CN109906268A - 用于生产d-乳酸或其盐的发酵方法 - Google Patents

用于生产d-乳酸或其盐的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于生产D‑乳酸或其盐的发酵方法。所述方法包括下述步骤：通过用甘蔗果汁发酵，培养左旋芽孢乳杆菌细菌菌株，以便获得种子培养物；在甘蔗果汁中，发酵所获得的种子培养物，其中进行培养步骤的时间使得培养步骤中左旋芽孢乳杆菌菌株的终浓度的范围为每升400mg至1,600mg干细胞。根据本发明的所述方法可提供具有高光学纯度的D‑乳酸的高产量和产率。而且，所述方法可容易进行并且减少了复杂步骤。

Description

用于生产D-乳酸或其盐的发酵方法
技术领域
生物技术涉及使用左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)细菌菌株用于生产D-乳酸或其盐的发酵方法。
背景技术
众所周知，乳酸广泛用于塑料工业、食品和制药工业，以及化妆品工业。对于塑料工业，广泛使用乳酸，尤其用于生产聚酯，比如聚乳酸，或聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)。由乳酸生产的聚合物的优势在于它们是生物可降解的和生物相容的。所述聚合物可用于许多应用，比如纺织品纤维、膜、包装、医学领域中的肠线和支架。
目前，存在若干乳酸的生产方法，比如化学合成和生物技术方法，它们具有若干优势，包括在微生物发酵中使用自然资源作为原料，比如木薯玉米、小麦或甘蔗。所述原料可连续再生。而且，微生物发酵具有可生产具有高光学纯度的乳酸的另一优势。
工业规模上，大部分乳酸的生产是通过发酵糖，比如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或其他碳水化合物，比如淀粉或纤维素来生产，其中能够产生乳酸的微生物是细菌和真菌。目前，在工业规模上广泛生产L-乳酸。
但是，还未公开在工业规模上生产D-乳酸。存在若干问题，比如大部分天然发现的细菌或真菌产生具有高光学纯度的L-乳酸，但是极少数可产生D-乳酸。基于该原因，对于这些细菌或真菌的细节，仅仅有少量研究。所以，通过天然发现的微生物生产开发D-乳酸更加困难。
目前，生产聚合物的另一问题是原料昂贵。需要乳酸的生产开发，以使该生产开发是有效的、降低生产成本的，并提供高产率和产量。已经尝试开发可良好生长和再生的微生物和微生物培养步骤。乳杆菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)和链球菌(Streptococcus)是熟知的在厌氧条件下，由糖生产乳酸的细菌菌株，它们相比真菌节省了成本并且提供具有更高浓度的产品。然而，所述细菌组是苛养菌。所以，它们生长时，需要使用若干维生素和必需氨基酸。而且，所述细菌组不能产生用于淀粉水解的酶。所以，用作原料的淀粉在发酵中使用之前，需要水解成糖。这造成更高的生产成本。
降低乳酸的生产成本的一种尝试是通过在为了生产乳酸的发酵中施加甘蔗果汁，来减少糖纯化步骤。这可减少干燥步骤并且可利用甘蔗果汁直接作为发酵液并且可利用甘蔗果汁中的营养物作为用于微生物的营养源。
但是，因为微生物发酵步骤复杂，难以实现使用甘蔗果汁生产乳酸，尤其是D-乳酸。所以，无法以高浓度和产量获得D-乳酸产物。
Prachamorn等人(The production of the lactic acid using sugarcanejuice as precursor,KKU Research Journal,2008,8(3)，2008年，7月-9月)公开了通过乳杆菌属细菌，使用甘蔗果汁生产L-乳酸的方法。结果显示虽然使用了用来自酵母提取物的氮化合物强化的，蔗糖浓度为150g/L的甘蔗果汁，还是不能生产浓度高于23g/L的L-乳酸。
US2010/0112652公开了在使用芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus genus)细菌的甘蔗果汁中，D-乳酸的发酵步骤。从该公开，发现尽管已经添加了来自酵母提取物的氮化合物，但是D-乳酸的最大浓度仅仅为20g/L。
Kanwar等人(Lactic acid production from molasses by Sporolactobacilluscellulosolvens.Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica.1995.42(4),331-318)报道了在生产D-乳酸时，用溶纤维芽孢乳杆菌(Sporolactobacilluscellulosolvens)发酵糖蜜的结果，提供乳酸的终浓度为24.2g/L，这不足以在工业规模上生产。
Sawai等人(Membrane-integrated fermentation system for improving theoptical purity of the D-lactic acid produced during continuousfermentation.Bioscience and Biotechnology Biochemistry.2011.75(12),2326-2332)报道了用纯蔗糖发酵菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)、左旋芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus laevolacticus)和土芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus terrae)。尽管，这可生产高浓度的D-乳酸，但是发酵需要120小时，导致所述方法非常高的生产成本。
出于上述所有原因，本发明的目的是通过开发用于使用便宜原料比如甘蔗果汁，生产D-乳酸的发酵方法而克服所述上述问题。这些开发的方法可提供具有高光学纯度的D-乳酸的高产量和产率。而且，所述方法可容易进行并且减少了复杂步骤。
发明内容
本发明涉及用于生产D-乳酸或其盐的发酵方法。所述方法包括下述步骤：通过用甘蔗果汁发酵，培养左旋芽孢乳杆菌细菌菌株，以便获得种子培养物；在甘蔗果汁中，发酵所获得的种子培养物，其中进行培养步骤的时间使得培养步骤中左旋芽孢乳杆菌菌株的终浓度的范围为每升400mg至1,600mg干细胞。根据本发明的所述方法可提供具有高光学纯度的D-乳酸的高产率和产量。而且，所述方法可容易进行并且减少了复杂步骤。
附图说明
图1显示了微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株的16SrRNA基因的核苷酸序列。
图2显示了微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株的构造。
图3显示了微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株的阳性过氧化氢酶测试。
具体实施方式
定义
除非另外指出，否则本文使用的技术术语或科学术语具有如本领域普通技术人员理解的定义。
本文提到的任何工具、装置、方法或化学品意思是本领域普通技术人员通常操作或使用的工具、装置、方法或化学品，除非另外指出它们是本发明专用的工具、装置、方法或化学品。
权利要求或说明书中，结合“包括”使用单数名词或单数代词指“一个”并且也指“一个或多个”、“至少一个”和“一个或大于一个”。
遍及本申请，术语“约”用于指示本文呈现或显示的任何值可潜在地变化或偏离操作装置或方法的单个操作员，包括因物理特性的改变而造成的变化或偏离。
“甘蔗果汁”指在有或没有其他加工的情况下，从甘蔗挤压方法获得的产物。所述产物可包括但不限于糖、淀粉、有机酸、多酚、蛋白质、氨基酸、纤维、叶绿素、硫酸化的灰烬、树胶、蜡、SiO2形式的二氧化硅、P2O5形式的磷酸盐、CaO形式的钙、K2O形式的钾、MgO形式的镁，或其混合物。
糖可为选自葡萄糖、果糖、半乳糖或其混合物的单分子糖；选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖或其混合物的双分子糖；选自棉子糖、异麦芽三糖、麦芽三糖、黑曲霉三糖、蔗果三糖或其混合物的三糖。
遍及本发明，甘蔗果汁指从甘蔗果汁获得的溶液，包括从使甘蔗果汁经受浓缩工艺获得的产物。从甘蔗果汁获得的溶液的例子是来自蒸发工艺，直到获得高浓度的溶液，称为高级糖蜜(high-test molasses)，或来自甘蔗果汁中糖的沉淀，然后将沉淀物在水中再次重新溶解获得的产物。
“微需氧条件”指将空气的量控制为是有限的，而不添加任何其他气体，无论是添加空气或添加惰性气体以便替换现有空气的条件。
下文，显示本发明实施方式而不带有限制本发明的任何范围的目的。
本发明涉及用于生产D-乳酸或其盐的发酵方法，所述发酵方法包括下述步骤：
(a)在甘蔗果汁中，培养微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株，以便获得种子培养物；和
(b)在甘蔗果汁中，发酵从步骤(a)获得的种子培养物；
特征在于进行步骤(a)的时间使得步骤(a)中左旋芽孢乳杆菌菌株的终浓度的范围为约每升400mg至1,600mg干细胞，优选地范围为约每升1,000mg至1,400mg干细胞。
在本发明的一个实施方式中，在需氧条件下进行步骤(a)。
在本发明的一个实施方式中，步骤(a)具有的左旋芽孢乳杆菌菌株的起始浓度的范围为约每升40mg至240mg干细胞，优选地范围为约每升120mg至160mg干细胞。
在本发明的一个实施方式中，进行步骤(b)的时间的范围为约12小时至50小时，优选地范围为约45小时至50小时。
在本发明的一个实施方式中，步骤(b)中的甘蔗果汁包括的糖使得步骤(b)中的糖浓度的范围为约按体积计4％至15％，其中甘蔗果汁可为从处理或非处理的甘蔗果汁获得的甘蔗果汁。
在一个实施方式中，步骤(a)和(b)在范围为约35℃至40℃的温度下进行，优选地在约37℃的温度下进行。
在一个实施方式中，步骤(a)和(b)可进一步包括摇床混合，其中步骤(a)中的摇床混合速度的范围可为10rpm至1,200rpm并且步骤(b)中的摇床混合速度的范围可为10rpm至1,200rpm。
在优选的实施方式中，从根据本发明的发酵方法获得的D-乳酸或其盐的光学纯度大于95％，更优选地光学纯度大于99％。
根据本发明的适当的微生物
根据本发明的适当的微生物是左旋芽孢乳杆菌细菌菌株，尤其是保藏在日本NITE专利微生物保藏中心(NITE Patent Microorganisms Depositary)(NPMD)，登录号为NITEABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株。
在一个实施方式中，根据本发明的左旋芽孢乳杆菌可在需氧条件下，在大于30℃的温度下生长并且可生产具有高光学纯度的D-乳酸或其盐。
优选地，所述左旋芽孢乳杆菌可在需氧条件下，在范围为30℃至42℃的温度下生长，并且可生产光学纯度超过95％的D-乳酸或其盐。
最优选地，所述左旋芽孢乳杆菌可在需氧条件下，在约37℃的温度下生长，并且可生产光学纯度超过99％的D-乳酸或其盐。
根据本发明的左旋芽孢乳杆菌是核苷酸序列为如图1中显示的16S rRNA基因的***，构造如图2中显示，并且如图3中显示，过氧化氢酶测试为阳性。
培养左旋芽孢乳杆菌细菌菌株和发酵由甘蔗果汁制备的种子培养物以生产D-乳 酸
下述是培养根据本发明的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株并且发酵由甘蔗果汁制备的种子培养物，用于生产D-乳酸的实施例。这些实施例仅仅是为了表明本发明的目的，而决不旨在限制本发明。
通过如下面阐释的方法和工具进行测定根据本发明的各特性，其中各测试方法和工具是常用的方法和工具并且不旨在限制本发明的范围。
使用配备Biorad柱、Aminex HPX-87H离子排阻有机酸300mm x 7.8mm的高效液相色谱(Agilent Technology)，在50℃的温度下测定糖、乳酸和副产物的量。使用的检测器是反射率检测器(Agilent Technology)作为与标准溶液的比较信号工具。
使用手性柱(Sumipack，Sumichiral OA5000)，在40℃的温度下，测定光学纯度。硫酸铜(CuSO4)用作洗脱液。流速是1mL/min。通过UV检测器，在254nm的波长下检测信号。
通过分光光度法在600nm的波长下，测定培养或发酵期间的光密度(OD)。
由生产的乳酸与发酵期间使用的糖之间的比例计算产率。
实施例1：使用根据本发明的方法生产D-乳酸，其中培养和发酵包括摇床混合
培养步骤中使用的微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株的制备可通过在每升具有下述组成的固体培养基中添加所述细菌进行：约10g的蔗糖、约15g的酵母提取物、约4g的氯化铵(NH4Cl)、约0.25g的磷酸氢二钾(K2HPO4)、约0.25g的磷酸二氢钾(KH2PO4)、约5g的碳酸钙(CaCO3)、约5g的硫酸镁(MgSO4)、约400mg的硫酸锰(MnSO4)、约20mg的硫酸亚铁、约20mg的氯化钠(NaCl)和约20g的琼脂。将混合器在约37℃下温育约24小时。
用于生产种子培养物的培养可通过用约0.5％至2％的氯化钠(NaCl)溶液将细菌稀释在所述固体培养基中而进行，以获得每升细菌细胞约12,000至16,000mg干细胞。然后，将约250μL的所述稀释细菌添加至包含下述的250mL烧瓶中：25L的糖浓度按重量计约1％的甘蔗果汁、约0.38g的酵母提取物、约0.10g的氯化铵、约6.25mg的磷酸氢二钾、约6.25mg的磷酸二氢钾、约0.13g的碳酸钙、约10mg的硫酸镁、约0.5mg的硫酸锰、约0.5mg的硫酸亚铁和约0.5mg的盐。根据该步骤，可获得每升约120mg至160mg干细胞的细菌细胞的起始浓度。然后，在约37℃的温度下，在需氧条件下，进行培养以获得种子培养物。摇床混合速率为约200rpm，持续约5小时，直到细菌细胞的终浓度为约每升1,000mg至1,400mg干细胞。
其后，通过添加糖浓度为按重量计约20％的约25ml的甘蔗果汁，发酵所述种子培养物。用碳酸钙将pH控制为约5.5至6.5。在约37℃的温度下，在微需氧条件下，进行发酵。摇床混合速度为约250rpm，持续约48小时。
实施例2：用根据本发明的方法生产D-乳酸，其中培养步骤包括摇床混合步骤
根据如实施例1中描述的方法，制备种子培养物。其后，在没有摇床混合的情况下，根据如实施例1中描述的方法发酵种子培养物。
实施例3：用根据本发明的方法生产D-乳酸，其中培养和发酵步骤包括摇床混合步骤，并且发酵在5L发酵罐中进行
培养生产种子培养物可通过如下进行：用约0.5％至2％的氯化钠(NaCl)溶液，将所述细菌稀释在从如实施例1中描述的步骤获得的固体培养基中，以获得每升细菌细胞约12,000至16,000mg干细胞的浓度。然后，将约750μL的所述稀释细菌添加至包含下述的500mL烧瓶中：糖浓度为按重量计约1％的75L的甘蔗果汁、约1.14g的酵母提取物、约0.30g的氯化铵、约18.75mg的磷酸氢二钾、约18.75mg的磷酸二氢钾、约0.39g的碳酸钙、约30mg的硫酸镁、约1.50mg的硫酸锰、约1.50mg的硫酸亚铁和约1.50mg的盐。根据该步骤，可获得每升约120-160mg干细胞的细菌细胞的起始浓度。然后，在约37℃的温度下进行培养用于获得细胞培养物。在需氧条件下，通过碳酸钙，将pH控制为约5.5至6.5。摇床混合速率为约200rpm，直到细菌细胞的终浓度为约每升1,000mg至1,400mg干细胞。其后，将获得的溶液添加至包括下述的5L发酵罐中：糖浓度为约按重量计1％的约1.5L的甘蔗果汁、约22.5g的酵母提取物、约6.0g的氯化铵、约0.38g的磷酸氢二钾、约0.38g的磷酸二氢钾、约7.5g的碳酸钙、约600mg的硫酸镁、约30mg的硫酸锰、约30mg的硫酸亚铁和约30mg的盐。其后，在约37℃的温度下培养细菌，并且在需氧条件下，通过碳酸钙将pH控制为约5.5至6.5。以1.5L/min的速率添加空气。摇床混合速度为约300rpm，直到细菌细胞的浓度为约每升1,000mg至1,400mg干重。
其后，通过添加糖浓度为按重量计约20％的约1.5L的甘蔗果汁，发酵从上述步骤制备的种子培养物。用碳酸钙，将pH控制为约5.5至6.5。在约37℃的温度下，在微需氧条件下，进行发酵。摇床混合速度为约300rpm，持续约45小时。
表1显示了根据本发明，通过用甘蔗果汁的发酵方法，微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株生产D-乳酸。
从表1发现用根据本发明的方法，用甘蔗果汁进行培养左旋芽孢乳杆菌并且发酵所获得的种子培养物的实施例1、2和3产生了良好的D-乳酸。换句话说，其提供了最大量的D-乳酸，约117g/L；每起始糖的最大的产率，约1.0g/g；并且获得的D-乳酸的光学纯度为约99％。
本发明的最佳模式
本发明的最佳模式如在本发明的说明书中提供。

Claims (13)

1.一种用于生产D-乳酸或其盐的发酵方法，所述发酵方法包括下述步骤：
(a)在甘蔗果汁中培养微生物登录号为NITE ABP-02334的左旋芽孢乳杆菌细菌菌株，以便获得种子培养物；和
(b)在甘蔗果汁中发酵从步骤(a)获得的所述种子培养物；
特征在于进行步骤(a)的时间使得步骤(a)中左旋芽孢乳杆菌菌株的终浓度的范围为每升400mg至1,600mg干细胞。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其中步骤(a)中所述左旋芽孢乳杆菌菌株的终浓度的范围为每升1,000mg至1,400mg干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其中在需氧条件下进行步骤(a)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的发酵方法，其中步骤(a)具有的左旋芽孢乳杆菌菌株的起始浓度的范围为每升40mg至240mg干细胞。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其中步骤(a)具有的左旋芽孢乳杆菌菌株的起始浓度的范围为每升120mg至160mg干细胞。
6.根据权利要求1所述的发酵方法，其中步骤(b)在微需氧条件下进行。
7.根据权利要求1或6所述的发酵方法，其中进行步骤(b)的时间的范围为12小时至50小时。
8.根据权利要求7所述的发酵方法，其中进行步骤(b)的时间的范围为45小时至50小时。
9.根据权利要求1所述的发酵方法，其中步骤(b)中的所述甘蔗果汁包括糖，使得步骤(b)中所述糖的浓度的范围为按体积计4％至15％。
10.根据权利要求1所述的发酵方法，其中在范围为35℃至40℃的温度下进行步骤(a)和(b)。
11.根据权利要求10所述的发酵方法，其中在37℃的温度下进行步骤(a)和(b)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的发酵方法，其中所述D-乳酸或其盐的光学纯度大于95％。
13.根据权利要求12所述的发酵方法，其中所述D-乳酸或其盐的光学纯度大于99％。
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