116(1.90g,2.92mmol)溶于无水甲苯(30mL)中，加入偶氮二异丁腈(0.05g,0.584mmol)和三丁基锡烷(1.6mL,5.84mmol)，回流反应2.5小时，旋干，硅胶柱纯化(5:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色泡沫状固体1.21g,产率79％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36(ddd,J＝24.5,14.5,7.1Hz,5H),7.08(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,2H),5.04(d,J＝5.1Hz,2H),4.48(d,J＝4.2Hz,1H),4.33(t,J＝8.4Hz,1H),4.22(d,J＝9.7Hz,1H),4.15(d,J＝8.8Hz,1H),3.81(s,2H),2.73(dd,J＝14.1,5.9Hz,1H),2.61(dd,J＝14.0,7.2Hz,1H),2.29(dq,J＝13.5,6.8Hz,1H),2.11–2.00(m,1H),1.60(dd,J＝15.2,6.2Hz,2H),1.35(s,9H),1.20(d,J＝6.9Hz,3H),0.89(dd,J＝14.0,6.9Hz,6H)。MS ESI m/zC30H41N2O6[M+H]+计算值525.28,实测值525.37。
实施例48.化合物118的合成
Figure GDA0001547895240001212
将化合物117(1.20g,2.29mmol)溶于四氢呋喃(30mL)和水(6mL)中，冰浴下加入LiOH(0.192g,4.58mmol)和H2O2(30％水溶液,1.4mL)，冰浴反应3小时，加入亚硫酸钠(1.5M,30mL)，冰浴下搅拌30分钟后用1N KHSO4调节pH至4，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(200mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(3:1石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体0.78g,产率82％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.28(m,5H),7.07(d,J＝7.7Hz,2H),6.91(d,J＝7.8Hz,2H),5.04(s,2H),4.52(d,J＝8.5Hz,1H),3.87(d,J＝41.8Hz,1H),2.82–2.43(m,3H),1.85(t,J＝12.2Hz,1H),1.41(s,9H),1.17(d,J＝6.9Hz,3H)。MS ESI m/z C24H32NO5[M+H]+计算值414.22,实测值414.21。
实施例49.化合物119的合成
Figure GDA0001547895240001221
将化合物118(0.77g,1.86mmol)溶于甲醇(15mL)中，加入Pd/C(10wt％,0.25g)，催化加氢(1atm H2)反应16小时，过滤，旋干得到白色固体0.58g,产率96％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.00(d,J＝7.5Hz,2H),6.80(s,2H),4.51(d,J＝9.0Hz,1H),3.88(s,1H),2.66(dd,J＝65.6,22.6Hz,4H),1.88(t,J＝12.2Hz,1H),1.42(s,9H),1.14(d,J＝6.6Hz,3H)。MS ESIm/z C17H26NO5[M+H]+:计算值324.17,实测值324.16。
实施例50.化合物120的合成
Figure GDA0001547895240001222
将化合物119(0.57g,1.76mmol)溶于无水四氢呋喃(10mL)中，冰浴下滴加亚硝酸叔丁酯(0.63mL,5.28mmol)，完毕升温至室温反应2h，加水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(3×30mL)，合并有机相，用饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(2:1石油醚/乙酸乙酯，含0.1％乙酸)得到黄色固体0.50g,产率77％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.00(s,1H),10.68(s,1H),7.67(s,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.03(d,J＝8.4Hz,1H),6.69(d,J＝8.9Hz,1H),3.56(d,J＝3.8Hz,1H),2.67(dd,J＝13.5,5.1Hz,1H),2.41(dd,J＝13.8,6.6Hz,1H),1.78–1.65(m,1H),1.27(s,9H),1.18(s,1H),1.05(d,J＝7.1Hz,3H)。MS ESI m/z C17H25N2O7[M+H]+计算值369.15,实测值369.14。
实施例51.化合物121的合成
Figure GDA0001547895240001231
将化合物120(0.77g,1.86mmol)溶于甲醇(10mL)中，加入Pd/C(10wt％,0.02g)，催化加氢(1atm H2)反应1小时，过滤，旋干得到白色固体0.43g,产率93％。MS ESI m/zC17H27N2O5[M+H]+计算值339.18,实测值339.17。
实施例52.化合物124的合成
Figure GDA0001547895240001232
将马来酸酐(285g,2.76mol)溶于乙酸(1L)中，加入4-氨基丁酸(285g,2.76mol,1.0eq.)，室温反应30分钟，升温至回流后反应1.5小时，冷却至室温，旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯溶解，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，粗品用石油醚和乙酸乙酯重结晶得到白色固体400g，产率80％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.71(s,2H),3.60(t,J＝6.7Hz,2H),2.38(t,J＝7.3Hz,2H),2.00–1.84(m,2H)。
实施例53.化合物125的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001233
将化合物124(400g,2.18mol)溶于无水二氯甲烷(1.5L)中，加入N-羟基马来酰亚胺(276g,2.40mmol)和DIC(303g,2.40mol)，室温反应过夜，旋干，硅胶柱纯化(1:2石油醚/乙酸乙酯)得到白色固体382g,产率63％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.74(s,2H),3.67(t,J＝6.8Hz,2H),2.85(s,4H),2.68(t,J＝7.5Hz,2H),2.13–2.03(m,2H)。
实施例54.化合物125的合成(方法二)
将马来酸酐(9.84g,100mmol)和4-氨基丁酸(10.3g,100mmol)溶于DMA(100mL)中，室温反应1小时，冰浴，加入N-羟基马来酰亚胺(14.4g,125mmol)和DCC(40.0g,194mmol)，完毕，升温至室温反应16小时，过滤，将滤液旋干，加水，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤一次，饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(10:1DCM/MeOH)得到白色固体6.85g,产率24％。
实施例55.化合物126的合成(方法一)
Figure GDA0001547895240001241
将化合物104(13.8g,40.8mmol)溶于EtOH(100mL)和磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 7.5,15mL)中，加入化合物125(12.6g,44.9mmol)。室温反应过夜，旋蒸除去乙醇，加水(100mL)，用乙酸乙酯萃取(3×150mL).，合并有机相，饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(5-10％DCM/MeOH)得到黄色泡沫状固体15.3g,产率65％。1HNMR(500MHz,MeOD)δ7.36(d,J＝12.5Hz,1H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),6.79(s,2H),6.76(dd,J＝8.2,4.3Hz,1H),6.36(dd,J＝18.5,9.3Hz,1H),3.74(s,2H),3.60(t,J＝6.7Hz,3H),3.04(d,J＝9.9Hz,1H),2.91(s,1H),2.62(dd,J＝9.6,5.5Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,3H),2.07(s,1H),2.01–1.93(m,3H),1.84(ddd,J＝13.7,9.8,3.7Hz,1H),1.39–1.33(m,9H),1.30–1.24(m,3H),1.19–1.09(m,4H)。MS ESI m/z C25H32N3O8[M-H]-计算值502.23,实测值502.22。
实施例56.化合物127的合成
Figure GDA0001547895240001242
将化合物126(0.20g,0.4mmol)溶于DCM(18mL)和TFA(2mL)中，室温反应2小时，浓缩得到化合物127，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C20H24N3O6[M-H]-计算值402.17,实测值402.17。
实施例57.化合物126的合成(方法二)
将化合物124(60g,328mmol)溶于THF(600mL)中，冰浴，滴加N-甲基吗啉(85.3mL,984mmol)和氯甲酸异丁酯(44.6mL,426mmol)，0℃下反应2小时后，滴加化合物104(102g,259mmol)的THF(400mL)溶液，完毕，0℃反应30分钟，加水(300mL)，用乙酸乙酯萃取(3×300mL)，合并有机相，饱和食盐水溶液(100mL)洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(9-35％乙酸乙酯/石油醚)得到浅黄色固体104g,产率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86(s,1H),8.40(d,J＝17.3Hz,1H),6.87(s,3H),6.70(s,2H),4.53–4.16(m,0H),3.79(s,0H),3.62(t,J＝6.1Hz,1H),2.63(s,1H),2.40(t,J＝6.9Hz,1H),2.12–1.88(m,4H),1.84–1.64(m,0H),1.38(t,J＝9.6Hz,6H),1.06(t,J＝6.0Hz,3H)。
实施例58.化合物128的合成
Figure GDA0001547895240001251
将化合物33(40mg,0.074mmol)溶于乙酸乙酯中，加入五氟苯酚(27mg,0.148mmol)和DCC(23mg,0.111mmol)，室温反应16小时，硅胶垫过滤，用乙酸乙酯洗脱，将滤液浓缩，再溶于DMA(6mL)中，加入化合物127(56.6mg,0.13mmol)和DIPEA(47.4μL,0.18mmol)，室温反应24小时，浓缩，制备HPLC(C18柱,10-100％乙腈/水)纯化得到白色固体43mg,产率63％。MSESI m/zC46H66N7O11S[M+H]+计算值924.45,实测值924.45。
实施例59.化合物147的合成
Figure GDA0001547895240001252
将(R)-4-异丙基-2-恶唑烷酮(25.0g，0.194mol)溶于1150mL无水THF中，在N2保护下，降温至-70℃，滴加n-BuLi(85.0mL，0.213mol)(温度控制在-70至-65℃之间)，滴加过程中有大量白色固体析出，滴加完毕，-70℃下反应1h，再滴加丙酰氯(20.0mL，0.232mol)，滴加完毕，-70℃下反应1h，薄层色谱跟踪，反应完毕。将反应液倒入到1.2L饱和氯化铵溶液中，乙酸乙酯萃取(700mL×1，350mL×2)，合并乙酸乙酯相，用1L 1mol/LNaOH溶液洗涤一次，1L水洗涤一次，1L饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干，得无色液体。乙酸乙酯/石油醚(6-10％)过柱，得产物26.6g，产率74.1％。ESI:m/z:C9H17NO3[M+H]+计算值:186.1,实测值186.1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.48–4.37(m,1H),4.27(t,J＝8.7Hz,1H),4.21(dd,J＝9.1,3.1Hz,1H),3.04–2.82(m,2H),2.45–2.30(m,1H),1.17(t,J＝7.4Hz,3H),0.90(dd,J＝17.1,7.0Hz,6H)。
实施例60.化合物148的合成
Figure GDA0001547895240001261
将化合物147(18.4g，99.5mmol)溶于200mL无水DCM中，加入到干燥的N2保护的1L三颈瓶，冰浴，滴加无水DIPEA(19mL，108.6mmol)，再慢慢滴加Bu2BOTf的DCM溶液(1.0M，100mL，100mmol)，滴加完毕，冰浴下搅拌45分钟，降温至-78℃，滴加醛(32.2g，90.5mmol，1.0eq)的320mL无水DCM溶液，-78℃下反应1h，升温至0℃，冰浴下反应，并慢慢升至室温反应过夜，升温过程中溶液由无色变成黄色。薄层色谱跟踪，反应完毕。将反应液倒入700mLPBS(0.1M,PH7.0)溶液中，分液，用200mL DCM萃取水相，合并DCM相，等体积饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干得79.8g橘黄色油状物，加入730mL甲醇溶解，冰浴，慢慢滴加225mL的30％H2O2(23eq)，冰浴下反应3h。加水750mL，旋蒸除去大部分甲醇，再加水100mL，乙酸乙酯萃取(500mL×1，150mL×2)，合并乙酸乙酯相，饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干，乙酸乙酯/石油醚过柱，得产物28.3g白色泡沫状固体，产率：58.7％。ESI:m/z:C30H41N2O7[M+H]+计算值:541.3,实测值541.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49–7.26(m,3H),7.17(t,J＝10.7Hz,1H),6.93(d,J＝7.0Hz,2H),5.06(s,1H),4.28(dd,J＝44.4,36.4Hz,2H),4.04–3.52(m,1H),3.11–2.73(m,1H),2.35(s,1H),1.41(t,J＝16.3Hz,9H),0.91(dd,J＝15.6,6.4Hz,5H)。
实施例61.化合物149的合成
Figure GDA0001547895240001262
称化合物148(28.3g52.3mmol)和TCDI(35.1g，157.0mmol)于500mL N2保护的干燥的两颈瓶中，加入350mL无水THF溶解，回流反应过夜。薄层色谱跟踪，反应完毕。饱和氯化钠溶液(200mL)洗涤一次，乙酸乙酯(75mL×2)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/石油醚过柱得产物26.1g淡黄色泡沫状固体，产率：76.8％。ESI:m/z:C34H43N4O7S[M+H]+计算值:651.3,实测值651.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.21(s,1H),7.43(d,J＝11.8Hz,1H),7.42–7.28(m,5H),7.06(d,J＝8.3Hz,2H),7.01(s,1H),6.80(d,J＝8.3Hz,2H),6.17(dd,J＝8.5,2.9Hz,1H),4.96(s,2H),4.42–4.04(m,5H),2.83(dd,J＝14.2,6.2Hz,1H),2.69(dd,J＝14.2,7.1Hz,1H),2.32(dd,J＝6.8,4.2Hz,1H),1.37(s,9H),1.30(d,J＝6.9Hz,3H),0.87(dd,J＝9.9,7.0Hz,6H)。
实施例62.化合物150的合成
Figure GDA0001547895240001271
称化合物149(26.0g，40.0mmol)和AIBN(0.066g,0.01eq)于500mL干燥的两颈瓶中，N2保护下，加入350mL无水甲苯溶解，滴加n-Bu3SnH(21.5mL，80.0mmol)，回流反应1h。薄层色谱跟踪，反应完毕。旋干，乙酸乙酯/石油醚过柱得产物6.0g白色泡沫状固体，产率：37.3％。ESI:m/z:C30H41N2O6[M+H]+计算值:525.3,实测值525.3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37(ddd,J＝25.1,15.1,7.1Hz,5H),7.08(d,J＝7.9Hz,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),5.03(s,2H),4.61(d,J＝8.4Hz,1H),4.40(s,1H),4.32–4.08(m,2H),3.91–3.66(m,2H),2.83(d,J＝8.4Hz,1H),2.60(t,J＝10.1Hz,1H),2.33(s,1H),1.71(s,1H),1.41(s,9H),1.15(d,J＝6.5Hz,3H),0.87(dd,J＝17.0,7.0Hz,6H)。
实施例63.化合物151的合成
Figure GDA0001547895240001272
将化合物150(7.84g，15.0mmol)溶于90mL THF和30mL水中，冰浴。将LiOH·H2O(1.57g，37.5mmol)溶于30％H2O2(11.4mL，112.5mmol)中，并将该溶液滴加到反应体系中，有浅黄色固体析出，冰浴下反应3h，薄层色谱跟踪，反应完毕。滴加160mL 1.5M Na2SO3溶液，冰浴反应30min，用1NKHSO4溶液调节pH至4，乙酸乙酯萃取(200mL×1，750mL×2)，合并乙酸乙酯相，饱和氯化钠溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/石油醚过柱，得6.18g白色固体，产率：100％。ESI:m/z:C24H32NO5[M+H]+计算值:414.2,实测值414.2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39(ddd,J＝24.5,15.0,7.2Hz,5H),7.11(d,J＝7.8Hz,2H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H),5.06(s,2H),4.44(t,J＝8.3Hz,1H),3.83(d,J＝69.4Hz,1H),2.85–2.61(m,2H),2.61–2.40(m,1H),1.99–1.70(m,1H),1.39(d,J＝26.1Hz,9H),1.19(s,3H)。
实施例64.化合物152的合成
Figure GDA0001547895240001281
将化合物151(6.18g，15.0mmol)溶于50mL甲醇中，加入0.6g Pd/C，催化加氢，室温过夜，薄层色谱跟踪，反应完毕。加入50mL乙酸乙酯，过滤，乙酸乙酯洗涤，旋干，真空抽干，得到4.8g无色透明油状物，产率：99.4％。ESI:m/z:C17H26NO5[M+H]+计算值:324.2,实测值324.2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.97(d,J＝6.5Hz,2H),6.74(d,J＝8.2Hz,2H),3.93–3.66(m,1H),2.58(tdd,J＝19.5,12.9,7.4Hz,3H),1.75(ddd,J＝20.1,16.3,7.7Hz,1H),1.37(d,J＝21.5Hz,9H),1.11(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例65.化合物153的合成
Figure GDA0001547895240001282
将化合物152(4.8g，15.0mmol)溶于75mL无水THF中，冰浴，N2保护下滴加t-BuONO(18.0mL，150mmol)，升温至室温反应3h，薄层色谱跟踪，反应完毕。冰浴条件下慢慢滴加100mL饱和NaHCO3溶液，有大量气泡产生，再用1N KHSO4调节pH至4，乙酸乙酯萃取(150mL×1，75mL×2)，饱和氯化钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/石油醚过柱，得产物3.6g产率：65.4％。ESI:m/z:C17H25N2O7[M+H]+计算值:369.2,实测值369.2。1HNMR(400MHz,MeOD)δ7.93(d,J＝2.0Hz,1H),7.48(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),3.83–3.71(m,1H),2.82(dd,J＝13.6,5.0Hz,1H),2.66–2.41(m,2H),1.84(ddd,J＝14.0,10.6,5.6Hz,1H),1.65–1.51(m,1H),1.28(d,J＝24.9Hz,9H),1.15(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例66.化合物154的合成
Figure GDA0001547895240001291
将化合物153(3.2g，7.74mmol)溶于20mL甲醇中，加入0.2g Pd/C，催化加氢，室温反应3h，薄层色谱跟踪，反应完毕。加入20mL乙酸乙酯，过滤，乙酸乙酯洗涤，旋干，真空抽干，得到2.3g白色泡沫状固体，产率：92.0％。ESI:m/z:C17H27N2O5[M+H]+计算值:339.2,实测值339.2。1H NMR(400MHz,MeOD)δ6.61(d,J＝8.0Hz,2H),6.45(d,J＝6.3Hz,1H),3.72(d,J＝7.3Hz,1H),2.68–2.34(m,3H),1.81–1.66(m,1H),1.56–1.45(m,1H),1.36(d,J＝29.0Hz,9H),1.08(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例67.化合物41a的合成
Figure GDA0001547895240001292
将化合物41(10g,19mmol)溶于DCM中，冰浴，加入五氟苯酚(7g,38mmol)和EDCI(7.2g,38mmol)，升温至室温反应过夜，浓缩，硅胶柱纯化(0-60％乙酸乙酯/石油醚)得到无定型固体11g,产率83％。MS ESI m/z C31H41F5N4O6S[M+H]+计算值693.27,实测值693.27。
实施例68.化合物132的合成
Figure GDA0001547895240001293
将化合物41a(11g,15.9mmol)和化合物127(12.3g,23.8mmol)溶于DMF(100mL)中，冰浴下加入DIPEA(6.9mL,39.7mmol)，升温至室温反应1小时，浓缩，硅胶柱纯化(0-10％甲醇/二氯甲烷)得到无定型固体10g,产率69％。MS ESI m/z C45H65N7O11S[M+H]+计算值912.45,实测值912.45。
实施例69.化合物171的合成
Figure GDA0001547895240001301
将化合物102(1.00g,2.52mmol)溶于乙腈(10mL)中，降温至-25℃，加入CCl4(2.2mL,22.7mmol)，搅拌10分钟，加入DIPEA(0.88mL,5.04mmol)和DMAP(0.03g,0.252mmol)，再滴加亚磷酸二苄酯(0.84mL,3.78mmol)，滴加完毕，升温至室温反应1.5小时，用KH2PO4(0.5M,50mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶柱纯化(10-50％乙酸乙酯/石油醚)得到无色油状物1.60g,产率96％。MS ESI m/zC33H41N2O10P[M+H]+计算值657,实测值657。
实施例70.化合物172的合成
Figure GDA0001547895240001302
将化合物171(1.60g,2.43mmol)溶于甲醇(20mL)中，加入Pd/C(10wt％,160mg)，催化加氢(1atm H2)反应1小时，过滤，旋干得到白色固体1.00g,产率91％。MS ESI m/zC19H31N2O8P[M-H]-计算值447,实测值447。
实施例71.化合物173的合成
Figure GDA0001547895240001303
将化合物172(730mg,1.63mmol)溶于甲醇(10mL)中，加入1N NaOH(16mL,16.3mmol)，室温反应过夜，浓缩，加水(20mL)稀释，用1N HCl酸化至pH 6，浓缩，将残余物用甲醇/乙酸乙酯(80:20,5mL)打浆，过滤，收集得到白色固体0.68g,产率99％。MS ESI m/zC17H27N2O8P[M-H]-计算值417,实测值417。
实施例72.化合物174的合成
Figure GDA0001547895240001311
将化合物173(300mg,0.72mmol)溶于乙醇/二氯甲烷/水(v/v/v 5:3:1,2mL)中，加入化合物125(262mg,0.94mmol)和TEA(0.15mL,1.08mmol).，室温搅拌过夜，浓缩，反相色谱柱HPLC(C18柱,10-90％乙腈/水)纯化得到白色固体200mg,产率48％。MS ESI m/zC25H34N3O11P[M-H]-计算值582,实测值582。
实施例73.化合物175的合成
Figure GDA0001547895240001312
将化合物174(140mg,0.24mmol)溶于DCM(2mL)和TFA(1mL)中，室温反应2小时，浓缩得到化合物175，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C20H27N3O9P[M-H]-计算值482,实测值482。
实施例74.化合物180的合成
Figure GDA0001547895240001313
将化合物33(86mg,0.16mmol,1.0eq.)溶于DCM(2mL)中，冰浴，加入五氟苯酚(44mg,0.24mmol,1.5eq.)和DIC(22mg,0.175mmol,1.1eq.)，升温至室温反应过夜，浓缩，EtOAc(2mL)溶解，过滤，再次浓缩得到五氟苯酚酯粗品，将其溶于DMA(2mL)中，加入化合物175(0.24mmol,1.5eq.)和DIPEA(42μL,0.24mmol,1.5eq.)，室温反应过夜，浓缩，反相色谱柱HPLC(C18柱,10-90％乙腈/水)纯化得到无定型固体90mg,产率56％。MS ESI m/zC46H67N7O14PS[M+H]+计算值1004.41,实测值1004.41。
实施例75.化合物289的合成
Figure GDA0001547895240001321
将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(21.0g，200mmol)和碳酸钾(83.0g，600mmol)混合于乙腈(350mL)中，加入苄基溴(57.0mL，480mmol)。将混合物回流过夜后，加入水(1L)，用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将合并的有机层用饱和食盐水(1000mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过SiO2柱色谱(4:1石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到无色油状物(50.97g，产率89.2％)。MS ESI m/z C18H23NO2Na[M+Na]+：计算值309.17,实测值309.19。
实施例76.化合物290的合成
Figure GDA0001547895240001322
向2-(2-(二苄基氨基)乙氧基)乙醇(47.17g，165.3mmol)，丙烯酸叔丁酯(72.0mL，495.9mmol)和四丁基碘化铵(6.10g，16.53mmol)的二氯甲烷(560mL)溶液中加入50％氢氧化钠水溶液(300mL)。将混合物搅拌过夜。分离有机层，水层用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有机层并用水(3×300mL)和饱和食盐水(300mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过SiO2柱色谱(7:1石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到无色油状物(61.1g，89.4％产率)。MSESI m/z C25H36NO4[M+H]+：计算值414.2566，实测值414.2384。
实施例77.化合物291的合成
Figure GDA0001547895240001323
在氢化瓶中向3-(2-(2-(2-(二苄基氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(20.00g，48.36mmol，1.0当量)的四氢呋喃(30mL)和甲醇(60mL)溶液中加入Pd/C(2.00g，10wt％)。将混合物在氢气环境中(1atm)振荡过夜，通过硅藻土(助滤剂)过滤，浓缩滤液，得到无色油状物(10.58g，93.8％产率)。MS ESI m/z C11H24NO4[M+H]+：计算值234.1627，实测值234.1810。
实施例78.化合物292的合成
Figure GDA0001547895240001331
在0℃下，向(E)-3-溴丙烯酸(0.15g，1mmol)，DMAP(0.15g，1.2mmol)和DCC(0.21g，1mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入化合物291(0.23g，1mmol)。将反应混合物升温至室温，搅拌过夜。将粗产物浓缩并通过SiO2柱色谱用乙酸乙酯/二氯甲烷梯度洗脱，得到化合物292(0.31g，85％产率)。ESI MS m/z C14H25BrNO5[M+H]+：计算值366.08，实测值366.08。
实施例79.化合物293的合成
Figure GDA0001547895240001332
将化合物292(0.31g，0.84mmol)在0℃下溶解于甲酸(4mL)中，然后加入水(2mL)。将反应混合物升温至室温，并搅拌过夜。将粗产物浓缩后直接用于下一步。ESI MS m/zC10H17BrNO5[M+H]+：计算值310.02，实测值310.03。
实施例80.化合物294的合成
Figure GDA0001547895240001333
将化合物293(0.12g，0.39mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.067g，0.58mmol)和EDCI(0.11g，0.58mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，混合物在室温下搅拌过夜，浓缩并通过SiO2柱色谱纯化，得到化合物294(0.13g，82％产率)。ESIMS m/z C14H20BrN2O7[M+H]+：计算值407.04，实测值407.04。
实施例81.化合物297的合成
Figure GDA0001547895240001334
向化合物256(50mg，0.066mmol)和化合物294(60mg，0.148mmol)的DMA(3ml)溶液中加入磷酸二氢钠(17.8mg，0.15mmol)。在室温下搅拌过夜，浓缩并通过制备HPLC纯化(用乙腈/水梯度洗脱)，得到化合物297(22.6mg，33％产率)。ESI MS m/z C48H73BrN7O12S[M+H]+：计算值1052.41，实测值1052.40。
实施例82.化合物302的合成
Figure GDA0001547895240001341
将3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(466mg，2mmol)和丙炔酸(210mg，3mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，向其中加入DCC(618mg,3mmol)。将所得溶液在室温下搅拌3小时后再浓缩。通过柱色谱(10％乙酸乙酯/石油醚至100％乙酸乙酯)纯化，得到化合物302(400mg，70％)。ESIMS m/z 286.17([M+H]+)。
实施例83.化合物303的合成
Figure GDA0001547895240001342
将化合物302(200mg，0.7mmol)溶于二氯甲烷(5mL)，向其中加入甲酸(7mL)。将所得溶液在38℃下搅拌过夜。减压蒸馏除去所有挥发物，得到化合物303(160mg)。ESI MS m/z230.11([M+H]+)。
实施例84.化合物304的合成
Figure GDA0001547895240001343
将N-羟基琥珀酰亚胺(115mg，1mmol)和EDC(192mg，1mmol)加入到化合物303(149mg，0.65mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中。室温搅拌过夜，将反应浓缩并通过柱色谱法(0％至10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物(180mg，85％)。ESI MS m/z 327.11([M+H]+)。
实施例85.化合物305的合成
Figure GDA0001547895240001344
将磷酸二氢钠(0.1M，1.5mL)加入到化合物304(90mg，0.276mmol)和化合物110(109mg，0.276mmol)的乙醇(7.5mL)溶液中。将所得溶液在室温下搅拌24小时。减压蒸馏除去所有挥发物，并通过柱色谱(30％乙酸乙酯/石油醚至100％乙酸乙酯)纯化残留物，得到标题化合物(160mg，96％)。ESI MS m/z 606.34([M+H]+)
实施例86.化合物306的合成
Figure GDA0001547895240001351
将化合物305(40mg，0.066mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，并在室温下与三氟乙酸(3mL)搅拌2小时。减压蒸馏除去所有挥发物，得到标题化合物(29mg，99％)。ESI MS m/z450.23([M+H]+)。
实施例87.化合物307的合成
Figure GDA0001547895240001352
将化合物306(29mg，0.066mmol)和化合物41a(46mg，0.066mmol)溶于DMA(3mL)中。然后加入DIPEA(10mg，0.078mmol)，并在室温下搅拌1.5小时。减压蒸馏除去溶剂，残留物用制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到标题化合物(15mg，24％)。ESI MS m/z 958.47([M+H]+)。
实施例88.化合物309的合成
Figure GDA0001547895240001353
向化合物110(424mg，1mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中加入咪唑(408mg，6mmol)和叔丁基氯二甲基硅烷(602mg，4mmol)。将所得溶液在室温下搅拌3小时。浓缩反应液并通过柱色谱(10％至30％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物309(344mg，64％产率)。
实施例89.化合物310的合成
Figure GDA0001547895240001354
将化合物309(200mg，0.37mmol)溶于乙酸乙酯(30mL)中，在室温氢气(1atm)环境下与Pd/C(10wt％，100mg)搅拌2小时。滤出催化剂后，滤液减压蒸馏除去所有挥发物，得到化合物310(187mg，99％产率)。
实施例90.化合物312的合成
Figure GDA0001547895240001361
将乙炔二羧酸(26.5mg，0.232mmol)溶于NMP(1.0mL)中并冷却至0℃，向其中加入化合物291(0.15g，0.557mmol)，随后加入DMTMM(0.18g，0.65mmol)。将反应在0℃下搅拌5小时，然后用乙酸乙酯稀释，用水和饱和食盐水洗涤。将有机溶液浓缩并通过柱色谱纯化(80-90％乙酸乙酯/石油醚)。将需要的馏分浓缩并保存在冰箱中过夜，滤出析出的固体。将滤液浓缩，得到浅黄色油状物(0.37g，>100％产率)，用于下一步反应。MS ESI m/z C26H45N2O10[M+H]+：计算值545.30；实测值545.30。
实施例91.化合物313的合成
Figure GDA0001547895240001362
将化合物312(0.21g)溶于二氯甲烷(2.5mL)中并冷却至0℃，加入三氟乙酸(2.5mL)，将反应升温至室温并搅拌45分钟，然后在旋转蒸发器上除去溶剂和残留的TFA。粗产物通过柱色谱(0-15％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到无色油状物(58.7mg，两步收率99％)。MS ESI m/z C18H29N2O10[M+H]+：计算值433.17；实测值433.17。
实施例92.化合物314的合成
Figure GDA0001547895240001363
将化合物313(0.085g，0.197mmol)，化合物310(0.1g，0.197mmol)和HATU(0.112mg，0.30mmol)在DMF(6ml)中混合，向其中加入三乙胺(55μL，0.40mmol)。反应在室温下搅拌过夜，减压蒸馏除去溶剂，残留物通过SiO2柱色谱纯化，得到标题产物314(0.065mg，36％产率)。ESI MS m/z C45H75N4O14Si[M+H]+：计算值923.50，实测值923.50。
实施例93.化合物315的合成
Figure GDA0001547895240001371
将化合物314(64.8mg，0.070mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入TBAF(1M，0.1mL)，将反应物在室温下搅拌1小时，然后浓缩并通过SiO2柱色谱纯化，得到标题产物315(34.5mg，61％产率)。ESI MS m/z C39H61N4O14[M+H]+：计算值809.41，实测值809.41。
实施例94.化合物316的合成
Figure GDA0001547895240001372
将化合物315(34.5mg，0.043mmol)溶于二氯甲烷(1mL)中，然后加入三氟乙酸(0.5mL)。将反应物在室温下搅拌2小时，浓缩后再溶解于DMA(4mL)中，加入五氟苯基酯(45mg，0.065mmol)和DIPEA(15μL，0.09mmol)，反应室温搅拌过夜后浓缩，通过制备HPLC纯化(用乙腈/水梯度洗脱)，得到标题产物316(22.8mg，46％产率)。ESI MS m/z C56H85N8O17S[M+H]+：计算值1173.57，实测值1173.58。
实施例95.化合物334的合成
Figure GDA0001547895240001373
将4-氨基丁酸(30g，300mmol)和NaOH(24g，600mmol)溶解于水(160mL)，在0℃加入氯甲酸苄酯(64.4g，380mmol)的四氢呋喃(130mL)溶液。将反应在0℃搅拌1小时，室温3小时。减压蒸馏除去四氢呋喃，在0℃用浓盐酸调节水溶液pH值至3。用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩得到白色固体(70.8g，99％)。ESI m/z C12H16NO4[M+H]+:计算值238.10,实测值238.22。
实施例96.化合物335的合成
Figure GDA0001547895240001381
将DMAP(0.8g，6.56mmol)和DCC(17.1g，83mmol)加入到4-((((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(16.4g，69.2mmol)和叔丁醇(15.4g,208mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液。室温搅拌过夜，将反应物过滤并浓缩滤液。将残留物溶于乙酸乙酯中，用1N HCl，饱和食盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩后通过柱色谱(10至50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到化合物335(7.5g，37％产率)。MS ESI m/z C16H23NO4Na[M+Na]+：计算值316.16，实测值为316.13。
实施例97.化合物336的合成
Figure GDA0001547895240001382
将4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸叔丁酯(560mg，1.91mmol)溶于甲醇(50mL)中，与Pd/C催化剂(10wt％，100mg)混合，然后氢化(1atm)反应3小时。滤出催化剂，减压蒸馏除去所有挥发物，得到化合物336(272mg，90％产率)。MS ESI m/z C8H18NO2[M+H]+：计算值160.13，实测值160.13。
实施例98.化合物338的合成
Figure GDA0001547895240001383
将4-氨基丁酸叔丁酯(477mg，3mmol)和2,3-二溴代琥珀酸(414mg，1.5mmol)溶于二氯甲烷(35mL)中，向其中加入DIPEA(1.16g，9mmol)和EDC(0.86g，4.5mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后用饱和食盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩后通过柱色谱法(纯二氯甲烷至10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物338(160mg，22％产率)。MS ESI m/zC20H34BrN2O6[M+H]+：计算值477.15，实测值477.16。
实施例99.化合物339的合成
Figure GDA0001547895240001384
将化合物338(80mg，0.168mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，并在38℃下与甲酸(8mL)搅拌过夜。减压蒸馏除去所有挥发物，得到化合物339(61mg，99％产率)。MS ESI m/zC12H18BrN2O6[M+H]+：计算值365.03，实测值365.05。
实施例100.化合物340的合成
Figure GDA0001547895240001391
将N-羟基琥珀酰亚胺(60mg，0.504mmol)和EDCI(97mg，0.504mmol)加入到化合物339(61mg，0.168mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中。在室温搅拌过夜，将反应混合物浓缩并通过柱色谱(0至10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物340(72mg，77％产率)。MS ESI m/zC20H24BrN4O10[M+H]+：计算值559.06，实测值559.78。
实施例101.化合物342的合成
Figure GDA0001547895240001392
将磷酸二氢钠水溶液(0.1M，1mL)加入到化合物340(36mg，0.065mmol)和化合物110(25mg，0.063mmol)的乙醇(5mL)溶液中。将所得溶液在室温下搅拌过夜，然后向其中加入HO-(PEG)24-NH2(95mg)，室温下搅拌过夜。减压蒸馏除去所有挥发物，并通过柱色谱(纯二氯甲烷至10％甲醇/二氯甲烷)纯化残留物，得到化合物342(28mg，24％产率)。MS ESI m/z1798.93([M+H]+)。
实施例102.化合物344的合成
Figure GDA0001547895240001393
将化合物342(28mg，0.0156mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，在室温下搅拌2小时。减压蒸馏除去所有挥发物，得到化合物344(25mg，98％产率)。MS ESI m/z 1642.82([M+H]+)。
实施例103.化合物346的合成
Figure GDA0001547895240001401
将化合物344(25mg，0.0152mmol)和五氟苯基酯(15mg，0.0213mmol)溶于DMA(5mL)中。向其中加入DIPEA(10mg，0.077mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，浓缩后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到化合物346(13mg，40％产率).MS ESI m/z2163.82([M+H]+)。
实施例104.化合物350的合成
Figure GDA0001547895240001402
向2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧))二乙醇(55.0mL，410.75mmol)的无水四氢呋喃(200mL)溶液中加入钠(0.1g)。将混合物搅拌直至钠消失，然后滴加丙烯酸叔丁酯(20.0mL，137.79mmol)，搅拌过夜，然后在0℃下用盐酸溶液(20.0mL，1N)淬灭。通过旋转蒸发除去四氢呋喃，加入饱和食盐水(300mL)，所得混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机层用饱和食盐水洗涤(3×300mL)，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到无色油状物(30.20g，收率79.0％)，无需进一步纯化即可使用。MS ESI m/zC13H27O6[M+H]+：计算值278.1729，实测值278.1730。
实施例105.化合物351的合成
Figure GDA0001547895240001403
向3-(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(30.20g，108.5mmol)和对甲苯磺酰氯(41.37g，217.0mmol)的无水二氯甲烷(220mL)溶液中加入三乙胺(30.0mL，217.0mmol)。将反应在室温下搅拌过夜，然后用水(3×300mL)和饱和食盐水(300mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过SiO2柱色谱(3:1石油醚/乙酸乙酯)纯化至得到无色油状物(39.4g，收率84.0％)。MS ESI m/zC20H33O8S[M+H]+：计算值433.1818，实测值433.2838。
实施例106.化合物352的合成
Figure GDA0001547895240001404
向3-(2-(2-(2-(2-甲氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(39.4g，91.1mmol)的无水DMF(100mL)溶液中加入NaN3(20.67g，316.6mmol)，在室温下搅拌过夜。加入水(500mL)，用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。将合并的有机层用水(3×900mL)和饱和食盐水(900mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过SiO2柱色谱(5:1石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到浅黄色油状物(23.8g，85.5％产率)。MS ESI m/z C13H25O3N5Na[M+Na]+：计算值326.2，实测值326.2。
实施例107.化合物353的合成
Figure GDA0001547895240001411
将雷尼镍(7.5g，悬浮在水中)用水(三次)和异丙醇(三次)洗涤，并与化合物101(5.0g，16.5mmol)异丙醇溶液混合。将混合物在室温氢气球下搅拌16小时，然后用硅藻土垫过滤，用异丙醇洗涤。将滤液浓缩并通过柱色谱(5-25％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到淡黄色油状物(2.60g，57％产率)。MS ESI m/z C13H28NO5[M+H]+：计算值279.19；实测值279.19。
实施例108.化合物354的合成
Figure GDA0001547895240001412
将乙炔二羧酸(0.35g，3.09mmol)溶解在NMP(10mL)中并冷却至0℃，向其中加入化合物353(2.06g，7.43mmol)，随后加入DMTMM(2.39g，8.65mmol)。将反应在0℃下搅拌6小时，然后用乙酸乙酯稀释，用水和饱和食盐水洗涤。将有机溶液浓缩并用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂打浆。滤出固体，浓缩滤液并通过柱色谱(80-90％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到淡黄色油状物(2.26g，>100％产率)，不经进一步纯化直接使用。MS ESI m/z C30H53N2O12[M+H]+：计算值633.35；实测值633.30。
实施例109.化合物355的合成
Figure GDA0001547895240001413
将化合物354(2.26g)溶于二氯甲烷(15mL)中并冷却至0℃，然后加入三氟乙酸(15mL)，将反应升温至室温，并搅拌45分钟，然后在旋转蒸发器上除去溶剂和残留的TFA。将粗产物通过柱色谱(0-15％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到淡黄色油状物(1.39g，两步收率86％)。MS ESI m/zC22H37N2O12[M+H]+：计算值521.23；实测值521.24。
实施例110.化合物358的合成
Figure GDA0001547895240001421
在Z-L-Ala-OH(0.84g，5mmol)，H-Gly-OtBu(0.66g，5mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入HOBt(0.68g，5mmol)，EDCI(1.44g，7.5mmol)，和DIPEA(1.7mL，10mmol)。将反应液在室温下搅拌过夜，然后用水(100mL)洗，水层用乙酸乙酯反萃。将合并的有机层用饱和食盐水洗，硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物用SiO2柱纯化，得到标题产物(0.87g，52％产率)。ESIm/zC17H25N2O5[M+H]+：计算值337.17，实测值337.17。
实施例111.化合物359的合成
Figure GDA0001547895240001422
将化合物358(0.25g，0.74mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中，在室温下加入三氟乙酸(10mL)，反应搅拌过夜。然后将反应物浓缩，得到化合物359，不经进一步纯化直接用于下一步。
实施例112.化合物360的合成
Figure GDA0001547895240001423
将化合物359(0.20g，0.70mmol)，化合物110(0.19g，0.48mmol)和HATU(0.18g，0.48mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，向其中加入三乙胺(134μL，0.96mmol)。将反应液在室温下搅拌过夜，减压浓缩，残留物用SiO2柱纯化，得到标题产物360(0.30g，95％产率)。ESI m/zC34H49N4O9[M+H]+：计算值657.34，实测值657.34。
实施例113.化合物361的合成
Figure GDA0001547895240001431
在氢化反应瓶中，加入化合物360(0.30g，0.46mmol)的甲醇(10mL)溶液和Pd/C(0.10g，10wt％)。将混合物在1个大气压H2下振荡过夜，然后通过硅藻土(助滤剂)过滤，将滤液浓缩，得到化合物361(0.21g，87％产率)，不经进一步纯化直接用于下一步。ESI m/zC26H43N4O7[M+H]+：计算值523.31，实测值523.31。
实施例114.化合物362的合成
Figure GDA0001547895240001432
向化合物361(0.11g，0.2mmol)，化合物355(0.104g，0.2mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入HATU(0.07g，0.2mmol)，和三乙胺(55μL，0.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后在减压下除去溶剂，残留物用SiO2柱纯化，得到标题产物362(0.046g，23％产率)。ESI m/zC48H75N6O17[M+H]+：计算值1007.51，实测值为1007.52。
实施例115.化合物363的合成
Figure GDA0001547895240001433
将化合物362(0.046g，0.045mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，在室温下加入三氟乙酸(5mL)，搅拌2小时后将反应物浓缩，得到化合物363，不经进一步纯化直接用于下一步。
实施例116.化合物364的合成
Figure GDA0001547895240001441
向化合物363的DMA(4mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(31.1mg，0.045mmol)，然后加入DIPEA(28μl，0.159mmol)，搅拌过夜。将反应溶液浓缩，粗产物用制备HPLC纯化(10-90％乙腈/水)，得到标题产物364(7.9mg，13％产率)。ESI MSm/zC64H99N10O20S[M+H]+：计算值1359.67，实测值1359.62。
实施例117.化合物319的合成
Figure GDA0001547895240001442
将化合物104(0.19g，0.48mmol)，化合物313(0.173g，0.4mmol)和HATU(0.30g，0.8mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，然后加入三乙胺(110μL，0.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物用SiO 2柱纯化，得到标题化合物319(0.25g，80％产率)。ESI m/z C39H59N4O13[M+H]+:计算值791.40,实测值791.40。
实施例118.化合物320的合成
Figure GDA0001547895240001443
将化合物319(0.10g，0.14mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)中，然后加入TFA(1.0mL)。将反应物在室温下搅拌2小时，浓缩后得到化合物320，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
实施例119.化合物321的合成
Figure GDA0001547895240001451
向化合物320(88.8mg，0.14mmol)的DMA(1.0mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(96.9mg，0.14mmol)和DIPEA(47.5μL，0.28mmol)。反应搅拌过夜后浓缩，然后用制备HPLC纯化(乙腈/水梯度洗脱)，得到标题化合物321(40mg，25％产率)。ESI m/z C55H83N8O16S[M+H]+:计算值1143.56,实测值1143.56。
实施例120.化合物386的合成
Figure GDA0001547895240001452
将HATU(39.9g，105mmol)加入到化合物334(26.1g，110mmol)的DMF(300mL)溶液。在室温下搅拌30分钟后，将该反应混合物加入到化合物110(39.4g，100mmol)和三乙胺(20.2g，200mmol)的DMF(300mL)溶液。反应在室温搅拌2小时，用水稀释，经乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，硫酸钠干燥。浓缩后通过硅胶柱层析纯化(20-70％乙酸乙酯/石油醚)，得到白色固体(45g，产率73％)。ESI m/z C33H48N3O8[M+H]+:计算值614.34,实测值614.15。
实施例121.化合物387的合成
Figure GDA0001547895240001453
将化合物386(100g，163mmol)溶解在甲醇(500mL)中，加入Pd/C催化剂(10wt％，10g)，在室温氢化反应(1atm H2)过夜。将催化剂过滤掉后，滤液减压浓缩，得到棕色泡沫状固体387(75.8g，产率97％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11(s,1H),6.83(d,J＝10.3Hz,2H),5.04–4.52(m,6H),3.90–3.56(m,1H),2.81(d,J＝5.3Hz,2H),2.63(dd,J＝12.5,6.1Hz,2H),2.54-2.26(dd,J＝14.0,7.6Hz,4H),1.94-1.64(m,3H),1.44–1.36(m,18H),1.08(d,J＝6.9Hz,3H)。ESI m/z C25H42N3O6[M+H]+:计算值480.30,实测值480.59。
实施例122.化合物388的合成
Figure GDA0001547895240001461
将化合物387(39mg，0.08mmol)，化合物313(43mg，0.1mmol)和HATU(30.4mg，0.08mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，然后加入三乙胺(22μL，0.16mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物通过SiO 2柱纯化，得到标题化合物388(42mg，60％产率)。ESI m/zC43H66N5O14[M+H]+:计算值876.45,实测值876.40。
实施例123.化合物389的合成
Figure GDA0001547895240001462
将化合物388(17mg，0.019mmol)溶于二氯甲烷(1.0mL)中，向其中加入TFA(1.0mL)。将反应物在室温下搅拌2小时，然后浓缩，得到化合物389，不经进一步纯化即可用于下一步骤。
实施例124.化合物390的合成
Figure GDA0001547895240001463
向化合物389(13.6mg，0.019mmol)的DMA(1.0mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(13mg，0.019mmol)和DIPEA(6.4μL，0.038mmol)。将反应物搅拌过夜后浓缩，残留物通过制备HPLC(乙腈/水梯度洗脱)纯化，得到标题化合物390(9.9mg，42％产率)。ESI m/zC59H90N9O17S[M+H]+:计算值1228.61,实测值1228.60。
实施例125.化合物392的合成
Figure GDA0001547895240001471
将化合物110(68mg，0.17mmol)，化合物124(94.5mg，0.52mmol)和HATU(162mg，0.425mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中。然后加入三乙胺(73μL，0.52mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物用SiO 2柱纯化，得到标题化合物392(98mg，80％产率)。ESI m/zC37H49N4O11[M+H]+:计算值725.33,实测值725.34。
实施例126.化合物393的合成
Figure GDA0001547895240001472
将化合物392(98mg，0.135mmol)溶解在二氯甲烷(1.0mL)中，在室温下加入TFA(1.0mL)，搅拌2小时。然后浓缩，得到化合物393，其不经进一步纯化用于下一步骤。
实施例127.化合物394的合成
Figure GDA0001547895240001473
向化合物393(76.9mg，0.135mmol)的DMA(1mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(44mg，0.06mmol)和DIPEA(45.8μL，0.27mmol)。将反应搅拌过夜，然后浓缩，残留物通过制备HPLC(乙腈/H 2O梯度洗脱)纯化，得到标题化合物394(37mg，55％产率)。ESI m/z C53H73N8O14S[M+H]+:计算值1077.49,实测值1077.50。
实施例128.化合物409的合成
Figure GDA0001547895240001481
将化合物110(100mg，0.25mmol)，3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸(65mg，0.25mmol)和HATU(190mg，0.5mmol)溶于二氯甲烷(50ml)中。加入三乙胺(73μL，0.5mmol)后将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后减压蒸馏除去溶剂，残留物用SiO 2柱纯化，得到标题化合物409(164mg，75％产率)。ESI m/z C43H61N4O15[M+H]+:计算值873.41,实测值873.41。
实施例129.化合物410的合成
Figure GDA0001547895240001482
将化合物409(1634mg，0.187mmol)溶解在二氯甲烷(1.0mL)中，在室温下加入TFA(1.0mL)，搅拌2小时后浓缩，得到化合物410，不经进一步纯化用于下一步骤。
实施例130.化合物411的合成
Figure GDA0001547895240001483
向化合物410(43mg，0.06mmol)的DMA(1mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(44mg，0.06mmol)和DIPEA(34μL，0.20mmol)，搅拌过夜。然后将反应液浓缩，残留物通过制备HPLC(乙腈/H 2O梯度洗脱)纯化，得到标题化合物411(33mg，45％产率)。ESI m/z C59H85N8O18S[M+H]+:计算值1225.56,实测值1225.55。
实施例131.化合物418的合成
Figure GDA0001547895240001491
在0℃下，向马来酰亚胺(6.35g，65.4mmol)的EtOAc(120mL)溶液中加入N-甲基吗啉(8.6mL，78.5mmol)和氯甲酸甲酯(6.0mL，78.5mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟，室温搅拌1小时。滤出固体并浓缩滤液，将残留物溶于二氯甲烷后通过硅胶柱过滤，并用二氯甲烷洗脱，以除去颜色。将产品收集浓缩，得到的固体用10％乙酸乙酯/石油醚打浆，得到白色固体9.00g(89％产率)。
实施例132.化合物419的合成
Figure GDA0001547895240001492
将N-Boc-乙二胺(5.6mL，35.4mmol)和饱和NaHCO 3(60mL)的混合物冷却至0℃，分批加入化合物418(5.00g，32.2mmol)。在0℃下搅拌30分钟后，将反应温度升至室温并搅拌1小时。过滤，收集沉淀并用冷水洗涤，然后溶于乙酸乙酯中，用饱和食盐水洗涤，无水Na 2SO4干燥并浓缩，得到白色固体(6.69g，87％产率)。
实施例133.化合物420的合成
Figure GDA0001547895240001493
在高压反应管中将化合物419(6.00g，25.0mmol)，呋喃(18.0mL)的甲苯(120mL)溶液加热至回流并搅拌16小时。无色溶液在反应过程中变黄。将反应物冷却至室温后浓缩，将所得白色固体用***打浆，得到化合物420(6.5g，84％产率)。
实施例134.化合物421的合成
Figure GDA0001547895240001501
将化合物420(9.93g，32.2mmol)溶于1，4-二氧六环(15mL)中，在室温下加入浓HCl(15mL)，搅拌3小时后将反应液浓缩，通过过滤收集所得固体，用乙酸乙酯洗涤滤饼。将固体在烘箱(50℃)中干燥过夜，得到化合物421(6.94g，88％产率)。
实施例135.化合物422的合成
Figure GDA0001547895240001502
在-10℃下，向化合物421(0.85g，3.47mmol)的THF(10mL)溶液中加入三氯氧磷(162μL，1.73mmol)，然后加入三乙胺(966μL，6.95mmol)。将反应物在-10℃下搅拌3小时，然后用二氯甲烷(20mL)稀释并通过硅藻土过滤，将滤液浓缩，得到化合物422，其直接用于下一步骤。ESI m/z C20H23ClN4O7P[M+H]+:计算值497.09,实测值497.09。
实施例136.化合物423的合成
Figure GDA0001547895240001503
在0℃下将化合物422(0.50g，1.0mmol)和DIPEA(0.4mL，2.4mmol)溶于二氯甲烷(5.0mL)中，然后加入化合物291(0.23g，1.0mmol)。将反应在0℃下搅拌2.5小时，浓缩并通过SiO 2柱纯化，得到标题化合物423(0.30g，43％)。ESI m/z C31H45N5O11P[M+H]+:计算值694.28,实测值694.28。
实施例137.化合物424的合成
Figure GDA0001547895240001504
将化合物423(0.30g，0.5mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，在室温下加入TFA(3mL)后搅拌2小时，浓缩后得到化合物424，不经进一步纯化即用于下一步骤。
实施例138.化合物425的合成
Figure GDA0001547895240001511
将化合物424(40mg，0.063mmol)，化合物110(40mg，0.10mmol)，HATU(24mg，0.063mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，然后加入三乙胺(27.8μL，0.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物用SiO2柱纯化，得到标题化合物425(53.4mg，收率84％)。ESI m/z C48H69N7O15P[M+H]+:计算值1014.45,实测值1014.45。
实施例139.化合物426的合成
Figure GDA0001547895240001512
将化合物425(53.4mg，0.053mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，在室温下加入TFA(2mL)后搅拌2小时，浓缩后得到化合物426，不经进一步纯化用于下一步骤。
实施例140.化合物427的合成
Figure GDA0001547895240001513
向化合物426(45.0mg，0.053mmol)的DMA(1mL)溶液中加入五氟苯基酯41a(37.0mg，0.053mmol)和DIPEA(17μL，0.1mmol)。将反应物搅拌过夜并浓缩，通过制备HPLC(乙腈/水梯度洗脱)纯化残留物，得到标题化合物427(26.2mg，36％产率)。ESI m/zC64H93N11O18PS[M+H]+:计算值1366.61,实测值1366.61。
实施例141.化合物428的合成
Figure GDA0001547895240001521
将化合物427(8.0mg，0.0058mmol)溶于甲苯(5.0mL)中，加热回流过夜，然后浓缩，用制备HPLC(乙腈/水梯度洗脱)纯化，得到标题化合物428(6.4mg，90％产率)。ESI m/zC56H85N11O16PS[M+H]+:计算值1230.56,实测值1230.56.
实施例142.化合物432的合成
Figure GDA0001547895240001522
在室温下将钠氢(60％，8g，200mmol)加入HO-PEG9-OMe(42.8g，100mmol)的四氢呋喃(1L)的溶液中。搅拌30分钟后，将溴乙酸叔丁酯(48.8g，250mmol)加入，在室温下搅拌1小时，然后倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，有机层用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析纯化(0-5％甲醇/二氯甲烷)得到化合物156，为黄色油状物状物(32g，59％产率)。
实施例143.化合物433的合成
Figure GDA0001547895240001523
将化合物432(40g，73.8mmol)溶解在二氯甲烷(400mL)中，然后加入甲酸(600mL)，25℃搅拌过夜。减压蒸馏除去所有的挥发物，得到黄色油状物(36g)。ESI m/z C21H43O12[M+H]+:计算值487.27,实测值487.24.
实施例144.化合物434的合成
Figure GDA0001547895240001524
将化合物433(36g，73.8mmol)溶解在二氯甲烷(640mL)，依次加入草酰氯(100mL)、DMF(52g，0.74mmol)。将得到的溶液在室温下搅拌4小时，减压蒸馏除去所有的挥发物，得到黄色油状物。
实施例145.化合物436的合成
Figure GDA0001547895240001531
将Z-L-Lys-OH(41.4g，147.6mmol)、碳酸钠(23.4g，221.4mmol)和NaOH(5.9g，147.6mmol)溶解于水(720ml)中，冷却到0℃，然后加入化合物434(37.2g，73.8mmol)的四氢呋喃溶液(20mL)。得到的混合物在室温下搅拌1小时，减压蒸馏除去THF，在冰浴下用浓盐酸调节至pH 3。溶液用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，得到黄色油状物(55g，99％产率)。ESI m/z C35H60N2O15[M+H]+:计算值749.40,实测值749.39。
实施例146.化合物439的合成
Figure GDA0001547895240001532
在化合物436(130g，174mmol)的DMF(500mL)溶液中在0℃依次加入三乙胺(66mL，474mmol)和HATU(72g，190mmol)，然后将反应混合物L温至室温，搅拌2小时。将化合物387(75.8g，158mmol)的DMF(500mL)溶液在0℃下加入到上述溶液中，反应在室温下搅拌1小时。将反应液倒入水(4L)中，用乙酸乙酯萃取(3×500ml)，合并有机层，用饱和食盐水洗(2L)，硫酸钠干燥，过滤浓缩后粗品439(190g)直接用于下一步反应。ESI m/z C60H100N5O20[M+H]+:计算值1210.69,实测值1210.69。
实施例147.化合物440的合成
Figure GDA0001547895240001533
将上一步反应得到的439粗品(190g)溶解在甲醇(900mL)中，加入Pd/C催化剂(10wt％，19g)，和在室温氢化(1atm H2)反应过夜。滤除催化剂，将滤液减压浓缩，用硅胶柱纯化(0-10％甲醇/二氯甲烷)得到一棕色油状物(105g，两步产率62％)。ESI m/zC52H95N5O18[M+H]+:计算值1077.65,实测值1077.65。
实施例148.化合物441的合成
Figure GDA0001547895240001541
室温下在化合物440(105g，97.1mmol)的EtOH(5.3L)溶液中，加入化合物125(54.4g，194.2mmol)和0.1N磷酸二氢钠溶液(1.1L)，反应在室温下搅拌过夜。减压蒸馏除去EtOH，残留水溶液倒入水(3L)中，然后用乙酸乙酯萃取(4×500ml)，合并有机相，用饱和食盐水洗(2L)，硫酸钠干燥、浓缩，粗产品用硅胶柱纯化(0-10％甲醇/二氯甲烷)得到一黄色油状物(100g，83％产率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.43(s,1H),7.35(s,1H),7.23(t,J＝5.1Hz,1H),7.01(d,J＝4.5Hz,2H),6.89(s,2H),6.70(s,2H),4.56–4.45(m,1H),4.30(t,J＝9.7Hz,1H),3.97(s,2H),3.86-3.74(m,1H),3.66–3.63(m,36H),3.58–3.52(m,5H),3.38(s,3H),3.33–3.19(m,3H),2.47(d,J＝6.2Hz,4H),2.23(dd,J＝11.6,6.1Hz,2H),1.91(dtd,J＝26.8,13.6,6.5Hz,7H),1.71(d,J＝7.7Hz,2H),1.56–1.49(m,2H),1.42(s,9H),1.39(s,9H),1.10(d,J＝6.5Hz,3H)。ESI m/z C60H101N6O21[M+H]+:计算值1241.69,实测值1241.69。
实施例149.化合物442的合成
Figure GDA0001547895240001542
将化合物441(79.1mg，0.062mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，加入TFA(2mL)后在室温搅拌2小时，减压蒸馏并与甲苯共沸蒸馏，得到化合物441，直接用于下一步。
实施例150.化合物443的合成
Figure GDA0001547895240001551
将化合物441(67mg，0.062mmol)和化合物41a(43mg，0.062mmol)溶解在DMA(4mL)中，然后加入DIPEA(43μl，0.248mmol)。在室温下搅拌3小时后，减压蒸馏除去溶剂，残留物用制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得到化合物443(59mg，60％产率)。ESI m/zC76H125N10O24S[M+H]+:计算值1594.92,实测值1594.24。
实施例151.化合物457的合成
Figure GDA0001547895240001552
将钠氢(60％，0.64g，16mmol)分批加入HO-PEG6-OMe(2.37g，8mmol)的四氢呋喃(25mL)溶液。在室温下搅拌15min后，加入溴乙酸叔丁酯(3.90g，20mmol)，在室温搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中，用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗，硫酸钠干燥，经硅胶柱层析纯化(20-50％乙酸乙酯/石油醚)，得一无色油状物(1.47g，45％)。ESI m/z C19H39O9[M+H]+:计算值411.25,实测值411.15。
实施例152.化合物458的合成
Figure GDA0001547895240001553
将化合物457(1.47g，3.60mmol)溶解在二氯甲烷(30mL)中，与甲酸(50mL)在38℃搅拌过夜。减压蒸馏除去所有挥发物，得标题化合物(1.20g，94％产率)，为一黄色油状物。ESI m/z C15H31O9[M+H]+:计算值355.19,实测值355.18。
实施例153.化合物459的合成
Figure GDA0001547895240001554
将化合物458(1.10g，3.20mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，依次加入草酰氯(4mL)和DMF(3滴)。将得到的溶液在室温下搅拌4小时，减压蒸馏除去所有挥发物，得黄色油状物，直接用于下一步。
实施例154.化合物460的合成
Figure GDA0001547895240001561
将Z-L-Lys-OH(1.80g，6.4mmol)、碳酸钠(1g，9.6mmol)和NaOH(0.26g，6.4mmol)溶解于水(30mL)，冷却到0℃后，加入化合物459(1.20g，3.2mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液。所得混合物在室温下搅拌1小时，减压蒸馏除去THF，水溶液在冰浴下用浓盐酸条件pH至3。用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，得标题化合物(1.77g，90％)，为一棕色油状物。ESI m/zC29H49N2O12[M+H]+:计算值617.32,实测值617.31。
实施例155.化合物461的合成
Figure GDA0001547895240001562
将NHS(644mg，5.60mmol)和EDC(1.08g，5.60mmol)加入到化合物460(2.30g，3.70mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中。在室温搅拌过夜后，将反应混合物直接在硅胶柱上样，纯化(0-10％甲醇/二氯甲烷)，得到一棕色油状物(2.10g，产率80％)。ESI m/zC33H52N3O14[M+H]+:计算值714.34,实测值714.32。
实施例156.化合物462的合成
Figure GDA0001547895240001563
将磷酸二氢钠(0.1M，3mL)加入到化合物461(357mg，0.50mmol)和化合物110(200mg，0.50mmol)的乙醇(15mL)溶液。将所得溶液在室温下搅拌24小时，减压蒸馏除去全部挥发物，残留物经硅胶柱层析纯化(5-10％甲醇/二氯甲烷)得到标题化合物(216mg，44％产率)，为一棕色油状物。ESI m/z C50H81N4O16[M+H]+:计算值993.56,实测值993.57。
实施例157.化合物463的合成
Figure GDA0001547895240001571
将化合物462(108mg，0.109mmol)溶解在甲醇(5mL)中，加入钯催化剂(10wt％、50mg)后，在氢气氛下(1atm)室温搅拌3小时，过滤掉催化剂，滤液减压蒸馏，得标题化合物(94mg)，为一黄色油状物。ESI m/zC42H75N4O14[M+H]+:计算值859.52,实测值859.93。
实施例158.化合物464的合成
Figure GDA0001547895240001572
将磷酸二氢钠(0.1M，2mL)加入到化合物463(94mg，0.109mmol)和化合物125(61mg，0.218mmol)的乙醇(10mL)溶液。将得到的溶液在室温下搅拌24小时，减压蒸馏除去全部挥发物，残留物通过柱色谱法纯化(5-10％甲醇/二氯甲烷)得一黄色油状物(40mg，36％产率)。ESI m/z C50H82N5O17[M+H]+:计算值1024.56,实测值1024.98。
实施例159.化合物465的合成
Figure GDA0001547895240001573
将化合物464(20mg，0.0196mmol)溶解在二氯甲烷(3mL)中，和TFA(3mL)在室温下搅拌2小时，减压蒸馏除去所有挥发物，得标题化合物(17mg)，为一黄色油状物。ESI m/zC41H66N5O15[M+H]+:计算值868.45,实测值868.47。
实施例160.化合物466的合成
Figure GDA0001547895240001581
将化合物465(17mg，0.0196mmol)和化合物41a(14mg，0.0196mmol)溶解在DMA(3mL)中。加入DIPEA(10μl，0.0588mmol)后在室温搅拌3小时，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得化合物466(15mg，产率64％)，为一黄色油状物。ESI m/z C66H106N9O20S[M+H]+:计算值1376.72,实测值1376.72。
实施例161.化合物378的合成
Figure GDA0001547895240001582
将化合物110(0.30g，0.76mmol)，Z-L-Ala-OH(0.17g，0.76mmol)和HATU(0.29g，0.76mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，向其中加入三乙胺(110μL，0.8mmol)。在室温下搅拌过夜，然后减压蒸馏除去溶剂，残留物通过SiO 2柱纯化，得到标题化合物378(0.43g，95％产率)。ESI m/z C32H46N3O8[M+H]+:计算值600.32,实测值600.32。
实施例162.化合物379的合成
Figure GDA0001547895240001583
在氢化反应瓶中，向化合物378(0.3g，0.5mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入Pd/C(0.10g，33wt％)。将混合物在1atm H 2下振荡过夜，然后通过硅藻土过滤，浓缩滤液得到化合物379(0.24g)，无需进一步纯化直接用于下一步骤。ESI m/z C24H40N3O6[M+H]+:计算值466.28,实测值466.28。
实施例163.化合物487的合成
Figure GDA0001547895240001591
将磷酸二氢钠(0.1M，4mL)加入到化合物379(233mg，0.5mmol)和化合物461(357mg，0.5mmol)的乙醇(20mL)溶液。将得到的溶液在室温下搅拌24小时，减压蒸馏除去全部挥发物，残留物通过柱色谱(5-10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到一黄色油状物(176mg，33％)。ESI m/z C53H86N5O17[M+H]+:计算值1064.59,实测值1064.60。
实施例164.化合物488的合成
Figure GDA0001547895240001592
将化合物487(176mg，0.166mmol)溶解在甲醇(15mL)中，加入钯催化剂(10％，80mg)，在室温氢化(1atm)反应3小时，催化剂被过滤掉后，减压蒸馏浓缩滤液，得标题化合物(154mg)，为一黄色油状物。ESI m/zC45H80N5O15[M+H]+:计算值930.56,实测值930.56。
实施例165.化合物489的合成
Figure GDA0001547895240001593
将磷酸二氢钠(0.1M，4mL)加入到化合物488(154mg，0.166mmol)和化合物125(93mg，0.332mmol)的乙醇(20mL)溶液。将得到的溶液在室温下搅拌24小时，减压蒸馏除去全部挥发物，残留物通过硅胶柱层析纯化(5-10％甲醇/二氯甲烷)，得到一黄色油状物(117mg，64％)。ESI m/zC53H87N6O18[M+H]+:计算值1095.60,实测值1095.61。
实施例166.化合物490的合成
Figure GDA0001547895240001601
将化合物489(39mg，0.0356mmol)溶解在二氯甲烷(3mL)中，和TFA(3mL)在室温下搅拌2小时，减压蒸馏除去全部挥发物，得标题化合物(33mg)，为一黄色油状物。ESI m/zC44H71N6O16[M+H]+:计算值939.48,实测值939.49。
实施例167.化合物491的合成
Figure GDA0001547895240001602
将化合物490(33mg，0.0356mmol)和化合物41a(25mg，0.0356mmol)溶解在DMA(3mL)中，向其中加入DIPEA(15mg，0.116mmol)，室温搅拌3小时，减压蒸馏除去反应溶剂，残留物通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得化合物491(17mg，33％)，为一黄色油状物。ESI m/zC69H111N10O21S[M+H]+:计算值1447.76,实测值1448.78。
实施例168.化合物494的合成
Figure GDA0001547895240001603
将化合物2-(二甲氨基)乙酸(0.60g，4.30mmol)和HATU(1.08g，2.86mmol)溶解在DMF(2mL)，加入TEA(1mL，7.16mmol)后在室温下搅拌1H，加入Z-L-LyS-OH(0.80g，2.86mmol)的DMF(2mL)溶液。反应液在室温下搅拌2H，然后减压浓缩。粗品用制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得到无色油状物494(0.50g，50％)。MS ESI m/z C18H28N3O5[M+H]+计算值：366.20，实测值366.20。
实施例169.化合物495的合成
Figure GDA0001547895240001611
将化合物494(0.50g，1.37mmol)溶于二氯甲烷(15mL)，向其中加入五氟苯酚(0.38g，2.05mmol)和EDCI(0.52g，2.74mmol)。室温搅拌过夜，反应液通过硅藻土过滤，用二氯甲烷洗涤滤饼。滤液浓缩得到的五氟苯酚的酯，将其溶于10mL二氯甲烷。将化合物387(0.44g，0.91mmol)和DIPEA(0.32mL，1.82mmol)加入上述溶液中，在室温下搅拌2小时，然后浓缩。用硅胶柱纯化粗品，甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得化合物495(1.02g，理论收率)。MS ESIm/zC43H67N6O10[M+H]+计算值：827.48，实测值827.48。
实施例170.化合物496的合成
Figure GDA0001547895240001612
将化合物495(1.02g，1.23mmol)溶解在甲醇(10mL)中，加入钯催化剂(10％，100mg)，在H2气氛下(1atm)室温搅拌过夜。真空抽滤除去催化剂，浓缩反应液，得到黄色油状物496(0.76g，89％)。MS ESI m/z C35H61N6O8[M+H]+计算值：693.45，实测值693.45。
实施例171.化合物497的合成
Figure GDA0001547895240001613
将化合物496(0.25g，0.36mmol)和化合物125(0.15g，0.54mmol)溶于乙醇(5mL)，加入磷酸二氢钠(0.1M，1mL)后，在室温下搅拌过夜。真空浓缩反应液，粗品通过柱色谱法纯化(5％～10％甲醇/二氯甲烷)得到化合物497(0.15g，48％)。MS ESI m/z C43H68N7O11[M+H]+计算值：858.49，实测值：858.49.
实施例172.化合物498的合成
Figure GDA0001547895240001621
将化合物497(0.15g，0.175mmol)溶解在二氯甲烷(1mL)和三氟乙酸(2mL)中，在室温下搅拌两小时，真空浓缩，得到黄色油状物，将其溶于DMA(2mL)，向其中加入五氟苯基酯41a(121.1mg，0.175mmol)，接着加入DIPEA(91μL，0.525mmol)。反应在室温搅拌过夜，然后低压浓缩，粗品用制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得到化合物498(30.7mg，14％)。MS ESI m/z C59H92N11O14S[M+H]+计算值：1210.65，实测值1210.62。
实施例173.化合物501的合成
Figure GDA0001547895240001622
将H-LyS-OH(0.31g，2.14mmol)溶于乙醇(20mL)，向其中加入化合物125(1.80g，6.42mmol)和0.5M的磷酸氢二钠(4mL)，反应液在室温下搅拌过夜。浓缩后，粗品用制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得到黄色油状物501(0.26g，26％)。MS ESI m/z C22H29N4O8计算值：477.19，实测值477.19。
实施例174.化合物502的合成
Figure GDA0001547895240001623
将化合物501(0.26g，0.55mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，加入NHS(0.095g，0.825mmol)和EDCI(0.16g，0.825mmol)。反应混合物在室温条件下搅拌过夜，然后浓缩，用水(50mL)稀释后，用乙酸乙酯萃取(2×20mL)。合并有机层，Na2SO4干燥，过滤，浓缩得到粗产品502(0.34g)，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C26H32N5O10[M+H]+计算值：574.21，实测值574.21。
实施例175.化合物503的合成
Figure GDA0001547895240001631
将化合物438(0.19g，0.4mmol)溶于乙醇(30mL)，加入化合物502(0.34g，0.6mmol)和0.1M的磷酸二氢钠(6mL)。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后真空浓缩。残留物用水(100mL)稀释，乙酸乙酯萃取(2×40mL)。合并有机层，Na2SO4干燥，硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂梯度洗脱)，得化合物503(0.115g，31％)。MS ESI m/z C47H68N7O13[M+H]+计算值：938.48，实测值938.49。
实施例176.化合物504的合成
Figure GDA0001547895240001632
将化合物503(0.115g，0.12mmol)溶于二氯甲烷(1mL)，加入2mL的TFA。反应混合物在室温下搅拌2h后低压浓缩，粗品用制备HPLC(C18柱，乙腈/水10-90％)纯化，得到黄色油状物504(0.0312g，33％)。MS ESI m/z C22H29N4O8[M+H]+计算值：477.19，实测值：477.19。
实施例177.化合物505的合成
Figure GDA0001547895240001641
将化合物504(31.2mg，0.04mmol)溶于DMA(2mL)，向其中加入五氟苯基酯41a(27mg，0.04mmol)，接着加入DIPEA(16μL，0.08mmol)。反应液在室温搅拌过夜，低压浓缩，通过制备液相色谱(10-90％乙腈/水)纯化，得到化合物505(11.9mg，24％)。MS ESI m/z：C63H92N11O16S[M+H]+计算值：1290.64，实测值：1290.64。
实施例178.化合物508的合成
Figure GDA0001547895240001642
将3-(2-(2-(二苄基氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁基酯(5g，12.1mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入5mL的三氟乙酸。反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩。粗产品溶于二氯甲烷(50ml)，依次加入NHS(4.25g，37mmol)和EDCI(7.10g，37mmol)。反应混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩，硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，得到黄色油状物508(5g，91％)。MS ESI m/z C25H31N2O6[M+H]+计算值：455.21，实测值455.21。
实施例179.化合物509的合成
Figure GDA0001547895240001643
将化合物110(1g，2.5mmol)溶于乙醇(10ml)，加入化合物508(1.80g，3.9mmol)和0.1M的磷酸二氢钠(2mL)，在室温下反应过夜，然后浓缩。残留物用水(100mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(3×50ml)。合并有机层用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇体系梯度洗脱)，得到黄色油状物509(0.93g，50％)。MS ESI m/z C42H60N3O8[M+H]+计算值：734.43，实测值734.43。
实施例180.化合物510的合成
Figure GDA0001547895240001651
将化合物509(0.93g，1.27mmol)，乙酸乙酯(20mL)和Pd/C(0.093g，10wt％)加入到氢化瓶中，在氢气(1atm)下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤固体。滤液浓缩得到化合物510(0.57g，81％)，产物不用进一步纯化。MS ESI m/z C28H48N3O8[M+H]+计算值：554.34，实测值554.34。
实施例181.化合物511的合成
Figure GDA0001547895240001652
将化合物510(0.25g，0.45mmol)溶于乙醇(5mL)中，室温下加入化合物502(0.39g，0.68mmol)和磷酸二氢钠(0.1M，1mL)，反应混合物在室温搅拌过夜。反应液真空浓缩后用水(100mL)稀释，用乙酸乙酯萃取(2×50mL)。合并有机层，Na2SO4干燥，过滤，浓缩，硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷梯度洗脱)，得到黄色油状物511(0.076g，17％)。MS ESI m/z C50H74N7O15[M+H]+计算值：1012.52，实测值：1012.53
实施例182.化合物512的合成
Figure GDA0001547895240001653
将化合物511(0.076g，75mmol)溶于二氯甲烷(2mL)，加入4mL的TFA后在室温下搅拌1小时，浓缩，得到的粗品512直接用于下一步反应。MS ESI m/z C41H58N7O13[M+H]+计算值：856.40，实测值856.40。
实施例183.化合物513的合成
Figure GDA0001547895240001661
将化合物512溶于DMA(2mL)，加入化合物41a(33mg，0.048mmol)和DIPEA(25μL，0.144mmol)。反应在室温下搅拌3小时，然后浓缩和制备HPLC纯化(乙腈/水梯度洗脱)，得到黄色油状物513(21.3mg，32％)。MS ESI m/z C66H98N11O18S[M+H]+计算值：1364.67，实测值1364.67。
实施例184.化合物515的合成
Figure GDA0001547895240001662
将化合物386(1g，1.63mmol)溶于二氯甲烷(1mL),向其中加入2mL TFA，反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩，得到的粗品515直接用于下一步反应。MS ESI m/zC24H32N3O6[M+H]+计算值：458.22，实测值：458.22。
实施例185.化合物516的合成合成
Figure GDA0001547895240001663
将化合物515溶于DMF(3mL)，向其中加入五氟苯基酯41a(0.63g，0.91mmol)和DIPEA(0.46mL，2.73mmol)。反应在室温下搅拌过夜，然后浓缩，硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，得到黄色油状物516(1.75g)。MS ESI m/z C49H72N7O11S[M+H]+计算值：966.49，实测值966.49。
实施例186.化合物517的合成合成
Figure GDA0001547895240001664
将化合物516(0.20g，0.20mmol)，甲醇(15mL)和Pd/C(0.02g，10wt％)加入到氢化瓶中，然后用1N HCl调节pH值至4左右。在H2(1atm)下搅拌过夜，垫硅藻土过滤，滤液浓缩得到化合物517，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C41H66N7O9S[M+H]+计算值：832.46，实测值832.46。
实施例187.化合物519的合成
Figure GDA0001547895240001671
将化合物H-Dap(Boc)-OH(1g，4.9mmol)与饱和NaHCO3溶液(20mL)混合，在0℃下加入化合物418(2.30g，14.7mmol)。反应在0℃搅拌1h，然后升温到室温搅拌1h。加入硫酸氢钾(1M)调整pH至约6，产生的混合物用乙酸乙酯萃取(2×50ml)。合并有机层，Na2SO4干燥，过滤，浓缩得化合物519(0.42g，30％)。MS ESI m/z C12H15N2O6[M-H]-计算值：283.10，实测值283.10。
实施例188.化合物520的合成
Figure GDA0001547895240001672
将化合物519(0.21g，0.74mmol)溶于乙酸乙酯(10mL)，然后加入五氟苯酚(0.27g，1.48mmol)和DCC(0.30g，1.48mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜，然后过滤，用EtOAC洗涤滤饼。浓缩滤液得到活化酯(0.17g，0.37mmol)，溶于1mL DMF，向其中加入化合物517(0.36g，0.43mmol)和DIPEA(0.13mL，0.74mmol)，反应混合物在室温下搅拌2小时，浓缩，制备HPLC纯化(梯度的乙腈/水)，得到化合物520(50mg，13％)。MS ESI m/z C53H80N9O14S[M+H]+计算值：1098.55，计算1098.55。
实施例189.化合物521的合成
Figure GDA0001547895240001673
将化合物520(50mg,0.046mmol)溶于0.5mL的二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸后在室温下反应1小时，浓缩并用制备HPLC(流动相乙腈/水)纯化得到产物521(11mg,25％产率)。MS ESI m/z C48H72N9O12S[M+H]+计算值:998.49,实测值998.49。
实施例190.化合物523的合成
Figure GDA0001547895240001681
将化合物509(1.00g,1.36mmol)溶于2mL二氯甲烷中，并向其中加入4mL三氟乙酸，加完后后室温下反应1小时。浓缩得到化合物523。MS ESI m/zC33H44N3O6[M+H]+计算值:578.32,实测值578.32。
实施例191.化合物524的合成
Figure GDA0001547895240001682
将化合物523溶于5mL DMF中，向其中加入化合物41a(0.78g,1.13mmol)和DIPEA(0.8mL,4.52mmol)。加完后后室温搅拌过夜，浓缩后用硅胶柱纯化(流动相MeOH/DCM)得到产物524(1.64g，100％产率)。MS MS ESI m/z C58H84N7O11S[M+H]+计算值:1086.59,实测值1086.58。
实施例192.化合物525的合成
Figure GDA0001547895240001683
将化合物524(0.80g，0.20mmol)溶于10mL甲醇中，向其中加入Pd/C(0.08g,10wt％),并用1N HCl调pH到4。氢气置换3次后，搅拌过夜。垫硅藻土过滤，滤液浓缩得到化合物525。MS ESI m/z C41H66N7O9S[M+H]+计算值:832.46,实测值832.46。
实施例193.化合物527的合成
Figure GDA0001547895240001691
将H-Lys(Boc)-OH(1.00g,3.8mmol)溶于16mL乙醇中，向其中加入化合物125(1.00g,5.6mmol)和磷酸二氢钠(0.1M,3mL)，加完后后室温搅拌过夜。反应液浓缩并用硅胶柱纯化(流动相MeOH/DCM)，得到产物527(1.62g,100％产率)。MS ESI m/z C19H30N3O7[M+H]+计算值:412.20,实测值412.20。
实施例194.化合物528的合成
Figure GDA0001547895240001692
将化合物527(0.24g,0.58mmol)溶于10mL乙酸乙酯中，加入五氟苯酚(0.21g，1.17mmol)和DCC(0.24g,1.17mmol)。加完后后室温搅拌过夜，过滤并浓缩滤液得到产物(32mg,0.056mmol)，将此化合物溶于DMF中，向其中加入化合物525(50mg,0.056mmol)和DIPEA(29μL,0.168mmol)。加完后后室温反应2小时，浓缩后用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)，得到产物528(3mg,4％产率)。MS ESI m/z C63H99N10O17S[M+H]+计算值:1299.68,实测值1299.68。
实施例195.化合物529的合成
Figure GDA0001547895240001693
将化合物528(3mg,0.002mmol)溶于0.5mL DCM中，加入1mL三氟乙酸。加完后后室温反应1小时，浓缩并用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)，得到产物529(1.43mg,52％产率)。MS ESI m/z C58H91N10O15S[M+H]+计算值:1199.63,实测值1199.62。
实施例196.化合物532的合成
Figure GDA0001547895240001701
将化合物527(0.11g,0.19mmol)的五氟苯酚酯溶于1mL DMF中，加入化合物517(0.21g,0.25mmol)和DIPEA(86uL,0.5mmol)。加完后后室温反应2小时并浓缩，用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)得到产物532(20mg,9％产率)。MS ESI m/z计算值C60H93N10O15S[M+H]+:1225.65,实测值1225.66。
实施例197.化合物533的合成
Figure GDA0001547895240001702
将化合物532(20mg,0.016mmol)溶于1mL二氯甲烷中，加入2mL三氟乙酸，加完后后室温反应1小时。反应液浓缩并用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)得到化合物533(8.9mg,18％产率)。MS ESI m/z C55H85N10O13S[M+H]+计算值:1125.59,实测值1125.59。
实施例198.化合物536的合成
Figure GDA0001547895240001703
将化合物3-[[叔丁氧羰基]氨基]-L-丙氨酸(1.00g,7.3mmol)溶于30mL乙醇中，加入化合物125(2.00g,7.3mmol)和0.1M磷酸二氢钠(6mL)。加完后室温搅拌过夜，浓缩后用硅胶柱纯化(流动相：MeOH/DCM)，得到产物536(1.41g,78％产率)。MS ESI m/z C16H24N3O7[M+H]+计算值:370.15,实测值370.15。
实施例199.化合物537的合成
Figure GDA0001547895240001704
将化合物536(1.41g,3.8mmol)溶于2mL的二氯甲烷中，加入5mL三氟乙酸后室温反应1小时。反应液浓缩得到产物537。MS ESI m/z C11H16N3O5[M+H]+计算值:270.10,实测值270.10。
实施例200.化合物538的合成
Figure GDA0001547895240001711
将化合物537溶于20mL乙醇中，然后加入化合物125(1.90g,6.9mmol)和0.1M磷酸二氢钠(4mL)，加完后室温搅拌过夜。反应液浓缩后用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)得到产物538(0.45g,22％产率)。MS ESI m/z C19H23N4O8[M+H]+计算值:435.14,实测值435.14。
实施例201.化合物539的合成
Figure GDA0001547895240001712
将化合物538(0.15g,0.34mmol)和化合物387(0.17g,0.34mmol)溶于DMF(2mL)中，向其中加入HATU(0.16g,0.41mmol)和三乙胺(95μL，0.68mmol)，加完后室温反应1小时。反应液浓缩后用制备HPLC纯化(流动相：乙腈/水)得到产物539(34mg,11％产率)。MS ESI m/zC44H62N7O13[M+H]+计算值:896.43,实测值896.42。
实施例202.化合物540的合成
Figure GDA0001547895240001713
将化合物539(34mg,0.04mmol)溶于0.5mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸后，室温反应2小时。反应液浓缩后得到化合物540。MS ESI m/zC35H46N7O11[M+H]+计算值:740.30,实测值740.32。
实施例203.化合物541的合成
Figure GDA0001547895240001721
将化合物540溶于DMA(2mL)中，向其中加入化合物41a(28mg,0.04mmol)和DIPEA(21μL，0.12mmol)。加完后搅拌过夜，浓缩后用制备HPLC纯化得到产物541(14.4mg,29％产率)。MS ESI m/z C60H86N11O16S[M+H]+计算值:1248.59,实测值1248.60。
实施例204.化合物544的合成
Figure GDA0001547895240001722
将化合物132(0.300g,0.329mmol)和N-BOC-乙二胺盐酸盐(0.063g，0.395mmol)溶于二氯甲烷(30mL)，在0℃下向其中加入EDCI(0.189g,0.988mmol)，10分钟后升至室温，搅拌过夜。反应液用二氯甲烷稀释后，水洗、盐水洗、硫酸钠干燥，浓缩并用硅胶柱纯化，得到产物(0.132g,54％产率)。MS ESI m/z C52H80N9O12S[M+H]+计算值:1054.6,实测值:1054.6。
实施例205.化合物545的合成
Figure GDA0001547895240001723
将化合物544(0.132g,0.125mmol)溶于二氯甲烷(45mL)，加入1.5mL三氟乙酸，室温反应1小时。反应液浓缩后用制备HPLC纯化得到产物545(111mg,93％产率)。MS ESI m/zC47H72N9O10S[M+H]+计算值:954.5,实测值:954.5。
实施例206.化合物548的合成
Figure GDA0001547895240001731
将化合物132(0.050g,0.0549mmol)和N-Boc-1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(0.024g,0.0549mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，在0℃下向其中加入EDCI(0.032g,0.1647mmol)，反应10分钟后，升至室温，搅拌过夜。反应液用二氯甲烷稀释后水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤浓缩，用硅胶柱纯化得到产物548(0.030g,46％产率)。MS ESI m/zC58H92N9O15S[M+H]+计算值:1186.6,实测值:1186.6。
实施例207.化合物549的合成
Figure GDA0001547895240001732
将化合物548(0.030g,0.0253mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸，室温反应1小时。浓缩后得到黄色油状液体，用制备HPLC纯化得到产物549(11.7mg,43％产率)。MS ESI m/z C53H84N9O13S[M+H]+计算值:1086.6,实测值:1086.6。
实施例208.化合物552的合成
Figure GDA0001547895240001733
将化合物二乙基三胺(28.7g,275mmol)和DMAP(0.034g,0.000275mmol)溶于二氯甲烷(350mL),在0℃下加入Boc2O(6.0g,0.0275mmol)。加完后室温搅拌过夜，浓缩反应液，并用硅胶柱纯化得到产物(45g,80％产率)。MS ESI m/z C9H22N3O2[M+H]+计算值:204.2,实测值:204.2。
实施例209.化合物553的合成
Figure GDA0001547895240001734
将化合物132(0.060g，0.0658mmol)和N-Boc-2,2’-亚氨基二乙胺(0.016g，0.0790mmol)溶于二氯甲烷(6mL)，在0℃下加入EDCI(0.038g,0.1974mmol)，加完后升至室温，搅拌过夜。反应液浓缩后用制备HPLC纯化得到产物553(48mg,66％产率)。MS ESI m/zC54H85N10O12S[M+H]+计算值:1097.6,实测值:1097.6。
实施例210.化合物554的合成
Figure GDA0001547895240001741
将化合物553(0.048g,0.0437mmol)溶于3mL二氯甲烷中，加入1mL三氟乙酸后，室温反应1小时。反应液浓缩后用制备HPLC纯化得到产物554(11.1mg，25％产率)。MS ESI m/zC49H77N10O10S[M+H]+计算值:997.5,实测值:997.5。
实施例211.化合物558的合成
Figure GDA0001547895240001742
将化合物132(0.400g,0.439mmol)和H-Lys(Boc)-OtBu·HCl(0.135g,0.528mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，在0℃下加入EDCI(0.189g,1.317mmol)，加完后升至室温，搅拌过夜。反应液用二氯甲烷稀释后，水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤，浓缩并用硅胶柱纯化得到产物558(0.43g,82％产率)。MS ESI m/z C60H94N9O14S[M+H]+计算值:1196.7,实测值:1196.7。
实施例212.化合物559的合成
Figure GDA0001547895240001743
将化合物558(0.230g,0.192mmol)溶于二氯甲烷(6mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温反应3小时，浓缩后用制备HPLC纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈；60分钟从10％的B到80％的B)得到产物559(153mg,76％产率)。MS ESI m/z C51H78N9O12S[M+H]+计算值:1040.5,实测值:1040.5。
实施例213.化合物562的合成
Figure GDA0001547895240001751
将化合物558(0.200g,0.167mmol)和(S)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(0.070g,0.200mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，在0℃下加入HATU(0.095g,0.250mmol)和三乙胺(46μL，0.334mmol)。反应液升至室温，搅拌过夜，二氯甲烷稀释后水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用硅胶柱纯化，得到产物562(0.270g,理论收率)。MS ESI m/z C76H122N11O19S[M+H]+计算值:1524.9,实测值:1524.9。
实施例214.化合物563的合成
Figure GDA0001547895240001752
将化合物562(0.27g，0.177mmol)溶于二氯甲烷(6mL)，加入三氟乙酸(2mL)，室温反应4小时。反应液浓缩后用制备HPLC纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈；60分钟从10％的B到80％的B)得到产物563(172mg,83％产率)。MS ESI m/z C57H90N11O13S[M+H]+计算值:1168.6,实测值:1168.6。
实施例215.化合物566的合成
Figure GDA0001547895240001753
将乙二胺(3.0g,0.5mmol)溶于二氯甲烷(500mL)中，降温至0℃，然后加入CbzCl(8.53g,0.050mol)，加完后升至室温，搅拌过夜。反应液水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤并浓缩得到N-苄氧羰基-1,2-二氨基乙烷(7.0g,94％产率).MS ESI m/z C10H14N2O2[M+H]+计算值:195.1,实测值:195.2。
实施例216.化合物567的合成
Figure GDA0001547895240001761
将化合物566(7g,35.8mmol)和37％甲醛(14mL,0.1772mmol)溶于甲醇(120mL)中，在0℃下加入氰基硼氢化钠(3.9g，0.062mol)，用乙酸(3mL)调pH至7，加完后升至室温，搅拌过夜。反应液用二氯甲烷(200mL)稀释，水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用硅胶柱纯化得到产物黄色油状物(6.4g,80％产率)。MS ESI m/z C12H18N2O2[M+H]+计算值:224.1,实测值:224.1。
实施例217.化合物568的合成
Figure GDA0001547895240001762
将化合物567(3.0g,13.4mmol)溶于甲醇(100mL)中，然后加入Pd/C(0.3g,10wt％)和HCl(3mL)，加完后在100psi压力的氢气下反应5小时。反应液垫硅藻土过滤、浓缩得到产物568(2.1g,98％产率)。1H NMR(400MHz,D2O)δ3.33(d,J＝4.6Hz,2H),3.27(s,2H),2.79(s,6H)。
实施例218.化合物569的合成
Figure GDA0001547895240001763
将化合物103(0.58g,1.58mmol)和化合物568(0.051g，3.15mmol)溶于无水DMF(10mL)中，在0℃下加入HATU(0.09g,2.37mmol)和三乙胺(0.656mL，4.74mmol)。加完后升至室温，反应90分钟。反应用水稀释，并用乙酸乙酯萃取(3×100mL)，合并有机相，水洗、盐水洗、硫酸钠干燥、过滤并浓缩得到黄色固体(0.67g,97％产率)。MS ESI m/z C21H35N4O6[M+H]+计算值:439.2,实测值:439.2。
实施例219.化合物570的合成
Figure GDA0001547895240001771
将Pd/C(0.2g,10wt％)加入到化合物569(0.6g,13.7mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中，在100psi的氢气压力下反应4小时。反应液垫硅藻土过滤、浓缩得到产物(5.5g,98％产率)。MS ESI m/z C21H37N4O64[M+H]+计算值:409.3,实测值:409.3。
实施例220.化合物571的合成
Figure GDA0001547895240001772
将化合物570(0.5g,1.22mmol)溶于95％乙醇(10mL)中，加入0.1MNaH2PO4(2mL)和化合物125(0.683g，2.44mmol)，加完后搅拌过夜。反应液浓缩并用硅胶柱纯化(流动相：MeOH/DCM)得到产物黄色油状物(0.624g,89％产率)。MS ESI m/z计算值C29H44N5O7[M+H]+:574.3,实测值:574.3。
实施例221.化合物572的合成
Figure GDA0001547895240001773
将化合物571(0.2g,0.349mmol)溶于6mL二氯甲烷中，加入2mL的三氟乙酸后，室温反应2小时。反应液浓缩得到产物(165mg,理论收率)。MS ESIm/z C24H36N5O5[M+H]+计算值:474.3,实测值:474.3。
实施例222.化合物573的合成
Figure GDA0001547895240001774
将化合物572(0.165g,0.349mmol)溶于2mL DMF中，在0℃下加入化合物41a(0.29g,1.047mmol)的DMF(3mL)溶液，加完后升至室温，反应1小时。反应液浓缩并用制备HPLC纯化(C18柱，流动相A：水，流动相B：乙腈；60分钟从10％的B到80％的B)得到产物(58mg,17％产率)。MS ESI m/z C49H76N9O10S[M+H]+计算值:982.5,实测值:982.5。
实施例223.化合物576的合成
Figure GDA0001547895240001781
将2-溴代异丁酸(3g，17.9mmol)溶于四氢呋喃中(30mL)，向其中加入三甲胺(1Min THF，17.9mL，35.9mmol)。加完后搅拌过夜，加入乙酸乙酯，过滤收集固体，得到产物576(4g,理论产率)。MS ESI m/z C7H16NO2[M+H]+计算值:146,实测值146。
实施例224.化合物577的合成
Figure GDA0001547895240001782
将化合物576(1.55g，6.9mmol)和五氟苯酚(2.5g，13.8mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入DCC(2.8g，13.8mmol),加完后搅拌过夜。反应液过滤并浓缩得到油状产物577。MSESI m/z C13H15F5NO2[M+H]+计算值:312,实测值312。
实施例225.化合物578的合成
Figure GDA0001547895240001783
将化合物16(2g,3.7mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，加入Pd/C(10wt％,0.20g)后，在H2(1atm)下室温搅拌过夜，过滤得到产物17(1.78g,3.4mmol)。将化合物17和化合物577(6.9mmol)溶于DMF(20mL)，在0℃下加入DIPEA(1.8mL，10.4mmol)，加完后升温至室温反应1小时。反应液浓缩并用硅胶柱纯化(1：100至1：5MeOH/DCM)，得到产物578(1.2g,54％产率)。MS ESIm/z C32H61N4O5SSi[M+H]+计算值:642,实测值642。
实施例226.化合物579的合成
Figure GDA0001547895240001791
将化合物578(1.20g,1.86mmol)溶于AcOH/THF/H2O(体积比3:1:1,20mL)中，室温搅拌过夜。反应液浓缩得到泡沫状固体(1.20g，54％产率)。MS ESI m/z C26H47N4O5S[M+H]+计算值:527,实测值527。
实施例227.化合物580的合成
Figure GDA0001547895240001792
将化合物579(1.86mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)，向其中加入1N氢氧化钠(9.3mL)，室温反应2小时。反应液浓缩后用1N盐酸调pH至4，再次浓缩得到白色固体产物580。MS ESI m/z C24H43N4O5S[M+H]+计算值:499,实测值499。
实施例228.化合物581的合成
Figure GDA0001547895240001793
将化合物580(1.86mmol)溶于吡啶(10mL)中，在0℃下加入乙酸酐(884μL,9.36mmol)，反应升温至室温，搅拌过夜。反应液用水(20mL)稀释后，用乙酸乙酯洗涤(3×10mL)，水相浓缩得到黄色固体产物581。MS ESI m/z C26H45N4O6S[M+H]+计算值:541,实测值541。
实施例229.化合物582的合成
Figure GDA0001547895240001794
将化合物581(150mg,0.277mmol)和五氟苯酚(76.5mg,0.415mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入EDCI(63.7mg,0.33mmol)后，室温反应3小时。反应液浓缩得到黄色液体582。MS ESI m/z C32H44F5N4O6S[M+H]+计算值:707,实测值707。
实施例230.化合物583的合成
Figure GDA0001547895240001801
将化合物127(50mg,0.10mmol)和化合物582(0.14mmol)溶于DMF(2mL)中，在0℃下加入DIPEA(49μL,0.28mmol)，加完后室温反应1小时。反应液浓缩并用制备HPLC纯化，得到白色固体产物583(30mg,46％产率)。MS ESI m/z C46H68N7O11S[M+H]+计算值:926,实测值926。
实施例231.化合物573的合成
Figure GDA0001547895240001802
将甜菜碱(870mg,7.4mmol)的氯化亚砜(10mL)悬浊液加热到70℃反应2小时。反应液浓缩并用甲苯(3×10mL)共沸，得到黄色固体586。
实施例232.化合物587的合成
Figure GDA0001547895240001803
将化合物17(1.90g,3.71mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，加入DIPEA(2.58mL,14.8mmol)，降温至0℃，滴加化合物586的二氯甲烷(20mL)溶液，加完后升至室温反应1小时。反应液浓缩并用硅胶柱纯化(1：100至1：5MeOH/DCM)，得到产物587(2.3g,理论收率)。MSESI m/z C30H57N4O5SSi[M+H]+计算值:613,实测值613。
实施例233.化合物588的合成
Figure GDA0001547895240001804
将化合物587(2.3g,3.7mmol)溶于AcOH/THF/H2O(体积比3:1:1,40mL)中，搅拌过夜。反应液浓缩后，得到化合物588。MS ESI m/z C24H43N4O5S[M+H]+计算值:499,实测值499。
实施例234.化合物589的合成
Figure GDA0001547895240001811
将化合物588(3.7mmol)溶于1,4-二氧六环(20mL)中，向其中加入1N氢氧化钠(18.5mL)，室温反应2小时。反应液浓缩后，加入1N盐酸调pH至4，再次浓缩得白色固体产物589(1.00g,57％产率)。MS ESI m/z C22H39N4O5S[M+H]+计算值:471,实测值471。
实施例235.化合物590的合成
Figure GDA0001547895240001812
将化合物589(1.00g,2.12mmol)溶于吡啶(10mL)中，在0℃下加入乙酸酐(1mL,10.6mmol)，反应升至室温，搅拌过夜。反应液用20mL水稀释后用乙酸乙酯洗涤(3×10mL)，浓缩水相得到黄色固体产物590。MS ESI m/z C24H41N4O6S[M+H]+计算值:513,实测值513。
实施例236.化合物591的合成
Figure GDA0001547895240001813
将化合物590(70mg,0.136mmol)和五氟苯酚(30mg,0.163mmol)溶于二氯甲烷(2mL)中，加入DCC(33.7mg,0.163mmol)，加完后反应3小时。反应液浓缩后得到黄色油状产物591，直接用于下一步反应。MS ESI m/z C30H40F5N4O6S[M+H]+计算值:679,实测值679。
实施例237.化合物592的合成
Figure GDA0001547895240001814
将化合物591(0.136mmol)和化合物127(0.11g,0.273mmol)溶于DMF(2mL)，在0℃下加入DIPEA(71μL,0.408mmol)。反应升至室温，进行1小时后浓缩，并用制备HPLC纯化得到黄色固体产物(30.9mg,25％产率)。MS ESI m/z C44H64N7O11S[M+H]+计算值:899,实测值899。
实施例238.化合物603的合成
Figure GDA0001547895240001821
将化合物N’-(2-氨乙基)乙基-1,2-二胺(4.2g,41mmol)溶于50mL四氢呋喃中，冷却至0℃，慢慢加入2-(叔丁氧羰基氧亚氨基)-2-苯乙腈(20.4g,82mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液，加完后再0℃下反应1小时。浓缩反应液后，用硅胶柱纯化(0-10％MeOH/DCM)，得到无色油状物(12g，96％产率)。HRMS(ESI)m/z C14H29N3O4[M+H]+计算值:304.22,实测值:304.22.
实施例239.化合物604的合成
Figure GDA0001547895240001822
将化合物603(5g,16.4mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，降温至0℃后，加入丁二酸酐(1.64g,16.4mmol)，加完升至室温反应1小时。浓缩反应液，用硅胶柱纯化(0-10％MeOH/DCM)得到产品(5.4g,81％产率)。HRMS(ESI)m/z C18H33N3O7[M+H]+计算值:404.23,实测值:404.23.
实施例240.化合物605的合成
Figure GDA0001547895240001823
将化合物604(5.4g,13.3mmol)溶于乙酸乙酯(30mL)中，0℃下加入浓盐酸(10mL)，撤去冰浴剧烈搅拌反应30分钟。减压蒸馏除去乙酸乙酯和盐酸，得到产品(3.69g,100％产率)。HRMS(ESI)m/z C8H17N3O3[M+H]+计算值:204.13,实测值:204.13.
实施例241.化合物606的合成
Figure GDA0001547895240001831
将化合物605(0.5g，1.81mmol)溶于5mL水中，加入2N氢氧化钠水溶液，调pH至7，浓缩至干，再加入10mL的碳酸氢钠饱和溶液，降温至5℃左右，加入N-甲氧基羰基顺丁烯二酰亚胺(0.56g,3.62mmol)，加完后在5℃下反应2小时。用2N HCl调pH至5，水相用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相后用硫酸钠干燥，过滤，浓缩并用制备HPLC纯化得到白色固体(200mg,30％产率)。HRMS(ESI)m/z C16H17N3O7[M+H]+计算值:364.11,实测值:364.11.
实施例242.化合物608的合成
Figure GDA0001547895240001832
将化合物606(37mg,0.102mmol)溶于DMF(2mL)，在0℃下加入HATU(39mg,0.102mmol)，加完升至室温反应1小时，再将上述溶液加入到化合物440(100mg,0.093mmol)和三乙胺(25.8μL，0.186mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温反应1小时。浓缩掉DMF后，用硅胶柱纯化得到产品(99mg,75％产率)。HRMS(ESI)m/z C68H108N8O24[M+H]+计算值:1421.75,实测值:1421.75.
实施例243.化合物609的合成
Figure GDA0001547895240001833
将化合物608(50mg,0.035mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中，加入TFA(1mL)后，室温反应2小时。浓缩得到产品(44mg,100％产率)。HRMS(ESI)m/z C59H92N8O22[M+H]+计算值:1265.63,实测值:1265.63.
实施例244.化合物670的合成
Figure GDA0001547895240001841
将化合物609(20mg,0.0158mmol)和化合物41a(10.9mg,0.0158mmol)溶于DMA(2mL)中，0℃下加入DIPEA(5.5μL，0.0316mmol)，加完升温至室温反应1小时。浓缩掉DMA后，用制备HPLC纯化得到产品(11mg,40％产率)。HRMS(ESI)m/z C84H132N12O27S[M+H]+计算值:1773.90,实测值:1773.90.
实施例245.化合物672的合成
Figure GDA0001547895240001842
将4-氨基丁酸叔丁酯(1.03g,6.12mmol)和化合物436(4.16g,5.56mmol)溶于DMF(18mL)中，在0℃下加入HATU(2.32g,6.12mmol)和TEA(1.2mL,8.34mmol),搅拌50分钟后加水(300mL)，用乙酸乙酯萃取(250mL×3)，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过柱纯化(3％MeOH/DCM)，得化合物672(5.98g)。[M+H]+计算值890.51,实测值891.09.
实施例246.化合物673的合成
Figure GDA0001547895240001843
将化合物672(5.98g,6.73mmol)溶于甲醇(30mL)，加入Pd/C(10wt％,0.6g)，在1atm氢气下，室温搅拌过夜。过滤浓缩得化合物673(4.57g)。ESI:m/z:C35H70N3O14[M+H]+计算值:756.48,实测值756.47.
实施例247.化合物674的合成
Figure GDA0001547895240001844
将化合物673(1g,1.32mmol)溶于NaHCO3饱和溶液(20mL)中，冰浴下加入化合物418(0.4g,2.64mmol)，反应于冰浴下搅拌30分钟。然后将上述反应液倒入装有100mL乙酸乙酯的分液漏斗中，分液收集有机相，再将有机相依次用50mL的水和50mL食盐水各洗涤一次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得化合物674(0.8g，产率72％)。ESI:m/z:C39H70N3O16[M+H]+计算值:836.47,实测值836.47
实施例248.化合物675的合成
Figure GDA0001547895240001851
将化合物674(0.40g，0.48mmol)溶于DCM(4.5mL)后，加入TFA(1.5mL)，于室温下搅拌1小时后，浓缩旋干，并用二氯甲烷带干两次，最后置于油泵上抽干，得到的残留物与化合物110(0.35g,0.48mmol)溶于DMF(10mL)，冰浴下加入HATU(0.36g,0.96mmol)，TEA(0.15mL,1.44mmol)，然后搅拌30分钟。然后将上述反应液倒入装有100mL水的分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取(50mL×2)，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(0-10％MeOH/DCM)，得化合物675(21mg,2.1％)。ESI:m/z:C91H153N8O35[M+H]+计算值:1919.04,实测值1919.04.
实施例249.化合物676的合成
Figure GDA0001547895240001852
将化合物675(21mg，0.01mmol)溶于DCM(0.5mL)后，加入TFA(1mL)，于室温下搅拌1小时后，浓缩旋干，并用二氯甲烷带干两次，最后置于油泵上抽干，得到的化合物与化合物41a(6.93g,0.01mmol)溶于DMA(2mL)，随后加入DIPEA(17μL,0.1mmol)，室温下搅拌30分钟。将上述反应液直接上样过制备HPLC，洗脱溶剂为MeCN/H2O，经纯化得到产物676(10mg,44％)。ESI:m/z:C107H177N12O38S[M+H]+计算值:2271.20,实测值2271.20.
实施例250.化合物678的合成
Figure GDA0001547895240001861
在氮气保护下，将NaH(3.1g，129.15mmol)溶于DMF(50mL)中，向其中加入二叔丁基叠氮草酸(10g，43.05mmol)的DMF(30mL)溶液，室温下搅拌20分钟后，冰浴下加入溴乙酸叔丁酯(28mL，172.2mmol)的DMF(20mL)溶液，搅拌20分钟后慢慢升至室温，搅拌1小时。将上述反应液倒入NH4Cl(aq)(400mL)中，用乙酸乙酯(300mL)萃取，合并有机相，再用水洗(100mL×3)，饱和食盐水(100mL)洗，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。浓缩液经硅胶柱纯化，洗脱溶剂为石油醚/乙酸乙酯，得到化合物678(16.5g，83％)。ESI:m/z:计算值C22H41N2O8[M+H]+:461.28,实测值461.27.
实施例251.化合物679的合成
Figure GDA0001547895240001862
将化合物678(10g，21.7mmol)溶于TFA(50mL)，于室温下搅拌过夜，浓缩，并用二氯甲烷带干两次，将所得的固体经二氯甲烷洗涤直至固体为白色，最后将收集到的固体置于油泵上抽干，得到化合物679(3g,94％)。ESI:m/z:C4H9N2O4[M+H]+计算值:149.05,实测值148.06.
实施例252.化合物680的合成
Figure GDA0001547895240001863
将化合物679(0.56g,3.8mmol)溶于THF(20mL)，冰浴下加入氯乙酰氯(3mL,38mmol)，搅拌30分钟后，慢慢升至室温搅拌过夜。将上述反应液浓缩至干，并用甲苯带干三遍，最后用油泵抽干得化合物680(1.16g,100％)。ESI:m/z:C8H11Cl2N2O6[M+H]+计算值:300.99,实测值301.00.
实施例253.化合物681的合成
Figure GDA0001547895240001871
将化合物L-丙氨酸叔丁酯(2.6g,14.35mmol)，L-Z-Gly-OtBu(3g,14.35mmol)溶于DMF(15mL)，冰浴下加入HATU(6g,15.78mmol)，TEA(4.1mL,28.7mmol)，搅拌5分钟后升至室温搅拌1h。将上述反应液倒入装有300mL水的分液漏斗中，乙酸乙酯(100mL)萃取，收集有机相，水相用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机相，再用饱和食盐水(100mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得化合物681(7.8g)。ESI:m/z:C17H25N2O5[M+H]+计算值:337.17,实测值338.19.
实施例254.化合物682的合成
Figure GDA0001547895240001872
将化合物681(3g，8.9mmol)溶于DCM(3mL)后，加入TFA(3mL)，室温下搅拌3h，浓缩，并用二氯甲烷带干两次，最后置于油泵上抽干，得到化合物682(2.5g,8.9mmol)。ESI:m/z:C13H17N2O5[M+H]+计算值:281.11,实测值281.12.
实施例255.化合物683的合成
Figure GDA0001547895240001873
将化合物682(2.5g,8.9mmol)，3-氨基丙酸叔丁酯(1.6g,8.9mmol)溶于DMF(10mL)，冰浴下加入HATU(3.4g,8.9mmol)，TEA(2.4mL,17.8mmol)，搅拌5分钟后升至室温搅拌1h。将上述反应液倒入装有300mL水的分液漏斗中，乙酸乙酯(100mL)萃取，收集有机相，水相用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机相，再用饱和食盐水(300mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(0-10％MeOH/DCM)纯化得化合物683(2.16g,60％)。ESI:m/z:C20H30N3O6[M+H]+计算值:408.21,实测值408.21.
实施例256.化合物684的合成
Figure GDA0001547895240001881
将化合物683(2.16g,5.31mmol)溶于甲醇(20mL)中，加入Pd/C(0.2g，10wt％)，反应置于氢气下(1atm)搅拌50分钟，经硅藻土过滤，将滤液收集浓缩，得到粗产品684(1.4g,5.31mmol)。ESI:m/z:C12H24N3O4[M+H]+计算值:274.17,实测值274.17.
实施例257.化合物685的合成
Figure GDA0001547895240001882
将化合物684(1.4g,5.31mmol)，化合物680(0.5g,1.66mmol)溶于DMF(30mL)，冰浴下加入Brop(1.9g，4.98mmol)，DIPEA(0.6mL,3.32mmol)，搅拌10分钟后慢慢升至室温，搅拌过夜。将上述反应液倒入装有300mL水的分液漏斗中，乙酸乙酯(100mL)萃取，收集有机相，水相用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得化合物685(0.37g,28％)。ESI:m/z:C32H53Cl2N8O12[M+H]+计算值:811.31,实测值811.31.
实施例258.化合物686的合成
Figure GDA0001547895240001883
将化合物685(0.37g，0.46mmol)溶于DCM(1mL)后，加入TFA(3mL)，室温下搅拌1h后，旋干浓缩，并用二氯甲烷带干两次，最后置于油泵上抽干，将得到的化合物(0.32g,0.46mmol)与化合物110(0.18g,0.46mmol)溶于DMF(20mL)，冰浴下加入HATU(0.35g,0.92mmol)，TEA(0.13mL,0.92mmol)，搅拌30分钟。将上述反应液倒入装有300mL水的分液漏斗中，乙酸乙酯(100mL)萃取，收集有机相，水相用乙酸乙酯(100mL)萃取，合并有机相，饱和食盐水(100mL)洗一次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得化合物686(0.16g,33％)。ESI:m/z:C45H67Cl2N10O15[M+H]+计算值:1057.41,实测值1057.40.
实施例259.化合物687的合成
Figure GDA0001547895240001891
将化合物686(0.16g，0.15mmol)溶于DCM(0.5mL)后，加入TFA(3mL)，于室温下搅拌1h后，旋干浓缩，并用二氯甲烷带干两次，最后置于油泵上抽干，将得到化合物与化合物41a(0.1g,0.15mmol)溶于DMA(3mL)中，随后加入DIPEA(0.1mL,0.6mmol)，室温下搅拌1小时。将上述反应液浓缩后加入1mL乙腈，上样过制备HPLC，洗脱溶剂为MeCN/H2O，纯化得到产物687(59mg,28％)。ESI:m/z:C61H91Cl2N14O18S[M+H]+计算值:1409.57,实测值1409.57.
实施例260.化合物690的合成
Figure GDA0001547895240001892
将化合物672(5.98g,6.73mmol)溶于甲醇(30mL)，加入Pd/C(0.6g,10wt％)，在1个大气压的氢气下，室温搅拌过夜。通过硅藻土过滤后，浓缩滤液，将得到的化合物(4.57g,6.05mmol溶于四氢呋喃(60mL)，加入化合物689(1.01g,2.42mmol)和HOBt(817g,6.05mmol),冷却至0℃后加入DCC(1.25g,6.05mmol)和DIPEA(2.1mL，12.10mmol)，逐渐升温至室温，搅拌过夜。加乙酸乙酯(400mL)稀释，用饱和碳酸氢钠洗，1N HCl洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化(4％MeOH/DCM)，得化合物690(5.65g，49％收率)。[M+H]+计算值1892.06,实测值1892.83.
实施例261.化合物691的合成
Figure GDA0001547895240001901
将化合物690(3.71g,1.96mmol)溶于甲醇(50mL)，加入Pd/C(0.40g,10wt％)，在1个大气压的氢气下，室温搅拌过夜。通过硅藻土过滤后，浓缩滤液，得化合物691(1.64g,51％收率)。[M+H]+计算值1623.98,实测值1624.42.
实施例262.化合物692的合成
Figure GDA0001547895240001902
将化合物691(315mg,0.194mmol)溶于乙醇(10mL),加入化合物125(136mg,0.485mmol)和0.5M Na2HPO4(2.5mL),室温搅拌3天，浓缩后，经过制备HPLC纯化(40％MeCN/H2O)。得化合物692(50mg，13％收率)。[M+H]+计算值1954.07,实测值1955.05.
实施例263.化合物693的合成
Figure GDA0001547895240001911
将化合物692(50mg，0.114mmol)溶于DCM(5mL)中，加入TFA(5mL)，室温搅拌过夜。浓缩反应液，加甲苯共沸蒸馏，将得到的化合物和化合物110(33mg,0.0837mmol)溶于DMF(6mL)中，0℃下加入HATU(64mg,0.1674mmol)和TEA(46uL,0.0.3348mmol)后，搅拌1小时。加水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化(15％MeOH/DCM)，得化合物693(98mg，53％收率)。[M+H]+计算值2200.17,实测值2200.15.
实施例264.化合物694的合成
Figure GDA0001547895240001912
将化合物693(98mg，0.045mmol)溶于DCM(3mL)中，加入TFA(6mL)，室温搅拌1小时。浓缩反应液，加甲苯共沸蒸馏，将得到的化合物和和化合物41a(31mg,0.045mmol)溶于DMA(1mL)，加入DIPEA(12μL,0.068mmol),室温搅拌90分钟。浓缩反应液，经过制备HPLC纯化，得化合物694(33.56mg，30％收率)。[M/2+H]+计算值1276.66,实测值1276.65.
实施例265.化合物696的合成
Figure GDA0001547895240001921
将化合物689(3.01g,7.23mmol)溶于四氢呋喃(30mL)，加入H-Gly-OtBu(3.03g,18.09mmol)和HOBt(2.44g,18.09mmol),0℃下加入DCC(3.73g,18.09mmol)和DIPEA(6.3mL，36.18mmol)，逐渐升温至室温，搅拌3天。加乙酸乙酯(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠洗，1NHCl洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得化合物696(10.17g)。[M+H]+计算值643.29,实测值643.29.
实施例266.化合物697的合成
Figure GDA0001547895240001922
将化合物696(5.38g，8.38mmol)溶于DCM(20mL)中，加入TFA(20mL)，室温搅拌3小时。浓缩，甲苯共沸蒸馏，用二氯甲烷打浆，得白色固体(1.00g,1.89mmol)，将其溶于四氢呋喃(20mL)，加入H-L-Ala-OtBu(857mg,4.72mmol)和HOBt(638g,4.72mmol),0℃下加入DIC(735uL,4.72mmol)和DIPEA(1.64mL，9.43mmol)，逐渐升温至30℃，搅拌过夜。加乙酸乙酯(100mL)稀释，用饱和碳酸氢钠洗，1N HCl洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化(6％MeOH/DCM)，得化合物697(734mg，50％收率)。[M+H]+计算值785.36,实测值785.70.
实施例267.化合物698的合成
Figure GDA0001547895240001923
将化合物697(743mg，0.936mmol)溶于DCM(6mL)中，加入TFA(6mL)，室温搅拌过夜。浓缩后，用甲苯共沸蒸馏，得固体化合物(629mg)，将其溶于四氢呋喃(20mL)，加入4-氨基丁酸叔丁酯(372mg,2.340mmol)和HOBt(316g,2.340mmol),0℃下加入DIC(365uL,2.340mmol)和DIPEA(815uL，9.43mmol)，逐渐升温至室温，搅拌过夜。加乙酸乙酯(150mL)稀释，用饱和碳酸氢钠洗，1N HCl洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化(8％MeOH/DCM)，得化合物698(612mg，68％收率)。[M+H]+计算值955.47,实测值955.75.
实施例268.化合物699的合成
Figure GDA0001547895240001931
将化合物698(500mg，0.524mmol)溶于DCM(6mL)中，加入TFA(6mL)，室温搅拌2小时。浓缩后，用甲苯共沸蒸馏，得固体化合物(441mg)，取186mg(0.17mmol,1.0eq)和化合物110(67mg,0.17mmol)溶于DMF(6mL)中，0℃下加入HATU(131mg,0.34mmol)和TEA(94uL,0.68mmol),0℃搅拌1小时。加水(100L)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，硅胶柱层析纯化(7％MeOH/DCM)，得化合物699(100mg)。[M+H]+计算值1201.57,实测值1201.53.
实施例269.化合物700的合成
Figure GDA0001547895240001932
将化合物699(228mg,0.19mmol)溶于甲醇(30mL)，加入Pd/C(30mg，10wt％)，在1个大气压氢气下室温搅拌过夜。过滤浓缩，将浓缩物溶于乙醇(5mL)，加入化合物110(50mg，0.180mmol)，加入0.1M NaH2PO4(1.25mL)，室温搅拌过夜。浓缩反应液，得化合物700(100mg)。[M+H]+计算值1263.58,实测值1263.52.
实施例270.化合物701的合成
Figure GDA0001547895240001941
将化合物700(100mg，0.079mmol)溶于DCM(2mL)中，加入TFA(3mL)，室温搅拌90分钟。浓缩反应液，加甲苯共沸腾蒸馏，将残留物和化合物41a(55mg,0.079mmol)溶于DMA(2mL)，加入DIPEA(28μL,0.158mmol),室温搅拌2h。浓缩反应液，通过制备HPLC纯化，得化合物701(1.2mg，1％收率)。[M+H]+计算值1615.74,实测值1615.68.
实施例271.化合物703的合成
Figure GDA0001547895240001942
将化合物436(2.93g,3.92mmol)和叔丁醇(1.87Ml,19.59mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，0℃依次加入DCC(970mg,4.70mmol)和DMAP(48mg,0.39mmol),逐渐升温至室温，搅拌过夜。过滤，浓缩滤液，加乙酸乙酯(50mL)稀释，用1N HCl洗，5％碳酸氢钠溶液洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后硅胶柱层析纯化(7％MeOH/DCM)，得化合物703(2.28g，72％收率)。[M+H]+计算值805.46,实测值805.41.
实施例272.化合物704的合成
Figure GDA0001547895240001943
将化合物703(2.28g,2.84mmol)溶于甲醇(80mL)，加入Pd/C(0.23g，10wt％)，在1个大气压氢气下，室温搅拌过夜。过滤浓缩滤液，经柱层析纯化(7％MeOH/DCM)，得到的化合物(1.39g,2.08mmol)溶于四氢呋喃(20mL)，加入化合物689(346mg,0.83mmol)和HOBt(281mg,2.08mmol),0℃下加入DIC(324uL,2.08mmol)和DIPEA(725uL，4.16mmol)，逐渐升温至室温，搅拌过夜。加乙酸乙酯(100mL)稀释，用饱和碳酸氢钠洗，1N HCl洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析纯化(7％MeOH/DCM)，得化合物704(673mg，47％收率)。[M+H]+计算值1721.95,实测值1722.59.
实施例273.化合物705的合成
Figure GDA0001547895240001951
将化合物704(673mg，0.39mmol)溶于DCM(6mL)中，加入TFA(6mL)，室温搅拌过夜。浓缩，甲苯共沸蒸馏，得一白色固体(627mg)，取335mg(0.208mmol,1.0eq)和化合物110(82mg,0.208mmol)溶于DMF(6mL)中，0℃下加入HATU(158mg,0.416mmol)和TEA(115uL,0.832mmol),0℃搅拌2小时。加水(80mL)稀释，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化(6％MeOH/DCM)得化合物705(318mg,77％收率)。[M+H]+计算值1968.05,实测值1969.32.
实施例274.化合物706的合成
Figure GDA0001547895240001952
将化合物705(318mg,0.16mmol)溶于甲醇(20mL)，加入Pd/C(30mg，10wt％)，在1个大气压氢气下，室温搅拌3小时。过滤浓缩，得一白色固体(287mg)。取98mg(0.0577mmol)溶于无水四氢呋喃(7mL),0℃下加入氯乙酰氯(9μL)和DIPEA(20μL)，搅拌过夜。浓缩，得化合物706(27mg，25％收率)。[M+H]+计算值1851.92,实测值1852.94.
实施例275.化合物707的合成
Figure GDA0001547895240001961
将化合物706(27mg，0.0146mmol)溶于DCM(2mL)中，加入TFA(2mL)，室温搅拌1小时。浓缩反应液，加甲苯共沸蒸馏，将得到的化合物(25mg,0.0146mmol)和化合物41a(10mg,0.0146mmol)溶于DMA(2mL)，加入DIPEA(5μL,0.0292mmol),室温搅拌90分钟。浓缩反应液，制备HPLC纯化浓缩液，得化合物707(10.2mg，32％收率)。[M/2+H]+计算值1102.54,实测值1103.27.
实施例276.化合物711的合成
Figure GDA0001547895240001962
将化合物Boc-N-甲基-L-缬氨酸(33mg,0.14mmol)，五氟苯酚(39mg,0.21mmol)和DCC(32mg,0.154mmol)溶于EtOAc(20mL)中。将混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤，将滤液浓缩并再次溶于DMA(2mL)中，然后加入化合物710(52mg，0.14mmol)和DIPEA(48.5μL，0.28mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜后浓缩，并通过制备HPLC(C18柱，10-100％乙腈/水)纯化，得到化合物711(40.2mg，49％)。ESI:m/z:C28H49N4O7S[M+H]+计算值:585.32,实测值585.32.
实施例277.化合物712的合成
Figure GDA0001547895240001963
将化合物711(40mg，0.069mmol)溶于吡啶(8mL)中，然后在0℃下加入乙酸酐(20.4mg，0.2mmol)，将反应物升至室温，并在室温下搅拌过夜。将混合物浓缩并用硅胶柱(0-10％MeOH、DCM)纯化，得到化合物712(48.1mg，～100％)。ESI:m/z:C30H51N4O8S[M+H]+计算值:627.33,实测值627.33.
实施例278.化合物715的合成
Figure GDA0001547895240001971
向化合物712(48.1mg，0.077mmol)的EtOAc(10mL)溶液中加入五氟苯酚(21.2mg，0.115mmol)和DCC(17.4mg，0.085mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤，将滤液浓缩并再次溶解在DMA(4mL)中，然后加入化合物714(20.7mg，0.1mmol)和DIPEA(26.8μL，0.154mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩并通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水)纯化，得到化合物715(63mg，～100％)。ESI:m/z:C42H66N5O9S[M+H]+计算值:816.45,实测值816.45.
实施例279.化合物716的合成
Figure GDA0001547895240001972
将化合物715(63mg，0.077mmol)溶解在DCM(1mL)中，然后加入TFA(3mL)，将反应物在室温下搅拌2小时，然后浓缩，将得到的化合物(55mg，0.077mmol)溶于DMA(4mL)中，然后加入化合物125(30.8mg，0.11mmol)和DIPEA(27μL，0.154mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩并通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水)纯化，得到化合物716(28.5mg，42％)。ESI:m/z:C45H65N6O10S[M+H]+计算值:881.44,实测值881.44.
实施例280.化合物719的合成
Figure GDA0001547895240001973
将化合物715(63mg，0.077mmol)溶解在DCM(1mL)中，然后加入TFA(3mL)，将反应物在室温下搅拌2小时，然后浓缩，将得到的化合物(55mg，0.077mmol)溶于DMA(4mL)中，然后加入化合物718(65.8mg，0.11mmol)和DIPEA(27μL，0.154mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩并通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水)纯化，得到化合物719(14mg，16％)。ESI:m/z:C55H84N7O16S[M+H]+计算值:1130.56,实测值1130.57.
实施例281.化合物721的合成
Figure GDA0001547895240001981
将化合物436(3g,4mmol)溶于DMF(50mL)，冰浴下加入HATU(2.3g,6mmol)，TEA(1.7mL,12mmol)，反应于冰浴下搅拌20分钟后升至室温，搅拌3小时。然后将上述反应液慢慢加入到对氨基苯甲醇(0.99g,8mmol)中，于室温下搅拌1.5小时后，倒入装有150mL水的分液漏斗中，用乙酸乙酯(50mL×2)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，过硅胶柱(0-10％MeOH/DCM)纯化，得化合物721(3.9g,～100％产率)。ESI:m/z:C42H68N3O15[M+H]+计算值:854.46,实测值854.46.
实施例282.化合物722的合成
Figure GDA0001547895240001982
将化合物721(1.9g,2.22mmol)溶于甲醇(20mL)中，加入Pd/C(0.19g)，反应置于氢气下(1atm)搅拌1.5小时后，经硅藻土过滤，将滤液收集浓缩，将得到的粗产品溶于EtOH(100mL)，随后加入化合物125(0.61g,2.2mmol)和0.1M的NaH2PO4(20mL)，于室温下搅拌过夜。然后将上述反应液浓缩至干，用甲醇上样(过滤除去不溶物，取滤液)，经过制备HPLC(C18柱，乙腈/水)纯化，得到化合物722(0.3g，19％)。ESI:m/z:C42H69N4O16[M+H]+计算值:885.46,实测值885.44.
实施例283.化合物723的合成
Figure GDA0001547895240001991
将化合物723(0.12g,0.14mmol)溶于DMF(50mL)，冰浴下加入SOCl2(11μL,0.154mmol)，反应于冰浴下搅拌1小时。然后将上述反应液浓缩至干，得到化合物723(0.13g，0.14mmol)。ESI:m/z:C42H68ClN4O15[M+H]+计算值:903.43,实测值903.44.
实施例284.化合物725的合成
Figure GDA0001547895240001992
将化合物723(0.13g，0.14mmol)，化合物724(0.06g，0.07mmol)溶于DMF(10mL)，随后依次加入TBAI(16mg,0.042mmol)和DIPEA(64μL,0.35mmol)，于室温下搅拌1小时。然后将上述反应液浓缩至干，通过制备HPLC(C18柱，乙腈/水)纯化，得到化合物725(10mg，8.9％)。ESI:m/z:C79H125N9O23S[M+H]+计算值:1599.85,实测值1599.82.
实施例285.化合物727的合成
Figure GDA0001547895240001993
在0℃下向化合物15(4.0g,7.6mmol)与碘乙烷(914mg,22.85mmol)的THF(20mL)溶液中加入钠氢(60wt％，9.5g,60.9mmol)。将反应液保持0℃搅拌过夜，而后倒入激烈搅拌的冰水饱和氯化铵(5L)溶液中。用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并后的有机相经干燥、过滤、浓缩后，柱层析(15-35％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得产物727(1.5g,36％产率)，为亮黄色油状物。
实施例286.化合物728的合成
Figure GDA0001547895240002001
向化合物12(1.5g,2.8mmol)的乙酸乙酯溶液中加入29(7.0mmol)和干Pd/C(10wt％,80mg)。反应液在氢气环境中(1atm)搅拌20小时。硅藻土过滤，乙酸乙酯洗。合并的有机相浓缩后经柱层析(0-13％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得化合物728(950mg,55％产率)..
实施例287.化合物729的合成
Figure GDA0001547895240002002
将化合物728(950mg,1.48mmol)溶于乙酸/水/四氢呋喃(v/v/v 3:1:1,50mL)混合溶液中，室温搅拌3天。反应液浓缩后用甲苯共沸带干，此步骤重复两遍后,残留物经柱层析(0-6％MeOH/DCM)纯化，得化合物729(700mg,90％产率)，为无色液体。
实施例288.化合物730的合成
Figure GDA0001547895240002003
在5℃下将LiOH(3.3N,2mL,6.67mmol,5.0eq.)的水溶液加入化合物26(700mg,1.33mmol)的甲醇(5.0mL)溶液中。室温搅拌2小时后浓缩。经柱层析(15％MeOH/DCM含0.1％NH3.H2O)纯化，得化合物730(533mg,80％)，为白色固体。
实施例289.化合物731的合成
Figure GDA0001547895240002004
将化合物730(520mg,1.03mmol)和DMAP(13mg,0.1mmol)溶于无水THF(5.0mL)与无水DMF(0.25mL)的混合溶液中。冷却至0℃,加入TEA(0.22mL,1.54mmol)和乙酸酐(0.15mL,1.54mmol)。反应液逐渐升至室温并搅拌3小时。浓缩后经柱层析(5-50％MeOH/DCM)纯化，得化合物731(553mg,94％产率)，为无定形白色固体。
实施例290.化合物732的合成
Figure GDA0001547895240002011
将化合物731(0.1g,0.185mmol)，DIC(42.9μL,0.28mmol)和五氟苯酚(40mg,0.22mmol)溶于乙酸乙酯(20mL)中，于室温下搅拌过夜。然后将上述反应浓缩至干，得到化合物732(63.5mg，粗产品)。ESI:m/z:C32H44F5N4O6S[M+H]+计算值:707.28,实测值707.28.
实施例291.化合物733的合成
Figure GDA0001547895240002012
将化合物732(63.5mg,0.09mmol)，化合物127(80.6mg,0.2mmol)溶于DMA(2mL)中，随后加入DIPEA(63μL,0.36mmol)，反应于室温下搅拌1小时。将上述反应液直接上样，制备HPLC(MeCN/H2O洗脱)纯化，得到产物733(8.38mg,10％)。ESI:m/z:C46H68N7O11S[M+H]+计算值:926.46,实测值926.45.
实施例292.化合物735的合成
Figure GDA0001547895240002013
将化合物732(63.5mg,0.09mmol)，化合物442(293mg,0.27mmol)溶于DMA(4mL)中，随后加入DIPEA(63μL,0.36mmol)，于室温下搅拌过夜。将上述反应液浓缩至2mL后直接上样，制备HPLC(MeCN/H2O洗脱)纯化，得到产物735(10.5mg,7.3％)。ESI:m/z:C77H127N10O24S[M+H]+计算值:1607.87,实测值1607.84.
实施例293.化合物737的合成
Figure GDA0001547895240002021
将化合物673(48.7g，64.4mmol)和化合物125(27.0g，96.6mmol)溶于250mL 95％乙醇中，加入50mL 0.1M NaH2PO4，室温反应过夜，旋蒸除去乙醇，加水(300mL)，DCM萃取(300mL×1，150mL×2)，合并有机相，水洗(500mL×2)，饱和食盐水洗(500mL)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后粗品用硅胶柱层析纯化(3-4％MeOH/DCM)，得36.6g浅黄色油状物，产率：61.7％。ESI:m/z:C43H77N4O17[M+H]+计算值:921.5,实测值:921.5。
实施例294.化合物738的合成
Figure GDA0001547895240002022
将化合物737(16.6g，0.018mmol)溶于100mL无水甲酸中，室温搅拌过夜，反应完毕。旋蒸除去HCO2H，加入大量DCM旋干，真空泵抽干得15.6g黄色油状物，产率：100％。将上述粗品(0.018mol，1.0eq)用180mL无水DCM溶解，在N2保护下，加入EDC(8.6g，0.045mol)和NHS(5.2g，0.045mol)，室温反应3小时后旋干，加入50mL乙酸乙酯，过滤，用少量乙酸乙酯洗涤，滤液旋干，真空泵抽干得18.0g黄色油状物，直接用于下一步合成。ESI:m/z:C43H72N5O19[M+H]+计算值:962.5,实测值:962.5。
实施例295.化合物739的合成
Figure GDA0001547895240002023
将化合物121(2.0g，5.91mmol)和化合物737(8.5g，8.87mmol)溶于20mL 95％乙醇中，加入2.0mL PBS(0.1M,pH7.5)，室温反应过夜，旋蒸除去乙醇，加100mL乙酸乙酯溶解，水洗(50mL×5)，水相用NaCl固体饱和，用乙酸乙酯萃取(150mL×1，75mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得产物3.56g，产率：50％。ESI:m/z:C56H93N6O21[M+H]+计算值:1185.6,实测值1185.6.
实施例296.化合物740的合成
Figure GDA0001547895240002031
化合物739(1.0g，0.844mmol)溶于12mL DCM中，加入4mL TFA，室温反应1小时，旋蒸除去溶剂，加入大量DCM旋干，加***，室温搅拌30分钟，静置，倒出***，重复该操作2次，残留物抽干得0.91g黄色油状物，将其(0.844mmol,1.0eq)和化合物41a(0.70g，0.101mmol)溶解于15mL无水DMA，冰浴，N2保护下滴加DIPEA(0.44mL，2.53mmol)，完毕，升温至室温反应3小时后旋干，加少量DCM溶解，甲酸调节pH至3，直接上样硅胶柱，先用乙酸乙酯/石油醚(0％-100％，含0.1％甲酸)除去极性较小的杂质，再用MeOH/DCM(0％-20％,含0.1％甲酸)洗脱，得1.43g黄色泡沫状固体。将其溶解在乙腈和水中，用制备HPLC(C18柱,流动相A:水,流动相B:乙腈,120min内乙腈从20％升到80％)纯化，得1.0g白色泡沫状固体,产率74.6％。ESI:m/z:C76H125N10O24S[M+H]+:计算值1593.9,实测值1593.9.
实施例297.化合物742的合成
Figure GDA0001547895240002032
将化合物154(2.0g，5.91mmol)和化合物738(8.5g，8.87mmol)溶于20mL 95％乙醇中，加入2.0mL PBS(0.1M,PH7.5)，室温反应过夜，旋蒸除去乙醇，加100mL乙酸乙酯溶解，水洗(50mL×5)，水相用NaCl固体饱和，用乙酸乙酯萃取(150mL×1，75mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，得产物4.85g，产率：69.2％。ESI:m/z:C56H93N6O21[M+H]+计算值:1185.6,实测值1185.6.
实施例298.化合物743的合成
Figure GDA0001547895240002041
将化合物742(1.0g，0.844mmol)溶于12mL DCM中，加入4mL TFA，室温反应1小时，旋蒸除去溶剂，加入大量DCM旋干，加***，室温搅拌30分钟，静置，倒掉***，重复该操作2次，将残留物抽干得0.90g黄色油状物，将其(0.843mmol,1.0eq)和化合物41a(0.70g，0.100mmol)溶于15mL无水DMA，冰浴，滴加DIPEA(0.44mL，2.53mmol)，升温至室温反应3小时，旋干，加少量DCM溶解，甲酸调节pH至3，直接上样硅胶柱，先用乙酸乙酯/石油醚(0％-100％，含0.1％甲酸)除去极性较小的杂质，再用MeOH/DCM(0％-20％,含0.1％甲酸)洗脱，得1.43g黄色泡沫状固体。将其溶解在乙腈和水中，用制备HPLC(C18柱,流动相A:水,流动相B:乙腈,120min内乙腈从20％升到80％)纯化，得1.0g白色泡沫状固体,产率75.0％。ESI:m/z:C76H125N10O24S[M+H]+计算值:1593.9,实测值1593.9.
实施例299.双(2-羟乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯.
Figure GDA0001547895240002042
将琥珀酸二甲酯(20.0g,136.9mmol)和二羟乙基胺(7.20g,68.7mmol)溶于无水甲苯(500ml)和吡啶(50ml)的混合溶液中，在150℃回流28小时。将混合溶液浓缩后经SiO2柱层析(从EtOAc/DCM＝5％-25％到EtOAc)获得标题化合物(12.5g,83％)。ESI MS m/z+离子峰：C9H17NaNO5(M+Na)计算值242.2,实验值242.4.
实施例300.双(2-(甲磺基氧基)乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002051
将双(2-羟乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯(12.0g,49.56mmol)溶于无水吡啶(350ml)，加入甲磺酰氯(20.0g,175.4mmol)。过夜反应后将溶液浓缩，然后加EtOAc(350ml)稀释，再用冷却的1M NaH2PO4溶液(2x 300ml)洗涤，用MgSO4干燥，过滤旋干后得到粗产品(18.8g,101％)。该粗产品未经纯化就直接用于下一步反应。ESI MS m/z+离子峰：C11H21NaNO9S2(M+Na)计算值398.2,实验值398.4.
实施例301.双(2-(硫代乙酰)乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002052
将双(2-(甲磺基氧基)乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯(新制,90％纯度,8.5g,约20mmol)溶于DMA(350ml)，在0℃下依次加入三乙胺(30ml,215mmol)和硫代乙酸(10ml,134mmol)。室温搅拌过夜，浓缩，用EtOAc(350ml)稀释后，依次用NaHCO3饱和溶液(300ml),NaCl饱和溶液(300ml)和1M NaH2PO4溶液(300ml)洗涤。然后，有机相用Na2SO4干燥，过滤旋干后经SiO2柱层析EtOAc/hexane(10％-25％EtOAc)得标题化合物(5.1g,76％)。ESI MS m/z+离子峰：C13H21NaNO5S2(M+Na)计算值358.1,实验值358.2.
实施例302.4-(双(2-(吡啶-2-基二硫基)乙基)胺基)-4-氧丁酸。
Figure GDA0001547895240002053
将双(2-(硫代乙酰)乙基)胺基-4-氧丁酸甲酯(5.0g,14.9mmol)溶于THF(150ml)加入NaOH(5.0g,125mmol)的水溶液(100ml)。室温搅拌35分钟后用H3PO4中和至pH 7。然后，将1,2-二吡啶二硫醚(Aldrithiol-2,26.0g,118mmol)的THF(100ml)溶液加入，并搅拌4小时。浓缩后经SiO2柱层析MeOH/DCM/HOAc(1:20/1％)得到标题化合物(5.8g,85.6％)。ESIMS m/z+离子峰：C18H21NaN3O3S4(M+Na)计算值478.0,实验值478.2.
实施例303.2,5-二氧代吡咯烷-1-基-双(2-(吡啶-2-基二硫基)乙基)胺基-4-氧丁酸酯。
Figure GDA0001547895240002061
将4-(双(2-(吡啶-2-基二硫基)乙基)胺基)-4-氧丁酸(5.2g,11.5mmol)溶于DMA(100ml)，加入NHS(1.6g,13.9mmol)和EDC(5.0g,26.1mmol)。搅拌过夜，旋干后经SiO2柱层析(从EtOAc/DCM＝5％-15％到EtOAc)得到标题化合物(5.8g,85.6％)。ESI MS m/z+离子峰：C22H24NaN4O5S4(M+Na)计算值575.1,实验值575.2.
实施例304.外-3，6-环氧-Δ-四氢酞酰亚胺。
Figure GDA0001547895240002062
将马来酰亚胺(10.0g,103.0mmol)的甲苯(200ml)溶液中加入呋喃(10.0ml,137.4mmol)，然后将混合溶液置于1L高压釜内加热至100℃反应8小时。冷却至室温后，将釜内固体用甲醇冲洗，浓缩后在乙酸乙酯和正己烷混合溶液中重结晶得到标题化合物(16.7g，99％)。1H NMR(CDCl3):11.12(s,1H)(NH),6.68-6.64(m,2H),5.18-5.13(m,2H),2.97-2.92(m,2H).MS m/z+离子峰：C8H7NaNO3(M+Na)计算值188.04,实验值188.04.
实施例305.4-((2-((3aR,4R,7S,7aS)-1,3-二氧3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧异吲哚-3H)-基)乙基)(2-((4R,7S,7aS)-1,3-二氧-3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧异吲哚-2(3H)-基)乙基)胺基)-4-氧丁酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002063
将4-(双(2-甲磺酰基)乙氧胺)-4-氧代丁酸甲酯(新制，90％纯度，8.5g，～20mmol)溶于DMA(350mL)中，再依次加入3，6-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺(10.2g，61.8mmol)，碳酸钠(8.0g,75.5mmol)和碘化钠(0.3g,2.0mmol)。反应混合液于室温下搅拌过夜。将反应液浓缩后，加乙酸乙酯(350mL)，并依次用饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)、饱和食盐水(300mL)和1M NaH2PO4(300mL)洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩；所得产物经硅胶柱色谱分离(10％～30％乙酸乙酯/正己烷)纯化后得到目标化合物(7.9g，77％)。ESI MS m/z+:C25H27NaN3O9(M+Na)：计算值：536.2，实验值：536.4。
实施例306.4-(双(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯烷)乙胺)-4-氧代丁酸
Figure GDA0001547895240002071
将4-((2-((3aR,4R,7S,7aS)-1,3-二氧3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧异吲哚-3H)-基)乙基)(2-((4R,7S,7aS)-1,3-二氧-3a,4,7,7a-四氢-1H-4,7-环氧异吲哚-2(3H)-基)乙基)胺基)-4-氧丁酸甲酯(3.0g，5.8mmol)和三甲基氢氧化锡(4.8g，26.4mmol)溶于1,2-二氯乙烷(150mL)中，于80℃下回流8小时。冷却至室温，将反应液用硅胶过滤，用二氯甲烷/甲醇漂洗以除去残余的三甲基氢氧化锡。合并滤液，减压浓缩后，加N,N-二甲基乙酰胺和甲苯，于120℃下回流搅拌过夜。经硅胶柱色谱分离(5％～10％甲醇/二氯甲烷)纯化得到目标化合物(1.62g，76％)。ESI MS m/z+C16H17NaN3O9(M+Na)：计算值：386.1；实验值：386.2。
实施例307.2,5-二氧吡咯烷-4-(双(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯烷)乙胺)-4-氧代丁酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002072
将4-(双(2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯烷)乙胺)-4-氧代丁酸(16.0g，4.4mmol)溶于DMA(100mL)中，加入NHS(0.76g，6.61mmol)和EDC(1.70g，8.90mmol)。反应混合液于室温下搅拌过夜。然后将反应液浓缩，经硅胶柱色谱分离(5％～15％乙酸乙酯/二氯甲烷)纯化得到目标化合物(1.72g，85.0％)。ESI MS m/z+C20H20NaN4O9(M+Na)：计算值：483.1；实验值：483.2。
实施例308.5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸叔丁酯
Figure GDA0001547895240002073
将5-羟基戊酸叔丁酯(10.0g，57.4mmol)溶于吡啶(60mL)中，加入甲磺酰氯(8.0mL，103.3mmol)。反应混合液于室温下搅拌6h。将反应液浓缩后，加乙酸乙酯稀释，用冷的1M NaH2PO4(pH 6)溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，母液减压浓缩干，得到甲磺酸盐。将其加入到化合物12(9.90g，60.0mmol)和Na2CO3(8.5g，80.1mmol)的DMF(80mL)溶液中。混合反应液于室温下搅拌过夜。将反应液浓缩后，加乙酸乙酯，用饱和食盐水和1MNaH2PO4(pH 6)溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，母液浓缩后经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:12)纯化，得到目标化合物(14.01g，76％)。ESI MS m/z+C17H23NaNO5(M+Na)：计算值：344.16；实验值：344.16。
实施例309.5-马来酰亚胺基戊酸。
Figure GDA0001547895240002081
将5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸叔丁酯(5.0g，15.57mmol)溶于1,4-二氧六环(40mL)中，然后于4℃下加入浓盐酸(10mL)，反应混合液于室温下搅拌30min。将反应液浓缩干后得到5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸(4.08g，99％)。将上述化合物溶于N,N-二甲基乙酰胺/甲苯(1:1，40mL)中回流反应6h。反应液浓缩后，用乙醇/***/正己烷重结晶得到目标化合物(2.76g，90％)。ESI MS m/z+C9H12NO4(M+H)：计算值：198.07；实验值：198.07。
实施例310.5-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(DMPS linker)
Figure GDA0001547895240002082
将5-马来酰胺基戊酸(2.0g，10.1mL)溶于二氯甲烷(20mL)中，然后加入NHS(1.50g，13.0mmol)和EDC(7.0g，36.4mmol)，反应混合液于室温下搅拌过夜。将反应液浓缩干后，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10)得到目标化合物(2.43g，82％)。ESIMS m/z+C13H14NaN2O6(M+Na)：计算值：317.09；实验值：317.09。
实施例311.5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸酰肼甲酸叔丁酯.
Figure GDA0001547895240002083
将5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸(1.0g，3.77mmol)溶于DMF(30mL)中，然后加入叔丁基氨基甲酸酯(0.60g，4.53mmol)和EDC(2.0g，10.4mmol)，反应混合液于室温下搅拌过夜。将反应液浓缩干后，经硅胶色谱柱(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10)纯化得到目标化合物(1.18g，83％)。ESI MS m/z+C18H25NaN3O6(M+Na)：计算值：402.17；实验值：402.18。
实施例312.5-(马来酰亚胺基)戊酸酰肼.
Figure GDA0001547895240002091
将5-(3'，6'-桥氧-△-四氢邻苯二甲酰亚胺)戊酸酰肼甲酸叔丁酯(1.18g，3.11mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺/甲苯(1:1，20mL)中，回流反应6h。将反应液浓缩，加1,4-二氧六环(20mL)，然后于4℃下加入HCl(5mL,36％)，搅拌30min。将反应液浓缩至干，用乙醇/***/正己烷重结晶得到目标化合物(577mg，88％)。ESI MS m/z+C9H14N3O3(M+H)：计算值：212.10,；实验值：212.10。
实施例313.3'-溴-马来酰亚胺化合物39和40，以及3',4'-二溴-马来酰亚胺化合物43和44
Figure GDA0001547895240002092
将化合物37或者38(～6g)溶于DMF(60mL)中，然后加入溴代顺丁烯二酸酐(1eq)或者2,3-二溴-顺丁烯二酸酐(1eq)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩至干后得到纯的反式酸。向上述反式酸中加入乙酸(～50mL)和乙酸酐(2～4g)，反应混合液于120℃下回流6～12h。将反应液浓缩，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10～1:1)得到3'-溴-马来酰亚胺化合物39和40，同法得到3',4'-二溴-马来酰亚胺化合物43和44(61％～87％)。
5-(3-溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸
Figure GDA0001547895240002093
ESI MS m/z+C9H11BrNO4(M+H)：计算值：275.98；实验值：275.98。
3-(2-(2-(2-(3-溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-丙酸。
Figure GDA0001547895240002101
ESI MS m/z+C13H19BrNO7(M+H)：计算值：380.03；实验值：380.03。
5-(3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸
Figure GDA0001547895240002102
ESI MS m/z+C9H10Br2NO4(M+H)：计算值：353.89；实验值：353.89。
3(2-(2-(2-(3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-丙酸
Figure GDA0001547895240002103
ESI MS m/z+C13H18Br2NO7(M+H)：计算值：457.94；实验值：457.94。
实施例314.3'-溴-马来酰亚胺的N-羟基琥珀酰亚胺醚化物41和42，以及3',4'-二溴-马来酰亚胺的N-羟基琥珀酰亚胺醚化物45和46.
Figure GDA0001547895240002104
R＝C1～C8alkyl or C2H4(OC2H4)n,n＝1～20；X3＝H or Br；41,42,X3＝H；45,46,X3＝Br
将3'-溴-马来酰亚胺化合物39和40(1eq)，或者3',4'-二溴-马来酰亚胺化合物43和44溶于DMA(～0.15ml)中，然后加入NHS(1.1eq)和EDC(2～4eq)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:20～1:5)得到3'-溴-马来酰亚胺的N-羟基琥珀酰亚胺醚化物41和42，以及3',4'-二溴-马来酰亚胺的N-羟基琥珀酰亚胺醚化物45和46(70％～93％)。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-(3-溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸酯(41)
Figure GDA0001547895240002111
ESI MS m/z+C13H13BrN2NaO7(M+Na)：计算值：395.00；实验值：395.00。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基5-(3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸酯(45)
Figure GDA0001547895240002112
ESI MS m/z+C13H12Br2N2NaO6(M+Na)：计算值：472.91；实验值：472.91。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(2-(3-溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(42)
Figure GDA0001547895240002113
ESI MS m/z+C17H21BrN2NaO9(M+Na)：计算值：499.04；实验值：499.04。
2,5-二氧代吡咯烷-1-基3(2-(2-(2-(3,4-二溴-2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(46)
Figure GDA0001547895240002114
ESI MS m/z+C17H20Br2N2NaO9(M+Na)：计算值：576.95；实验值：576.95。
实施例315.4-(2-吡啶基二硫)-4-甲基戊酸
Figure GDA0001547895240002115
将4-巯基-4-甲基戊酸(Goff,D.等,Bioconjugate Chem.1990,1,381-386)(4.67g，31.5mmol)溶于甲醇(15mL)中，然后加入2,2,-二硫二吡啶(30.0g，136.2mmol)的甲醇溶液(80mL)和100mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.5，70mL)，反应液搅拌6h。将反应液浓缩后，用乙酸乙酯/正己烷(1：1)萃取，然后将水层用1M HCl调到pH 3，再用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。经硅胶色谱柱分离(甲醇/二氯甲烷/乙酸＝1:15:0.01)得到目标化合物(7.05g，87％)。ESI MS m/z+C11H16NO2S2(M+H)：计算值：258.05；实验值：258.05。
实施例316.4-(2-吡啶二硫)-4-甲基戊酸琥珀酰亚胺酯(SMDP linker)
Figure GDA0001547895240002121
将4-(2-吡啶二硫)-4-甲基戊酸(2.0g，7.78mmol)溶于二氯甲烷(20mL)中，然后加入NHS(1.10g，9.56mmol)和EDC(4.0g，20.8mmol)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩后，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10)得到目标化合物(2.48g，90％)。ESI MS m/z+C15H18NaN2O4S2(M+Na)：计算值：377.07；实验值：377.08。
实施例317.2-((1R,3R)-3-(叔丁氧羰基)-1-氢-4-甲基胺戊基)噻唑-4-甲酸甲酯.
Figure GDA0001547895240002122
将(3R,5R)-叔丁基-3-异丙基-3-(4-(甲氧羰基)噻唑)异丙基恶唑-2-甲酸甲酯(1.00g，2.81mmol)溶于乙腈(20mL)和H2O(2mL)中，加入Mo(CO)6(1.10g，3.12mmol)，反应混合液于70℃下搅拌16h。将反应液浓缩后，加乙酸乙酯(50mL)和10％柠檬酸水溶液(50mL)，再加入NaIO4直至水层变得澄清，用乙酸乙酯萃取。有机相用10％Na2S2O3水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，经硅胶色谱柱分离(正己烷/乙酸乙酯＝3:2)得到无色固体化合物(906mg，90％)。ESI MS m/z+C16H26N2NaO5S(M+Na)：计算值：381.14；实验值：381.14。
实施例318.2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002123
将2-((1R,3R)-3-(叔丁氧羰基)-1-氢-4-甲基胺戊基)噻唑-4-甲酸甲酯.(900mg，2.51mmol)溶于吡啶(15mL)中，加入乙酸酐(0.5mL，5.29mmol)，搅拌过夜后将反应液浓缩，经硅胶色谱柱分离(正己烷/乙酸乙酯＝4:1)得到无色固体化合物(950mg，95％)。ESI MSm/z+C18H28N2NaO6S(M+Na)：计算值：423.15；实验值：423.16。
实施例319.2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸。
Figure GDA0001547895240002131
将2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(940mg，2.35mmol)溶于THF(15mL)中，于4℃下加入NaH(120mg，3.0mmmol，60％)，反应混合液搅拌2h后加入CH3I(0.155mL，2.49mmol)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩，再溶于乙酸乙酯，过滤，浓缩至干，得到纯的2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(73a)。将上述所得化合物(73a)溶于1,2-二氯乙烷(20mL)中，加三甲基氢氧化锡(620mg，3.43mmol)，反应混合液于80℃下搅拌过夜。将反应液浓缩，溶解于甲醇/二氯甲烷/乙酸(1:5:0.01,20mL)中，过滤，浓缩，母液加甲苯后再次浓缩得到干燥的化合物。然后，将上述所得化合物溶于吡啶(15mL)中，加入乙酸酐(0.4mL，4.23mmol)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩后，经硅胶色谱柱分离(甲醇/二氯甲烷/乙酸＝1:10:0.01)得到无水固体化合物(735mg，78％)。ESI MS m/z+C18H28N2NaO6S(M+Na)：计算值：423.15；实验值：423.16。
实施例320.2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基(甲基)胺)-1-(3-(1,3-二氧代异吲哚啉)-4-甲基胺-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯.
Figure GDA0001547895240002132
将2-((1R,3R)-3-(叔丁氧羰基)-1-氢-4-甲基胺戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(850mg，2.37mmol)溶于THF(15mL)中，于-20℃加入NaH(100mg，2.5mmol，60％)，并在该温度下搅拌20min，再加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(655mg，2.4mmol)，上述反应混合液在-20℃下搅拌30min后，升至室温反应4h。向反应液中加入甲醇(0.5mL)淬灭反应，加二氯甲烷(60mL)，过滤，浓缩，得到2-(1R,3R)-3-(叔丁氧基-甲基胺)-1-(3-(1,3-二氧异吲哚啉-2-丙氧基-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯，所得化合物无需纯化，可直接进行下一步。将上述所得化合物溶于THF(10mL)中，然后于室温下加入NaH(170mg，4.25mmol，60％)，搅拌45min，加入CH3I(0.20mL，3.21mmol)，反应混合液于室温下搅拌过夜。将反应液用NaH2PO4(2.0M，2mL)淬灭，然后加入DMA(5mL)，减压浓缩，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10～1:4)得到目标化合物(921mg，69％)。ESI MS m/z+C28H37N3NaO7S(M+Na)：计算值：582.22；实验值：582.22。
实施例321.2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基(甲基)胺)-1-(3-(1,3-二氧代异吲哚啉)-4-甲基胺-戊基)噻唑-4-甲酸。
Figure GDA0001547895240002141
将干燥的2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基(甲基)胺)-1-(3-(1,3-二氧代异吲哚啉)-4-甲基胺-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯.(910mg，1.63mmol)溶于1,2-二氯乙烷(20mL)中，加入三甲基氢氧化锡(400mg，2.21mmol)，反应混合液于80℃下搅拌过夜。将反应液浓缩，经硅胶色谱柱分离(甲醇/二氯甲烷/乙酸＝1:10:0.01)得到目标化合物(756mg，85％)。ESI MS m/z+C27H37N3O7S(M+H)：计算值：546.22；实验值：546.22。
实施例322.2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基(3-(1,3-二-氧代异吲哚啉-2-戊胺)-4-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯.
Figure GDA0001547895240002142
将2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(800mg，2.00mmol)溶于THF(30mL)中，于室温下加入NaH(150mg，3.75mmol，60％)，搅拌45min，再加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(655mg，2.4mmol)。反应混合液于室温下搅拌过夜。将反应液用NaH2PO4(2.0M，2mL)淬灭，然后加入DMA(5mL)，减压浓缩，经硅胶色谱柱分离(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10～1:4)得到目标化合物(971mg，82％)。ESI MS m/z+C29H37N3NaO8S(M+Na)：计算值：610.22；实验值：610.22。
实施例323.2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基(3-(1,3-二-氧代异吲哚啉-2-戊胺)-4-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸。
Figure GDA0001547895240002151
将干燥的2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基(3-(1,3-二-氧代异吲哚啉-2-戊胺)-4-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(900mg，1.53mmol)溶于1,2-二氯乙烷(35mL)中，加入三甲基氢氧化锡(400mg，2.21mmol)，反应混合液于80℃下搅拌过夜。将反应液浓缩，所得产物溶于吡啶(20mL)，再加入乙酸酐(3mL)，反应混合液搅拌过夜。将反应液浓缩后，经硅胶色谱柱分离(甲醇/二氯甲烷/乙酸＝1:10:0.01)得到目标化合物(755mg，86％)。ESIMSm/z+C28H35N3NaO8S(M+Na)：计算值：596.20；实验值：596.20。
实施例324.(S)-5-(4-(苄氧)苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊烯酸乙酯(185)
Figure GDA0001547895240002152
在-78℃的温度下，把二异丁基氢化铝(40ml,40mmol,1.0M)慢慢加入到(S)-3-(4-(苄氧)苯基)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-丙酸甲酯184(8.00g,20.76mmol)的DCM(250ml)溶液中，反应2小时后，加入MeOH(5ml)淬灭。待反应混合物升至室温，加入1M HCl调至pH＝4,分液。水层用DCM(2x 150ml)萃取，有机层用水洗，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩得到醛基中间体的初产物。将该初产物溶解于DCM，室温下加入由1-(1-乙氧羰基乙基)三苯基溴化膦(18.0g,40.64mmol)和KOtBu(5.00g,44.64mmol)的二氯甲烷(80ml)溶液合成的叶立德溶液，待混合物过夜反应后浓缩，柱层析(乙酸乙酯/正己烷，1:8-1:4)得到目标产物(185)(6.90g,76％),ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C26H33NNaO5,462.22,实验值，462.22.
实施例325.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002153
在氢气反应瓶中加入(S)-5-(4-(苄氧)苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊烯酸乙酯(185)(6.70g,15.26mmol)，甲醇(150ml),10％Pd/C(0.3g),在30psi氢气下反应6小时，用硅藻土过滤，浓缩，从乙醇/正己烷中重结晶得到目标产物(186)(4.61g,86％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C19H29NNaO5,374.20,实验值，374.30。
实施例326.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(4-羟基-3-硝基苯基)-2-甲基戊酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002161
往(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸乙酯4.50g,12.81mmol)的无水CH2Cl2(200ml)溶液中加入Ac2O(2ml,21.16mmol)和发烟硝酸(0.65ml,14.07mmol)，在室温下搅拌4小时，用水(150ml)稀释,分离，水相用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/二氯甲烷＝1:10)得到目标产物(4.21g,83％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C19H28N2NaO7,419.19,实验值，419.20.
实施例327.4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)戊酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002162
把(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(4-羟基-3-硝基苯基)-2-甲基戊酸乙酯(4.00g,10.09mmol)溶解于乙腈(70ml)和N,N-二甲基乙酰胺(30ml)中，冷却至0℃后，加入N,N’-二异丙基乙胺(4.00ml,23.00mmol),两分钟后加入三氯氧磷(2.00ml,21.45mmol)。在室温下搅拌8小时，冷至0℃，慢慢往里加入碳酸氢钠(3.5g,41.60mmol)与水(20ml)配成的溶液，继续在0℃搅拌过夜，浓缩，用C-18柱(20x4cm)纯化，梯度洗脱条件:25ml/min,A:0.5％醋酸,B:甲醇,100％A洗10分钟,然后经45分钟到75％A和25％B。收集目标组分，浓缩得到目标化合物(3.89g,81％)。ESI:m/z:[M-H]-，离子峰：C19H28N2O10P,475.16,实验值，475.20.
实施例328.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)戊酸。
Figure GDA0001547895240002171
往4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)戊酸乙酯(3.75g,7.87mmol)的THF(100ml)溶液中加入氢氧化锂(5.0g,208.7mmol)的水(60ml)溶液,在0℃反应4小时，用4M的盐酸调至pH6，浓缩，C-18柱纯化，梯度洗脱，25ml/min,A:0.5％醋酸,B:甲醇,100％A保持10分钟,然后经45分钟到75％A和25％B。收集目标组分，浓缩得到目标化合物(2.82g,80％)。ESI:m/z:[M-H]-,离子峰：C17H24N2O10P,447.12,实验值，447.20.
实施例329.(4R)-5-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊酸。
Figure GDA0001547895240002172
往氢气反应瓶中依次加入(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)戊酸(2.6g,5.80mmol)，甲醇(80ml),10％Pd/C(0.2g)。在35psi氢气压力下反应6小时。混合物用硅藻土过滤，浓缩得粗产物(2.18g,90％)，无需进一步纯化直接用于下一步反应。ESI:m/z:[M-H]-，离子峰：C17H26N2O8P,417.15,实验值，417.15.
实施例330.(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-羟基-3-硝基苯基)-丙酸甲酯(196)。
Figure GDA0001547895240002173
往(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-羟基苯基)-丙酸甲酯(4.5g,15.24mmol)的无水二氯甲烷(240ml)溶液中加入醋酸酐(4ml,42.32mmol)和发烟硝酸(0.85ml,18.40mmol)。在室温下搅拌4小时后，用水(150ml)稀释，分离，水相用乙酸乙酯萃取。合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/二氯甲烷，1:10)得到目标产物(4.30g,83％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C15H20N2NaO7,363.13,实验值，363.20.
实施例331.(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)-丙酸甲酯.
Figure GDA0001547895240002181
在0℃，往(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(4-羟基-3-硝基苯基)-丙酸甲酯(4.10g,12.05mmol)的乙腈(90ml)溶液中加入N,N’-二异丙基乙基胺(4.00ml,23.00mmol)，搅拌2分钟后，加入三氯氧磷(2.00ml,21.45mmol)，反应混合物在室温下搅拌8小时后，冷至0℃，慢慢往里加入碳酸氢钠(3.5g,41.60mmol)与水(20ml)配成的溶液，继续在0℃下搅拌过夜，然后浓缩，C-18柱(20x4cm)纯化，梯度洗脱，25ml/min,A:0.5％醋酸,B:甲醇,100％A保持10分钟,然后经45分钟到75％A和25％B。收集目标组分，浓缩得到目标化合物(4.20g,83％)。ESI:m/z:[M-H]-，离子峰：C15H20N2O10P,419.08,实验值，419.10.
实施例332.3-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-(2R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-丙酸。
Figure GDA0001547895240002182
将干燥后的(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)-丙酸甲酯(4.0g,9.52mmol)溶解于混合溶剂1,2-二氯乙烷(50ml)和N,N-二甲基乙酰胺(60ml)，往该溶液中加入三甲基氢氧化锡(4.00g,22.1mmol)。混合物在80℃下反应6小时，浓缩，柱层析(水/乙腈1：4)，收集目标组分，浓缩得(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)-丙酸。将所得的化合物与N,N-二甲基乙酰胺(70ml)和10％Pd/C(0.3g)一并加入到氢气反应瓶中。在35psi氢气压力下反应6小时。混合物用硅藻土过滤，浓缩，重结晶得到目标产物(2.86g,80％)，无需进一步纯化直接用于下一步反应。ESI:m/z:[M-H]-，离子峰：C14H20N2O8P,375.10,实验值，375.10.
实施例333.3-(4-苄氧基苯基)-(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-丙酸苄基酯.
Figure GDA0001547895240002183
往3-(4-苄氧基苯基)-(2R)-2-[(叔丁氧基羰基氨基)-丙酸苄基酯(4.0g,8.67mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液中加入氢化钠(430mg,10.75mmol,60％油合物)，室温搅拌1小时后，加入碘甲烷(1.82g,12.82mmol)，混合液搅拌过夜，用甲醇(0.5ml)淬灭反应，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/二氯甲烷，1:10)得到目标产物(3.83g,93％)。MS ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C29H33NNaO5,498.24,实验值，498.24.
实施例334.(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-3-(4-羟基-2-硝基苯基)丙酸.
Figure GDA0001547895240002191
往氢气反应瓶中依次加入3-(4-苄氧基苯基)-(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-丙酸苄基酯(3.8g,8.00mmol)，甲醇(80ml),10％Pd/C(0.3g)。在35psi氢气压力下反应6小时后，用硅藻土过滤，浓缩得粗产物(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸,该化合物无需进一步纯化。在-25℃的温度下，往此化合物的无水二氯甲烷(240ml)溶液中加入四氯化锡(1.5ml,12.75mmol)和发烟硝酸(0.60ml,12.98mmol)的二氯甲烷(40ml)溶液，混合物在-25℃下搅拌75分钟，用饱和碳酸氢钠淬灭，调至pH＝3-4，水相用乙酸乙酯萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(MeOH/DCM/HOAc 1:8:0.01)得到目标化合物(1.98g,73％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C15H20N2NaO7,363.13,实验值，363.13.
实施例335.(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-3-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)丙酸.
Figure GDA0001547895240002192
将(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-3-(4-羟基-2-硝基苯基)丙酸(1.98g,5.82mmol)溶解于乙腈(30ml)和N,N-二甲基乙酰胺(30ml)中，所得的溶液在0℃下加入N,N’-二异丙基乙胺(2.00ml,11.50mmol)),并于该温度下反应两分钟后加入三氯氧磷(1.10ml,11.79mmol)。反应混合液在室温下搅拌8小时后，冷至0℃，慢慢往里加入碳酸氢钠(2.0g,23.80mmol)与水(10ml)配成的溶液，继续在0℃下搅拌过夜，混合物浓缩，C-18柱(20x4cm)纯化，梯度洗脱，25ml/min,A:0.5％醋酸,B:甲醇,100％A保持10分钟,然后经45分钟到75％A和25％B。收集目标组分，浓缩得到目标化合物(1.96,80％)。ESI:m/z:[M-H]-，离子峰：C15H20N2O10P,419.09,实验值，419.09.
实施例336.3-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]丙酸.
Figure GDA0001547895240002201
往氢气反应瓶中依次加入(2R)-2-[(叔丁氧基羰基)-甲基氨基]-3-(3-硝基-4-膦酰氧基苯基)丙酸(1.96g,4.67mmol)，N,N-二甲基乙酰胺(60ml),10％Pd/C(0.2g)。在30psi氢气压力下反应6小时。混合物硅藻土过滤，浓缩得粗产物(1.74g,95％))，无需进一步纯化直接用于下一反应。ESI:m/z:[M-H]-,calcd forC15H22N2O8P,389.12,Found,389.12.
实施例337.苯基-2-(2R)-叔丁氧基羰基氨基-1-丙酮。
Figure GDA0001547895240002202
将(1S,2R)-(+)-去甲基麻黄碱(7.0g,46.29mmol)加入到混合液四氢呋喃(40ml)和1M碳酸氢钠(100ml)中，在4℃的温度下，于45分钟内慢慢加入二碳酸二叔丁酯(10.15g,46.53mmol)的四氢呋喃(60ml)溶液，反应混合物在室温下搅拌6小时后，浓缩，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(EtOAc/Hexane 1:2)，收集目标组分，浓缩得粗产物(1S)-苯基-2-(2R)-叔丁氧基羰基氨基-1-丙醇(10.81,93％)，粗产物无需进一步纯化，MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C14H21NaNO3,274.15,实验值，274.15。往此化合物的二氯甲烷(50ml)溶液中加入戴斯-马丁试剂的二氯甲烷(180ml,0.3M)溶液，搅拌一小时后，往混合物中加入冰冻的氢氧化钠溶液(1M,100ml)，分离，有机相用1M磷酸二氢钠(100ml)调至pH＝6，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(EtOAc/Hexane 1:5)得到目标产物(9.34g,81％intwo steps)。MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C14H19NaNO3,272.14,实验值，272.14.
实施例338.2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002211
往化合物33(788.1mg,1.464mmol)的N,N’-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(202.0mg,1.756mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(980mg,5.104mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，柱层析(EtOAc/CH2Cl2＝1:3)得到目标化合物(762.8mg,82％)。MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C30H45NaN5O8S,658.30,实验值，658.30.
实施例339.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(3-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸.
Figure GDA0001547895240002212
往(4R)-5-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊酸(825.1mg,1.973mmol)的N,N’-二甲基甲酰胺(7ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基-5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酸乙酯(711mg,2.417mmol)，N,N’-二异丙基乙胺(0.250ml,1.438mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，C-18柱层析(4x25cm,v＝15ml/min,从100％的1％HOAc到75％的1％HOAc/25％MeOH in 45min)得到目标化合物(895.7mg,76％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C26H35N3O11P,596.21,实验值，596.21.
实施例340.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5–(3-(3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸。
Figure GDA0001547895240002213
往(4R)-5-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊酸(632.5mg,1.512mmol)的N,N’-二甲基甲酰胺(7ml)溶液中加2,5-二氧代吡咯烷-1-基-3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸乙酯(727mg,1.826mmol)，N,N’-二异丙基乙胺(0.250ml,1.438mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，C-18柱层析(4x25cm,v＝15ml/min,从100％的1％HOAc到75％的1％HOAc/25％MeOH in45min)得到目标化合物(763.2mg,72％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C30H44N3O14P,700.25,实验值，700.25.
实施例341.(4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸.
Figure GDA0001547895240002221
往(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(3-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸(102mg,0.171mmol)的1，4-二氧六环(4ml)溶液中加入浓盐酸(1.0ml,37％)，混合物搅拌30分钟后，浓缩至干燥得粗脱Boc产物。将此粗产物溶于N,N-二甲基乙酰胺(5ml)，往该溶液中依次加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(110mg,0.173mmol),N,N’-二异丙基乙胺(30ul,0.172mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，柱层析(含1％HOAc的水/丙酮,1:9-1:4)得到目标化合物(123.2mg,71％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C47H67N7O14PS,1016.42,实验值，1016.42.
实施例342.(4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-3-(3-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸.
Figure GDA0001547895240002222
往(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5–(3-(3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酰氨基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸(108mg,0.154mmol)的1，4-二氧六环(4ml)溶液中加入浓盐酸(1.0ml,37％)，混合物搅拌30分钟后，浓缩至干燥得脱Boc粗产物。将此粗产物溶于N,N-二甲基乙酰胺(5ml)，往该溶液中依次加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(110mg,0.173mmol),N,N’-二异丙基乙胺(30ul,0.172mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，柱层析(含1％HOAc的水/丙酮,1:9-1:4)得到目标化合物(131.2mg,76％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C51H75N7O17PS,1120.47,实验值，1120.48.
实施例343.(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(4-(膦酰氧基)-3-(4-(吡啶-2-二硫基)丁酰氨基)苯基)戊酸。
Figure GDA0001547895240002231
往(4R)-5-(3-氨基-4-膦酰氧基苯基)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊酸(548.3mg,1.311mmol)的N,N’-二甲基甲酰胺(10ml)溶液中加琥珀酰亚氨基4-(吡啶-2-二硫基)丁酸(550.2mg,1.687mmol)和N,N’-二异丙基乙胺(0.18ml,1.03mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，柱层析(含1％HOAc的水/丙酮,1:9-1:4)得到目标化合物(660.2mg,80％)。MSESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C26H35N3O9PS2,628.16,实验值，628.16.
实施例344.(4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基-5-(4-(膦酰氧基)-3-(4-(吡啶-2-二硫基)丁酰氨基)苯基)戊酸
Figure GDA0001547895240002232
在4℃的温度下，往(4R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-(4-(膦酰氧基)-3-(4-(吡啶-2-二硫基)丁酰氨基)苯基)戊酸(110.5mg,0.175mmol)的1，4-二氧六环(4ml)溶液中加入浓盐酸(1.0ml,37％)，混合物搅拌30分钟后，浓缩至干燥得脱Boc粗产物。将此粗产物溶于N,N-二甲基乙酰胺(5ml)，往该溶液中依次加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(110mg,0.173mmol),N,N’-二异丙基乙胺(30ul,0.172mmol)，混合物过夜搅拌后，浓缩，柱层析(含1％HOAc的水/丙酮,1:9-1:4)得到目标化合物(129.1mg,71％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C47H67N7O12PS3,1048.38,实验值，1048.38.
实施例345.(4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-(4-巯基丁酰胺基)-4-(膦酰氧基)苯基)-2-甲基戊酸。
Figure GDA0001547895240002241
将(4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1-甲基哌啶-2-甲酰氨基)戊酰氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基-5-(4-(膦酰氧基)-3-(4-(吡啶-2-二硫基)丁酰氨基)苯基)戊酸(30mg,0.0285mmol)加入到N,N-二甲基乙酰胺(2ml)和磷酸二氢钠(0.1M,pH 7)中，往该混合液中加入二硫苏糖醇(20mg,0.129mmol)。混合物搅拌2小时后，浓缩，柱层析(含1％HOAc的H2O/MeCN,1:9-1:4)得到目标化合物(22mg,85％)。MS ESI:m/z-:[M-H]-，离子峰：C42H64N6O12PS2,939.38,实验值，939.38.
实施例346.4-(4-溴丁基)-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.0^{2,6}]癸-8-烯-3,5-二酮。
Figure GDA0001547895240002242
将10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.0^{2,6}]癸-8-烯-3,5-二酮(6.0g,36.35mmol)和氢化钠(60％油合物，1.50g,37.50mmol)加入到N,N-二甲基乙酰胺(60ml)中，搅拌1小时后，加入1，4-二溴丁烷(35.0g,162.10mmol)和碘化钠(0.50g,3.33mmol)。混合物搅拌过夜，用甲醇(0.5ml)淬灭，浓缩，柱层析(EtOAc/Hexane＝1:8)得到目标化合物(9.34g,86％)。MSESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C12H14BrNaNO3，322.02,实验值，322.02.
实施例347.甲基2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-1-[4'-(3”,6”-桥氧-四氢邻苯二甲酰氨基)丁氧基]-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002251
将甲基2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸甲酯(1.0g,2.79mmol)和氢化钠(120mg,3.00mmol,60％油合物)加入到四氢呋喃(30ml)，搅拌30分钟后，加入4-(4-溴丁基)-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.0^{2,6}]癸-8-烯-3,5-二酮(1.00g,3.34mmol)和碘化钠(50mg,0.33mmol)。混合物搅拌过夜，用甲醇(0.5ml)淬灭，浓缩，柱层析(EtOAc/CH2Cl2＝1:10)得到目标化合物(1.36g,84％)。MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C28H39NaN3O8S,600.25,实验值，600.25.
实施例348.甲基2-((1R,3R)-3-(N,N-叔丁氧基羰基甲基氨基)-1-[4'-(3”,6”-桥氧-四氢邻苯二甲酰氨基)丁氧基]-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸甲酯。
Figure GDA0001547895240002252
将甲基2-((1R,3R)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-1-[4'-(3”,6”-桥氧-四氢邻苯二甲酰氨基)丁氧基]-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸甲酯(1.30g,2.25mmol)和氢化钠(108mg,2.70mmol,60％油合物)加入到N,N-二甲基甲酰胺(80ml)中，搅拌1小时后，加入碘甲烷(460mg,3.24mmol)。混合物搅拌过夜，浓缩，柱层析(EtOAc/CH2Cl2＝1:12-1:8)得到目标化合物(1.01g,76％)。MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C29H41NaN3O8S,614.26,Found,614.26.
实施例349.2-((1R,3R)-3-(N,N-叔丁氧基羰基甲基氨基)-1-[4'-(3”,6”-桥氧-四氢邻苯二甲酰氨基)丁氧基]-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸.
Figure GDA0001547895240002253
将干燥后的甲基2-((1R,3R)-3-(N,N-叔丁氧基羰基甲基氨基)-1-[4'-(3”,6”-桥氧-四氢邻苯二甲酰氨基)丁氧基]-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸甲酯(900mg,1.52mmol)溶于1，2-二氯乙烷(30ml)和甲苯混合溶剂中，加入三甲基氢氧化锡(400mg,2.21mmol)。混合物在100℃下搅拌过夜，浓缩，柱层析(MeOH/CH2Cl2/HOAc＝1:10:0.01)得到目标化合物(730mg,94％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C28H39N3NaO8S,600.22,实验值，600.22.
实施例350.甲基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(N,N-(叔丁氧羰基)(4'-(3”，6”-桥氧-四氢)丁基)氨基)-4-甲基戊基)-噻唑-4-羧酸。
Figure GDA0001547895240002261
将2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基-甲基胺)-4-戊基)噻唑-4-甲酸甲酯(1.50g,3.74mmol)和氢化钠(180mg,4.50mmol,60％油合物)加入到N,N-二甲基甲酰胺(80ml)中，搅拌1小时后，加入4-(4-溴丁基)-10-氧杂-4-氮杂三环[5.2.1.0^{2,6}]癸-8-烯-3,5-二酮(1.48g,4.94mmol)和碘甲烷(70mg,0.467mmol)。混合物搅拌过夜，浓缩，柱层析(EtOAc/CH2Cl2＝1:10-1:6)得到目标化合物(1.60g,69％)。MS ESI:m/z+:[M+Na]+，离子峰：C30H41NaN3O9S,642.26,实验值，642.26.
实施例351.2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(N,N-(叔丁氧羰基)(4'-马来酰亚胺丁基)氨基)-4-甲基戊基)-噻唑-4-羧酸。
Figure GDA0001547895240002262
将干燥后的甲基2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(N,N-(叔丁氧羰基)(4'-(3”，6”-桥氧-四氢)丁基)氨基)-4-甲基戊基)-噻唑-4-羧酸(800mg,1.29mmol)溶于1，2-二氯乙烷(40ml)和甲苯混合溶剂中，加入三甲基氢氧化锡(400mg,2.21mmol)。混合物在100℃下搅拌过夜，浓缩，柱层析(MeOH/CH2Cl2/HOAc＝1:5:0.01)，收集组分浓缩，干燥。将所得的粗产物溶解于吡啶(15ml)，在0℃下往该溶液中加入乙酸酐(0.3ml,3.17mmol)，混合物室温搅拌过夜，浓缩，柱层析(MeOH/CH2Cl2/HOAc＝1:10:0.01)得到目标化合物(578.4mg,74％)。ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C29H39N3NaO9S,628.24,实验值，628.24.
实施例352.1-(2-甲基-2-环氧乙烷基)-2-苯基乙胺
Figure GDA0001547895240002263
在0℃的温度下，往1-(2-甲基-2-环氧乙烷基)-2-苯基乙基)氨基甲酸叔丁酯(Sun,L.et al,J.Mol.Catalysis A:Chem.,2005,234(1-2),29-34)(300mg,1.08mmol)的1，4-二氧六环(8mL)溶液中加入浓盐酸(37％,2mL)，在该温度下继续搅拌1小时，TLC显示已经没有起始反应原料。将所得的混合液用甲苯(10ml)稀释，浓缩，从EtOH/Hexane中重结晶得到目标化合物的盐酸盐(201mg,87％)。ESI:m/z:[M+H]+，离子峰：C11H16NO,178.12,实验值，178.12.
实施例353.(S)-5-苯基-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基戊烯酸乙酯.
Figure GDA0001547895240002271
在-78℃的温度下，把二异丁基氢化铝(40ml,40mmol,1.0M)慢慢加入到(S)-3-苯基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-丙酸甲酯(5.60g,20.05mmol)的CH2Cl2(80ml)溶液中，反应45分钟后，在该温度下加入用1-(1-乙氧羰基乙基)三苯基溴化膦(18.0g,40.64mmol)和KOtBu(5.00g,44.64mmol)的二氯甲烷(80ml)溶液所形成的叶立德溶液，待混合物在-78℃反应1小时后，室温下搅拌过夜，再往该混合物中加入1升的磷酸二氢钠溶液，剧烈搅拌，分液，水相用二氯甲烷萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/正己烷＝1:7-1:5)得到目标产物(5.50g,83％)，ESI:m/z:[M+Na]+，离子峰：C19H27NNaO4,356.19,实验值，356.20.
实施例354.多肽缩合的一般步骤
将胺的盐酸盐溶解在二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺(0.2M)中，冷至4℃，依次加入叔丁氧基羰基保护的氨基酸(1.3eq)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2eq)，或O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(2eq)，或三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(2eq)，1-羟基苯并***(1.5eq)，N,N-二异丙基乙胺(3.5eq)。将反应慢慢升至室温后继续反应15小时，用乙酸乙酯稀释，紧接着依次用1M盐酸水溶液，饱和碳酸氢钠，水和饱和氯化钠水溶液洗涤。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(0％-20％MeOH:CH2Cl2)得叔丁氧基羰基保护的多肽。
实施例355.脱叔丁氧基羰基的一般步骤
将叔丁氧基羰基保护的氨基酸溶解于含20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液或含4M盐酸的1，4-二氧六环溶液中，搅拌30分钟，或通过TLC跟踪来判断反应是否完全。减压浓缩得相应的三氟乙酸盐或盐酸盐多肽化合物。含三氟乙酸盐的多肽可以用含2％盐酸的二氯甲烷/甲苯溶液浓缩3-4次以便形成对应的盐酸盐化合物。
实施例356.固相肽合成(SPPS)的一般步骤
叔丁氧基羰基保护的SPPS使用的是Merrifield树脂或改性PAM树脂或MBHA树脂。9-芴甲氧羰基保护的SPPS使用的是Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂，或HMPB，MBHA树脂。根据树脂生产商的操作指南，对树脂进行前处理(预膨胀)和氨基化合物的装载。树脂上用叔丁氧基羰基保护的氨基酸用20％三氟乙酸的二氯甲烷溶液或含4M盐酸的1，4-二氧六环溶液去保护(搅拌30分钟即可)，然后依次用N,N-二甲基甲酰胺，甲醇，含50％N,N-二异丙基乙胺的二氯甲烷和纯二氯甲烷洗涤，对于涉及多个游离胺的去保护步骤，为确保反应的完全，这个步骤在酰化之前需要再重复一次。将游离胺悬浮于由保护的氨基酸(游离胺的3当量)，O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯或三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(游离胺的3当量)和N,N-二异丙基乙胺(游离胺的5当量)组成的溶液中，混合反应4小时后，依次用N,N-二甲基甲酰胺，甲醇和二氯甲烷洗涤。对于涉及多个游离胺酰基化的反应，为确保反应的完全，在脱保护之前的偶合步骤需再重复一次。一般需重复这些步骤，直至合成所需的肽。
实施例357.从Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂中切肽的一般步骤
将结合了肽的Wang树脂与含有50％三氟乙酸的二氯甲烷和三异丙基硅烷(1-5％)混合，或将2-氯三苯甲基氯树脂结合的肽与含有1％三氟乙酸的二氯甲烷混合，混合2小时后过滤，依次用二氯甲烷(3x30ml)，甲醇(3x30ml)洗脱，合并滤液，浓缩，干燥后加入冷的***，所得沉淀即为去保护的肽。
实施例358.从Merrifield树脂，改性PAM树脂或MBHA树脂中切肽的一般步骤
将结合了肽的树脂与HF/Me2S/anisole(10:1:1)或CH3SO3H/Me2S/anisole(20:1:1)混合(对于含有半胱氨酸的肽来说，应与HF/anisole/Me2S/p-thiocresol(10:1:1:0.2)混合)，2小时后，在氮气保护下浓缩，再用三氟乙酸稀释，过滤。然后依次用二氯甲烷(3x30ml)和甲醇(3x30ml)洗脱树脂，合并滤液，浓缩，干燥后加入冷的***，所得沉淀即为去保护的肽。
实施例359.色谱纯化
将粗产物多肽混合物通过硅胶柱层析纯化(5％到25％的甲醇：二氯甲烷洗脱)或反相HPLC纯化(0％到70％甲醇水溶液梯度洗脱(最好添加1％乙酸)，反应1小时内结束，后混合目标组分，蒸发后收集样品。
实施例360.共轭体(偶联物)制备
抗体，作为一类结合分子，可通过酰胺、硫醚或二硫键与***抑制剂偶联。用含50mM硼酸钠的PBS缓冲液(pH8.0)稀释抗体(>5mg/mL),加入二硫苏糖醇(终浓度为10mM)，35℃处理30分钟，抗体可释放自由巯基。用G-25柱凝胶过滤层析(PBS缓冲液中添加1mM EDTA)后，通过Ellman试剂[5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)]测定，每个抗体上大约偶联8个巯基。抗体与Traut's试剂(2-亚氨基噻吩)(Jue,R.,et al.Biochem.1978,17(25):5399-5405)也可释放巯基，或在pH7～8条件下，与SATP(N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代丙酸盐)或N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基(硫代四乙二酸)(SAT(PEG)4)等不同的连接物反应，后经羟胺作用，形成巯基(Duncan,R,et al,Anal.Biochem.1983,132,68-73,Fuji,N.et al,Chem.Pharm.Bull.1985,33,362-367)。基本上，每个抗体分子上连接5～8个巯基分子。
4℃条件下，向冰冷的含有自由巯基的抗体的二甲基乙酰胺(DMA)(2～20％v/v)中加入含有马来酰亚胺或溴乙酰胺基团(需0.5M的硼酸钠溶液(pH 9)促成抗体与溴乙酰胺的烷基化)的药物(连接的药物与巯基的摩尔比应为1.2～1.5：1)。1～2小时后，添加过量半胱氨酸使反应终止；通过超滤、凝胶层析(G-25，缓冲液为PBS)、无菌过滤后得到浓缩的偶联产物。通过测定280nm和252nm处的吸光度测定蛋白浓度和每个抗体所连接的药物个数。分子排阻HPLC可用来测定连接物的单体形式所占的比重，而低于0.5％的未结合的药物可用RP-HPLC用来测定。对于硫醚键连接形成的单体药物而言，每个抗体分子平均会连接3.2-4.2个有丝***抑制剂的小分子。
连接接头的种类可分为二甲基(苯基)甲硅烷基(DMPS),SMDP,4-琥珀酰亚胺基氧羰基-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT),N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶硫)戊酸酯(SPP),N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶硫)丙酸酯(SPDP),N-琥珀酰亚胺-4-(2-吡啶硫)丁酸酯(SPDB),琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧化酯(SMCC),N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺(SM(PEG)n)等。抗体(>5mg/mL)稀释于缓冲液(pH 6.5～7.5，5mM PBS,50mMNaCl,1mM EDTA)中，与链接反应2小时，而链接体与抗体的摩尔比为6～10倍以上。反应混合物可通过Sephadex G25凝胶层析分离，其分子量较低的分子会被除去。(抗体的浓度通过分光光度法测定，连接物包含吡啶硫基。抗体在280nm处的消光系数为2067550M-1cm-1。修饰的抗体用过量的二硫苏糖醇(20倍以上当量)处理后，测定释放的2-硫吡啶基团，在343、280nm处的消光系数分别为8080和5100M-1cm-1)。向修饰抗体中加入1.2～1.5当量带有巯基基团的Tubulysin衍生物分子。该反应在是室温下进行5～18小时。反应混合物通过Sephadex G25凝胶层析，除去未连接的药物或其他低分子量的物质。再通过测定280nm和252nm处的吸光度来测定连接产物的浓度。连接产物是单体形式，平均每个抗体分子连接3.2～4.5个药物分子。
实施例361.含有可同巯基基团反应的Tubulysin衍生物分子共轭物的一般制备方法。
在2.0毫升10毫克/毫升pH值为6.0～8.0的HER2抗体的溶液中，加入0.70ml～2.0ml 100mM磷酸(PBS),pH值为6.5～8.5缓冲液，TCEP(16-20μl，20mM的水溶液)，室温下～37.5℃孵育1～4小时，加入同当量的叠氮化合物(叠氮苯甲酸，或2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基叠氮化合物)室温～37.5℃下孵育1～4小时，随后加入含能同巯基基团反应的Tubulysin衍生物分子(28-32μl，20mM的DMA溶液)。混合物在室温～37.5℃下孵育4～18小时，然后DHAA(135μl，50毫米)加入。在RT隔夜连续培养后，混合物经G-25柱用100mM磷酸，50mM NaCl pH 6～7.5的缓冲溶液纯化得到共轭体化合物(75％～90％收率)。通过液相色谱-质谱法质谱测定药物/抗体比率(DAR)是3.1～4.2，HPLC分析为94～99％单体(TosohBioscience，Tskgel G3000SW柱子,内径7.8毫米x 30厘米，0.5毫升/分钟，100分钟)。
实施例362.体外毒性试验
BJAB(伯基特淋巴瘤细胞)，BT-474(乳腺癌细胞)，Namalwa(人伯基特淋巴瘤细胞)，Ramos(人伯基特淋巴瘤细胞)，N87(胃癌细胞)及SK-OV-3(卵巢癌细胞)，都购自ATCC。上述细胞都在含10％已灭活胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中生长，培养条件为37℃、6％CO2的培养箱中。克隆形成实验可作为毒性试验检测的一种方法，参见文献(Franken,etal,Nature Protocols 1,2315-2319(2006))。测试用的细胞按照每孔5000个细胞接种于6孔板中，加入1pM～50nM梯度稀释的药物(有丝***抑制剂或偶联物)，孵育72小时。替换旧有的培养基，细胞继续培养，7～10天后会有克隆形成。固定细胞，然后用0.2％结晶紫(稀释于10％***或PBS中)染色，计数细胞克隆。未处理的细胞(只加培养基)的数目可通过孔中形成的克隆数来测定。细胞的存活率是用药物处理后与对照组(药物未处理)孔中形成的克隆数的比值来计算。体外活性抑制N87(胃癌细胞)的IC50值列于下面表一中。
实施例363.体内抗肿瘤活性(balb/c/c裸鼠,NCI-N87移植瘤)。
在人胃癌N-87细胞系肿瘤xenograft模型中,her2抗体-Tubulysin类似物共轭体(偶连物)(其结构式列于表一中)分为3批次进行疗效对比实验。第一批次129、133、181、317、467；第二批次365、377、385、412、444、474、480、546；第三批次506、522、564、574、695、677。上述3批次药物分别同T-DM1和生理盐水(PBS))进行小鼠体内药效评价。五周老的女性balb/c/c裸鼠(三批次共150只动物)在右肩下的N-87癌细胞(5x 107细胞/小鼠)在无血清培养基中进行皮下注射。肿瘤生长8天,平均大小为130mm3。然后将这些动物随机分为组(每组6只动物)。每一组小鼠对照组用磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗。共轭体药物和T-DM1分别对动物静脉注射剂量6毫克/千克一次性给药。肿瘤的体积三维度每3-4天测量一次,肿瘤体积是用公式肿瘤容积＝1/2(长度x宽度x高度)计算的。同时也测量了动物的重量。当满足以下任一条件时,就会杀死动物:(1)体重的损失超过20％,(2)肿瘤体积大于2000mm3,(3)太病重不能自己进食物和饮水,或(4)皮肤坏死。如果没有明显的肿瘤,小鼠被认为是无肿瘤的。
实验结果绘在图60、61和62。所有的19共轭物并没有造成动物体重下降。其中共轭物133、129、317、467、365、377、385、412、444、474、480、506、522、564、574、677显示出较强的抗肿瘤疗效作用。尤其是共轭物133、129、467、377、385、412、444、474、480、677显示比T-DM1更好的抗肿瘤活性。
表1一些抗体-Tubulysin衍生物共轭体的结构式及其IC50值
Figure GDA0001547895240002311
Figure GDA0001547895240002321
Figure GDA0001547895240002331
Figure GDA0001547895240002341
Figure GDA0001547895240002351
Figure GDA0001547895240002361
Figure GDA0001547895240002371
Figure GDA0001547895240002381
Figure GDA0001547895240002391
Figure GDA0001547895240002401

Claims (9)

1.一种偶联物，其选自：
Figure FDA0003891152500000011
Figure FDA0003891152500000021
Figure FDA0003891152500000031
Figure FDA0003891152500000041
Figure FDA0003891152500000051
Figure FDA0003891152500000061
Figure FDA0003891152500000071
其中
n＝1～8；mAb是Her2单抗；
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其选自：
Figure FDA0003891152500000072
Figure FDA0003891152500000081
Figure FDA0003891152500000091
其中
n＝1～8；mAb是Her2单抗；
或其药学上可接受的盐。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1或2中所述的偶联物或其药学上可接受的盐，以及稀释剂或赋形剂。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其具有以下重量百分数的组成：
Figure FDA0003891152500000092
Figure FDA0003891152500000101
所述多醇化合物选自果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、山梨醇、甘油或葡萄糖酸及其金属盐中的一种或几种；
所述表面活性剂选自聚山梨酯，泊洛沙姆，Triton，十二烷基硫酸钠SDS，月桂硫酸盐钠，辛基糖苷钠，月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基(linoleyl)-、或硬脂基-磺基甜菜碱，月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-、或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、月桂酰胺丙基、椰油酰胺丙基(palmidopropyl)-、或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱，肉豆蔻酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基-二甲基胺，甲基椰油酰基牛磺酸钠或甲基油酰基牛磺酸二钠；月桂、肉豆蔻、亚油或硬脂-酸钠，亚油、肉豆蔻、十二烷基或十六烷基甜菜碱，甲基椰油钠，二甲基甲基牛磺酸钠，椰油两性甘氨酸，或异硬脂ethylimidonium ethosulfate，聚丙二醇、聚乙二醇、乙二醇、乙烯和丙烯的共聚物Pluronics F68；所述聚山梨酯为聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、或聚山梨酯85；所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷、泊洛沙姆407或聚乙二醇-聚丙二醇；
所述络合剂为EDTA或EGTA；
所述防腐剂选自苄醇，十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化胺、苯扎氯铵、苄索氯铵、丁苄醇、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、或间甲酚中的一种；
抗氧化剂为抗坏血酸和/或蛋氨酸；
所述氨基酸或支撑剂选自甘露醇、山梨醇、醋酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾，柠檬酸钠，或NaCl中的一种；
所述缓冲溶液选自柠檬酸、丁二酸、醋酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、Tris盐酸盐，酞酸或磷酸溶液中的一种；
所述组合物的pH值为4.5～8.0，所述组合物的药液渗透压为225至370摩斯摩尔。
5.权利要求4的药物组合物，其中所述组合物被制备成预装针剂，或灌装至西林瓶后冻干成分针，或通过高效喷雾干燥制备成粉末。
6.权利要求1或2所述的偶联物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
7.一种产品，其包含权利要求3-5中任一项所述的药物组合物与止痛剂的组合，其中所述止痛剂为1wt％的苯甲醇、0.2wt％～2.0wt％的盐酸普鲁卡因、0.2wt％～1.0wt％的盐酸利多卡因、0.3wt％～0.5wt％三氯叔丁醇、曲马多、***、硫酸***、氢***酮、羟氢可待酮、加巴喷丁、环苯扎林、曲唑酮或可乐定。
8.权利要求3-5中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
9.权利要求1或2所述的偶联物或其药学上可接受的盐或者权利要求3-5中任一项所述的药物组合物与协同剂的组合在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述协同剂选自以下一种或几种药物：阿巴西普，阿比特龙乙酸酯，白蛋白紫杉醇，对乙酰氨基酚/氢可酮，CAS号为1420477-60-6的阿卡拉不儒替尼，阿达木单抗，重组人白介素-2，阿法替尼二马来酸酯，艾乐替尼，阿仑单抗，阿利维A酸，CAS号为1018448-65-1爱都曲妥单抗美登素，安非他明或安非他明/右***混合盐，阿那曲唑，蒽环类抗生素，阿立哌唑，阿扎那韦，阿特珠单抗，阿托伐他汀，CAS号为1537032-82-8的阿威单抗，阿昔替尼，CAS号为866323-14-0的贝利司他，贝伐珠单抗，蓓萨罗丁，博纳吐单抗，硼替佐米，博舒替尼，本妥昔单抗，布加替尼，布***，布***/福莫特罗，丁丙诺啡，CAS号为183133-96-2的卡巴他赛，卡博替尼，卡培他滨，卡非佐米，嵌合抗原受体工程T的细胞，塞来昔布，赛立替尼，西妥昔单抗，环孢素，西那卡塞，克唑替尼，CAS号为934660-93-2的考比替尼，达比加群，达拉菲尼，达卡巴嗪，达珠单抗，达托霉素，CAS号为945721-28-8的德瑞单抗，达贝泊汀，CAS号为206361-99-1的地瑞那韦，甲磺酸伊马替尼，达沙替尼，CAS号为173146-27-5的地尼白介素-2，CAS号为615258-49-7的地诺单抗，双丙戊酸钠，***，CAS号为138530-94-6的右兰索拉唑，哌甲酯，CAS号为1363687-32-4的地努妥昔单抗，多西环素，度洛西汀，CAS号为1428935-60-7的德威单抗，CAS号为915296-00-3的依托珠单抗，替诺福韦/依法韦仑，依诺替尼，依泽替米贝，依泽替米贝/辛伐他汀，非诺贝特/非诺贝特/依诺替尼，芬戈莫德，丙酸氟替卡松，氟替卡松/沙美特罗，氟维司群，吉非替尼，格拉替雷，醋酸戈舍瑞林，伊曲替尼，伊马替尼，伊布替莫单抗，依鲁替尼，异环磷酰胺，英夫利昔单抗，依利替尼，门冬胰岛素，地特胰岛素，甘精胰岛素，赖脯胰岛素，干扰素β1a，干扰素β1b，拉帕替尼，易普利姆玛，异丙托溴铵，利那莫利，乐伐替尼，来曲唑，左旋甲状腺素，利多卡因，利奈唑胺，利拉鲁肽，CAS号为608137-33-3赖氨酸***，美金刚，哌醋甲酯，美托洛尔，***，莫米松，CAS号为906805-06-9的耐昔妥单抗，CAS号为698387-09-6的来那替尼，CAS号为641571-10-0的尼罗替尼,CAS号为1038915-60-4的尼拉帕尼,CAS号为946414-94-4的纳武单抗,奥法木单抗，奥帕珠单抗，奥美沙坦，奥沙利铂，氢***，奥马珠单抗，欧米伽-3脂肪酸乙酯，奥司他韦,CAS号为1421373-65-0的奥斯替尼，盐酸羟考酮，帕瑞单抗，帕珠单抗，帕洛单抗，帕唑帕尼，PD-1抗体，PD-L1抗体，聚乙二醇干扰素α-2a，CAS号为1374853-91-4的派姆单抗，培美曲塞，培妥珠单抗，肺炎球菌缀合物疫苗，泊马度胺，普瑞巴林，***，喹硫平，雷贝拉唑，镭223氯化物，雷洛昔芬，拉替拉韦，雷莫卢单抗，雷珠单抗，瑞格菲尼，利妥昔单抗，利伐沙班，罗米地辛，罗苏伐他汀，鲁索利替尼，沙丁胺醇，CAS号为1313725-88-0的萨沃利替尼，沃利替尼，索马鲁肽，司维拉姆，西地那非，CAS号为541502-14-1司妥昔单抗，西他列汀，西他列汀/二甲双胍，索利那新，索尼德吉，索拉非尼，舒尼替尼，他克莫司，替拉莫帕明，替莫唑胺，替西罗莫司，替诺福韦/恩曲他滨，睾酮凝胶，沙利度胺，噻托溴铵，托瑞米芬，曲美替尼，曲妥珠单抗，CAS号为114899-77-3的曲贝特酊，CAS号为183204-72-0的三氟胸苷/替匹扰西，维甲酸，优特克，缬沙坦，维利帕尼，凡德他尼，威罗菲尼，CAS号为1257044-40-8的外尼韬可莱斯，伏立诺他，阿普西柏，带状疱疹疫苗，及其药学上可接受的盐或赋形剂。
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