CN109906381B - 鉴别、靶向以及分离人树突细胞(dc)前体“前dc”的方法及其用途 - Google Patents

鉴别、靶向以及分离人树突细胞(dc)前体“前dc”的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

定义了用于检测和鉴别常规树突细胞(cDC)的前体(前DC)及其细胞子集(前cDC 1或前cDC 2)的生物标志物，其包括用于检测前DC的CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合。还公开了用于检测疾病或疾病状况、现有疾病或疾病状况的预后的方法，包括与对照相比，确定来自个体的样品中前DC细胞的数量，以及治疗患者的方法，包括施用针对CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合的抗体。另外，还公开了用于引发针对传染病或癌症的免疫原性组合物，所述组合物包含对靶疾病的一种或多种生物标志物或抗原和/或一种或多种选自早期前DC、前cDC 1和前cDC 2的细胞具有特异性的一种或多种结合分子。

Description

鉴别、靶向以及分离人树突细胞(DC)前体“前DC”的方法及其 用途
技术领域
本公开一般涉及用于鉴别、靶向和分离人树突细胞(DC)前体“前DC(pre-DC)”的方法及其在检测和治疗疾病中的用途。本公开提供了用于鉴别前DC和各种前DC子集(subset)的特异性标志物和所述标志物的组合。本公开还涉及对这些标志物或前DC及其子集具有特异性的结合分子的免疫原性组合物，以及它们在引发针对疾病和癌症的免疫应答中的用途。
背景技术
树突细胞(DC)是对免疫应答的启动和调节至关重要的专职病原体感知和抗原呈递细胞(1)。DC细胞是异质的，并且能够加工和呈递天然T细胞的抗原以启动特异性免疫应答。DC群体分为两个谱系：浆细胞样DC(pDC)和常规DC(cDC)，后者包括cDC1和cDC2亚群(2,3)。DC子集以逐步进展的方式起源于位于骨髓中的DC限制性祖细胞。共同的树突祖细胞定向发展为pDC谱系或cDC谱系。后者通过称为cDC前体(前DC)的中间体前体发生。
鼠DC起源于称为共同DC祖细胞(CDP)的独特DC限制性骨髓(BM)祖细胞，其分化成pDC和DC前体(前DC)并从BM迁移到外周组织中(4-6)。已经证明：(a)pDC培养物具有cDC潜能并获得cDC样形态(10,11)，如最近在小鼠BM pDC中观察到的(36)；(b)pDC通过产生IFNα和IL-12介导Th1免疫(10、37-41)；(c)pDC表现出天然T细胞同种异体刺激能力(30,39)；和(d)pDC表达共刺激分子并以IFNα分泌为代价表现出抗原呈递/交叉呈递能力(37,42)。
最近已经描述了鼠CDP和前DC的人等同物(8,9)。人前DC包含约0.001％的外周血单核细胞(PBMC)，并通过其表达在小鼠中标记并驱动DC分化的细胞因子受体来鉴定，包括CD117(c-Kit或肥大细胞/干细胞生长因子受体(SCF))、CD116(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GMCSF))、CD135(FMS样酪氨酸激酶3(FLT3))和CD123(IL3-Rα)(9)。以前的研究已经在人pDC群中观察到相似的受体表达模式，当用IL-3和CD40L刺激时，人pDC群可以分化成cDC样细胞(10,11)。因此，由于检测到细胞因子受体的表达，pDC是cDC的前体(11)，或者常规定义的pDC群并入了独立的前DC亚群而是异质的。
仔细分析产生DC亚群或子集的起源和分化途径对于理解它们的体内稳态和在免疫应答中的作用以及开发DC子集特异性治疗干预是必要的。
人pDC和前DC表达各种共同标志物，例如CD123、CD303、CD304和CD45RA。这些标志物通常用于鉴别pDC。因此，这些标志物也不能用于鉴别前DC或区分前DC与pDC。用于鉴别pDC的常规门控策略不足以区分人前DC和细胞群。而且，DC子集，包括前DC，具有不同的功能特化，因此一些子集也可能作为监测疾病进展的潜在生物标志物(例如，某个子集中细胞数量的变化可能表示具体炎症和/或感染的易感性)。
因此，需要提供用于检测、鉴别和分离人的早期前DC、前cDC1和/或前cDC2子集以克服或至少改善上述一个或多个缺点的手段。
需要提供用于检测、鉴别和分离人早期前DC子集、前cDC1子集和/或前cDC2子集，且能够清楚地将所述子集与DC的其他子集区分开或将所述子集彼此区分开的特异性生物标志物或所述生物标志物的组合，用于进一步的子集特异性研究或它们的用途。
还需要提供用于通过将治疗化合物靶向早期前DC子集、前cDC1子集和/或前cDC2子集以调节、扩增或消耗所述子集来调节疾病或改善接种的手段。
发明内容
根据第一方面，提供了检测常规树突细胞(cDC)前体(前DC)的方法，包括确定存在选自CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合的生物标志物。
有利的是，所述方法能够检测、鉴别和分选早期前DC、前cDC1和前cDC2，从而允许子集特异性的广泛潜在应用，这在本公开之前是不可能的。例如，它能够确定具体子集(例如细胞群大小的子集)与具体疾病之间的相关性。
根据第二方面，提供了检测疾病/疾病状况、现有疾病/疾病状况的预后，和/或确定个体发展疾病/疾病状况的可能性的方法，包括使用本文公开的方法测定个体的样品中前DC细胞的数量，并将测定的细胞数量与对照样品中前DC细胞数量进行比较，其中所述个体的样品中前DC细胞的数量比对照样品中前DC细胞的数量高，则表示个体存在疾病/疾病状况或发展所述疾病/疾病状况的可能性，其中前DC包括选自早期前DC、前cDC1、前cDC2及其组合的细胞，并且其中对照样品是选自以下的样品：在发展疾病/疾病状况之前从相同患者获得的样品和来自健康个体的样品。
据第三方面，提供了治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的方法，包括向所述患者施用选自抗CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合片段、抗CD271抗体或其抗原结合片段、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合的抗体。
有利的是，所述方法允许靶特异性治疗应用。
据第四方面，提供了抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的药物中的用途，其中所述抗体选自抗CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合片段、抗CD271抗体或其抗原结合片段、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合。
根据第五方面，提供了用于治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自抗CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合片段、抗CD271抗体或抗原组成的抗体、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合。
根据第六方面，提供了用于本文公开的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定存在一种或多种选自本文公开的生物标志物的生物标志物的试剂，并且其中所述试剂盒还任选地包括使用说明。
根据第七方面，提供了免疫原性组合物，包含：(a)一种或多种对本文定义的生物标志物具有特异性的结合分子，(b)靶疾病的抗原，和/或(c)一种或多种选自前DC、前cDC1和前cDC2的细胞。
根据第八方面，提供了在个体中引发针对传染病或癌症的免疫应答的方法，包括施用本文公开的免疫原性组合物。
根据第九方面，提供了检测样品中常规树突细胞(cDC)前体(前DC)的方法，其中：
(I)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)从所述样品中除去死细胞；
(ii)任选地分离具有特定大小，任选地直径7-10μm的细胞；
(iii)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(iv)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(v)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(vi)确定存在CD45RA和CD123生物标志物；和
(vii)确定存在CD169、CD327、CD271和/或CD324；
(II)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；和
(v)确定存在CD169、CD327、CD271和/或CD324；
(III)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；
(v)确定存在CD45RA生物标志物；
(vi)确定不存在CADM1生物标志物；和
(vii)确定存在CD123生物标志物和不存在CD1c生物标志物；
(IV)前DC包括前cDC1细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；和
(v)确定存在CADM1和CD45RA生物标志物；和
(V)前DC包括前cDC2细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；
(v)确定不存在CADM1生物标志物；和
(vi)确定存在CD1c和CD45RA生物标志物。
定义
本文所用的以下词语和术语应具有所示的含义：
术语“检测(detect)”及其所有语法变体如“检测(detecting)”可以指确定一种或多种生物标志物是否存在，量化一种或多种生物标志物，或量化一种或多种生物标志物的基因表达或蛋白质表达。检测生物标志物还能鉴别存在生物标志物的一种或多种细胞类型。
在检测诸如前DC等细胞的背景下，术语“不存在”(或其语法变体)可以指使用具体检测方法不能检测到细胞。例如，如果样品不含前DC，例如，95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含、99.9％不含或100％不含前DC，或通过所用的检测方法测量时检测不到，则可以认为样品中不存在前DC。或者，如果前DC的水平(例如前DC数量，或其一种或多种生物标志物的基因或蛋白质表达)低于先前测定的截止水平，则也可认为样品中“不存在”前DC。
在检测诸如前DC等细胞的背景下，术语“存在”可以指使用具体检测方法可以检测到细胞。例如，如果前DC的水平(例如前DC数量，或其一种或多种生物标志物的基因或蛋白质表达)高于先前测定的阈值水平，则可以认为样品中“存在”前DC。
术语“生物标志物”是指任何生物化合物，例如蛋白质及其片段、肽、多肽或其他生物材料，其存在、不存在、水平或活性与诸如细胞类型等特征相关或预测诸如细胞类型等特征。这类通过本公开的方法可检测的特异性生物标志物包括细胞表面蛋白。生物标志物可以例如通过抗体(或其抗原结合片段)或其他特异性结合蛋白识别。提到生物标志物还可以包括其同种型、前体形式(preform)、成熟形式、变体、其降解形式及其代谢物。
术语“标记(label)”是指直接或间接与另一分子缀合以促进该分子的检测的可检测的化合物或组合物。标记的具体非限制性实例包括荧光标记(例如荧光标签)、放射性标记(例如放射性同位素)、化学标记(例如化学发光标签)、酶标记、蛋白质标记、磁性标记和重金属。
术语“治疗”包括以任何方式补救疾病状态或症状、预防疾病建立或以其他方式预防、阻碍、延缓或逆转疾病或其他不期望症状的进展的任何和所有用途。因此，“治疗”包括预防性治疗和治疗性治疗。
术语“患者”是指人或其他哺乳动物患者，并且包括期望使用本公开的方法检查或治疗的任何个体。然而，应当理解“患者”并不意味着存在症状。落入本公开范围内的合适的非人哺乳动物包括但不限于灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、伴侣动物(如猫、狗)和圈养的野生动物(如狐狸、鹿、澳洲野狗)。
术语“施用(administering)”和该术语的变体，包括“施用(administer)”和“施用(administration)”，包括通过任何适当的方式使本发明的化合物或组合物接触生物体或表面，将其应用于生物体或表面，将其递送给生物体或表面或将其提供给生物体或表面。
当针对治疗例如“靶特异性治疗”使用时，术语“靶特异”是指，为了治疗需要治疗的患者，向所述患者施用能够结合具体生物靶标(例如本文公开的细胞的具体子集)，从而对患者产生所需的生物学或治疗效果的化合物，例如药物(诸如本公开鉴别的抗体)。
词语“基本上”不排除“完全”，例如从“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，可以从本公开的定义中省略“基本上”一词。
除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”和“包含(comprise)”及其语法变体旨在表示“开放”或“包括性”语言，使得它们包括所列举的元素但也允许包含额外的未列举的元素。
如本文所用，在制剂组分浓度的上下文中，术语“约”通常表示所述值的+/-5％，更通常为所述值的+/-4％，更通常所述值的+/-3％，更通常所述值的+/-2％，甚至更通常为所述值的+/-1％，甚至更通常所述值的+/-0.5％。
在整个本公开中，某些实施例可以以范围的形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，应当认为对诸如1-6等范围的描述具体公开了诸如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范围以及该范围内的个别数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
本文还广泛和上位地描述了某些实施方案。落入上位公开中的每个较窄类别和亚属群组也构成本公开的一部分。这包括实施方案的上位描述，附带条件或否定限制是从该上位描述中去除任何主题，无论本文是否具体列举了除去的材料。
具体实施方式
在第一方面，本公开涉及检测常规树突细胞(cDC)前体(前DC)的方法，包括(i)确定存在选自CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合的生物标志物。有利的是，本文公开的生物标志物和组合允许清楚地分离前DC、pDC和cDC子集，并因此随后分离所需细胞子集，用于所需应用或用途。在一个实例中，发现CD271(NGF-R)和CD324(E-钙粘蛋白)在血液前DC中高度表达，而pDC子集表达较少的这两种表面标志物(参见图31)。这能够从其他子集(例如以比前DC低的水平表达CD271和CD324的pDC)检测和鉴别前DC细胞。
生物标志物可以是CD169、CD327、AXL、CD271、CD324；CD169和CD327的组合；CD169和AXL的组合；CD169和CD271的组合；CD169和CD324的组合；CD327和AXL的组合；CD327和CD271的组合；CD327和CD324的组合；AXL和CD271的组合；AXL和CD324的组合；CD271和CD324的组合；CD169、CD327和AXL的组合；CD169、CD327和CD271的组合；CD169、CD327和CD324的组合；CD169、AXL和CD271的组合、CD169、AXL和CD324的组合；CD169、CD271和CD324的组合；CD327、AXL和CD271的组合；CD327、AXL和CD324的组合；CD327、CD271和CD324的组合；AXL、CD271和CD324的组合；CD169、CD327、AXL和CD271的组合；CD169、CD327、AXL和CD324的组合；CD169、CD327、CD271和CD324的组合；CD169、AXL、CD271和CD324的组合；CD327、AXL、CD271和CD324的组合；或CD169、CD327、AXL、CD271和CD324的组合。
在一个实施方案中，所述方法的步骤(i)包括确定存在CD169和AXL以检测前DC细胞群内的早期前DC细胞群。所述方法还可以包括在检测CD169和AXL以检测早期前DC细胞群之前(ii)确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CD5、CX3CR1、CD2及其组合的生物标志物；和(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16及其组合的生物标志物。下面的实施例描述了用于达到所需的早期前DC细胞群的各种门控步骤。
在另一个实施方案中，步骤(i)包括确定存在CD169，并且还包括确定存在细胞粘附分子1(CADM1)以检测前cDC1。所述方法还可以包括在检测CD169和CADM1以检测前cDC1之前确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物；和(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、CD1c及其组合的生物标志物。下面的实施例描述了用于获得所需早期前cDC1细胞群的各种门控步骤，例如在图28中。
在另一个实施方案中，步骤(i)包括确定存在CD327，并且还包括确定存在CD1c以检测前cDC2。所述方法还可以包括在检测CD327和CD1c以检测前cDC2之前(ii)确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物；和(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、CADM1及其组合的生物标志物。下面的实施例描述了用于获得所需早期前cDC2细胞群的各种门控步骤，例如在图28中。
在另一个实施方案中，本文公开的方法还包括测定任何一种或多种已经用本文所述方法检测到的生物标志物的表达水平，其中：
(I)(a)相对于对照，任何一种或多种选自CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合，或选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CD5、CX3CR1、CD2及其组合的生物标志物的表达增加，表明所述细胞是早期前DC；和/或
(b)相对于对照，任何一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16及其组合的生物标志物的表达水平降低(例如不表达或表达减少)，表明所述细胞是早期前DC；
或
(II)(a)相对于对照，任何一种或多种选自CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合，或选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物的表达水平增加，表明所述细胞是前cDC1；和/或
(b)相对于对照，任何一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、CD1c及其组合的生物标志物的表达水平降低(例如不表达或表达减少)，表明所述细胞是前cDC1；
或
(III)(a)相对于对照，任何一种或多种选自CD169、CD327、AXL、CD271、CD324及其组合，或选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物的表达水平增加，表明所述细胞是前cDC2；和/或
(b)相对于对照，任何一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、CADM1及其组合的生物标志物的表达水平降低(例如不表达或表达减少)，表明所述细胞是前cDC2；
其中对照包括存在的其他细胞群或不表达CD169、CD327、AXL、CD271和/或CD324的pDC群。其他细胞群可以是诸如cDC1和cDC2等细胞类型，并且可以由本领域技术人员适当地确定。可以使用本领域已知的方法，基于基因表达或蛋白质表达水平，确定生物标志物的表达，所述方法例如但不限于流式细胞术、荧光显微术、免疫印迹、RNA测序、基因阵列、质谱、质谱流式细胞技术(mass cytometry,Cy TOF)和PCR方法。
在一个实施方案中，所述方法还包括确定任何一种或多种生物标志物表达水平的变化，其中(a)与对照中任何一种或多种生物标志物的表达水平相比，任何一种或多种生物标志物表达水平的变化表明所述细胞是前DC、前cDC1或前-cDC2；(b)与对照中任何一种或多种生物标志物的表达水平相比，任何一种或多种生物标志物的表达水平没有变化表明所述细胞不是前DC、前cDC1或前cDC2，其中对照包括存在的其他细胞群或不表达CD169、CD327、AXL、CD271和/或CD234的pDC群。例如，变化可以是表达水平的显著增加或显著降低，而没有变化可以是表达水平的非显著增加或非显著降低，或者表达水平的增加或降低是不可检测的。
在一个实施方案中，本文公开的方法中的检测包括使疑似含有前DC的样品与一种或多种对本文所定义的生物标志物具有特异性的结合分子接触，所述前DC包括早期前DC、前cDC1和/或前cDC2细胞。结合分子的非限制性实例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段、适体和配体。术语“接触”是指本领域技术人员认为适合于本公开的任何类型的接触。关于本公开，接触可以指使样品与生物标记物物理结合。接触可以在体外、体内或离体发生。例如，在样品是流体样品(例如血液样品)的情况下，“接触”可以包括将结合分子的溶液与血液样品混合。例如，在样品是组织样品的情况下，则可以使用酶溶液消化组织，并将单细胞悬浮液与结合分子的溶液混合。
在一个实施方案中，所述方法还包括分离使用本文公开的方法检测到的前DC细胞的步骤。本领域已知的细胞分离技术的非限制性实例是细胞分选器、荧光纳米金刚石、磁珠和微流体。这些技术中的任何一种都可以用于本文公开的方法中以分离感兴趣的细胞子集。
结合分子可以与可检测标记偶联，例如但不限于荧光标记、放射性标记、化学标记、酶标记、蛋白质标记、磁性标记和重金属。
可以使用本领域所用的各种方法，例如流式细胞术来实现生物标志物的检测。用于检测生物标志物的其他非限制性实例是荧光显微术、RNA测序、基因阵列、质谱和质谱流式细胞技术(Cy TOF)。
可以应用本文公开的方法的示例性样品包括但不限于血液样品、组织样品、细胞样品和体液。
组织样品可包括骨髓、肺、脾、肝、心脏、骨、皮肤、脂肪组织、真皮、肠、膀胱、肌腱、韧带、肌肉、筋膜、神经组织、血管、肾、软骨，组织切片例如活组织检查样品和尸检样品、用于组织学目的而采集的冷冻切片，档案样品、外植体和源自患者组织和/或任何其他合适组织的原代和/或转化的细胞培养物。
可以应用上述方法的细胞样品包括外周血单核细胞。
体液可以是淋巴液、囊液、痰、粪便、泪液、粘液、腹水、囊液、尿液、***渗出物或***吸出物。本文公开的方法还可以应用于其他体液。
在一个实施方案中，样品来自人个体。当样品是对照样品时，人可以是健康的个体。人也可以是需要诊断或治疗的患者，例如，疑似患有或患有可以使用本文公开的方法检测或治疗的疾病/疾病状况的人。
在第二方面，提供了检测疾病/疾病状况、现有疾病/疾病状况预后，和/或确定个体发展疾病/疾病状况的可能性的方法，包括使用本文公开的方法测定个体的样品中前DC细胞的数量，并将测定的细胞数量与对照样品中前DC细胞的数量进行比较，其中所述个体的样品中前DC细胞的数量比所述对照样品中前DC细胞的数量高，则表明个体中存在疾病/疾病状况或发生疾病/疾病状况的可能性，其中前DC包括选自早期前DC、前cDC1、前cDC2及其组合的细胞。在所述方法旨在检测疾病/疾病状况或确定个体发展疾病/疾病状况的可能性的情况下，对照样品可以是从健康个体获得的样品。在所述方法用于现有疾病/疾病状况预后的情况下，对照样品可以是在较早时间点，例如在开始治疗之前从同一患者(其样品正在使用所述方法测试)获得的样品。在下文所述的一个实例中，在皮特霍普金斯综合症(PHS)的情况下，患者的血液pDC显示在血液中显著减少。然而，前DC没有减少(图2H和图13)。上述分析表明，与PHS(即TCF4突变)有关的遗传缺陷仅影响pDC而不影响前DC。因此，不同的效果表明pDC和前DC是独立的实体。
本文公开的方法可能有用的示例性疾病/疾病状况包括但不限于炎性疾病、肥胖(与炎性疾病和代谢性疾病二者都有关)、癌症、自身免疫疾病、传染病和代谢性疾病/疾病状况。例如，如下文所述，***性红斑狼疮(SLE，自身免疫疾病)的进展与患者血液中前DC增加相关。与无病灶皮肤样品相比，还观察到SLE患者病灶中前DC的存在增加。由于前DC可以是炎性细胞，因此较高数量的前DC可能是疾病严重性的促成因素。因此，前DC可用作检测自身免疫疾病进展或严重性的标志物。
炎性疾病可以选自扁平苔藓、特应性皮炎和牛皮癣，并且自身免疫疾病可以是***性红斑狼疮。如下所述，图38显示与健康个体相比，肥胖患者的前DC子集增加(是健康个体的2.8倍)和患有扁平苔藓的前DC子集增加(是健康个体的1.3倍)、特应性皮炎的前DC子集增加(是健康个体的1.4倍)和牛皮癣的前DC子集增加(是健康个体的2倍。
传染病可以选自HIV和奇卡病毒(Zika)等。已发现前DC子集能够增强天然CD4+T细胞的增殖。因此，前DC子集可以用作疫苗递送的靶标。例如，激活前DC子集的佐剂可用于增强对用于传染病疫苗(包括来自感染因子的抗原)或癌症疫苗的免疫应答。
在第三方面，提供了用于治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的方法，包括向所述患者施用选自抗CD169抗体的抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合片段、抗CD271抗体或其抗原结合片段、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合的抗体。
本文公开的方法可能有用的示例性疾病包括但不限于发病机理由前DC、早期前DC、前cDC1、前cDC2或其组合引起或驱动的疾病。在一个实施方案中，所述抗体的给药导致特定细胞子集耗尽。在一个实施方案中，耗尽早期前DC。在又一个实施方案中，耗尽前cDC1。在另一个实施方案中，耗尽前cDC2。在又一个实施方案中，耗尽前DC、早前DC、前cDC1和前cDC2中的两个或更多个或全部。如图34所示，前DC细胞对HIV-1感染敏感。因此，作为实例，可以使用本公开鉴别的前DC生物标志物来实现特异性降低感染的子集(在这种情况下，前DC子集)的靶特异性治疗。作为另一个实例，靶特异性治疗还可以是将具体治疗化合物或药物递送至例如细胞群的具体子集，已经证明，用抗CD169预处理诱导前DC的HIV-1感染降低，特别是对于X4病毒(见图36)。对于接种，抗原可以(i)特异性靶向作为传染病靶标的细胞群的子集，或(ii)将疫苗抗原递送至相关抗原呈递细胞(即前DC)以更有效地诱导免疫应答。靶特异性疗法的一般目的是耗尽、动员和/或调节具体细胞群。
在第四方面，提供了抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的药物中的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段选自抗CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合物片段、抗CD271抗体或其抗原结合片段、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合。
在第五方面，提供了用于治疗根据本文公开的方法确定患有疾病/疾病状况的患者的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段选自抗CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD327抗体或其抗原结合片段、抗AXL抗体或其抗原结合片段、抗-CD169抗体或其抗原结合片段、抗CD271抗体或其抗原结合片段、抗CD324抗体或其抗原结合片段及其组合。
在第六方面，提供了用于本文公开的方法中的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于确定存在一种或多种选自本文公开的生物标志物的生物标志物的试剂，并且其中所述试剂盒还任选地包括使用说明。试剂盒的其他组分可包括但不限于上文以抗体或其抗原结合片段形式描述的一种或多种生物标志物、一种或多种缓冲剂和一种或多种稀释剂。
在第七方面，提供了免疫原性组合物，包含：(a)一种或多种对本文公开的一种或多种生物标志物具有特异性的结合分子，(b)靶疾病的抗原和/或(c)一种或多种选自使用本文公开的方法检测的早期前DC、前0cDC1和前cDC2的细胞。靶疾病的实例包括但不限于传染病和癌症。在一个实施方案中，所述一种或多种结合分子选自抗体、抗体的抗原结合片段和配体。在另一个实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂、防腐剂、稳定剂、封装剂和/或药学上可接受的载体。可用的示例性佐剂包括但不限于(a)氢氧化铝，(b)磷酸铝，(c)γ菊粉，(d)algammulin(氢氧化铝和γ菊粉的组合)，(e)在油中的胆骨化醇，(f)在10mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中含有角鲨烯、吐温-80、Span-85的水包油乳液OWEM1，(f)在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中含角鲨烯、吐温-80、Span-85、α生育酚的水包油乳液OWEM2，和(g)在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中含有角鲨烯、吐温-80、Span-85、胆骨化醇的水包油乳液OWEM3等。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含：(a)针对前DC标志物、用于靶向前DC、前cDC1和/或pre-cDC2的结合分子(例如mAb、scFv、适体)，(b)衍生自感染因子或癌症、用于产生针对该疾病接种目的的免疫应答的特异性抗原，(c)佐剂，和/或(d)防止抗原在递送到前DC之前分散或降解的封装剂(例如脂质膜、壳聚糖颗粒、生物相容性聚合物)。
在第八方面，提供了在个体中引发针对传染病或癌症的免疫应答的方法，包括施用如上所述的免疫原性组合物。可以靶向的示例性传染病包括但不限于HIV、奇卡病毒、基孔肯雅热、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性出血热、痘病毒感染和蚊媒传播的脑炎病毒等。病毒性出血热的实例可以是但不限于登革热和埃博拉病毒(Ebola)等。在一个实施方案中，通过选自肌肉内给药、皮内给药、皮下给药、静脉内给药、口服给药和鼻内给药的途径施用免疫原性组合物。示例性癌症可以是急性和慢性白血病(例如急性淋巴性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性淋巴细胞白血病和慢性髓性白血病)、骨肿瘤(例如骨肉瘤)、所有类型的神经胶质瘤(例如少突神经胶质瘤和胶质母细胞瘤)、乳腺癌、结肠癌、肺癌、***癌和胃癌。
在第九方面，提供了检测样品中常规树突细胞(cDC)前体(前DC)的方法，其中：
(I)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)从样本中除去死细胞；
(ii)任选地分离具有特定大小，任选地直径7-10μm的细胞；
(iii)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(iv)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(v)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(vi)确定存在CD45RA和CD123生物标志物；和
(vii)确定存在CD169、CD327、CD271和/或CD324；
(II)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；和
(v)确定存在CD169、CD327、CD271和/或CD324；
(III)前DC包括早期前DC细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；
(v)确定存在CD45RA生物标志物；
(vi)确定不存在CADM1生物标志物；和
(vii)确定存在CD123生物标志物和不存在CD1c生物标志物；
(IV)前DC包括前cDC1细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；和
(v)确定存在CADM1和CD45RA生物标志物；
和
(V)前DC包括前cDC2细胞，所述方法按以下顺序包括下述步骤：
(i)确定存在CD45生物标志物和不存在CD34生物标志物；
(ii)确定不存在CD3/19/20/14和CD16生物标志物；
(iii)确定存在HLA-DR和CD123生物标志物；
(iv)确定存在CD45RA和CD33生物标志物；
(v)确定不存在CADM1生物标志物；和
(vi)确定存在CD1c和CD45RA生物标志物。
在上述方法的初始步骤中去除倾向于非特异性结合许多试剂的死细胞可以有利地提高检测的准确性。特异性分离特定大小的细胞的步骤还可以增加上述方法靶向所需群体的特异性。
附图说明
当结合非限制性示例和附图考虑时，参考具体实施方式会更好地理解本公开，其中：
图1.MARS-seq和CyTOF鉴别了稀有的CD123+CD33+推定的DC前体(前DC)。(A-E)使Lin(CD3/CD14/CD16/CD20/CD34)–HLA-DR+CD135+分选的PBMC执行MARS-seq。(A)710个细胞的t-随机邻域嵌入(tSNE)图满足所有质量标准，由通过tSNE加Seurat聚类识别的簇或由pDC、cDC1和cDC2的相对特征分数(signature score)着色。(B)连接性MAP(cMAP)分析显示了tSNE/Seurat簇中pDC或cDC特征基因(signature gene)的富集程度。(C)应用于tSNE/Seurat簇的Mpath分析定义其发育关系。通过(D)Monocle，(E)主成分分析(PCA)和(F)扩散图表示710个细胞，突出显示在(A)中鉴别的tSNE/Seurat簇。(G)tSNE/Seurat pDC簇、簇#4和cDC簇的Violin图显示pDC和Cdc特征基因的表达，在簇#4和pDC簇之间具有差异表达。通过Kruskal-Wallis检验，然后Dunn多重比较程序计算的调整的P值。(H、I)来自CD45+Lin(CD7/CD14/CD15/CD16/CD19/CD34)–HLA-DR+PBMC的CyTOF数据的tSNE图显示(H)门控限定CD123+CD33+细胞和DC子集，和(I)所选标志物的相对表达。(J)将(H)中限定的子集叠加在2D轮廓图上以进行表型比较。MARS-seq之前的门控策略如图6A所示。
图2.人前DC的表征。(A)PBMC和脾细胞悬浮液中前DC和pDC的流式细胞术鉴别。(B)血液前DC和DC子集表达CD303/CD304/CD123/CD11c。(C)脾(n＝3)和PBMC(n＝6)CD45+群中的前DC％。(D)分选的血液前DC和DC子集的Wright-Giemsa染色。(E)显示了在RER潴泡(cisterna)附近的前DC和pDC[(RER(箭头)，中心粒(C)和微管(小箭头)的电子显微照片。(F)将DC子集或前DC与MS-5饲养细胞、FLT3L、GM-CSF和SCF共培养5天。通过流式细胞术测量它们分化成cDC1或cDC2的能力(n＝3)。(G)来自对照个体(Ctrl，n＝11)和皮特霍普金斯综合征(PHS)患者(n＝4)的pDC和前DC的频率。P值由Mann-Whitney检验计算。误差棒表示平均值+/-SEM。
图3.定向的人前DC子集的鉴别。(A-B)92个Lin(CD3/14/16/19/20)–HLA-DR+CD33+CD123+细胞的单细胞mRNA测序(scmRNAseq)(图12A中的分选门控策略)。(A)细胞的连接性MAP(cMAP)富集分数(cDC1特异性特征相对cDC2特异性特征)。(B)Mpath分析显示了(A)限定的“未引发的”细胞、cDC1引发的细胞或cDC2引发的细胞之间的发育关系。(C)通过流式细胞术分析Lin–HLA-DR+CD33+PBMC，并将其显示为三个细胞簇(前DC、cDC1和cDC2)以及CADM1、CD1c和CD123相对表达的3D-PCA。(D)在同一个3D-PCA图中CD45RA、BTLA、CD327、CD141和CD5的相对表达。黑色虚线圆圈表示中间CD45RA+群体。(E)CD45RA/CD123斑点印迹显示了在3D-PCA图(左图版)中定义的叠加细胞子集和BTLA、CD327、CD141和CD5的相对表达。(F)在3D-PCA和CD45RA/CD123斑点印迹上叠加了Wanderlust维度(显示了从早期(暗)事件到晚期(清晰)事件的进程)。(G)从活CD45+Lin(CD3/14/16/19/20)–CD34–HLA-DR+PBMC开始门控策略，以定义CD33+CD45RA+cDC中的前DC子集。(H)将前DC子集与MS-5饲养细胞、FLT3L、GM-CSF和SCF共培养5天(n＝3)。通过流式细胞术分析它们分化成Clec9A+CADM1+cDC1(红色)或CD1c+CD11c+cDC2(米黄色)的能力。(I)前DC和DC子集的扫描电子显微术(比例尺：1μm)。
图4.DC和前DC子集基因表达分析。(A)使用差异表达的基因(DEG)通过3D PCA分析来自分选的DC和前DC子集(图3中所示)的微阵列数据。对于每个PCA维度(主成分，PC)，显示了由每个成分解释的方差。(B-D)在(B)早期前DC/pDC、(C)早期前DC/前cDC1/cDC1和(D)早期前DC/前cDC2/cDC2之间的DEG的热图。(E)随着从早期前DC谱系进展成成熟cDC，分别为cDC1和cDC2，由DEG分析比较鉴别的62个共同基因的表达谱。用log2倍数变化值(相对于早期前DC)绘制表达谱。(F)通过流式细胞术评估的DC和前DC子集的CD327(SIGLEC6)、CD22和AXL蛋白的表达水平。显示了平均荧光强度。(G)所选转录因子的表达谱。
图5.使用CyTOF进行DC个体发育的无监督作图。使用isoMAP降维分析来自骨髓(BM)和PBMC的CyTOF数据，以比较细胞群的总体表型相关性，并使用表型图算法(phenograph algorithm)自动细分成簇。(A、B)IsoMAP1-2图显示了(A)BM和(B)血液Lin(CD3/CD7/CD14/CD15/CD19/CD34)–HLA-DR+CD123+细胞中共同DC祖细胞(CDP)、pDC、前DC和cDC特异性标志物的表达水平。(C)Lin-HLA-DR+CD123hi BM和CD123+PBMC之间的表型关联，显示了BM中从CDP向pDC或前DC的进展，以及血液中pDC和前DC的明显分离。通过isoMAP进一步分析前DC表型图簇内的细胞(BM中的簇#1和#2，血液中的#6)和pDC表型图簇内的细胞(BM中的簇#3和#4，以及血液中的#7)，以定义前DC子集(左图版，和图23C和D)和pDC之间的异质性(右图版，和图23D和E)。
图6.(A)来自总Lin–HLA-DR+CD135+细胞的单细胞的FACS的门控策略。(B)MARS-seq单细胞数据分析的工作流程。(C)分子计数和细胞之间的关联。从独特分子标识符(UMI)或分子计数的最高到最低数进行分类细胞ID。数据显示在log10轴上。这三条线对应于每个细胞的分子计数650(B)、1,050(R)和1,700(G)。灰色区域表示每个细胞的分子计数范围为400-1,200UMI。从分析中除去具有<1,050个分子的细胞(n＝1,786个细胞)。总共710个高质量细胞用于进一步的下游分析。(D)密度图(上图版)表示具有一定数量分子的细胞的分布，以及密度函数的第一(中间图版)和第二导数(下图版)。所述三条线对应于每个细胞650(B)、1,050(R)和1,700(G)的分子计数。(E)在不同归一化阈值下模拟后的主成分分析(PCA)。根据不同的运行对点进行着色。(F)run2(y轴)中基因的平均表达与run1(x轴)中基因的平均表达的相关图。数据显示在log10轴上。皮尔逊相关系数为0.99。(G)通过运行关联着色的710个单细胞的t-分布随机邻域嵌入(tSNE)分析显示了tSNE图内细胞的均匀分布。线代表点的线性拟合。沿着tSNE成分1和成分2的点的分布分别表示为顶部图版或右侧图板中的密度图。(H)run1和run2的五个确定的簇中的细胞的频率。(I)平均变异性图显示了每个基因的平均表达和分散。该分析用于测定高度可变的基因表达(用基因符号标记)。36个高度可变的基因用于通过PCA进行单细胞数据的降维。(J)显示了来自710个高质量细胞的PCA的第一和第二主成分(PC1和PC2)中的最高基因负荷。
图7.(A)图1C中定义的Mpath簇中pDC(TCF4)、cDC1(CADM1)和cDC2(CD1D)的特征基因的相对表达。(B)图1C所示的Mpath分析的加权邻域网络。(C)使用Wishbone算法分析MARS-seq数据。在2D-t-分布随机邻域嵌入(tSNE)图(上图版)和3D扩散图(下图版)中(分别参见图1A和F)，细胞根据Wishbone轨迹的值(左图版)或Wishbone分支的值(右图版)对细胞进行着色。沿着Wishbone轨迹的折线图(右上图版)的特征基因表达。X轴表示Wishbone轨迹的伪时间。实线表示主干轨迹，虚线表示沿两个分支的单独轨迹。在两个分支上沿着Wishbone轨迹的特征基因表达的热图(右下图版)。
图8.(A)来自CyTOF分析的CD45+Lin(CD7/CD14/CD15/CD16/CD19/CD34)–HLA-DR+血液单核细胞的门控策略，用于如图1E到G所示的下游t分布随机邻域嵌入(tSNE)。在每个相应的2D图中显示了被排除的群的名称。(B)来自图1H到J的CyTOF数据的tSNE图显示了cDC2、cDC1和pDC特异性标志物的表达水平。(C)无监督的表型图聚类鉴别了10个叠加在来自图1H和图1I的CyTOF数据的tSNE1/2图上的簇。
图9.(A)鉴别图2A中显示的Lin–HLA-DR+细胞群的流式细胞术数据的门控(显示的血液数据)。(B)来自图1的CyTOF数据的经典等高线图显示了与图2A中所示的流式细胞术分析中应用的相同的门控策略。(C)流式细胞术数据显示了血液(上图版)和脾脏(下图版)中图2A定义的前DC、pDC、cDC1和cDC2的CD33、CX3CR1、CD2、CD141、CD11c、CD135、CD1c和CADM1的相对表达。(D)脾(左)和血液(右)中，图2A定义的总Lin–CD34–HLA-DR+CD33+cDC中，前DC、cDC1和cDC2的比例的环形图示。(E)代表性电子显微照片显示了前DC的形态特征。(F)来自如图2F所述的体外分化测定的CD123+CD172α-细胞、Clec9A+CADM1+cDC1或CD172α+CD1c+cDC2的平均相对数的直方图(n＝4)。误差棒代表平均值±SEM。
图10.用于体外分化测定中所用的DC子集和前DC的荧光激活细胞分选的门控策略(图2F)。(A)预先分选的数据和B-D。(B)前DC、(C)cDC1、(D)cDC2和(E)pDC的分选后再分析。
图11.(A)-(C)比较了(A)Breton等(9)人的门控策略(前DC以绿色表示)与(B)图2A和图9A所用的门控策略(前DC以紫色表示)，以定义前DC。斑点印迹显示了活CD45+外周血单核细胞中使用两种门控策略定义的前DC的相对数量。(C)用图表示活CD45+血液单核细胞中使用两种门控策略定义的前DC的中值相对数(n＝4)。显示了CD45+值的中值百分比。使用Mann-Whitney检验计算P值。(D)直方图显示了通过流式细胞术测定的DC子集和前DC的CD117的表达。(E)-(F)鉴别Lin–HLA-DR+(E)ILT3+ILT1–细胞(10)或ILT3+ILT1+(cDC)和(F)CD4+CD11c–细胞(11)或CD4intCD11c+cDC中的前DC(紫色门控)、cDC1(红色门控)和cDC2(米色门控)。
图12.鉴别Lin-HLA-DR+CD303+CD2+细胞中的CD33+CX3CR1+前DC(33)。
图13.对照个体(Ctrl，n＝11)和患有皮特霍普金斯综合征患者(PHS；n＝4)的外周血单核细胞的荧光激活细胞分选分析的门控策略。在Lin-HLA-DR+CD45RA+CD123+细胞中定义pDC(以蓝色圈出)和前DC(以紫色圈出)。
图14.(A)用于通过C1单细胞mRNA测序(scmRNAseq)分析的Lin-HLA-DR+CD33+CD45RA+CD1clo/-CD2+CADM1lo/-CD123+前DC的FACS的门控策略。(B)质量控制(去除低质量细胞和低于准确检测限度的低表达基因；使用SINGuLAR工具箱鉴别低质量细胞；在<95％的细胞中，每百万转录本数(TPM)的值≥1的最低表达基因的)和(C)图3A-B所示的C1scmRNAseq分析的工作流程。误差线表示最大值、第三四分位数、中位数、第一四分位数和最小值。
图15.图3B中定义的Mpath簇中cDC1的特征基因(BTLA、THBD和LY75)和cDC2的特征基因(CD2、SIRPA和ITGAX)的特征基因的相对表达水平。
图16.(A)显示了来自图3C和图3D的3D-主成分分析(PCA)图中标志物的表达水平。(B)流式细胞术数据的顺序门控策略从活CD45+Lin(CD3/14/16/19/20)-CD34–HLA-DR+外周血单核细胞开始，定义CD33–CD123+CD303+pDC、CD33+CD45RA–分化的cDC(CADM1+cDC1、CD1c+cDC2)和CD33+CD45RA+细胞(包括CD123+CD45RA+前-DC和CD123loCD45RA+中间细胞)。(C)上述前DC子集的脾(n＝3)(左)和外周血(n＝6)(右)中CD45+单核细胞的比例。(D)图3H所述的体外分化测定中获得的CD303+CD172α–细胞、Clec9A+CADM1+cDC1或CD1c+CD11c+cDC2的平均比例的直方图(n＝3)。误差棒表示平均值±SEM。
图17.用于分选体外分化测定所用的前DC子集(图3G)的门控策略。(A)预先分选的数据和B-D显示了(B)前早期DC、(C)前cDC1和(D)前cDC2的分选后再分析。
图18.(A)按照侧向散射区域(SSC-A)的平均荧光强度(MFI)的表达水平表示来自五个单个人供体的血液前DC和DC子集的细胞粒度(n＝5)。误差棒表示平均值±SEM。B-C为流式细胞术数据显示了图3G和图16B中定义的Pdc、早期前DC、前cDC2、cDC2、前cDC1和cDC1对以下的相对表达：(B)CD45RA、CD169、CD11c、CD123、CD33、FcεRI、CD2、Clec9A、CD319、CD141、BTLA、CD327、CD26、CD1c、CD304，或(C)IRF4和IRF8。
图19.2D图显示了使用来自图4的微阵列分析的差异表达基因的主成分分析成分1、2或3(PC1-3)的组合。
图20.所有差异表达基因相对表达水平的热图，和来自图4的微阵列分析的早期前DC(盒内黄色区域)和前cDC1(盒内绿色区域)中的特定基因放大图。
图21.维恩图(Venn diagram)显示了cDC1DEGs(来自比较前cDC1与早期前DC的DEG和比较cDC1与前cDC1的DEG的合并)和cDC2DEGs(来自比较前cDC2与早期前DC和比较cDC2与前cDC2的DEG的合并)的列表之间的共同基因。然后以log2倍数变化值(相对于早期前DC)，将这62个基因绘制在图4E中。
图22.a-c。基于在(a)cDC和早期前DC或(b)pDC和早期前DC之间差异表达的基因的Ingenuity Pathway分析(Ingenuity Pathway analysis,IPA)。仅显示了DC生物学相关途径，并且所有显示的途径都显著富集(P<0.05，右尾费舍尔精确检验(right-tailedFischer’s Exact Test))。棒的高度对应于通路的激活z分数。预测在早期前DC途径中更活化的富集途径以粉红色显示，并且预测在cDC或pDC中更活化的富集途径分别以橙色和蓝色显示。IPA基于文献对所述途径的了解(the Ingenuity Knowledge Base)与用户数据中观察到的定向表达之间的相关性预测途径激活/抑制。有关激活z分数计算的完整说明，请参阅IPA Upstream Regulator Analysis Whitepaper和IPA Downstream EffectorsAnalysis Whitepaper。(c)早期前DC和pDC中差异表达基因(DEG)的基因本体论(GO)富集分析显示了显著富集的生物过程(Benjamini-Hochberg调整的p值<0.05)，与pDC相比，基因在早期前DC中表达更丰富。注意，在与早期前DC相比基因在pDC中表达更丰富的情况下，没有生物过程显著富集。
图23.(a)显示了骨髓(BM)Lin(CD3/CD7/CD14/CD15/CD19/CD34)-CD123hi细胞的isoMAP1-2图(上图版)和沿isoMAP1维度定义的细胞表型进展的决定性标志物的分级中值表达图(下图版)。(b)isoMAP1-2-3 3D图中所选标志物的表达水平(图5C，左下图版)对应于血液Lin-CD123+细胞isoMAP分析的前DC表型图簇(#1和#2)中的细胞。(c)isoMAP1-2图中所选标记物的表达水平(图5C，左上图)对应于BM Lin-CD123hi细胞isoMAP分析的前DC表型图簇(#3和#4)内的细胞。(d)使用isoMAP方法输出并分析分别在图5A和5B的BM Lin-CD123hi(绿色：表型图簇#3和#4)或血液Lin-CD123+(红色：表型图簇#7)细胞中定义的pDC，并使用表型图算法细分为簇。显示了BM和血液串接(黑色)和叠加的BM(绿色)和血液(红色)isoMAP1/3图(左图版)。isoMAP1/3图中BM(左)和血液(右)pDC中CD2的表达水平。(e)图5C的BM和血液串接的isoMAP1/3图中所选标志物的表达水平(右图版)。
图24.随着前DC向cDC分化，主要前DC、cDC1和cDC2标志物的表达的示意图。
图25.随着前DC向cDC分化，主要前DC、cDC1和cDC2标志物的表达的示意图。
图26.用于识别人前DC和pDC和cDC子集的标志物和门控策略。
图27.通过11色流动面板识别大量前DC。
图28.如果包括死细胞排除染料，通过12色鉴别大量前DC。
图29.前DC和DC子集上的AXL和CD5表达。
图30.前DC和DC子集上的AXL和CD169表达。
图31.标记物CD169、CD271、CD324和CD327在不同细胞类型中的表达。
图32.人血液DC和前DC子集上的AXL(奇卡病毒受体)染色。
图33.PBMC的体外感染以及DC和前DC中的奇卡病毒的细胞内检测。
图34.前DC对R5和X4热带病毒的HIV-1感染敏感。
图35.前DC和DC的HIV-1感染。
图36.抗CD169预处理诱导前DC的HIV-1感染减少，特别是对于X4病毒而言。
图37.感染的前DC的HIV-1传播。
图38.循环的前DC的比例在炎症条件下增加，包括自身免疫疾病、癌症和传染病。
图39.前DC也表达CD5。
图40.与其他细胞类型相比，血液前DC表现出CD169和CD327的最高表达。
表
表1.在总DC MARS-seq实验中每个细胞检测到的基因数量。
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表2.来源于Gene Expression Omnibus数据系列GSE35457，并用于MARS-seq和C1数据分析的DC子集特征基因。
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表3.用于质谱流式细胞技术(CyTOF)的抗人抗体的列表
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表4.在前DC C1 scmRNAseq实验中每个细胞的检测到的表达基因数量。
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表5.随着从早期前DC谱系进展为成熟cDC，分别为cDC1和cDC2根据微阵列DEG分析鉴别的基因列表，以及62个共同基因的列表。
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表6.流式细胞术所用的抗人抗体列表
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实施例
通过参考具体实施例会更详细地进一步描述本公开的非限制性实施例，包括最佳模式和比较实施例，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
实施例1–方法
血液、骨髓和脾样品
根据来自Singapore SingHealth and National Health Care Group ResearchEthics Committees的起促进作用的伦理观点获得人样品。根据National University ofSingapore Institutional Review Board(新加坡国立大学机构审查委员会)和SingHealth Centralised Institutional Review Board批准的程序，从所有捐赠者处获得书面知情同意书。通过对利用健康科学机构(HAS,Singapore)从志愿者供体获得的单采残留物样品进行密度梯度离心，分离外周血单核细胞(PBMC)。从4名患有分子证实的皮特霍普金斯综合征(PHS)的患者获得血液样品，所述患者都显示出经典表型(44)。从患有远端胰腺切除术的胰腺肿瘤患者(Singapore General Hospital,Singapore(新加坡综合医院，新加坡))获得脾组织。如前所述处理脾组织(20)。骨髓单核细胞购自Lonza。
利用MARS-seq产生单细胞转录物组
如前所述(15)，使用Biomek FXP***(Beckman Coulter)执行MARS-Seq，用于进行人外周血DC区室的scmRNAseq。简而言之，将谱系标志物(Lin)(CD3/14/16/19/20/34)-CD45+CD135+HLA-DR+CD123+CD33+单细胞分选到384孔板的各个孔中，所述孔填充了2μl裂解缓冲液(在分子生物学级H2O(Sigma Aldrich)中的0.2％Triton(Sigma Aldrich))，补充有0.4U/μl蛋白质基RNA酶制剂(Takara Bio Inc.)，并使用400nM IDT进行条形码化。关于用poly-T引物进行条形码程序的详细信息先前已有描述(15)。将样品在80℃预孵育3min(分钟)，向每个孔中加入每个细胞1:80*107的稀释度的逆转录酶混合物，所述逆转录酶混合物由10mM DTT(Invitrogen)、4mM dNTPs(NEB)、2.5U/μl于50mM Tris-HCl(pH8.3；Sigma)中的SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)、75mM KCl(Sigma)、3mM MgCl2(Sigma)、ERCC RNA Spike-In混合物(Life Technologies)组成。将mRNA用在42℃下2min，在50℃下50min，和在85℃下5min的一个循环逆转录为cDNA：。用ExoI(NEB)在37℃下将过量引物消化30min，然后在80℃下消化10min，然后使用SPRIselect珠(Beckman Coulter)以1.2x比例进行清理。合并样品，并使用Second Strand Synthesis试剂盒(NEB)在16℃合成第二链，持续2.5h(小时)，然后使用SPRIselect珠(Beckman Coulter)以1.4倍比例进行清理。使用T7High Yield RNA聚合酶IVT试剂盒(NEB)在37℃下通过T7-启动子引导的体外转录将样品线性扩增12h。用Turbo DNA酶I(Ambion)在37℃将DNA模板消化15min，然后使用SPRIselect珠子(Beckman Coulter)以1.2x的比例进行清理。然后将RNA在Zn2+RNAFragmentation Solution(片段化溶液)(Ambion)中在70℃下片段化1.5min，然后使用SPRIselect珠粒(Beckman Coulter)以2.0x的比例进行清理。然后在22℃下，在50mM TrisHCl pH7.5(Sigma Aldrich)、10mM MgCl2和1mM DTT中，将带条形码的ssDNA衔接子(IDT；条形码详情参见(15))与9.5％DMSO(Sigma Aldrich)、1mM ATP、20％PEG8000和1U/μl T4RNA连接酶I(NEB)溶液中的片段化RNA连接，持续2小时。然后使用Affinity Script ReverseTranscription缓冲液、10mM DTT、4mM dNTP、2.5U/μl Affinity Script ReverseTranscriptase(Agilent)进行第二次逆转录反应，持续一个循环：在42℃下2min，在50℃下45min，在85℃下5min，然后在SPRIselect珠(Beckman Coulter)上以1.5x的比例进行清理。使用0.5μM的每种Illumina引物(IDT；引物的详情参见(15))和KAPA HiFi HotStart ReadyMix(Kapa Biosystems)，根据制造商的方案，通过随后的巢式PCR反应，进行15个循环，产生最终的文库，然后使用SPRIselect珠(Beckman Coulter)以0.7x的比例进行最后的清理。使用Agilent 2200TapeStation仪器(Agilent)评估所得文库的质量和数量，并使用IlluminaHiSeq1500仪器对文库进行下一代测序(PE索引；read1：61个读数(3个读取随机核苷酸，4个读取池条形码，53个读取序列)，read2：13个读数(6个读取细胞条形码，6个读取独特的分子标识)。MARS-seq单细胞转录物组数据的预处理、质量评估和控制
从测序的数据池条形码中提取细胞特异性标签和独特分子标识符(UMI)(2,496个测序的细胞)。使用Bowtie1序列分析软件(48)，参数为“-M 1-t--best--chunkmbs 64–strata”，消除具有模糊板和/或细胞特异性标签的测序读数、低质量的UMI序列(Phred<27)或定位于E.coli的读取。使用来自fastx_toolkit的fastx_barcode_splitter对Fastq文件进行解复用，并使用Bowtie“-m 1-t--best--chunkmbs 64–strata”，将R1读数(修剪合并的条形码序列)定位于人hg38+ERCC伪基因组组装。然后，如果有效读取定位于源自Ensembl(46)提供的BiomaRt HG38数据挖掘工具的基于外显子的基因模型，则使用UMI计算有效读数。然后产生含有每个细胞和基因的UMI数量的基因表达矩阵。另外，如前所述(15)，校正和过滤UMI和细胞条形码误差。
MARS-seq单细胞转录物组数据的归一化和过滤
为了解释每个细胞的总分子计数的差异，如几项研究(15,47)所建议的那样进行下采样归一化。在这里，将每个细胞随机下采样到每个细胞1,050个独特分子的分子计数(下文讨论阈值详情)。从分析中排除分子计数<1,050的细胞(表1：每个细胞检测到的基因数)。另外，从分析中去除线粒体基因与内源基因之比超过0.2的细胞和具有<90个独特基因的细胞。在Seurat分析(48)之前，过滤表达表以排除线粒体基因和核糖体基因以去除噪音。
MARS-seq单细胞转录物组数据分析
使用Mpath(22)、PCA、tSNE、连接性MAP(cMAP)(21)和Seurat单细胞分析程序包的几个函数(function)分析归一化和过滤的单细胞基因表达数据(在最终表达表中所用的710个单细胞转录组中的8,657个基因)。使用来自基因表达的omnibu数据系列GSE35457(20)的pDC和cDC之间的DEG进行cMAP分析。对于单个细胞，cMAP产生的富集分数将富集(或“接近”)程度量化至给定基因特征(gene signature)。将富集分数进行缩放并分配正值或负值以分别指示pDC或cDC特征基因的富集。对每个富集分数进行基因特征之间的排列检验(n＝1,000)以确定统计学显著性。对于tSNE/Seurat分析，使用Seurat过滤器，以包括在至少一个细胞中检测到的基因(分子计数＝1)，并排除具有<90个独特基因的细胞。为了推断单细胞基因表达数据的结构，对确定为超过0.75的分散阈值的基因的高变基因执行PCA。前两个主成分用于执行tSNE，其与DBSCAN聚类算法(19)组合以鉴别具有相似表达谱的细胞。通过将10设置为可到达点的最小数并且将4.1设置为可到达的ε邻域参数(epsilonneighbourhood parameter)来执行DBSCAN；后者是使用集成在DBSCAN R程序包中的KNN图(49)(https://cran.r-project.org/web/packages/dbscan/)测定的。使用可达点的默认最小数时，聚类不会改变。
为了给簇做注释，从Gene Expression Omnibus数据系列GSE35457(20)(表2：特征基因列表，下面描述了数据处理)导出血液pDC、cDC1和cDC2的基因特征，以计算细胞类型特异性基因特征的特征基因表达分数，然后将这些特征分数叠加到tSNE图上。将来自高达四个供体(I、II、V和VI)血液的CD141+(cDC1)、CD1c+(cDC2)DC和pDC样品的原始表达数据输入
Figure BDA0002039650330000571
软件，版本6.6/>
Figure BDA0002039650330000572
2017(PGS)，在那里对其进行进一步处理。对数据进行分位数归一化和log2转化，并使用PGS对供体进行批次校正。由每种细胞类型与剩余细胞类型的三次比较的归一化数据(ANOVA,Fold-Change≥2和FDR-adj。p-值<0.05)计算差异探针表达。将三个差异表达(DE)的探针列表相交，并且仅将特异性表达的探针用于细胞类型特异性基因特征。然后通过保持在整个数据集中具有最高平均表达的相应基因的探针，将探针还原为单个基因。所得的血液pDC、CD1c+和CD141+DC的基因特征分别包含725、457和368个基因。将特征基因表达分数计算为簇中所有特征基因的平均表达。为了避免由异常值引起的偏差，我们计算了截尾均值(trim＝0.08)。
使用Monocle v.2.1.0(23)的最新预发布版本进行Monocle分析。将数据加载到monocle目标中，然后进行对数转换。如果基因的平均表达≥0.5并且分散至少是分散拟合的两倍，则通过分散分析确定所述基因的排序。使用reduceDimension命令进行降维，参数为max_components＝2、reduction_method＝"DDRTree"且norm_method＝"log"。然后使用plot_cell_trajectory命令以标准参数构建轨迹。
使用从https://github.com/ManuSetty/wishbone下载的Python工具包进行Wishbone分析(24)。使用wishbone.wb.SCData.from_csv函数，参数为data_type＝'sc-seq'和normalize＝True，加载MARS-seq数据。然后使用wb.run_wishbone函数，参数为start_cell＝"run1_CATG_AAGACA",components_list＝[1,2,3,4],num_waypoints＝150,branch＝True，执行Wishbone。从中心簇#4中随机选择Start_cell。使用scdata.run_diffusion_map函数以默认参数进行扩散图分析(25)。Wishbone揭示了分别产生pDC、cDC1和cDC2的三条轨迹。沿着每个轨迹，各自的特征基因显示出表达增加(图7C)。尽管Wishbone结果可能被解释为表明cDC2是早期细胞并且在两个不同的分支上分化为pDC和cDC1，但这仅仅是因为Wishbone允许最多两个分支并假设所有细胞落在连续轨迹上。然而，它能够描绘与Mpath、monole和扩散图分析一致的三个轨迹。
C1单细胞mRNA测序
将Lin(CD3/14/16/19/20)-HLA-DR+CD33+CD123+细胞以300个细胞/μl加载到两个5-10μm的C1Single-Cell Auto Prep集成流体回路(Fluidigm)上，并且根据制造商的说明进行细胞捕获。在光学显微镜下检查各个捕获位点，以确认存在单个活细胞。弃去空捕获孔和含有多个细胞或细胞碎片的孔，用于质量控制。使用SMARTer Ultra Low RNA试剂盒(Clontech)和Advantage 2PCR试剂盒(Clontech)进行cDNA生成。使用ArrayControlTMRNASpots和Spikes试剂盒(峰值数(spike numbers)1、4和7)(Ambion)监测技术变异性，所用稀释液由制造商推荐。通过Quant-iTTM
Figure BDA0002039650330000581
dsDNA试剂测定每个单细胞的cDNA浓度，并使用DNA High Sensitivity Reagent Kit和DNA Extended Range LabChip(PerkinElmer)确认正确的大小和谱。使用Nextera XT DNA Library Preparation Kit和NexteraXT Index Kit(Illumina)产生多重测序文库。合并文库并在Illumina HiSeq 2000(Illumina)上进行2x51个循环的索引PE测序运行，平均深度为250万行读数/细胞。
C1单细胞分析
使用RSEM程序版本1.2.19，以默认参数(51)，将原始读数与来自GENCODE的人参考基因组GRCh38(53)进行比对。使用RSEM程序和人GENCODE注释版本22计算每百万转录物中的基因表达值。使用SINGuLAR(Fluidigm)分析工具箱进行质量控制和异常细胞检测。相对于从Gene Expression Omnibus数据系列GSE35457鉴别的cDC2DEG(20)，使用cDC1进行cMAP分析，并获得富集分数。与基因集富集分析类似，cMAP用于确定转录物组谱与细胞类型特征性基因特征的关联。
MARS-或C1单细胞mRNA测序数据的Mpath分析
使用Mpath算法(22)定义发育轨迹，该算法构建多分支细胞谱系并沿着分支重新排序单个细胞。在MARS-seq单细胞转录物组数据分析中，我们首先使用Seurat R程序包来鉴别五个簇：对于每个簇，Mpath计算几何中心并将其用作表示规范细胞状态的界标；随后，对于每个单细胞，Mpath计算其与所有界标的欧几里德距离，并鉴别出两个最近的界标。因此，每个单独的细胞被分配到其两个最近界标的邻域。对于每对界标，Mpath然后计数被分配到邻域的细胞的数量，并使用所测定的细胞计数来估计界标之间转变(transition)为真的可能性。高细胞计数意味着转变有效的可能性很高。然后，Mpath构建加权邻域网络，借此节点表示界标，边缘表示界标之间的推定转变，而分配给边缘的数字表示转变的细胞计数支持。鉴于单细胞转录物组数据倾向于有噪声，具有低细胞计数支持的边缘被认为可能是伪像。因此，Mpath通过使用(0-n))(n-n表示细胞计数)来去除具有低细胞支持的边缘，以量化节点之间的距离，然后应用最小生成树算法寻找可以以最小的距离总和连接所有节点的最短路径。因此，所得的修剪网络是以最小边缘数量和边缘上的最大细胞总数连接所有界标的网络。然后使用Mpath将各个细胞投影到连接其两个最近界标的边缘上，并根据它们在边缘上的投影点的位置为细胞分配伪时间排序。在C1单细胞转录物组数据分析中，我们首先使用cMAP分析来鉴别cDC1引发的簇、cDC1未引发的簇和cDC2引发的簇，然后使用Mpath构建这三个簇之间的谱系。Mpath分析以无监督的方式进行，无需事先知道起始细胞或分支数。这种方法可用于非分支网络、趋异(bifurcation)和具有三个或更多分支的多分支网络的情况。
质谱流式细胞技术染色、条形码技术(barcoding)、获取和数据分析
对于质谱流式细胞技术，如表3中所列，从Invitrogen、Fluidigm(预缀合抗体)、Biolegend、eBioscience、Becton Dickinson或R&D Systems获得预缀合或纯化的抗体。对于一些标志物，荧光团或生物素-缀合的抗体用作一抗，然后用如前所述(16)产生的抗荧光金属缀合的抗体(例如抗FITC克隆FIT-22)或金属缀合的链霉抗生物素蛋白进行二次标记。简而言之，U形底96孔板(BD Falcon,Cat#3077)中的3x 106个细胞/孔用200μLFACS缓冲液(4％FBS、2mM EDTA、0.05％叠氮化物，在1X PBS中)洗涤一次，然后用100μL 200μM顺铂(Sigma-Aldrich,Cat#479306-1G)在冰上染色5min以排除死细胞。然后将细胞用抗-CADM1-生物素和抗-CD19-FITC一抗在50μL反应中在冰上孵育30min。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次，并用50μL重金属同位素缀合的二级mAb混合物在冰上孵育30min。然后用FACS缓冲液将细胞两次洗涤，并用PBS洗涤一次，然后用PBS中的200μL 2％多聚甲醛(PFA；ElectronMicroscopy Sciences,Cat#15710)固定过夜或更长时间。固定后，将细胞沉淀并在室温下重悬浮于200uL 1X透化缓冲液(Biolegend,Cat#421002)中5分钟，以进行细胞内标记。然后将细胞用金属缀合的抗CD68在50μL反应中在冰上孵育30min。最后，将细胞用透化缓冲液洗涤一次，然后用PBS洗涤，然后进行条形码技术。
通过将BABE(Dojindo,Cat#B437)溶解在100mM HEPES缓冲液(Gibco,Cat#15630)中至终浓度为2mM来制备溴代乙酰胺基苄基-EDTA(BABE)-连接的金属条形码。然后将同位素纯化的PdCl2(Trace Sciences Inc.)加入到2mM BABE溶液中至终浓度为0.5mM。类似地，通过将DM(Macrocyclics,Cat#B-272)溶解在L缓冲液(MAXPAR,Cat#PN00008)中至终浓度为1mM来制备DOTA-马来酰亚胺(DM)-连接的金属条形码。然后将RhCl3(Sigma)和同位素纯化的LnCl3以0.5mM终浓度加入DM溶液中。使用六种金属条形码：BABE-Pd-102、BABE-Pd-104、BABE-Pd-106、BABE-Pd-108、BABE-Pd-110和DM-Ln-113。
立即将所有BABE和DM-金属溶液混合物在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。选择独特的条形码双重组合来染色每个组织样品。条形码Pd-102以1:4000稀释使用，Pd-104以1:2000稀释使用，Pd-106和Pd-108以1:1000稀释使用，Pd-110和Ln-113以1:500稀释使用。将细胞用PBS中的100μL条形码在冰上孵育30min，在透化缓冲液中洗涤，然后在冰上在FACS缓冲液中孵育10min。然后将细胞沉淀并在室温下重悬浮于100μL在2％PFA/PBS(1:2000)中的核酸Ir-Intercalator(MAXPAR,Cat#201192B)。20min后，将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，并用水洗涤两次，最后重悬浮于水中。在每组中，将细胞从所有组织类型合并、计数并稀释至0.5×106个细胞/mL。在获取之前以1％浓度添加EQ Four Element Calibration Beads(DVS Science,Fluidigm)。获取细胞数据并使用CyTOF质谱流式细胞计数器(Fluidigm)分析。
以常规流式细胞术文件(.fcs)格式输出CyTOF数据，并使用先前描述的软件(52)归一化。使用在先前版本的质谱流式细胞技术软件中使用的自定义R脚本，将具有零值的事件随机分配在0和-1之间的值(53)。使用FlowJo中的Boolean门控算法(Boolean gatingalgorithm)对每个条形码的细胞进行去卷积。PBMC的CD45+Lin(CD7/CD14/CD15/CD16/CD19/CD34)-HLA-DR+群使用FlowJo进行门控，并导出为.fcs文件。使用逻辑转换函数转换标志物表达值(54)。进行无需替换的随机二次采样以选择20,000个细胞事件。然后使用表3中列出的标志物和Rtsne R程序包中的Rtsne函数以默认参数，对二次采样细胞事件的变换值进行t分布随机邻域嵌入(tSNE)降维(18)。类似地，使用vegan R程序包中的vegdist、spantree和isomap函数(55)进行等距特征映射(isoMAP)(34)降维。
以method＝“euclidean”运行vegdist函数。spantree函数以默认参数运行。以ndim等于输入数据的原始维数且k＝5，运行isoMAP函数。在降维之前使用表3中列出的标志物进行表型图聚类(26)，并且最近邻域的数量等于30。将从tSNE、isoMAP和Phenograph分析获得的结果作为附加参数并入.fcs文件中，然后将其加载到FlowJo中以在降维上生成标志物表达的热图。使用cytofkit R程序包进行上述分析，该程序包提供了现有最先进的细胞术数据分析方法的包装(56)。
人细胞流式细胞术:标记、染色、分析、细胞分选
除鸡抗人CADM1IgY初级mAb外，用于荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术的所有抗体均为小鼠抗人单克隆抗体(mAb)。表6列出了用于流式细胞术的mAb和二抗(secondary reagent)。简言之，洗涤5×106个细胞/管并用Live/Dead蓝色染料(Invitrogen)在4℃下在磷酸缓冲盐水(PBS)中孵育30min，并且然后在4℃下在5％热灭活的胎牛血清(FCS)中孵育15min(Sigma Aldrich)。将在具有2％胎牛血清(FCS)和2mM EDTA的PBS中稀释的适当抗体加入细胞中，并在4℃下孵育30min，然后洗涤并用二抗检测。对于胞质内或核内标记或染色，根据制造商的说明分别用BD Cytofix/Cytoperm(BDBiosciences)或eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience/Affimetrix)固定并透化细胞。使用BD LSRII或BD FACSFortessa(BDBiosciences)进行流式细胞术，并使用BD FACSDiva 6.0(BD Biosciences)或FlowJo v.10(Tree Star Inc.)分析数据。为了分离前体树突细胞(前DC)，首先根据制造商的说明，使用AutoMACS Pro分离器(Miltenyi Biotec)，用抗CD3、抗CD14和抗CD20微珠(MiltenyiBiotec)耗尽PBMC的T细胞、单核细胞和B细胞。使用BD FACSAriaII或BD FACSAriaIII(BDBiosciences)进行FACS。使用从https://www.c2b2.columbia.edu/danapeerlab/html/cyt-download.html下载的CYT工具进行流式细胞术数据的Wanderlust分析(33)。由于Wanderlust要求用户指定起始细胞，我们从CD45RA+CD123+群中随机选择了一个细胞。
细胞离心涂片(cytospin)和扫描电子显微术
从纯化的细胞制备细胞离心涂片，并根据制造商的方案(Fisher Diagnostics)用Hema 3***染色。用Olympus BX43直立显微镜(Olympus)以100X放大率分析图像。如前所述(20)进行扫描电子显微术。
MS-5基质细胞的树突细胞(DC)分化共培养测定
如前所述(8)维持MS-5基质细胞并传代。将MS-5细胞以每孔3,000个细胞接种于96孔圆底板(Corning)内的完全α极限必须培养基(α-MEM)(Life Technologies)中，所述培养基补充有10％胎牛血清(FBS)(Serana)和1％青霉素/链霉素(Nacalai Tesque)。18-24h后，在含有200ng/mL Flt3L(Miltenyi Biotec)、20ng/mL SCF(Miltenyi Biotec)和20ng/mLGM-CSF(Miltenyi Biotec)的培养基中添加总共5,000个分选的纯化细胞，并培养长达5天。然后通过物理解离将细胞重新悬浮于它们的孔中，并用细胞过滤器过滤到聚苯乙烯FACS管中。
混合的淋巴细胞反应
根据制造商的说明，使用
Figure BDA0002039650330000621
Pan T-Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)从PBMC分离天然T细胞，并用0.2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Life Technologies)在37℃下标记5min。将来自分选的DC子集的总共5,000个细胞与100,000个CFSE标记的天然T细胞在Iscove改良的达尔伯克氏培养基(IMDM；Life Technologies)中共培养7天，所述培养基补充有10％KnockOutTMSerum Replacement(Life Technologies)。在第7天，用10μg/ml佛波酯(phorbol myristate acetate,InvivoGen)和500μg/ml离子霉素(Sigma Aldrich)在37℃刺激T细胞1h。加入10μg/ml布雷菲德菌素A溶液4小时，然后用细胞因子特异性抗体标记细胞，并通过流式细胞术分析，如上所述。
电子显微术
将分选的细胞在37℃下接种在聚赖氨酸涂覆的盖玻片上1h。然后将细胞在pH 7.4的0.1M二甲胂酸盐缓冲液中的2％戊二醛中固定1h，用2％缓冲的四氧化锇后固定1小时，然后在分级系列的乙醇溶液中脱水，然后包埋在环氧树脂中。使用安装在于80kV下操作的Tecnai 12透射电子显微镜(FEI Company)上的Quemesa(SIS)数码相机获取图像。
微阵列分析
使用
Figure BDA0002039650330000631
Micro试剂盒(Qiagen)从FACS分选的血液前DC子集和DC子集中分离总RNA。使用Agilent Bioanalyzer(Agilent)评估总RNA完整性，并计算RNA完整性数(RIN)。所有RNA样品的RIN≥7.1。使用Epicenter TargetAmp TM 2-Round Biotin-aRNAAmplification Kit 3.0，根据制造商的说明，使用500pg总RNA起始材料制备生物素化的cRNA。在Illumina Human-HT12Version 4芯片组(Illumina)上进行cRNA的杂交。将微阵列数据从GenomeStudio(Illumina)输出，无需背景扣除。检测P值>0.05的探针被认为未在样品中检测到，并被滤出。将剩余探针的表达值进行log2转化并进行分位数归一化。对于差异表达基因(DEG)分析，使用limma R程序包(57)进行一个细胞子集与另一个细胞子集的比较，其中样品与供体标识符配对。选择Benjamini-Hochberg多重检验(58)校正的P值<0.05的DEG。以这种方式，通过将一个子集与合并为一组的所有其他子集进行比较，使用limma来为前DC数据中的每个细胞子集选择上调和下调的特征基因。图4E所示的表达谱来自于从以下鉴别的62个共同基因：来自比较前cDC1与早期前DC和比较cDC1与前cDC1的DEG的联合，以及来自比较前cDC2与早期前DEG和比较cDC2与前cDC2的DEG的联合(表5列出了cDC1谱系和cDC2谱系的DEG的列表，和62个共同基因的列表；图21为两个DEG列表的维恩图比较和62个共同基因的鉴别)。
统计分析
用Mann-Whitney检验比较来自患有皮特霍普金斯综合征的患者和对照的数据。使用Kruskal-Wallis检验，然后使用Dunn多重比较检验，比较MARS-seq单细胞RNAseq数据集中单个细胞中单个基因的表达水平。当调整P<0.05时，差异被定义为统计学上显著的。使用Windows用GraphPad Prism 6.00(GraphPad Software)进行所有统计学检验。相关系数计算为皮尔逊相关系数。
DC的HIV感染和刺激
将分选的细胞沉淀并以0.4×106个细胞/mL重悬浮于完全X-体内培养基中，将50μl接种在圆底96孔板中。在一些实验中，以20μg/mL添加抗-Siglec-1mAb(克隆7-239)或mIgG1同种型对照(Miltenyi)，并且在添加病毒之前将细胞在37℃下孵育30分钟。对于感染，加入150μl培养基或病毒上清液的稀释液(150μl或50μl)。以5μM添加AZT。CpG-A(ODN2216,Invivogen)以5μg/mL使用，CL264(Invivogen)以10μg/mL使用，并且在感染前24小时孵育细胞。除非另有说明，否则将感染在25℃下以800g旋转接种(spinoculated)2小时。感染后48小时，收获细胞培养物上清液，并将细胞在PBS中的4％多聚甲醛(PFA；Electron Microscopy Sciences)中固定，然后在FACSVerse流式细胞仪(BD)上分析。或者，用PE-Vio770抗-Siglec-1(Miltenyi)染色细胞，并在FACS Fortessa(BD)上分析。使用Mac用FlowJo v10和Prism v7(GraphPad)分析数据。
激活的CD4+细胞的HIV捕获和反式感染(trans-infection)
将分选的细胞沉淀并以0.4×106个细胞/mL重悬浮于完全X-体内培养基中，并将50μl接种在圆底96孔板中。在一些实验中，以20μg/mL添加抗Siglec-1mAb或mIgG1同种型对照，并且在添加病毒之前将细胞在37℃下孵育30分钟。将HIV-1X4GFP加入细胞(150μl/孔的HEK293FT培养物上清液)中，并在37℃下孵育2小时。将细胞充分洗涤并固定于PBS中的4％PFA中。使用KC-57RD1mAb(Beckman Coulter，6604667)进行p24染色。对于反式感染实验，在用HIV-1X4GFP培养2小时后充分洗涤分选的DC，并以1:1的比例加入活化的CD4+T细胞。或者，以5μg/mL加入CpG-A，以10μg/mL将CL264加入到DC中，并将细胞培养过夜，然后加入HIV-1X4GFP。然后洗涤细胞并加入活化的CD4+T细胞。48小时后，将细胞固定在PBS中的2％PFA中。然后用PE-Cy7抗CD3(BD)染色细胞，并在FACS Verse(BD)上分析。使用Mac用FlowJo v10和Prism v7(GraphPad)分析数据。
人细胞流式细胞术：标记、染色、分析和分选
对从志愿者供体获得的单采残留物样品进行Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度梯度离心，分离外周血单核细胞(PBMC)，并通过流式细胞术分析。简而言之，洗涤5×106个细胞/管并用Live/Dead蓝色染料(Invitrogen)在4℃下在磷酸缓冲盐水(PBS)中孵育30分钟，然后在5％热灭活的胎牛血清(FCS)中在4℃下孵育15分钟(Sigma Aldrich)。将在具有2％胎牛血清(FCS)和2mM EDTA的PBS中稀释的适当抗体加入细胞中，并在4℃下孵育30分钟，然后洗涤并用二抗检测。使用BD LSRII或BD FACSFortessa(BD Biosciences)进行流式细胞术，并使用BD FACSDiva6.0(BD Biosciences)或FlowJo v.10(Tree Star Inc.)分析数据。
实施例2–结果
通过无监督单细胞RNAseq和CyTOF无偏鉴别DC前体
使用从人血液中分离的PBMC，进行大规模并行单细胞mRNA测序(MARS-seq)(15)，以评估谱系标志物(Lin)(CD3/CD14/CD16/CD20/CD34)–、HLA-DR+CD135+群(12,13)(图1A至G，和图6A：分选策略，图6B至J：工作流程和质量控制，表1：检测到的基因数量)中710个单独细胞的转录谱。通过t-随机邻域嵌入(tSNE)使用非线性降维处理MARS-seq数据，所述t-随机邻域嵌入(tSNE)能够以二维图的形式使细胞之间的高维相似性无偏可视化(16-18)。
在tSNE维度上具有噪声的基于密度的空间聚类算法(density-based spatialclustering of applications with noise)在所选择的PBMC群内鉴别了五个转录相关细胞的不同簇(图1A和图6G)。为了定义这些簇的性质，计算Pdc、cDC1和cDC2的基因特征分数(如(20)所述，表2：特征基因列表)，并且将归因于每个细胞的特征的表达叠加在tSNE可视化上。簇#1和#2(分别含有308个细胞和72个细胞)被鉴别为pDC，簇#3(含有160个细胞)被鉴别为cDC1，簇#5(含有120个细胞)鉴别为为cDC2。簇#4(含50个细胞)位于cDC1(#3)和cDC2(#5)簇之间，并具有弱的混合pDC/cDC特征(图1A)。使用连接性MAP(cMAP)分析(21)来计算每个单独细胞中pDC或cDC特征基因转录物的富集程度。该方法证实了pDC(#1和#2)和cDC(#3和#5)簇的特征，并且显示簇#4中的大多数细胞表达cDC特征(图1B)
然后将Mpath算法(22)应用于五个簇，以基于细胞之间的这些转录相似性来识别假设的发育关系(图1C和图7A和B)。Mpath揭示了五个簇被分成三个不同的分支，在三个分支的交叉处具有一个中心簇(簇#4)(图1C和图7A)。将簇#4连接到cDC1簇#3和cDC2簇#5的Mpath边缘具有高细胞计数(分别为159个细胞和137个细胞)，这表明从簇#4到簇#3和#5的转变可能是有效的，并且表明簇#4可能含有推定的cDC前体(图1C)。相比之下，连接簇#4和pDC簇#2的边缘的细胞计数仅仅为7(图1C和图7B)，这表明该连接非常弱。当Mpath修剪加权邻域网络时，保留了连接簇#4和#2的边缘(图7B)，这仅仅是由于Mpath算法需要连接所有簇这一特征(22)所致。
使用Monocle(23)、主成分分析(PCA)、Wishbone(24)和扩散图算法(25)来证实这些发现。Monocle和PCA将细胞解析为与原始Mpath分析相同的三个分支，来自tSNE簇#4的细胞再次落在交叉点(图1D和E)。Diffusion Map(扩散图)和Wishbone分析表明，簇#3(cDC1)、#4和#5(cDC2)之间存在连续性：来自簇#4的细胞主要存在于DiffMap_dim2low区域，而来自簇#3和#5的细胞逐渐地从DiffMap_dim2low区域分别向左和向右漂移。pDC簇(#1和#2)与所有其他簇清楚地分开(图1F和图7C)。为了支持这一观察，来自这些pDC簇的细胞具有比cDC簇(#3和#5)和中心簇#4更高的pDC特异性标志物和转录因子(TF)表达。相反，簇#4中的细胞比pDC簇表达更高水平的标志物和与所有cDC谱系相关的TF(图1G)。这表明簇#4代表推定的未定向cDC前体群的可能性。
接下来，利用在单细胞水平上同时测量高达38种不同分子的表达强度的CyTOF来进一步理解描绘的亚群的组成。设计了一组38个标记的抗体来识别DC谱系和/或祖细胞相关表面分子(表3，图1H至J和图8)，以及由MARS-seq鉴别的簇#4中的分子，例如CD2、CX3CR1、CD11c和HLA-DR(图1I)。使用tSNE算法，CD45+Lin(CD7/CD14/CD15/CD16/CD19/CD34)–HLA-DR+PBMC部分(fraction)(图8A)解析成代表cDC1、cDC2和pDC的三个不同的簇(图1H)。cDC和pDC簇交叉处表达cDC相关标志物(CD11c/CX3CR1/CD2/CD33/CD141/BTLA)和pDC相关标志物(CD45RA/CD123/CD303)的中间簇(图1I到J，和图8B)对应于MARS-seq簇#4。当应用表型图无监督聚类算法(26)时，确认了这些聚类的描述(图8C)。中间CD123+CD33+细胞簇的位置是独特的，并且细胞表现出CD5、CD327、CD85j高表达，以及高水平的HLA-DR和cDC相关分子CD86(图1I至J)。总之，这些特征提出了CD123+CD33+细胞是否可能代表循环的人前DC的问题。
前DC存在于pDC部分并引起cDC
通过流式细胞术分析PBMC的Lin–HLA-DR+部分内的CD123+CD33+细胞簇。在此，鉴别了CD123+CD33–pDC、CD45RA+/–CD123–cDC1和cDC2以及CD33+CD45RA+CD123+推定的前DC(图2A和图9A)。推定的前DC表达CX3CR1、CD2、CD303和CD304，CD11c表达低，而CD123+CD33–pDC表现出可变的CD2表达(图2A和B，以及图9B和C)。
将该分析扩展至脾的免疫细胞，并鉴别了相似的推定的前DC群，其比血液中更丰富并且表达更高水平的CD11c(图2A和C，以及图9D)。
血液和脾中的推定的前DC群均表达CD135和中间水平的CD141(图9C)。从血液中分选的推定前DC的Wright-Giemsa染色揭示了与经典cDC相称的锯齿状核模式(indentednuclear patter)、核周清除区域和与pDC相称的嗜碱细胞质(图2D)。
在超结构水平，推定的前DC和pDC表现出不同的特征，尽管它们的形态相似(图2E和图9E)：与pDC相比，推定的前DC具有更薄的细胞质，均匀分布的线粒体(m)、较不粗糙的内质网(RER)、锯齿状核模式、大细胞核和有限的细胞溶质；pDC含有较小的细胞核，丰富的细胞溶质，包装的线粒体，在许多堆粗糙ER膜周围的平行潴泡中组织化的发育良好的极化皮质RER，与先前公布的数据一致(27)，这表明一种发达的分泌装置。
如前所述(8)，在FLT3L、GMCSF和SCF存在的情况下，通过基质培养比较了前DC与cDC和pDC的分化能力。5天后，pDC、cDC1和cDC2群仍然主要处于其初始状态，而推定的前DC群体已经以体内发现的已知比例(14、20、28、29)分化成cDC1和cDC2(图2F、图9F和图10)。总之，这些数据表明CD123+CD33+CD45RA+CX3CR1+CD2+细胞是具有cDC分化潜能的循环前DC。
Breton及其同事(9)最近报道了一小部分人前DC群(在图11A中突出显示)，其与本文定义的Lin–CD123+CD33+CD45RA+前-DC共有相似的表型(图11A和B)。本发明的结果揭示，血液和脾中的前DC群体明显大于在先前考虑的较小的CD303–CD141-CD117+部分中鉴别的群(图11C和D)。
前DC在功能上不同于pDC
当与IL-3和CD40L一起培养时，分泌IFNα的pDC可以分化成类似cDC的细胞(10,11)，并且已经被认为是DC前体(11)。然而，当使用传统的ILT3+ILT1–(10)或CD4+CD11c–(11)pDC门控策略时，检测到两组中的“污染性”CD123+CD33+CD45RA+前DC亚群(图11E和F)。这种“污染性”亚群结果提出了传统分类的“pDC群”的其他属性是否可归因于前DC这一问题。
皮特霍普金斯综合症(PHS)的特征在于异常的颅面和神经发育、严重的智力迟钝和运动功能障碍，并且由TCF4的单倍体功能不全引起，TCF4编码E2-2转录因子-pDC发育的中枢调节剂(31)。与健康个体相比，患有PHS的患者的血液pDC数量显著减少，但保留了前DC的群(图2G，和图13)，这可能是解释了在这些患者中报道的意外的CD45RA+CD123+CD303lo细胞群(32)。总之，本发明的数据表明，虽然前DC和pDC共有一些表型特征，但它们可以通过其几种标志物的差异表达来分开，包括CD33、CX3CR1、CD2、CD5和CD327。pDC是真正产生IFNα的细胞，但报道的pDC的IL-12产生和CD4+T细胞同种异基因刺激能力可能归因于可以产生cDC1和cDC2的“污染性”前DC。
定向的前DC子集的鉴别和表征
鼠前DC群含有未定向和定向的前cDC1和前cDC2前体(7)。因此，使用微流体scmRNAseq来确定对于人血液前DC是否也是如此(图14A：分选策略，图14B和C：工作流程和质量控制，表4：表达基因的数量)。
使相对于图1A至G所用的MARS-seq策略的其他单细胞基因表达数据(250万读数/细胞和每个细胞平均检测到4,742个基因，分别相对于60,000个读数/细胞和每个细胞平均检测到749个基因)进行cMAP分析，其计算每个单个细胞的cDC1或cDC2特征基因转录物的富集程度(20)(图3A)。在92个分析的前DC中，25个细胞显示出cDC1基因表达特征的富集，12个细胞显示出cDC2基因表达特征的富集，55个细胞未显示与任一cDC子集的转录相似性。
进一步的Mpath分析显示，这些55个“未引发的”前DC与cDC1引发的和cDC2引发的前DC在发育上相关，因此它们的基因表达模式落在通过cMAP的cDC1和cDC2特征分数之间(图3B和图15)。这些数据表明，如在小鼠中观察到的(7)，人前DC群含有向cDC1和cDC2谱系表现出转录物组引发的细胞。
通过流式细胞术的前DC群内的这种异质性，进一步使用前DC特异性标志物(CD45RA、CD327、CD5)或与cDC2相比前DC更强烈表达的标志物(BTLA，CD141)来鉴定。Lin–HLA-DR+CD33+群(含有分化的cDC和前DC)的3D-PCA分析鉴别了三个主要细胞簇：CADM1+cDC1、CD1c+cDC2和CD123+前-DC(图3C和图16A)。
有趣的是，虽然位于这三个簇交叉点的细胞(图3D)表达的CD123水平低于前DC，但却高于分化的cDC(图3C)，它们还表达高水平的前DC标志物(图3D和图16A)。可能这些CD45RA+CD123lo细胞是分化为cDC1或cDC2的定向前DC(图3E)。Wanderlust算法(34)根据细胞成熟度将细胞录入构建的轨迹，其证实了前DC(早期事件)、CD45RA+CD123lo细胞(中间事件)和成熟cDC(晚期事件)之间的发育关系(图3F)。PBMC的流式细胞术鉴别了CD123+CADM1–CD1c–推定的未定向前DC，以及剩余CD45RA+细胞内推定的CADM1+CD1c–前cDC1和CADM1–CD1c+前cDC2(图3G和图16B)。这三个群体在脾中也存在，并且更丰富(图16C)。
重要的是，从PBMC分选的前DC子集的体外培养物不产生任何CD303+细胞(其可以是未分化的前DC或分化的pDC)，而早期前DC产生两种cDC子集，并且前cDC1和前cDC2分别仅分化成cDC1和cDC2子集(图3H，图16D和图17)。
扫描电子显微镜证实，早期前DC在外观上比pDC大且粗糙，并且定向的前DC子集非常类似于它们的成熟cDC对应物(图3I和图18A)。
通过流式细胞术对血液前DC进行分型(图18B)确定了在早期前DC向前cDC1/2和分化的cDC1/2发育的整个过程中转变标志物表达的模式。具体而言，并行获得CD45RO和CD33，同时丧失CD45RA；CD5、CD123、CD304和CD327由早期前DC大量表达，由前cDC1和前cDC2中等表达，并且就算是由成熟cDC和pDC表达也会很少；当早期前DC定向于cDC2谱系时获得FcεRI和CD1c，同时丧失BTLA和CD319表达；早期前DC具有CD141的中等表达，其随cDC2分化下降，但在定向于cDC1的过程渐增，同时一些前cDC1已经开始表达Clec9A；以及早期前DC和前cDC1表达调节cDC谱系发育的转录因子IRF8和IRF4(2,3)，而前cDC2仅维持IRF4表达(图18C)。
接下来从血液中分选前DC和DC子集，并进行微阵列分析以确定它们的整个转录物组。微阵列数据的3D-PCA分析表明，pDC沿水平PC1轴与其他前DC和DC子集明显分开(图4A和图19)。PC2轴和PC3轴的组合表明，前cDC1占据了早期前DC和cDC1之间的位置，并且尽管cDC2和前cDC2表现出相似的转录物组，但是前cDC2沿着PC3轴位于cDC2和早期前DC之间(图4A)。
差异表达基因(DEG)的分级聚类证实了定向的前DC及其相应的成熟子集之间的相似性(图20)。最大数量的DEG介于早期前DC和pDC(1249个基因)之间，其中早期前DC更高度表达CD86、CD2、CD22、CD5、ITGAX(CD11c)、CD33、CLEC10A、SIGLEC6(CD327)、THBD、CLEC12A、KLF4和ZBTB46，而pDC表现出CD68、CLEC4C、TCF4、PACSIN1、IRF7和TLR7的较高表达(图4B)。从早期前DC到前cDC1然后到cDC1来看，基因表达模式的进化是明显的(图4C)，而前cDC2与cDC2相似(图4D和图20)。比较前cDC1与早期前DC和比较cDC1与前cDC1的DEG的联合与比较前cDC2与早期前DC和比较cDC2与前cDC2的DEG的联合具有62个共同基因。这62个共同基因包括转录因子BATF3、ID2和TCF4(E2-2)，和前DC标志物CLEC4C(CD303)、SIGLEC6(CD327)和IL3RA(CD123)(图4E、图21和表5)。
在早期前DC向cDC分化期间SIGLEC6(CD327)、CD22和AXL转录物丰度的逐渐减少也反映在蛋白质水平上(图4F)。参与DC子集分化和/或成熟的关键转录因子表现出其表达沿着从前DC向成熟cDC的分化途径渐进变化(图4G)。最后，途径分析表明，前DC相对于pDC表现出cDC功能的富集，并且与成熟cDC相比维持在相对不成熟的状态(图22)。
DC个体发育的无监督作图
为了理解细胞子集的相关性，对从CyTOF分析获得的人BM细胞进行无监督isoMAP分析(34)，用于非线性降维(图5A和图23A)。该分析专注于Lin-CD123hi部分并鉴别了CD123hiCD34+CDP(表型图簇#5)，其中分支的CD34-CD123+CD327+CD33+前DC(簇#1和#2)和CD34-CD123+CD303+CD68+pDC(簇#3和#4)逐渐获得其各自的表型。前DC分支中的细胞越来越多地表达CD2、CD11c、CD116，并且在稍后阶段表达CD1c。
外周血中Lin–CD123+细胞的IsoMAP分析鉴别了两个平行谱系，对应于前DC和pDC，其中未检测到CDP群(图5B)。从图5A(BM，簇#1和#2)和图5B(血液，簇#6)的isoMAP分析中提取的前DC的IsoMAP和表型图分析揭示了三个由唯一标志物表达模式(图23B和C)定义的不同前DC子集(图5C)。
总之，通过CyTOF追踪从BM到外周血的DC发育阶段，其证明BM中的CDP群分成两个途径，在血液中发育成前DC或pDC(图5A至C)。这个前DC群是异质的，并且作为血液和BM中可检测的不同子集存在(图5C，和图23B和C)。此外，揭露了血液和BM pDC中有趣的异质性，这需要进一步研究(图6C，和图23D和E)。
验证用于MARS-seq单细胞转录物组数据归一化的下采样阈值
由于RNA输入材料的量低，在单细胞RNA测序实验中预期单细胞转录物组质量方面的高度差异。这一警告需要严格的质量控制，以避免低质量单细胞转物录组引入的偏差。因此，在单细胞转录物组学中，通常的做法是去除低质量转录物组以确保无偏见的且生物学上有意义的分析(59,60)。已经使用不同的策略来滤除低质量细胞，包括根据经验确定的用于细胞过滤的截止值(59)，用于归一化和过滤低质量细胞的下采样策略(15)，以及来自600UMI/细胞或400UMI/细胞的各种过滤截止值(15)，每个细胞的分子计数<500(61)和UMI/细胞<200(62)。据我们所知，在任何这些研究中都没有报道数学上确定的截止值。由于这些先前的研究是在小鼠细胞上进行的，并且必须在相应的数据集内建立单细胞数据中的质量过滤器，本方法已经适应人细胞的过滤策略。为了测定当前数据集的质量阈值，使用几种诊断来估计分子计数下采样的最佳截止值。首先，可视化分子计数的累积分布，其中x轴上的细胞通过降低UMI计数来排序(图6C)。在这里，在某个区域，每个细胞的分子计数数值有一个强烈下降期。该区域对应于每个细胞400-1200个UMI之间的一系列分子计数。用于判断客观阈值的下一个度量(图6D)是所有细胞的分子计数分布。许多细胞条形码的分子计数<650-这些细胞条形码最可能代表当前MARS-seq数据集的背景信号。具有一定数量分子的细胞条形码的数量随着每个细胞的分子计数增加而减少；通过这种可视化，确定了在分布中可能用作过滤和归一化的客观阈值的自然断点，因为这些断点标记了数据结构和质量的变化，并指示了从背景到信号的转变，或从低质量转录物组到高质量转录物组的转变。在此，确定了三个值得注意的点(图6D)，其对应于每个细胞650(B)、1,050(R)和1,700(G)的分子计数。为了客观地确定这些点中的哪一个代表数据质量从低质量转录物组到高质量转录物组的转变，需要确定转折点(图6D)。在密度图(图6D，上图版)中，三条线(G、R、B)是密度函数的斜率(密度的一阶导数，图6D，中间图版)突然变化的断点。在B线上，向下斜率(一阶导数)从非常陡峭变为不太陡峭，因此二阶导数在此点时最高。类似地，在R线上，向下斜率从不太陡峭变为更陡峭，因此二阶导数最低。基于这些观察，通过二阶导数确定了三个转折点(图6D，下图版)。当应用650的截止值时，每个细胞的分子计数数目太低，并且主成分分析(PCA；图6E)可能无法区分三个DC群——浆细胞样DC(pDC)和常规DC(cDC)子集cDC1和cDC2。当应用1,700的截止值时，保留的细胞数量太少。因此，1,050的截止值是所分析的细胞数量(通过下采样归一化过滤后保留的细胞)与细胞中分子计数的数目(通过下采样丢弃分子计数后剩余的基因表达信息)之间的最佳权衡。
为了确保所选分子截止值的数据再现性、稳定性和独立性，使用650、1,050、1,700和2,350分子计数的截止值模拟初始分析(图6E)。如果使用PCA对数据进行降维，则所有四个所选的模拟值都表现出相同的一般数据拓扑，从而证明生物数据结构是稳健的并且与过滤阈值无关。此外，过滤阈值对前两个主成分内基因负荷的影响是相关的。下采样至1,050分子计数的数据集的主成分1(PC1)与下采样至650或1,700分子计数的数据集的PC1高度相关(皮尔逊(Pearson)分别为0.996和0.999)。PC2也是如此(皮尔逊分别为0.960和0.925)。这些结果表明，所选择的1,050的滤波截止值具有代表性和且是客观导出的。
通过两个独立的实验(run1和run2)生成本公开获得的MARS-seq数据，将它们组合用于进一步的数据分析。归一化后，评估run1中相对run2所有基因的平均分子计数之间的相关性(图6F，其显示在两次运行中，平均分子计数之间的高度相关性(r＝0.994))。在评估批处理效果时，确保运行不决定聚类本身非常重要。绘制了t分布随机邻域嵌入(tSNE)值以及它们的密度估计值的图(图6G)(run1和run2的细胞的比例相等)。该分析表明一般分布不受运行控制，因此聚类也不受运行控制，这与观察结果一致，即当前聚类鉴别了与三个DC群(pDC、cDC1和cDC2)明显对应的生物学上合理的群组(图1A)。因此，观察到的簇不是由运行之间的差异来解释，而是由生物学来解释。
在两次运行中，正如通过聚类所确定的，比较了细胞类型的频率(图6H)。这表明不同簇中细胞之间的比例在两次运行之间是相当的。值得注意的是，在两次运行中，所述比率不需要相同(61)。此外，该分析表明，没有簇在单个运行中占据主导地位。由于我们从一个大的总体中采集相对较小的样本，预计细胞类型的频率在运行之间显示出自然变化，这可能解释了细胞频率的轻微变化。
讨论
使用无监督scmRNAseq和CyTOF分析，揭示了单细胞水平上人DC谱系的复杂性，揭示了血液中两个谱系的具有CDP的BM中开始，在前DC和pDC潜能的出现点处趋异，并最终成熟的连续分化过程。
先前使用传统的基于表面标志物方法的研究表明在PBMC中存在较小的前DC群(9)，但是在此采用的高维技术和无偏分析的组合表明这个较小的群被显著低估：由于目前的结果揭示前DC群与Breton及其同事(9)在PBMC的CD117+CD303-CD141-部分中所观察到的群重叠，但是是外周细胞中最初估计的细胞数量的10倍以上，并且相当多样化(图11C)。
最近在小鼠中的工作发现了BM中未定向的和子集定向的前DC子集(7,35)。在这里，类似地鉴别了人PBMC、脾和BM中三个功能上和表型上不同的前DC群，它们是：未定向的前DC和两个子集定向的前DC群(图24和图25)。根据从BM向外周连续分化的概念，BM的前DC群中未定向细胞的比例高于血液中的比例。总而言之，这些发现支持DC发育的两步模型，据此，中心转录物组子集特异性程序从CDP阶段开始印记在DC前体上，从而赋予核心子集身份而不管最终组织目的地如何；在该过程的第二步中，发生外周组织依赖性编程以确保位点特异性功能和适应(7,35)。
偏分析的一个重要方面是，并不将细胞基于有关细胞表面表型的先入之见排除在考虑之外。发现前DC表达大多数经典定义的pDC的标志物，例如CD123、CD303和CD304。因此，依赖于这些标志物鉴别和分离pDC的任何策略都会无意中包括CD123+CD33+前DC。虽然这需要重新考虑pDC群生物学的某些方面，但它也可以解释早期的发现，包括：pDC培养物具有cDC潜能并获得cDC样形态(10,11)，如最近在小鼠BM pDC中观察到的(36)；pDC通过产生IFNα和IL-12介导Th1免疫(10,37-41)；pDC表现出天然T细胞异基因刺激能力(30,39)；和pDC表达共刺激分子并以IFNα分泌为代价表现出抗原呈递/交叉呈递能力(37,42)。
这些观察结果可能归因于这些研究所描述的pDC群中未检测到的前DC，并且实际上已推测，在这些早期研究中观察到的IL-12产生可能是由于存在污染性CD11c+cDC所致(43)。本公开通过从CX3CR1-CD33-CD123+CD303+CD304+“纯”pDC中分离CX3CR1+CD33+CD123+CD303+CD304+前DC并证明pDC可能不极化或诱导天然CD4T细胞增殖解决了这种可能性，而前DC具有这种能力。因此，在未来的研究中，特别是在使用商业pDC分离试剂盒时，将前DC排除在pDC群之外是至关重要的。最后，如果剥夺pDC的所有cDC特性，就出现它们是否真正属于DC谱系，或者更确切地说它们是否是一类独特的先天性产生IFN-I的淋巴样细胞的问题。BMCD34+CD123hi CDP群是否也是独立的真正cDC祖细胞和pDC祖细胞的混合物，还有待证明。
除了鉴别前DC之外，目前的数据揭示了循环的成熟DC群中先前未曾认识的转录和表型异质性。这在cDC2和pDC的情况下尤为明显，cDC2和pDC在单细胞RNAseq分析中被分组为多个Mpath簇，并且在CyTOF数据的tSNE分析中表现出出显著的分散和表型异质性。CyTOF数据的IsoMAP分析通过说明BM(包括可能是前pDC的中间细胞)中从CDP向CD2+pDC的进行性表型转变，还揭示了另一个pDC异质性水平。是否存在循环的前pDC群体仍有待作出结论。最后，定义指导未定向的前DC分化为cDC1或cDC2的机制，或将这些细胞维持于其在健康和疾病中的初始未定向状态的机制，可能导致开发调节这种分化过程的新治疗策略。
本公开内容提供了前DC细胞对R5和X4向性病毒的HIV-1感染敏感(图34)，并且在存在Vpx(病毒蛋白X)的情况下感染增强(图3)。35)。还公开了用CD169抗体预处理诱导前DC的HIV-1感染减少，同时所述抗体显示出针对X4病毒的较高效力(图36)。
图37提供了除了对HIV-1感染最敏感之外，在存在Vpx的情况下，感染的前DC细胞还能够将病毒传输至作为HIV-1感染的主要靶标的活化CD4T细胞。因此，前DC可能是HIV-1治疗的新靶标。
图38显示循环前DC子集在各种炎性疾病状态例如扁平苔癣、特应性皮炎、牛皮癣和肥胖中的比例增加。此外，癌症和传染病也显示出前DC增加(图38)。而且，如图38所示，在***性红斑狼疮(SLE)中循环前DC的比例与SLEDAI分数相关，SLEDAI分数是疾病活动的量度。因此，还提供了基于检测前DC群的变化诊断或预测局部或***性炎性、自身免疫性、传染性、代谢性疾病/疾病状态进展的方法。
总之，通过CD135和HLA-DR的表达鉴别了人血液和组织DC及其在BM中的前体。使用几种集成的高维度分析技术(使用单细胞mRNA测序和飞行时间质谱或CyTOF的细胞术的质谱流失细胞术)，人血液的CD135+HLA-DR-部分。这些方法取代了传统的基于表面标志物的方法，并在常规定义的pDC群中鉴别了前DC群。目前的用于DC祖细胞的标志物组合以前从未描述过，并且允许区分前DC子集与循环pDC；实际上，到目前为止，所有有关pDC的实验观察都是在存在污染性前DC的情况下进行的。这些前DC具有独特的表型和先前归因于pDC的不同功能特性。通过将本公开的分析扩展到血液和BM中的所有DC群，鉴别了由BM产生的整个DC谱系，并揭示了前DC向不同DC子集的转录启动。这些数据提供了对DC异质性和个体发育的新见解，并突出强调了研究DC子集特异性靶向的治疗潜力的未开发途径。
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Claims (14)

1.确定生物标志物存在的试剂在制备用于检测常规树突细胞的前体前DC的方法中的制剂的用途，所述前DC包括早期前DC、前cDC1和前cDC2，其中所述方法包括(i)使用所述试剂确定存在选自由以下组成的组的生物标志物：
(a)CD169、CD327和AXL的组合；
(b)CD169、CD327和CD271的组合；
(c)CD169、CD327和CD324的组合；
(d)CD169、CD327、AXL和CD271的组合；
(e)CD169、CD327、AXL和CD324的组合；
(f)CD169，CD327、CD271和CD324的组合；和
(g)CD169、CD327、AXL、CD271和CD324的组合。
2.根据权利要求1所述的用途，其中步骤(i)包括确定存在:
(A)CD169、CD327和AXL以检测前DC细胞群内的早期前DC细胞群；
(B)CD169、CD327、CD271和CD324，其中所述方法还包括确定存在细胞粘附分子1以检测前cDC1；或
(C)CD169、CD327、CD271和CD324，其中所述方法还包括确定存在CD1c以检测前cDC2。
3.根据权利要求2所述的用途，其中(A)还包括在权利要求2所述的步骤(i)之前：
(ii)确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CD5、CX3CR1、CD2及其组合的生物标志物；和
(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16及其组合的生物标志物。
4.根据权利要求2所述的用途，其中(B)还包括在权利要求2所述的步骤(i)之前：
(ii)确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD303、CD304、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物；和
(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、CD1c及其组合的生物标志物。
5.根据权利要求2所述的用途，其中(C)还包括在权利要求2所述的步骤(i)之前：
(ii)确定存在一种或多种选自HLA-DR、CD123、CD45RA、CD45、CD33、CX3CR1、CD2、CD5及其组合的生物标志物；和
(iii)确定不存在一种或多种选自CD34、CD3、CD19/CD20、CD14、CD16、细胞粘附分子1及其组合的生物标志物。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的用途，其中所述方法还包括测定所述生物标志物的表达水平，其中：
(I)(a)相对于对照，权利要求2的(A)中的生物标志物，或权利要求2的(A)中的生物标志物与权利要求3的(ii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平增加，表明所述细胞是早期前DC；和/或
(b)相对于对照，权利要求2的(A)中的生物标志物，或权利要求2的(A)中的生物标志物与权利要求3的(iii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平降低，表明所述细胞是早期前DC；
或
(II)(a)相对于对照，权利要求2的(B)中的生物标志物，或权利要求2的(B)中的生物标志物与权利要求4的(ii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平增加，表明所述细胞是前cDC1；和/或
(b)相对于对照，权利要求2的(B)中的生物标志物，或权利要求2的(B)中的生物标志物与权利要求4的(iii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平降低，表明所述细胞是前cDC1；
或
(III)(a)相对于对照，权利要求2的(C)中的生物标志物，或权利要求2的(C)中的生物标志物与权利要求5的(ii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平增加，表明所述细胞是前cDC2；和/或
(b)相对于对照，权利要求2的(C)中的生物标志物，或权利要求2的(C)中的生物标志物与权利要求5的(iii)中任何一种或多种生物标志物的表达水平降低，表明所述细胞是前cDC2；
其中所述对照包括存在的其他细胞群或不表达CD169、CD327、AXL、CD271和/或CD324的pDC群。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述方法还包括确定所述生物标志物表达水平的变化，其中：
a)与对照中所述生物标志物的表达水平相比，所述生物标志物表达水平的变化表明所述细胞是早期前DC、前cDC1或前cDC2；和
(b)与对照中所述生物标志物的表达水平相比，所述生物标志物的表达水平没有变化表明所述细胞不是早期前DC、前cDC1或前cDC2，
其中所述对照包括存在的其他细胞群或不表达CD169、CD327、AXL、CD271和/或CD234的pDC群。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述检测包括使疑似含有前DC的样品与对权利要求1-5中任一项所定义的生物标志物具有特异性的一种或多种结合分子接触，所述前DC包括早期前DC、前cDC1和/或前cDC2细胞，所述结合分子选自抗体、抗体的抗原结合片段、适体和配体。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述结合分子与选自以下的可检测标记偶联：荧光标记、放射性标记、化学标记、酶标记、蛋白质标记、磁性标记和重金属。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述检测包括质谱流式细胞技术或流式细胞术。
11.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品选自：血液样品；组织样品，其选自骨髓、肺、脾、肝、心脏、骨、皮肤、脂肪组织、真皮、肠、膀胱、肌腱、韧带、肌肉、筋膜、神经组织、血管、肾、软骨，组织切片，用于组织学目的而采集的组织的冷冻切片，档案样品、外植体和源自患者组织和/或任何其它合适组织的原代和/或转化的细胞培养物；选自外周血单核细胞的细胞样品；和体液样品，其选自淋巴液、囊液、痰、粪便、泪液、粘液、腹水、尿液、***渗出物和***吸出物。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述样品是活组织检查样品或尸检样品。
13.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品来自人受试者。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述方法还包括分离用权利要求1-5中任一项所定义的方法检测到的前DC细胞的步骤。
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