CN109897809A - 合成钴（II）啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种合成CBAD的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。具体地，本发明以大肠杆菌为出发菌株，构建了包含尿卟啉原III基因模块并且内源的血红素合成基因的表达被下调的工程菌，所述工程菌可以提高HBA的前体尿卟啉原III的积累，并且可以降低血红素途径通量，从而进一步提高HBA产量。

Description

合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法 与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

钴(II)啉酸a，c-二酰胺(Cob(II)yrinic acid a,c-diamide，CBAD)是合成维生素B₁₂的前体。在大肠杆菌中表达腺苷钴胺素合成基因cobAIGJMFKLH、cobB、cobNST、cbiMNQO，可以得到钴(II)啉酸a，c-二酰胺。但是现有技术中钴(II) 啉酸a，c-二酰胺的产量很低，必然导致维生素B₁₂的产量低。LC-MS没有检测到Hydrogenobyrinic acid(HBA)，说明HBA的产量低可能是钴(II)啉酸a，c- 二酰胺产量低的直接原因。

δ-aminolevulinate(ALA)是合成维生素B₁₂的前体，大肠杆菌自身可以通过C₅途径合成ALA。利用大肠杆菌来合成ALA的研究比较多，多数都是通过构建异源的C₄途径。表达光合细菌如Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas palustris的ALA合成酶基因hemA、hemO都可以使大肠杆菌积累ALA。

目前，现有技术中利用大肠杆菌合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的产量都不高，不能满足工业生产的需求。因此，本领域迫切需要开发适用于工业生产的合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于生产CBAD(钴(II)啉酸a，c-二酰胺) 或其前体的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块 (genemodule)，所述的基因模块包括：

(a)尿卟啉原III基因模块，所述尿卟啉原III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、 hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

并且，所述工程菌的内源的血红素合成基因的表达被下调；

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和 /或hemH基因。

在另一优选例中，所述工程菌的内源基因endA被下调或缺失。

在另一优选例中，所述的尿卟啉原III基因模块整合在基因组上，较佳地整合于***糖诱导的启动子P_BAD位点。

在另一优选例中，所述的hemA基因、hemO基因、hemB基因、hemC基因和 hemD基因各自独立地来源于：Rhodobacter capsulatus菌株、Sinorhizobium meliloti菌株、Rhodopseudomonas palustri菌株、Brucella melitensis菌株、 Rhodobactersphaeroides菌株、或Brucella melitensis菌株；

优选地，hemA基因来源于Sinorhizobium meliloti菌株、或R.palustri菌株，

hemO基因来源于R.palustri菌株；

hemB基因、hemC基因和hemD基因来源于S.meliloti菌株。

在另一优选例中，来源于Sinorhizobium meliloti菌株的hemA基因的序列如 SEQID NO.:1所示。

在另一优选例中，来源于R.palustri菌株的hemA基因的序列如SEQ ID NO.:2 所示。

在另一优选例中，所述的hemO基因的序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述的hemB基因的序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述的hemC基因的序列如SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述的hemD基因的序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述的基因模块还包括：

(b)HBA基因模块，所述HBA基因模块表达用于以尿卟啉原III为原料，生物合成HBA的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBA的基因包括：cobA基因、cobI基因、cobG 基因、cobJ基因、cobM基因、cobF基因、cobK基因、cobL基因、和cobH基因；

(c)HBAD基因模块,所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成 HBAD的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBAD的基因包括：cobB基因；

(d)CBAD基因模块，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD为原料，生物合成 CBAD的基因；

较佳地，所述的用于生物合成CBAD的基因包括：(i)cobN基因、cobS基因、cobT 基因、cobW基因，或(ii)cobN基因、chlI基因、chlD基因、cobW基因、或其组合；

(e)钴吸收基因模块，所述钴吸收基因模块表达用于向胞内转运钴离子的转运蛋白的编码基因；

较佳地，所述的用于向胞内转运钴离子的转运蛋白编码基因包括cbiMNQO操纵子，所述的cbiMNQO操纵子包括：串联表达的cbiM基因、cbiN基因、cbiQ基因和cbiO基因；和

(f)血红素途径弱化模块，所述血红素途径弱化模块用于(通过sRNA)下调血红素合成基因的表达；

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和 /或hemH基因。

在另一优选例中，所述的钴吸收基因模块还包括cbtAB操纵子，所述的cbtAB 操纵子包括：串联表达的cbtA基因和cbtB基因。

在另一优选例中，当所述的基因模块含有≥2个基因时，有部分或全部基因是串联表达的。

在另一优选例中，所述的HBA基因模块中的基因为串联表达的。

在另一优选例中，所述的HBAD基因模块和CBAD基因模块串联表达。

在另一优选例中，所述的各基因模块中的各个基因受组成型或诱导型启动子的驱动。

在另一优选例中，所述的各基因模块中的各个基因受诱导型启动子的驱动。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：T7启动子、tac启动子、trc启动子、 lac启动子、***糖诱导型启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述的表达模块部分或全部整合在基因组上。

在另一优选例中，所述的表达模块部分或全部位于表达载体上。

在另一优选例中，所述的载体为质粒和/或核酸片段。

在另一优选例中，所述的载体还具有抗性基因元件。

在另一优选例中，所述抗性基因选自下组：四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、硫酸链霉素抗性基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体还具有终止子元件。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌还含有外源的T7RNA聚合酶表达盒。

在另一优选例中，所述的T7RNA聚合酶表达盒整合在基因组上，较佳地整合于lacZ位点。

在另一优选例中，所述的cbiM基因、cbiN基因、cbiQ基因和cbiO基因各自独立地来源于：R.capslutaus菌株、Salmonella typhimurium菌株、Propionibacterium.freudenreichii subsp.Shermanii菌株、Klebsiella pneumoniae 菌株、Yersinia enterocolitica菌株、Bacillus stearothermophilus菌株、Listeriamonocytogenes菌株、Clostridium acetobutylicum菌株、Clostridium perfringens菌株、Clostridium botulinum菌株、Clostridium difficile菌株、Desulfitobacteriumhalfniense菌株、Streptomyces coelicolor菌株、Propionibacterium.freudenreichiisubsp.Shermanii菌株、Chlorotium tepidum菌株、Methanosarcina acetivorans菌株、Archeoglobus fuldigus菌株、Methanococcus jannaschii菌株、Methanobacteriumthermoaut菌株、或Geobacter metallireducens菌株，较佳地来源于R.capslutaus 菌株、或Salmonella typhimurium菌株。

在另一优选例中，所述的cbiMNQO操纵子整合在基因组上，较佳地整合于 ldhA基因位点。

在另一优选例中，所述的cbtA基因和cbtB基因各自独立地来源于：Pseudomonasdenitrificans菌株、Mesorhizobium loti菌株、Brucella melitensis菌株、Agrobacterium tumefaciens菌株、Pseudomonas putida菌株、Pseudomonas fluorescens菌株、Pseudomonas syringae菌株、或Pseudomonas aeruginosa菌株。

在另一优选例中，所述HBA基因模块中的各个基因来源于R.capsulatus菌株、S.meliloti菌株、B.melitensis菌株、或Pseudomonas denitrificans菌株；优选地来源于R.capsulatus菌株。

在另一优选例中，所述cobB基因、cobN基因、cobS基因、cobT基因和cobW基因各自独立地来源于：R.capsulatus菌株、S.meliloti菌株、B.melitensis菌株、 Sinorhizobiummeliloti菌株、Mesorhizobium loti菌株、Bradyrhizobium japonicum 菌株、Agrobacterium tumefaciens菌株、或Rhodopseudomonas palustris菌株；

优选地，所述的cobN基因、cobS基因、cobT基因、cobW基因来源于B.melitensis 菌株；

优选地，所述的cobB基因来源于R.capsulatus菌株。

在另一优选例中，所述cobN基因、chlI基因、chlD基因和cobW基因各自独立地来源于Pseudomonas denitrificans菌株、Burkholderia pseudomallei菌株、 Ralstoniasolanacearum菌株、Pseudomonas aeruginosa菌株、Pseudomonas putida 菌株、Pseudomonas fluorescens菌株、Pseudomonas syringae菌株、 Corynebacteriumdiphtheriae菌株、Mycobacterium tuberculosis菌株、Thermobifida fusca菌株、Rhodococcus属菌株、Streptomyces coelicolor菌株、Treponema denticola菌株、Chlorobium tepidum菌株、或Halobacterium属菌株；

优选地，所述的cobN基因、chlI基因、chlD基因和cobW基因来源于 Pseudomonasdenitrificans菌株。

在另一优选例中，所述的工程菌用于从头合成CBAD。

在另一优选例中，所述的工程菌可以用于从头合成维生素B₁₂。

在另一优选例中，所述的工程菌可以用于好氧合成途径合成维生素B₁₂。

在另一优选例中，所述的工程菌的CBAD的产量≥0.17mg/g细胞干重，较佳地≥0.5mg/g细胞干重。

在本发明的第二方面，提供了一种生产CBAD或其前体的方法，包括步骤：

(i)培养本发明第一方面所述的工程菌，从而获得含CBAD或其前体的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出CBAD或其前体。

在本发明的第三方面，提供了一种构建本发明第一方面所述工程菌的方法，包括步骤：

(a)构建含有尿卟啉原III基因模块的载体或整合到基因组上，所述尿卟啉原 III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、 hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

(b)构建用于下调血红素合成基因表达的载体，

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和 /或hemH基因；和

(c)将步骤(a)和步骤(b)获得的载体分别转入大肠杆菌，获得含有所述基因模块，并且内源的血红素合成基因的表达被下调的工程菌。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(I)构建含有HBA基因模块的载体，所述HBA基因模块表达用于以尿卟啉原III 为原料，生物合成HBA的基因；

(II)构建含有HBAD基因模块的载体，所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成HBAD的基因；

(III)构建含有CBAD基因模块的载体，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD 为原料，生物合成CBAD的基因；

(IV)构建含有钴吸收基因模块的载体或整合到基因组上，所述钴吸收基因模块用于表达向胞内转运钴离子的转运蛋白；和

(V)构建endA基因敲除的菌株。

在另一优选例中，在步骤(c)中，将步骤(a)、步骤(b)、步骤(I)、步骤(II)、步骤(III)、步骤(IV)载体分别转入步骤(V)获得的大肠杆菌，获得含有所述基因模块的工程菌。

在另一优选例中，全部或部分所述的模块整合到大肠杆菌基因组上。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌包括但不限于endA基因敲除或下调的菌株。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(d)：PCR验证步骤(c)得到的重组子的基因型；和/或

步骤(e)：发酵检测步骤(c)得到的重组子的CBAD或其前体的产量。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述工程菌的用途，其特征在于，所述工程菌被用作发酵生产CBAD或其前体的菌株。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了表达异源的hemABCD的重组菌发酵过程中的OD₆₀₀。

图2显示了表达异源的hemABCD的重组菌发酵过程中的ALA产量变化。

图3显示了表达异源的hemABCD的重组菌发酵过程中的HBA产量变化。

图4显示了弱化血红素合成途径的基因hemE、hemF、hemG、hemH的重组菌发酵过程中的OD₆₀₀。

图5显示了弱化血红素合成途径的基因hemE、hemF、hemG、hemH的重组菌发酵过程中的ALA产量变化。

图6显示了弱化血红素合成途径的基因hemE、hemF、hemG、hemH的重组菌发酵过程中的HBA产量变化。

图7显示了组合弱化血红素合成途径的基因hemEF、hemEG、hemEH、 hemFG、hemFH、hemGH的重组菌发酵过程中的OD₆₀₀。

图8显示了组合弱化血红素合成途径的基因hemEF、hemEG、hemEH、 hemFG、hemFH、hemGH的重组菌发酵过程中的ALA产量变化。

图9显示了组合弱化血红素合成途径的基因hemEF、hemEG、hemEH、 hemFG、hemFH、hemGH的重组菌发酵过程中的HBA产量变化。

图10显示了FH228重组菌发酵过程中的OD₆₀₀和HBA产量变化。

图11显示了LC-MS验证FH274重组菌合成的钴(II)啉酸a，c-二酰胺。

图12显示了LC-MS验证FH275重组菌合成的钴(II)啉酸a，c-二酰胺。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，以大肠杆菌为出发菌株，通过对外源基因及其组合的大量筛选和测试，首次意外地发现通过强化尿卟啉原III合成途径和弱化血红素合成途径可以提高HBA的产量，进而提高CBAD及维生素B₁₂的产量。实验表明，表达异源的hemA/hemO、hemB、hemC与hemD可以提高HBA的前体尿卟啉原III的积累，而通过sRNA弱化hemE、hemF、hemG与hemH可以降低血红素合成途径通量，从而进一步提高HBA产量。此外，在将HBA基因模块、尿卟啉原III基因模块、血红素途径弱化模块整合到一个质粒上，将HBAD基因模块、CBAD基因模块、钴吸收基因模块整合到另一个质粒上，导致质粒不稳定性。而通过敲除宿主菌的endA基因，将尿卟啉原III基因模块、钴吸收基因模块整合到基因组上后，解决了质粒不稳定性。在此基础上完成了本发明。

本发明涉及的基因如下表所示：

基因名称	登录号	备注
			hemA	9004270	ALA合成酶
hemO	JQ048722.1	ALA合成酶
			hemE	948497	尿卟啉原脱羧酶
hemF	946908	粪卟啉原III氧化酶
			hemG	948331	原卟啉氧化酶
hemH	947532	原卟啉亚铁螯合酶
			cobB	31490895	氢咕啉酸a，c-二酰胺合成酶
cobN	29593490	钴螯合酶
			cobS	29594978	钴螯合酶
cobT	29594975	钴螯合酶
			cobW	29593484	钴螯合辅助蛋白
chlI	32563000	镁螯合酶
			chlD	32564605	镁螯合酶
cbiM	31490899	钴转运***透过酶
			cbiN	31490898	钴转运蛋白
cbiQ	31490897	钴转运***透过酶
			cbiO	31490896	钴转运***ATP结合蛋白
cbtA	32564928	钴转运蛋白
			cbtB	32562082	钴转运蛋白

本发明中涉及的部分缩写的含义如下：

ALA：5-氨基乙酰丙酸(δ-aminolevulinate)；HBA：氢咕啉酸 (Hydrogenobyrinicacid)；Urogen III：尿卟啉原III(Uroporphyrinogen III)； CBAD：钴(II)啉酸a，c-二酰胺(Cob(II)yrinic acid a,c-diamide)；LC-MS： liquid chromatography-massspectrometry；

本发明的主要实验流程如下：

(a)构建尿卟啉原III基因模块，包括p15ASI-RphemOBCD、 p15ASI-RphemABCD、p15ASI-SmhemABCD、p15ASI-RchemABCD、 p15ASI-hemOBCD质粒。将上述质粒转化到HBA合成出发菌FH001中，TYG培养基发酵后评价表达尿卟啉原III基因模块对HBA的影响。

(b)将血红素途径弱化模块克隆到pET28-HBA质粒的BamHI酶切位点，得到质粒pET28-HBA-anti-hemE、pET28-HBA-anti-hemF、 pET28-HBA-anti-hemG、pET28-HBA-anti-hemH、pET28-HBA-anti-hemEF、 pET28-HBA-anti-hemEG、pET28-HBA-anti-hemEH、pET28-HBA-anti-hemFG、 pET28-HBA-anti-hemFH、pET28-HBA-anti-hemGH。将上述质粒分别与p15ASI-RphemOBCD质粒共同转化FH001，得到的菌株经TYG培养基发酵后评价弱化血红素单基因与弱化血红素双基因对HBA合成的影响。

(c)将尿卟啉原III基因模块克隆到pET28-HBA-anti-hemFG质粒的SacI、 HindIII酶切位点，得到pET28-HBA-anti-hemFG-RphemOBCD质粒，将其转化大肠杆菌MG1655(DE3)，TYG培养基发酵后评价HBA产量。

(d)构建HBA基因模块、CBAD基因模块、钴吸收基因模块整合质粒 pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT-cbiMNQO质粒。构建HBAD基因模块与不同来源的CBAD基因模块整合质粒pCDF-RccobBBmcobNSTW、 pCDF-BWNID质粒。

(e)首先敲除E.coli MG1655(DE3)的endA基因，得到FH224，然后将钴吸收基因模块，即P_Tac-cbiMNQO表达盒整合到FH224的ldhA位点，得到FH225。最后，将尿卟啉原III基因模块，即P_Tac-RphemOBCD表达盒整合到FH225的***糖诱导的启动子位点，得到FH236，作为合成CBAD的底盘细胞。

(f)将pET28-HBA-antihemFG和pCDF-RccobBBmcobNSTW质粒共同转化到 FH236中，得到FH274。将pET28-HBA-antihemFG和pCDF-BWNID质粒共转到 FH236中，得到FH275。FH274与FH275经TYG培养基发酵后评价CBAD的产量。

具体地，本发明涉及到的尿卟啉原III基因模块用于大肠杆菌合成HBA、维生素B₁₂及其前体。弱化血红素途径合成基因hemE、hemF、hemG、hemH用于大肠杆菌合成HBA、维生素B₁₂及其前体。CBAD基因模块、钴吸收基因模块共同应用于大肠杆菌合成CBAD、维生素B₁₂及其前体。FH236、FH274与FH275 应用于合成CBAD、维生素B₁₂及其前体。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明通过表达异源hemA/hemO、hemB、hemC与hemD基因和弱化血红素合成途径基因hemE、hemF、hemG、hemH大幅提高了HBA的产量。

(b)本发明通过敲除基因组上endA基因，并将质粒上的尿卟啉原III合成模块和钴吸收转运模块整合到基因组上，通过减小质粒的手段解决质粒不稳定的问题

(c)本发明通过对表达不同来源螯合酶的重组菌进行发酵评价，得到了优选的合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的重组菌，是合成维生素B₁₂的基础。

(d)与现有技术相比，本发明的重组菌合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的产量提高了至少12.6倍。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料和方法

材料：在实施例中，所有质粒和菌株均为常规的或可市售获得，除非特别说明。具体地，实施例中的出发菌株为大肠杆菌，其中一例是Escherichia coli MG1655，该菌株的基因组上整合表达噬菌体来源的T7RNA聚合酶，命名 MG1655(DE3)。

Gibson assembly方法见参考文献Gibson DG et al.，2009，Nature Methods， 6(5):343-345；CRISPR/Cas9方法敲除大肠杆菌基因见文献Zhao D et al.，2016，Microbial Cell Factories，15:205。

实施例1

表达尿卟啉原III基因模块的HBA合成重组菌构建与发酵评价

1、表达尿卟啉原III基因模块的HBA合成重组菌构建

p15ASI-hemOBCD质粒构建：在北京金唯智生物科技有限公司合成带有按照大肠杆菌密码子优化的hemO的基因并克隆到puc57(金唯智基因合成标准载体)上，质粒命名puc57-hemO。以这个质粒为模板，扩增带接头的hemO-Gibson 片段。以S.meliloti 320基因组作模板，扩增得到用于Gibson assembly的hemB片段、hemCD片段。以p15ASI质粒为模板，扩增得到p15ASI质粒骨架，与上面的 hemO-Gibson片段、hemB-Gibson片段和hemCD-Gibson片段通过Gibson assembly 得到p15ASI-hemOBCD质粒。

p15ASI-SmhemABCD、p15ASI-RchemABCD质粒的构建：以S.meliloti 320 基因组做模板，扩增SmhemA片段，以p15ASI-hemOBCD质粒做模板扩增得到片段p15ASI-hemBCD，以此作为质粒骨架。片段SmhemA与片段 p15ASI-hemBCD通过Gibson assembly连接得到质粒p15ASI-SmhemABCD。以R. capsulatus基因组做模板，扩增RchemA片段，与片段p15ASI-hemBCD通过Gibson assembly连接得到质粒p15ASI-RChemABCD。

p15ASI-RphemOBCD、p15ASI-RphemABCD质粒的构建。以 Rhodopseudomonaspalustris基因组作模板，RPhemA-F1、RPhemA-R1引物扩增RPhemA及其上下游片段，RPhemO-F1、RPhemO-R1引物扩增RPhemO及其上下游片段。将扩增后的RphemA及其上下游片段、RphemO及其上下游片段克隆到pEASY-blunt载体上，测序得到RphemA和RphemO的CDS。用引物 RPhemO-p15ASI-F-GBS、RPhemO-p15ASI-R-GBS扩增RphemO用于Gibson assembly的片段，与片段p15ASI-hemBCD通过Gibson assembly连接得到质粒 p15ASI-RPhemOBCD。用引物RPhemA-p15ASI-F-GBS和 RPhemA-p15ASI-R-GBS扩增RphemA用于Gibson assembly的片段，与片段 p15ASI-hemBCD通过Gibson assembly连接得到质粒p15ASI-RphemABCD。

本部分所用引物如下：

表1表达尿卟啉原III基因模块的HBA合成重组菌构建所用到的引物

将p15ASI、p15ASI-RphemOBCD、p15ASI-RphemABCD、p15ASI-SmhemABCD、p15ASI-RchemABCD、p15ASI-hemOBCD质粒分别转化到FH001菌株(来源于专利“从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)，得到FH167、FH168、FH177、FH178、FH179、FH180。

本部分所用到的菌株及质粒如下：

表2表达尿卟啉原III基因模块的HBA合成重组菌和所用质粒

2、重组菌的发酵

从平板上分别挑取FH167、FH168、FH177、FH178、FH179、FH180的单菌落，在试管中过夜培养。然后按1％接种量接种到含有50ml LB培养基的250 mL三角瓶中，培养12h。接下来按5％接种量接种到含有600ml TYG培养基(5 g/L yeast extract、10g/L tryptone、5g/L KH₂PO₄、2g/L glucose、2g/L glycine、 10g/L succinic acid、15g/L甜菜碱，用NaOH调节初始pH 6.5)的3L三角瓶中，在37℃，200r·min^-1条件下培养，在OD₆₀₀达到0.6的时候添加IPTG至终浓度0.4 mM，然后温度更换为28℃培养。

3、HBA的分离纯化

发酵结束后取一定量发酵液离心后收集菌体经高压破碎，离心得到胞内产物，通过DEAE-Sephadex A-25阴离子交换层析柱纯化得到HBA。得到的HBA 样品用0.22μm滤膜过滤后做HPLC定量分析。

4、ALA的定量

ALA的测定采用比色法。取发酵液在12000r·min^-1条件下离心2min，取上清200μL，加入100μL乙酸钠(pH 4.6，1M)缓冲液，50μL乙酰丙酮溶液混合，沸水浴15min后冷却至室温。取100μL水浴后的反应液与100μL modified Ehrlich’s试剂(1g对二甲氨基苯甲醛，加入30mL冰醋酸，再加入8mL的70％高氯酸，用冰醋酸补齐到50ml)在酶标板里混合，稳定15min后用酶标仪在554 nm下测量其吸光光度值，根据ALA的标准曲线计算样品中ALA含量。

5、HBA的定量

HBA通过HPLC定量，HPLC条件为：分析在安装有Agilent TC C18柱(4.6 ×250mm)的Agilent 1260设备上进行。进样量20μL。A相为0.10M磷酸钾(pH 6.5)，B相为50％0.10M磷酸钾(pH 8)，50％乙腈。流速：1.0mL/min，色谱柱温度：35℃，检测波长为329nm。梯度洗脱条件：0-5min，0-2％buffer B； 5-10min，2-5％buffer B；10-20min，5-20％buffer B；20-30min，20％buffer B； 30-40min，20-100％buffer B；40-45min，100-0％buffer B。

6、表达尿卟啉原III基因模块的HBA合成重组菌发酵结果

在大肠杆菌中表达cobAIGJMFKLH后，可以合成HBA。大肠杆菌可以通过 C₅途径合成ALA，ALA经过HemB、HemC、HemD的催化生成Urogen III。HBA 的生成量低，可能是合成途径中hemA、hemB、hemC、hemD在基因组上表达太弱的原因。为提高前体的供应，在FH001菌株中表达Urogen III合成的基因hemA、 hemB、hemC、hemD。HemA是合成ALA的关键酶。而ALA是HBA的前体，ALA 的浓度直接影响HBA的产量。可以通过筛选不同来源的ALA合成酶来调节ALA的产量，从而控制HBA的产量。为此，在FH001菌株中表达了S.meliloti 320、 R.capsulatus来源的hemA、R.palustris来源的ALA合成同工酶编码基因hemA或 hemO基因，分别与S.meliloti 320来源的hemB、hemC、hemD基因组成的5种操纵子。同时构建了对照菌FH167，为FH001菌中表达p15ASI空质粒的菌株。

在用IPTG诱导后8、20、32、45h测定各个重组菌的OD₆₀₀、ALA与HBA产量。测定结果如图1-3所示。表达外源的hemA/hemO基因与S.meliloti 320的hemB、 hemC、hemD基因的重组菌OD₆₀₀都有所降低，但是HBA产量都明显提高(图1、图3)。本批发酵TYG培养基中含2g/L葡萄糖。发酵8h时葡萄糖已被利用完，这也可能是导致重组菌生物量低的一个原因。重组菌中表达未命名的R. palustris菌株的hemO基因(RphemO)与S.meliloti 320的hemB、hemC、hemD基因的重组菌FH168的HBA产量最高，达到9.02mg/g DCW,而两个对照菌株 FH001与FH167最大HBA产量分别只有0.54mg/g DCW、1.24mg/g DCW。与此同时，表Urogen III前体合成模块的重组菌胞外ALA最大产量都超过0.69g/L，而FH001与FH167由于只有内源的C₅合成途径(图2)，ALA最大产量分别只有 0.10g/L和0.077g/L。另外，发酵后期从32h到45h这个范围内，FH168、FH177 与FH179都出现生物量降低的现象。

发酵后期所有菌株HBA产量都明显降低，原因可能是诱导时间长导致酶以包涵体形式存在，HBA的生成量减少，而原来生成的HBA由于不稳定而逐渐分解。另一种可能是质粒不稳定。发酵后期质粒逐渐丢失，导致HBA合成降低。

实施例2

弱化血红素合成途径的基因的HBA合成重组菌构建与发酵评价

1、弱化血红素合成途径的基因的HBA合成重组菌的构建

在金唯智合成用于弱化基因的模块，包含Pr启动子、MicC Scaffold、B0015double terminator。另外为了同时弱化多个基因，在前后分别添加Biobrick前缀 (包括EcoR I、Xba I酶切位点)和后缀(包括Spe I、Pst I酶切位点)。这段序列被克隆到pUC57质粒的EcoRV酶切位点上，新质粒命名pUCS。

血红素合成途径单基因弱化质粒的构建：以pUCS质粒为模板，用设计好的引物通过反向PCR扩增得到质粒全长片段，自连，得到pUCS-anti-hemE、 pUCS-anti-hemF、pUCS-anti-hemG、pUCS-anti-hemH质粒。

血红素合成途径双基因弱化质粒的构建：将质粒pUCS-anti-hemE用Spe I、 Pst I酶切后纯化片段，将pUCS-anti-hemF质粒用Xba I、Pst I酶切后，胶回收较小的片段。将这两个片段用T4连接酶连接得到质粒pUCS-anti-hemEF，用于同时弱化hemE和hemF。用同样方法可以得到pUCS-anti-hemEG、 pUCS-anti-hemEH、pUCS-anti-hemFG、pUCS-anti-hemFH、pUCS-anti-hemGH 质粒。

血红素合成途径单基因弱化模块与HBA合成模块组合的质粒构建：以 pUCS-anti-hemE、pUCS-anti-hemF、pUCS-anti-hemG、pUCS-anti-hemH质粒作模板，用SRNA-HBA-F-GBS和SRNA-HBA-R-GBS引物分别扩增通过sRNA弱化 hemE、hemF、hemG、hemH的元件，通过Gibsonassembly***到pET28-HBA质粒BamHI位点，得到质粒pET28-HBA-anti-hemE、pET28-HBA-anti-hemF、 pET28-HBA-anti-hemG、pET28-HBA-anti-hemH。

血红素合成途径双基因弱化模块与HBA合成模块组合的质粒构建：以 pUCS-anti-hemEF、pUCS-anti-hemEG、pUCS-anti-hemEH、pUCS-anti-hemFG、 pUCS-anti-hemFH、pUCS-anti-hemGH质粒作模板，用SRNA-HBA-F-GBS和 SRNA-HBA-R-GBS引物分别扩增通过sRNA弱化hemEF、hemEG、hemEH、 hemFG、hemFH、hemGH的元件，通过Gibson assembly***到pET28-HBA质粒 BamHI位点，得到质粒pET28-HBA-anti-hemEF、pET28-HBA-anti-hemEG、pET28-HBA-anti-hemEH、pET28-HBA-anti-hemFG、pET28-HBA-anti-hemFH、 pET28-HBA-anti-hemGH。

pET28-HBA-anti-hemFG-RphemOBCD质粒的构建：以p15ASI-RphemOBCD 质粒作模板，用RPhemOBCD-F-pet28-Sac I、RPhemOBCD-R-pet28-Hind III引物扩增RphemOBCD及其启动子部分，通过Gibson assembly克隆到 pET28-HBA-anti-hemFG质粒的SacI、HindIII位点，得到 pET28-HBA-anti-hemFG-RphemOBCD质粒。本部分所用引物如下：

表3弱化血红素合成途径的基因的HBA合成重组菌的构建所用到的引物

将质粒pET28-HBA-anti-hemE、pET28-HBA-anti-hemF、 pET28-HBA-anti-hemG、pET28-HBA-anti-hemH、pET28-HBA-anti-hemEF、 pET28-HBA-anti-hemEG、pET28-HBA-anti-hemEH、pET28-HBA-anti-hemFG、 pET28-HBA-anti-hemFH分别转化大肠杆菌MG1655(DE3)中，得到FH189、 FH190、FH191、FH192、FH193、FH194。本部分所用到的菌株及质粒如下：

表4弱化血红素合成途径的基因的HBA合成重组菌及其质粒

2、重组菌的发酵，HBA的分离纯化、定量，ALA的定量与实例1中的方法相同。唯一改变是将TYG培养基中葡萄糖的加入量，从2g/L提高到10g/L。

3、发酵结果

生产HBA的菌株在表达Urogen III前体合成模块后，发酵过程中发现菌体颜色发生了明显变化，原因是Urogen III流向了血红素合成途径。过多的血红素不仅对细胞有毒性，也导致HBA得率降低。为了抑制血红素合成，将代谢流引向 HBA，通过sRNA分别抑制FH168血红素合成途径的基因hemE、hemF、hemG、 hemH，菌株分别命名为FH185、FH186、FH187、FH188。为进一步提高工程菌 HBA的水平，我们通过sRNA组合弱化血红素合成的基因hemEF、hemEG、 hemEH、hemFG、hemFH、hemGH的菌株，分别称为FH189、FH190、FH191、 FH192、FH193、FH194。

发酵实验结果如图4-6所示。对照菌FH168的HBA单位细胞产率为6.43mg/g 细胞干重。对血红素合成途径的基因弱化后的FH185、FH186、FH187、FH188 发酵后HBA的产量都有不同程度的提高，单位细胞最大产率分别达到6.68 mg/g、8.66mg/g、9.34mg/g、8.66mg/g细胞干重(图6)。虽然将葡萄糖浓度提高后，FH168的HBA产量占细胞干重的比例降低了，但是最大OD₆₀₀从3.11提高到了4.50(图4)，总的HBA产量略有提高。所有重组菌的ALA产量接近，分布于0.65g/L到0.70g/L之间(图5)。

组合弱化血红素合成基因的重组菌除FH190菌株HBA产量略有降低外，其余菌株都有不同程度的提高(图9)。所以菌都是发酵诱导后20h HBA产量达到最高，其中FH192单位细胞的HBA产率最高，达到14.09mg/g DCW，此时OD₆₀₀为4.00，最大OD₆₀₀为发酵诱导32h的4.78(图7)。其它所有菌株的最大OD₆₀₀都有所提高，有可能是血红素合成量降低导致对细胞毒性降低。另外，所有菌株ALA产量无明显变化(图8)。

为了降低多个质粒对细胞所造成的代谢负担，将前体合成模块从 p15ASI-RPhemOBCD质粒上克隆到pet28-HBA-antihemFG质粒上，得到pet28-HBA-antihemFG-RPhemOBCD质粒。将该质粒转化到E.coli MG1655(DE3)(来源于同日申请的专利“从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)中，得到FH228菌株。这个菌株生物量到38h未出现降低，最大OD₆₀₀为5.93(图10)，比之前的重组菌有所提高，说明了降低代谢负担提高了其生物量。HBA最大产量为12.88mg/g DCW(图10)。

实施例3

优化的CBAD的合成重组菌的构建与发酵

1、优化的CBAD的合成重组菌的构建

pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT-cbiMNQO质粒的构建：以 p15ASI-cbiMNQO质粒为模板，用Rccbi-F-pac I-gbs和Rccbi-R-pac I-gbs引物扩增 P_Tac-cbiMNQO表达盒，通过Gibson assembly克隆到 pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒的pac I酶切位点，得到该质粒。

将pET28-HBA-anti-hemFG-RphemOBCD质粒和 pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT-cbiMNQO质粒共转到E.coli MG1655(DE3)中，发酵后检测不到任何咕啉化合物，推测是由于质粒不稳定性的原因。为此，首先通过CRISPR/Cas9方法敲除E.coli MG1655(DE3)的endA基因，得到FH224。然后通过CRISPR/Cas9方法将钴吸收基因模块，即 P_Tac-cbiMNQO表达盒整合到FH224的ldhA位点，得到FH225。最后，通过 CRISPR/Cas9方法将尿卟啉原III基因模块，即P_Tac-RphemOBCD表达盒整合到 FH225的***糖诱导的启动子位点，得到FH236，作为合成钴(II)啉酸a， c-二酰胺的底盘细胞。

pCDF-RccobBBmcobNSTW质粒的构建：以B.melitensis bv.1str.16M基因组为模板，用BMcobW-F-Ecor I、BMcobW-R-Xba I引物扩增BmcobW，克隆到 pTrc99a质粒的Ecor I、Xba I酶切位点，得到pTrc99a-BmcobW质粒。以该质粒为模板，用PTrc-BMcobW-Xho I-F-gbs、PTrc-BMcobW-Xho I-R-gbs引物扩增 BmcobW表达盒，通过Gibson assembly克隆到pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒的Xho I酶切位点，得到 pCDF-RccobBBmcobNSTW质粒。

pCDF-BWNID质粒的构建：以Pseudomonas denitrificans ATCC 13867基因组为模板，用PDcobW-F-Gibson、PDcobW-R-Gibson引物扩增PdcobW片段，用 PDcobN-F-Gibson、PDcobN-R-Gibson引物扩增PdcobN片段，二者通过SOE-PCR 融合得到PdcobWN片段。以pCDF-RccobB质粒作模板，用 PCDF-RccobB-gbs-2-F2、PCDF-RccobB-gbs-2-R2引物扩增pCDF–RccobB质粒骨架，与PdcobWN片段通过Gibson assembly得到pCDF-RccobB-PdcobWN质粒。以P.denitrificans ATCC 13867基因组为模板，用chlID-pet28-F-Gibson、 chlID-pet28-R-Gibson引物扩增chlID片段。以pet28a质粒为模板，用 pet28-chlID-F-Gibson、pet28-chlID-R-Gibson引物扩增pet28a质粒骨架，与chlID 片段通过Gibson assembly得到pET28-chlID质粒。以pET28-chlID质粒为模板，用T7-chlID-F-Gibson、T7-chlID-R-Gibson引物扩增chlID表达盒，通过Gibson assembly克隆到pCDF-RccobB-PdcobWN质粒的Bgl II酶切位点，得到 pCDF-BWNID质粒。

表5优化的CBAD的合成重组菌的构建所用引物

将pET28-HBA-antihemFG和pCDF-RccobBBmcobNSTW质粒共同转化到 FH236中，得到FH274。将pET28-HBA-antihemFG和pCDF-BWNID质粒共转到 FH236中，得到FH275。

本部分所用到的菌株与质粒如下：

表6优化的CBAD的合成重组菌及所用到的质粒

2、CBAD的合成重组菌的发酵

从平板上挑取单菌落，在试管中过夜培养。然后按1％接种量接种到含有50 ml LB培养基的250mL三角瓶中，培养12h。接下来按5％接种量接种到600mL 含有添加20mg/LCoCl_2·6H₂O的TYG培养基(5g/L yeast extract、10g/L tryptone、5g/L KH₂PO₄、10g/Lglucose、2g/L glycine、10g/L succinic acid、 15g/L甜菜碱，用NaOH调节初始pH 6.5)的3L三角瓶中，在37℃，200r·min^-1条件下培养，在OD₆₀₀达到0.6的时候添加IPTG至终浓度0.4mM，然后温度更换为28℃培养。

3、LC-MS鉴定CBAD

分析在安装有Agilent TC C18柱(4.6×250mm)的Agilent 1200/BrukermicrOTOF-Q II设备上进行。进样量为25μL。HBA与HBAD的检测波长为329 nm。钴(II)啉酸a，c-二酰胺的检测波长为314nm。A相为含0.1％甲酸的水， B相为含0.1％甲酸的甲醇。色谱柱温度控制在30℃，流速0.7ml/min，梯度洗脱条件如下：0-5min，维持25％B；5-15min，34％B；15-19min，100％B； 19-24min，100％B；24-25min，25％B；25-35min，25％B。

质谱采用阳离模式，参数设置为：喷针电压，4500V；喷雾压力，1.0Bar；离子源，电喷射离子化；雾化气流速，6.0L/min；雾化气温度，180℃。扫描范围为400-2000(m/z)。

为提高HBA的产量并解决质粒不稳定性，通过敲除endA，基因组上整合尿卟啉原III基因模块和钴吸收基因模块得到了底盘细胞FH236。然后在FH236中分别表达HBA模块、HBAD模块、B.melitensis与P.denitrifican的钴螯合酶合成 CBAD。同时考虑到CobW可能起到传递钴离子的作用，在CBAD基因模块上整合cobW的表达盒，得到pCDF-RccobBBmcobNSTW质粒。FH274为含有 pET28-HBA-antihemFG质粒并表达来源于B.melitensis的cobNSTW的菌株， FH275为含有pET28-HBA-antihemFG质粒并表达来源于P.denitrifican的cobN、chlID、cobW的菌株。由于没有CBAD的标准品，为了评价两个菌的产量，将这两个菌株用含10g/L葡萄糖和20mg/L CoCl₂·6H₂O的TYG培养基发酵后做 LC-MS分析。两个菌的CBAD产量比出发菌FH164菌株大幅提高。图11、图12 分别为FH274与FH275的CBAD质谱图。说明通过表达尿卟啉原III基因模块和弱化血红素途径可以提高CBAD的产量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 合成钴（II）啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

<130> P2017-2122

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1251

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 1

atgattgaag aaagcggccg ggcactggag aaaatgatgg atttcgagaa tttctttaag 60

aacgagctgg acgggctgca tcaggaaggc cgctaccggg ttttcgcaga cctcgcccgt 120

catcgcggcc aattcccgaa ggccgcgcgc catacggctg aaggcgttca ggaagtcacc 180

gtctggtgtt cgaacgacta tctcggcatg ggccagcatt ctgtcgtcac cgaggcgatg 240

aagcgcgcca tcgacgaatg cggcgccggc gccggcggca cccgcaacat ttccggtacc 300

aaccattacc acgtcctgct tgagcgcgag ctcgcggacc tgcatggcaa ggaatcggcg 360

ctgctcttta cttcgggcta cgtgtccaac tgggccgcgc tcggaacgct ctgttccaag 420

attcccggtg ttatcgtctt ctcggacgcc gggaatcacg cttcgatgat cgaggggatc 480

cgtcactcca agtgcgaacg cgtcatcttc aagcataatt cggtcgctga cctcgaggcc 540

aagctcgctg ccgccgatcc gcgtgcgccg aagctcatcg ctttcgagtc cgtctattcg 600

atggatggcg acatcgcgcc gatcaaggaa ttctgcgacc tcgccgacaa gtacggcgcc 660

atgacctatc tcgacgaagt gcatgcggtc ggcatgtacg gtccgcgcgg cggcggcatt 720

gccgagcgcg aaggcctgat gcaccgcctg acggtgatcg aaggcacgct cggcaaggct 780

ttcggcgtga tgggcggcta catcaccggc tcagccgcac tctgcgactt catccgctcg 840

tttgcctccg gcttcatctt cacgacggcg ctgccgccga cgcttgccgc cggtgcgctc 900

gcctcgatcc gccacctgaa ggaaagccag gtcgaacgtt tcgcgcacca ggagcgtgtg 960

cgtcgtctgc gctcgctgct cgaccagcgc ggcattccgc acatgccgaa cccgagccat 1020

atcgtgccgg tcatggttgg cgacgctgcc aagtgcaagt ggatctcgga tctcctgctc 1080

gacaatttcg gcgtctacgt gcagccgatc aactatccga cggtgccgaa gaagaccgag 1140

cgcctgcgca tcaccccgac gccgctccat tcggatgccg acatcgacca tctcgtcggc 1200

gcgctgcatt cgctgtggtc gcgctgtgcg ctggcccgcg ctgtcgcgta a 1251

<210> 2

<211> 1213

<212> DNA

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 2

atgaactacg aagcctattt caagcggcag atcgaaggcc tccatcgcga gggtcgctat 60

cgcgtgttcg ctgacctcga gcgtcacgcg ggttcgttcc cgcgcgcgac tcaccatcgg 120

cccgaaggca ccaacgaagt tacggtatgg tgctccaatg actatctcgg catgggtcag 180

catccggcgg tgctgagcgc gatgcacgag gcgctggaca gctgcggcgc cggcgccggc 240

ggcacccgca acatcgcggg caccaaccac tatcacgtgc tgctggagca ggagctcgcc 300

gcgctgcacg gcaaggaagc cggcctgctg ttcgcctcgg ggtacgtctc gaactgggcg 360

acgctgtcga cgctggcatc gcgcatgccc ggctgcgtga ttctgtcgga cgagctgaac 420

cacgcctcga tgatcgaagg catccgccac agccgcagcg agacccggat cttcgcgcat 480

aacgacccgc gcgacctcga gcgcaagctc gccgatctcg acccacacgc gccgaagctg 540

gtggcgttcg agtcggtgta ctcgatggac ggcgacatcg cgccgatcgc tgagatctgc 600

gacgtcgccg acgcgcacaa cgccatgacc tatctggacg aggtgcatgg cgtcggcctg 660

tacggcccga acggcggcgg catcgccgat cgcgaaggcc tcagccaccg cctcacggtg 720

atcgagggca cgctggcgaa agcgttcggc atcgtcggcg gctacatcac cggctcggcg 780

gcgctgtgcg atttcgtccg cagcttcgcc tcgggcttca tcttctcgac ctcgctgccg 840

ccggcggtcg ccgccggtgc gctggccagc gtccgccaca tccgctccag ctcggctgag 900

cgcgatcgtc accaggatcg cgtcgcgcgg ctgcggatgc ggctcgacca ggtcggcgtc 960

gcccacatgc cgaacccgag ccacatcgtg ccggtgatgg tcggcgatgc ggtgctgtgc 1020

aagcagatca gcgacgagct gatcaaccgc tacggcatct acgtgcagcc gatcaactat 1080

ccgaccgtgc cgcgtggcac cgagcggctg cggatcacgc cgtcgccgca gcacaccgac 1140

gccgacatcg agcatctggt gcaggcgctc tctgaaatct gggcacgggt cggcctcgcc 1200

aaggcaagcc tga 1213

<210> 3

<211> 1230

<212> DNA

<213> 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)

<400> 3

atgcagtaca atcaattctt tcaagacgct ctcacccgcc ttcacgacga gcgtcgttac 60

cgggtgttcg ctgatctcga gcggattgcc ggcaggttcc cgcatgctac gtggcactcg 120

aactccggag ctcgcgatgt cgtgatctgg tgctcgaacg attatctcgg catgggccag 180

cacccgaagg tggtcggcgc gatggtcgag accgcaaccc ggatcggcac cggcgccggc 240

ggcacccgca acatcgccgg tacgcatcat ccgttggtgc agctggagca ggagatcgcc 300

tctctgcacg gcaaggaagc cgcgctgctg ttcacctccg gctacgtctc caaccagacc 360

ggcctgtcga ccctcggcaa actgatcccg aactgcctga tcctgtcgga cgcgctcaat 420

cacaattcga tgatcgaagg catccgtcag tcgggctgcg agcgcgtggt ctggcgccac 480

aacgataccg ctcatctcga agagctgctg atcgccgccg gtcccgaccg tccgaagctg 540

atcgcgttcg agagcctgta ctcgatggac ggtgacaccg ctccgctggc gaagatctgc 600

gatctcgccg agaagtacaa cgcgatgacc tactgcgacg aagtgcacgc ggtcggcatg 660

tacggtgcgc acggtgccgg cgtcgccgag cgtgacggcg tgatggcccg catcgacatc 720

atcgaagcga ccctcgccaa ggcgttcggc tgcctcggcg gctacatcac cggcaagacc 780

gaagtgatcg acgccgtacg ctcctacgca ccgggcttca tcttcaccac cgcgctgccg 840

ccgccgatct gcgccgcggc caccgcagcg atcaagcatc tgcgcagctc gacctgggag 900

cgtgagcgcc atcaggatcg cgccgcgcgc gtcaaggccg tgctgaacaa cgccggcatt 960

ccggtgatgc cgaccgacac ccacatcgtg ccggtgttcg tcggcgacgc cgagaagtgc 1020

aagaaggcgt cggacatgct gctcgagcag cacaacatct acatccagcc gatcaactac 1080

ccgaccgtcg cccgcggcct cgaacggctc cgcatcacgc cgtcgccgta tcacgacgac 1140

aagctgatcg acgcgctggc cgaagccttg gtgcaggtct ggaacgagct cggcctgccg 1200

ctcggcgcca aggcgatcgc tgcggagtga 1230

<210> 4

<211> 1017

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 4

atgaacgaca ggacaaatct tgtggacagg gtcaccggcc atcgccgcat gcgccgcaac 60

cgcaaggccg actggacgcg ccggctggtg caggaaaacc gcctgaccgt cgacgacctg 120

atctggccga tcttcatcgt gccgggcgag aacatcatcc agccgatcga cgcgatgccg 180

ggcgtcaacc gcatgagcat cgacaaggcc gtggaagcgg taaaggaagc ggccggtctc 240

ggcatcccgg cgatcgccac cttccccaac atcgacctgt cgctgcgcga cgataccggc 300

tccaacagtc ttgcggccga caacctgatc aaccaggcga cgcgcgcctt caagaaagcc 360

gtgcctgaga tcggcatcat caccgacgtc gcgctcgacc ccttcaccag ccacggccat 420

gacggcatcc tgcgcaatgg cgagatcgtc aacgacgaga cggtcgagac gatcgcaagg 480

gcggccgtcg cccaggcgga cgccggctcc gatatcatcg ccccctccga catgatggac 540

ggacgcatcg gcgccatccg ccaggcgctc gacgctcacg gccaccagaa tgtcggcatc 600

atgtcctatg cgacgaagtt cgcctccggc ttctacggtc cctatcgcga ggcgatcggc 660

accggcggcc ttttgaaggg cgacaagaag acctattaca tcgacccggc caacggcacc 720

gaagcgatcc gcgacgcagc cctcgacgtc gaggaaggcg ccgacatgct gatggtgaag 780

ccaggccttc cctatctcga catctgctgg cggatgaagg aagccttcgg cctgccggtc 840

tttgcctacc aggtgtccgg cgagtattcg caggtgaagg cggcggctgc caacggctgg 900

atcgatggcg agaaggtgat gctcgaaacg ctgctcgcct tcaagcgcgc cggctgcgac 960

ggcatcctca gctacttcgc ggtcgaagtg gcccgcattc tcgccaaagg ccgctga 1017

<210> 5

<211> 930

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 5

atgcaaacaa aacctttccg gatcggcacg cgcggcagcc cgctggcgct cgctcaagcc 60

catgaaacgc gcgatcgcct cgcagcggcg catggtctgg cgccggaaat gttcgaggtc 120

gtcatcctct cgaccaaggg cgaccggatc accgaccgct cgctcgccga gatcggcggc 180

aagggcctgt tcaccgaaga gatcgagcaa caattgctgt cgggcgaact cgatttcgct 240

gtgcattcgt ccaaggacat gccgacgaaa ctgcctgacg gcctctgtct ttccgccttc 300

ctgccgcgtg aggacattcg agatgccttc atcggtcgga cggcaaaaaa actgatggaa 360

ctgccgcagg gcgtgaccgt cggctcgtcg tcgctgcgcc gccaggcgct gatccgccgg 420

ctgcgtccgg atatcaatgt catcacctat cgcggccagg tggaaacgcg gctgagaaag 480

ctcgccgagg gccaggtcga tgcgacactg cttgcctatg cgggcctcaa gcgtctcggc 540

atgaccgacg ttccgaccga actgctcgac ccccaggaat tcccgccggc gccggcccaa 600

ggcgcgatct gcatcgagag ccgcatcggc gacagccgca tcaacgacct gctcgcagcc 660

atcgacgatc cccgcaccca tgaggcagtc gcctgcgagc gtggcttcct cgcgacgctc 720

gacggctcgt gccgcacgcc gatcgccggt ctcgccacct cggacggcac ccatctcagc 780

ttttccggca tgatcctcac gcccgacggc cagacccatc accgggttac gatcgagggc 840

aaggccaccg acgccgaagc gcttgggcaa aaggccggcg aagagatccg cgccaaggcc 900

ggccccggct tctttgcaag ctggacttaa 930

<210> 6

<211> 714

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 6

atgcgcgtgc tcgtcacccg gccgcttccc gccgccgagg cgacggtacg ccggctggaa 60

gccgccggcc accggccgat cctgctgccg ctgatgcagg cgacacatct tgctgccgtc 120

tctgttgccg cgcttgaagt gccgcatgcg gcgatcgcgc tcaccagcgc cgaagccatt 180

cgggtgctcg tatcgtcaga tgcagacctg tcacagcatc tggcgacccc gtgcttctgc 240

gtgggcgccg ccacggcgca agcagcagcc gggctcggtt tctccgatct gcgcatagcg 300

gagggtaccg gccagtccct ggcggaactg atcggtgcga ccatcgacac gctgccgcca 360

cttcccctgc tctatctggc aggaacgccg cgctccgaag ggctggaaaa gggactgaga 420

caccgcggca tcgaacaccg gacggtcgag tgctaccgca tggagccgat cgcccattcg 480

cgcgccgcga tcgaagatct gcggcgaagc agccgtcccg acgccgtgct tttatactcg 540

cgagagaccg cgcgacagtt cgttcgcctg ctttccgaag ccggtgtcga tgctgcttcc 600

tttgcgccgc gctacctctg cctcagcccc gtggtggccg aggcactgcc gggtaacgtc 660

gtggcggaga ccgccgcaag caccgatgaa gacagccttt tcagtcttct ctaa 714

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tyaacgggag gacytcatga a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcaacgag accatcaagc a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgctga gcaagatctc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcggcgatcg aggtgatgtt 20

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gatccccaag gagatatacc atgcagtaca atcaattctt tcaagacg 48

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccacattgt cacctcctta tcactccgca gcgatcg 37

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gatccccaag gagatatacc atgaactacg aagcctattt caagc 45

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tccacattgt cacctcctta tcaggcttgc cttggcg 37

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttcgagctct gcgactcctg cattagg 27

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccaagcttt tagagaagac tgaaaaggct g 31

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtcgacggag ctcgaattcg caggaaacag ctatgac 37

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggaataggc actagttttg gtaaaacgac ggccagt 37

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttaaaaacga gcaaccatta tcaccgcca 29

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gttcggtcat tttctgttgg gccattgcat tg 32

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacaccaggt taagcaacca ttatcaccgc ca 32

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtcgggttt cattttctgt tgggccattg cattg 35

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcttttctca acaagcaacc attatcaccg cca 33

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

attaatgttt tcactttctg ttgggccatt gcattg 36

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaaaccggta tcgcaaccat tatcaccgcc a 31

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agtctgacgc attttctgtt gggccattgc attg 34

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ttcgagctct gcgactcctg cattagg 27

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cccaagcttt tagagaagac tgaaaaggct g 31

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tctactagcg cagcttaatg cgactcctgc attaggttg 39

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tggcagcagc ctaggttaat ctaacgccgg gtccagc 37

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggaattctaa ggaggtgaca atatgcaggg acagaaaatt cc 42

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gctctagagt cagtcggcat ctttcac 27

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gatcgctgac gtcggtaccc ttgacaatta atcatccggc 40

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cagcggtttc tttaccagac tcagtcggca tctttcac 38

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

catatgtata tctccttctt atacttaact aatatac 37

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gcagatctca attggatatc gg 22

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aagaaggaga tatacatatg aaaaccctgg ccaaactcc 39

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

atgcattaat tatacctcct ttacgccagg gcggtacg 38

<210> 39

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

aggaggtata attaatgcat ctgctgcgca cc 32

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gatatccaat tgagatctgc tcactgctcc tcgctgtc 38

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

atggtatatc tccttcttaa agttaaac 28

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aattcgagct ccgtcgac 18

<210> 43

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

taagaaggag atataccatg agcgcccttc cccat 35

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ttgtcgacgg agctcgaatt tcacgagggt agcggagg 38

<210> 45

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

acagcgagga gcagtgagca cgagatctcg atcccgcg 38

<210> 46

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gccggccgat atccaattga tcacgagggt agcggagg 38

Claims (10)

1.一种用于生产CBAD(钴(II)啉酸a，c-二酰胺)或其前体的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述的基因模块包括：

(a)尿卟啉原III基因模块,所述尿卟啉原III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

并且，所述工程菌的内源的血红素合成基因的表达被下调；

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和/或hemH基因。

2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌的内源基因endA被下调或缺失。

3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的尿卟啉原III基因模块整合在基因组上，较佳地整合于***糖诱导的启动子P_BAD位点。

4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的hemA基因、hemO基因、hemB基因、hemC基因和hemD基因各自独立地来源于：Rhodobacter capsulatus菌株、Sinorhizobiummeliloti菌株、Rhodopseudomonas palustri菌株、Brucella melitensis菌株、Rhodobacter sphaeroides菌株、或Brucella melitensis菌株；

优选地，hemA基因来源于Sinorhizobium meliloti菌株、或R.palustri菌株，hemO基因来源于R.palustri菌株；

hemB基因、hemC基因和hemD基因来源于S.meliloti菌株。

5.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的基因模块还包括：

(b)HBA基因模块，所述HBA基因模块表达用于以尿卟啉原III为原料，生物合成HBA的基因；

(c)HBAD基因模块,所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成HBAD的基因；

(d)CBAD基因模块，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD为原料，生物合成CBAD的基因；

(e)钴吸收基因模块，所述钴吸收基因模块表达用于向胞内转运钴离子的转运蛋白的编码基因；和

(f)血红素途径弱化模块，所述血红素途径弱化模块用于(通过sRNA)下调血红素合成基因的表达。

6.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌用于从头合成CBAD。

7.一种生产CBAD或其前体的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养权利要求1所述的工程菌，从而获得含CBAD或其前体的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出CBAD或其前体。

8.一种构建权利要求1所述工程菌的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)构建含有尿卟啉原III基因模块的载体或整合到基因组上，所述尿卟啉原III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

(b)构建用于下调血红素合成基因表达的载体，

较佳地，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和/或hemH基因；和

(c)将步骤(a)和步骤(b)获得的载体分别转入大肠杆菌，获得含有所述基因模块，并且内源的血红素合成基因的表达被下调的工程菌。

9.如权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌包括但不限于endA基因敲除或下调的菌株。

10.一种权利要求1所述工程菌的用途，其特征在于，所述工程菌被用作发酵生产CBAD或其前体的菌株。