CN109900914A - 一种基于特异性ca19-9抗体的纸基传感器的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于特异性CA19‑9抗体的纸基传感器的检测方法，包括：滤纸纸基；羧基化碳纳米管，若干所述羧基化碳纳米管沉积于所述滤纸纸基，所述羧基化碳纳米管特征性结合有胰腺癌细胞的特异性CA19‑9抗体。本发明能够将抗原浓度信息转换为直接可测的电信号，具有制造成本低，精度高，稳定性强的优点，可实现经济、快速的癌症抗原筛查；另外，本发明的传感器在低CA19‑9浓度范围(0～40U/ml)下仍具有良好的探测性，在早期阶段能够发现胰腺癌。本发明传感器的检测时间只需两个小时左右，在检测效率上比ELISA快约12倍。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域以及癌症检测技术领域，特别涉及一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法。
背景技术
癌症的早期检测对于其早发现、早治疗至关重要，能显著提高病人的生存机会。以胰腺癌为例，其是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌，其发病率和死亡率近年来明显上升。胰腺癌发病后5年生存率小于1％，是死亡率最高的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的检测对保证高生存率至关重要，胰腺癌于早期检测出来后接受治疗几乎可以100％延长患者五年的存活时间，但它在后期阶段下降到31％。目前检测早期胰腺癌的方式多种多样，如检测血清中的肿瘤标物(CA19-9)，超声波检查，CT扫描检查，造影检查等。酶联免疫吸附法(ELISA)是医院常用的CA19-9检测方法，这种方法的重复性欠佳，且易于受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，此外，采用这种方法时，不论仪器和手工操作，干扰因素较多，成本较高，不易于普及。
因此，虽然针对癌症及其抗原的早期检测方法繁多，但受到检测极限、检测成本、检测条件的约束较大，即使是目前较为成熟的ELISA检测法也仍然存在耗时长(大约1天)，费用高，且检测需在装备完善的实验室进行的缺陷。综上，现有的检测技术受到检测场所、条件等限制，其高昂费用也将给受试者更大的经济压力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，以解决上述存在的一个或多个技术问题。本发明的纸基传感器，在低CA19-9浓度范围下仍具有良好的探测性；本发明检测条件要求不高，检测速度快速，具有显著的推广潜力。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，在纸基传感器的滤纸纸基未完全干燥前，通过两个电极测量纸基传感器的初始阻值R0，并记录；
步骤2，在纸基传感器的生物传感器元件上滴加待测血清；
步骤3，将步骤2处理后的纸基传感器密封在干燥箱中培育预设时间，使得待测血清中的抗原与生物传感器元件上的抗体相结合，然后在空气中干燥；
步骤4，测量获取步骤3处理后的纸基传感器的电阻值R；
步骤5，计算R/R0的比值；根据计算的比值与抗原浓度的线性化关系得出抗原浓度，完成待测血清中的肿瘤标物浓度检测。
进一步地，步骤3具体包括：在干燥箱中，于36℃～38℃环境培育使得抗原抗体结合；干燥去除多余的水。
进一步地，步骤5中，R/R0比值与抗原浓度为线性关系。
进一步地，步骤1中的纸基传感器按照以下步骤制备获得：
S1，准备材料：按照质量份数记，每2份羧基化多壁碳纳米管对应大于等于77份的EDC以及大于等于22份的NHSS；
S2，将羧基化碳纳米管、EDC和NHSS分散于MES溶液中，震荡并混匀；
S3，将S2获得的混合液放入离心机离心，离心后除去上清液；
S4，向S3处理后的容器内剩余沉淀中加入PBS缓冲溶液，中和残余的EDC和NHSS，震荡离心并除去上清液；此步骤重复若干次，然后跳转至步骤S5；
S5，先加入PBS以增加羧基化多壁碳纳米管的均匀性，然后将CA19-9抗体加入到混合液中，搅拌使得CA19-9抗体加在羧基化多壁碳纳米管中；
S6，将Tween 20溶液混合在BSA中，然后加入到步骤S5处理后获得的混合液中，静置后，离心处理并除去上清液；
S7，将PBS缓冲液加入步骤S6获得的沉淀中，清洗去除多余CA19-9抗体和BSA；此步骤重复若干次，获得结合了CA19-9抗体的多壁碳纳米管混合物；
S8，将步骤S7中得到的混合物分散于水溶液，混匀后沉积在滤纸纸基上，获得用于检测癌症抗原的纸基传感器元件。
进一步地，步骤1中，所述纸基传感器包括：滤纸纸基、生物传感器元件和两个电极；
所述滤纸纸基上沉积有所述生物传感器元件；所述生物传感器元件包括：羧基化碳纳米管；所述羧基化碳纳米管表面特征性结合有胰腺癌细胞的特异性CA19-9抗体；两个电极分别与所述生物传感器元件电连接。
进一步地，所述滤纸纸基采用微孔滤纸。
进一步地，羧基化碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管。
进一步地，电极为金属电极；两个金属电极分别通过导电胶粘接在生物传感器元件上。
进一步地，还包括：第二基板；所述滤纸纸基封装于两块第二基板之间，两个电极连接有引出导线。
进一步地，所述第二基板为载玻片；所述引出导线为铜导线；所述滤纸纸基通过银胶粘在载玻片上。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明传感器的检测时间只需两个小时左右，在检测效率上比ELISA快约12倍；且药品用量相对较少，使用的多壁碳纳米管等材料价格低廉，成本相对较低，与现有的酶联免疫吸附法相比更加适合欠发达地区癌症的早期筛查，具有显著的推广潜力。
本发明的传感器中，在多壁碳纳米管表面添加有能与胰腺癌抗原CA19-9特异性结合的单克隆抗体，并将多壁碳纳米管沉积在具有固定尺寸的试纸表面，最后连接金属电极进行电学测试表征，能够将抗原浓度信息转换为直接可测的电信号(即U-I特性，可反映电阻)，具有制造成本低，精度高，稳定性强的优点，可实现经济、快速的癌症抗原筛查。
本发明的具体优势体现在：对于肿瘤的生物标志物检测范围极大，最大检测极限超过1000U/mL，是现有酶联免疫吸附法(ELISA)的十几倍；另外，正常机体的CA19-9浓度应小于40U/ml，本发明的传感器在低CA19-9浓度范围(0～40U/ml)下仍具有良好的探测性，这意味着传感器可以检测CA19-9的低浓度，以在早期阶段能够发现胰腺癌。
附图说明
图1是本发明实施例的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的结构示意图；
图2是本发明实施例的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的制备方法流程示意图；
图3是本发明的制备方法中带抗体多壁碳纳米管的制备流程示意图；
图4是本发明的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测抗原浓度流程示意图；
图5是不同批次生产的本发明的传感器的抗原浓度电阻测试示意图；图5(a)为第一批次电阻测试示意图；图5(b)为第二批次电阻测试示意图；图5(c)为第三批次电阻测试示意图；图5(d)为第四批次电阻测试示意图；
图6是本发明实施例中羧基化多壁碳纳米管的SEM电镜图；
图7是本发明实施例中接抗体后的羧基化多壁碳纳米管的SEM电镜图；
图8是本发明实施例中接抗原抗体后的羧基化多壁碳纳米管的SEM电镜图；
图1中，1、铜导线；2、载玻片；3、微孔滤纸；4、金属电极；5、CA19-9抗体-多壁碳纳米管。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
请参阅图1，本发明实施例的一种用于检测癌症的生物传感器元件，包括：滤纸纸基，滤纸纸基采用微孔滤纸3，微孔滤纸的滤孔可以小于等于1.8um；在滤纸纸基上沉积有若干羧基化多壁碳纳米管，所述羧基化多壁碳纳米管添加有保持活性的预设肿瘤标物；例如为CA19-9抗体-多壁碳纳米管5，即特征性结合的预设肿瘤标物为胰腺癌细胞的特异性抗体CA19-9；两个金属电极4分别通过导电胶与羧基化碳纳米管电连接。滤纸纸基用银胶固定并封装于两块载玻片2之间，两个金属电极4通过铜导线1引出。本发明的传感器中，在多壁碳纳米管(MWCNTs)表面添加有胰腺癌细胞的特异性抗体CA19-9，并将多壁碳纳米管沉积在具有固定尺寸的试纸表面，最后连接金属电极4进行电学测试表征，能够将抗原浓度信息转换为直接可测的电信号(即U-I特性，可反映电阻)，具有制造成本低，精度高，稳定性强的优点，可实现经济、快速的癌症抗原筛查。
请参阅图2、图3以及图6至图8，本发明实施例的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的制备方法，包括：按照质量份数记，羧基化多壁碳纳米管为2份，EDC应大于等于77份，NHSS应大于等于22份；
具体的，准备制备过程需要的试剂及材料：羧基化多壁碳纳米管2mg、至少4mL(0.1M)MES溶液、EDC粉末77mg、NHSS粉末22mg、PBS溶液至少100mL、Tween20溶液(浓度0.05％)10uL、BSA溶液(浓度1％)100uL、滤纸两张、载玻片两片、凝胶、抗体溶液(浓度0.01mg/mL)0.5mL。
其制备过程包括以下步骤：
1)称2mg的羧基化碳纳米管，然后把粉末倒进大离心管；也可自行设计羧基化步骤，通过羧化能增强抗体与碳纳米管的结合能力。
2)用滴管向大离心管里滴加2mL的MES溶液，用于提高碳纳米管的分散性。
3)将大离心管放进超声波震荡机，震荡1min，再使用混匀仪将溶液混匀。
4)称取77mg EDC并倒入离心管，再加1mL的MES，清洗管壁，然后超声波震荡10-15min。
5)称取并向大离心管内加入22mg NHSS，用于保护EDC在与抗原结合之前不水解；再加MES到4mL，之后超声波震荡40min。
6)震荡完成后用MES冲洗管壁，定容并放入离心机离心(5000r/min)10min，离心后用滴管吸出上清液。
7)向大离心管内加入PBS至7.5mL，以中和残余的EDC和NHSS，再超声波震荡1min，完成后离心(5000r/min)10min，结束后用滴管吸出上清液。该步骤至少重复5次。
8)加入PBS至10mL，也可加入更多PBS使碳纳米管分散的更均匀，超声波震荡1min，全部倒入磁转子瓶；用PBS清洗离心管管壁，洗液倒入磁力搅拌瓶。
9)取出抗体并在室温下解冻；将抗体倒进磁转子瓶，并用PBS将剩余抗体冲洗出来。
10)用磁力搅拌机搅拌一昼夜，温度设置在20度以下，使CA19-9加在功能化修饰的多壁碳纳米管中。
11)搅拌完成后，用移液枪向大离心管内加入10uL的Tween20和100Ul的BSA；其中，Tween20为非离子型表面活性剂，用于清除CA19-9抗体的结合位点，BSA用于阻止所有的非特征结合；然后室温静置一小时。
12)离心10min(5000r/min)，去除上清液，然后加入PBS定容至7.5mL，超声波震荡1min，以去除多余CA19-9抗体和BSA。该步骤至少重复5次，最后一次离心后加水，用超声波震荡混匀。
13)取出一张滤纸，在8个环形对称位置处画出2mm×5mm的长方形。
14)抽滤大离心管内的液体到另一张滤纸上。
15)将两张滤纸重叠到一起，剪出8个长方形纸基传感器元件。
16)用导电银胶在8个长方形纸基传感器两端各粘上一根铜线，后密封保存，完成制备。
本发明通过在多壁碳纳米管(MWCNT)表面添加胰腺癌细胞的特异性CA19-9抗体，并将其沉积在具有固定尺寸的试纸表面，最后连接金属电极进行电学测试表征，将抗原浓度信息转换为直接可测的电信号(即可反映电阻的U-I特性)，制造出成本低，精度高，稳定性强的癌症抗原浓度检测试纸，可实现经济、快速的癌症抗原筛查。本发明具有如下优势：对于肿瘤的生物标志物检测范围极大，最大检测量为超过1000U/mL，是现有酶联免疫吸附法(ELISA)的十几倍，而更重要的是，正常机体的CA19-9浓度应小于40U/ml，本传感器在低CA19-9浓度范围(0～40U/ml)下仍具有良好的探测性，这意味着传感器可以检测CA19-9的低浓度，以在早期阶段能够发现胰腺癌。检测时间只需两个小时左右，在检测效率上比ELISA快约12倍，而且使用的多壁碳纳米管等材料价格低廉，与现有的酶联免疫吸附法相比更加适合欠发达地区癌症的早期筛查。
请参阅图4，本发明实施例的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测抗原浓度的方法，包括：
1)在滤纸未完全干燥前，先测量并记录纸基传感器初始阻值R0。
2)在纸基传感器上滴加10uL抗原；此处根据制备纸基传感器中抗原的预设体积加入。
3)于36℃～38℃环境培育使得抗原抗体结合；干燥去除多余的水；例如，于37℃环境培育至少1.5h；在空气中干燥至少30min；具体的，密封后在干燥箱中37℃培育1.5h，然后在空气中打开盖子，盖子虚掩住，干燥30min。
4)测量抗原抗体结合后的纸基传感器电阻R。
5)计算R/R0的值，由该值和抗原浓度的线性化关系可得出抗原浓度，即可检测出血清中的肿瘤标物浓度。
本发明实施例的一种用于检测癌症的生物传感器元件的制备方法，包括以下步骤：准备2mg的羧基化多壁碳纳米管(购买于上海麦克林生化科技有限公司，内径5-12nm，外径30-50nm，长度<10nm)，加入0.4mmolEDC和0.1mmolNHSS，并分散于4mL的0.1mol的MES溶液中。分散溶液在超声仪(新芝SB-3200 OTD)中水浴超声约40min，再用混匀仪(SCI LOGEXICC 8)混合均匀。混合后用离心机(平凡仪器TD6)离心10min(3000rp/m)，然后去除上清液。结束后将PBS缓冲溶液加入沉淀中，离心10min(3000rp/m)，去除上清液。重复上述PBS洗涤过程洗至少5次去除沉淀中多余的EDC和NHSS。将CA19-9抗体0.5mL(0.01mg/mL，购买于上海领潮生物科技有限公司)，加入到混合液中，常温下将小瓶置于磁力搅拌器上搅拌一夜，使CA19-9加在功能化修饰的多壁碳纳米管中。
将浓度为0.05％的Tween 20溶液混合在100μL的1％BSA中，然后将其加入搅拌一夜后所得的溶液中。待混合物溶液在室温下静置一小时后，用离心机(平凡仪器TD6)离心10min(5000rp/m)，去除上清液，清洗沉淀并与PBS缓冲液离心5次去除多余CA19-9抗体和BSA。这个过程的产物所得的产物叫做CA19-9抗体-多壁碳纳米管。
将所得产物分散于水溶液，并在超声仪(新芝SB-3200OTD)中水浴超声混匀。采用注射过滤法将CA19-9抗体-多壁碳纳米管沉积在微孔滤纸上，并将碳纳米管饼滤纸剪成5mm×2mm规格(滤纸应该从中心到圆周切割)，从而制备出我们的生物传感器元件。
本发明实施例的一种纸基传感器检测方法，包括：将100μL包含PBS溶液的CA19-9滴在滤纸单元上，应保留一片不滴加CA19-9的传感器单元作对照，放在带有密封盖的塑料皿中37℃保持1.5h，在空气中干燥30min。
在环境条件下，进行U-I特性的测量，测出该传感器单元的电阻值，其与不加CA19-9的传感器单元的电阻值之比应当满足以下线性关系：
抗原浓度(U/mL)＝90.513·(R/R0)-87.636
根据此测量结果，便可计算得出所滴加的抗原浓度。在试剂略有区别的情况下，线性关系函数取值可能略有不同，故为了更加精确，实际使用中，建议先按制备过程制作第一批样品计算出函数关系，再进行检测。
请参阅图5，本发明的纸基传感器的性能验证：
实际考量纸基传感器性能中，一共制作了4批产品。一次从第一个批次制造了3个相同的传感元件，并在3个CA19-9水平上进行了电阻测试；一次从第二个批次制造了6个相同的传感元件，并在6个CA19-9水平上进行了电阻测试；一次从第三个批次制造了5个相同的传感元件，并在5个CA19-9水平上进行了电阻测试；一次从第四个批次制造了6个相同的传感元件，并在6个CA19-9水平上进行了电阻测试。这是一种很好的检查传感器性能的方法，因为制备的传感器不应该被干燥，直到CA19-9检测过程保持生物活性。图(a)、(b)、(c)、(d)示出电阻的变化几乎线性地在0～1000U/ml范围内的CA19-9浓度上变化。这种线性度的测试可以用作检测的内部标准，以确认相同的批感测元件在不同检测环境下的检测能力。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在纸基传感器的滤纸纸基未完全干燥前，通过两个电极测量纸基传感器的初始阻值R0，并记录；
步骤2，在纸基传感器的生物传感器元件上滴加待测血清；
步骤3，将步骤2处理后的纸基传感器密封在干燥箱中培育预设时间，使得待测血清中的抗原与生物传感器元件上的抗体相结合，然后在空气中干燥；
步骤4，测量获取步骤3处理后的纸基传感器的电阻值R；
步骤5，计算R/R0的比值；根据计算的比值与抗原浓度的线性化关系得出抗原浓度，完成待测血清中的肿瘤标物浓度检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，步骤3具体包括：在干燥箱中，于36℃～38℃环境培育使得抗原抗体结合；干燥去除多余的水。
3.根据权利要求1所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，步骤5中，R/R0比值与抗原浓度为线性关系。
4.根据权利要求1所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，步骤1中的纸基传感器按照以下步骤制备获得：
S1，准备材料：按照质量份数记，每2份羧基化多壁碳纳米管对应大于等于77份的EDC以及大于等于22份的NHSS；
S2，将羧基化碳纳米管、EDC和NHSS分散于MES溶液中，震荡并混匀；
S3，将S2获得的混合液放入离心机离心，离心后除去上清液；
S4，向S3处理后的容器内剩余沉淀中加入PBS缓冲溶液，中和残余的EDC和NHSS，震荡离心并除去上清液；此步骤重复若干次，然后跳转至步骤S5；
S5，先加入PBS以增加羧基化多壁碳纳米管的均匀性，然后将CA19-9抗体加入到混合液中，搅拌使得CA19-9抗体加在羧基化多壁碳纳米管中；
S6，将Tween 20溶液混合在BSA中，然后加入到步骤S5处理后获得的混合液中，静置后，离心处理并除去上清液；
S7，将PBS缓冲液加入步骤S6获得的沉淀中，清洗去除多余CA19-9抗体和BSA；此步骤重复若干次，获得结合了CA19-9抗体的多壁碳纳米管混合物；
S8，将步骤S7中得到的混合物分散于水溶液，混匀后沉积在滤纸纸基上，获得用于检测癌症抗原的纸基传感器元件。
5.根据权利要求1所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述纸基传感器包括：滤纸纸基、生物传感器元件和两个电极；
所述滤纸纸基上沉积有所述生物传感器元件；
所述生物传感器元件包括：羧基化碳纳米管；所述羧基化碳纳米管表面特征性结合有胰腺癌细胞的特异性CA19-9抗体；
两个电极分别与所述生物传感器元件电连接。
6.根据权利要求5所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，所述滤纸纸基采用微孔滤纸。
7.根据权利要求5所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，羧基化碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管。
8.根据权利要求5所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，电极为金属电极；两个金属电极分别通过导电胶粘接在生物传感器元件上。
9.根据权利要求5所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，还包括：第二基板；
所述滤纸纸基封装于两块第二基板之间，两个电极连接有引出导线。
10.根据权利要求9所述的一种基于特异性CA19-9抗体的纸基传感器的检测方法，其特征在于，所述第二基板为载玻片；所述引出导线为铜导线；所述滤纸纸基通过银胶粘在载玻片上。
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Application publication date: 20190618 |
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