CN109891240A - 载脂蛋白e4的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的方法，其中所述方法包括下述步骤：将所述样品与固相相接触，将所述样品与至少一种特异性结合到ApoE4或其片段的结合剂相接触，由此形成ApoE4‑结合剂复合物，以及检测所述ApoE4‑结合剂复合物。

Description

载脂蛋白E4的检测方法

技术领域

本发明提供了一种确定个体的载脂蛋白E(ApoE)状态的简单且成本效益高的方法。这些个体包括但不限于患有认知缺损、痴呆症和/或阿兹海默氏病(AD)的患者。

背景技术

在与迟发性阿兹海默氏病(LOAD)和其他神经病症的风险相关的不同易感性基因中，ApoE已被鉴定为一种强的遗传决定子(Leduc 等，2011)。人类APOE基因作为三种多态性等位基因ε2、ε3和ε4存在，它们在世界范围内的频率为8.4％、77.9％和13.7％。载脂蛋白E(ApoE)由299个氨基酸构成，并在血浆和脑脊液中与脂蛋白结合(Leduc等，2011)。所述三种ApoE同种型之间的差异限于第112和158位氨基酸(SEQ ID NO.1)，在所述位点处存在半胱氨酸或精氨酸：ApoE2(cys112，cys158)，ApoE3(cys112，arg158)和ApoE4(arg112，arg158)。此外，AD的风险与ApoE4等位基因强烈相关。具有一个ApoE4等位基因的个体发生AD的风险提高5至6倍，具有两个ApoE4等位基因的个体发生AD的风险提高超过20倍。此外，在患有迟发性疾病的患者中，一个(杂合的)或两个拷贝(纯合的)ApoE4等位基因的存在与相对于非携带者早约10-20年的发病年龄相关(Verghese等，2011；Weisgraber&Mahley 1996；Leduc 等，2011)。研究表明，满足轻度认知缺损(MCI)的临床标准并且也是ApoE4阳性的个体，与ApoE4阴性的个体相比更可能在几年内发展到AD(Aggarwal等，2005)。因此，ApoE基因型的确定可用于鉴定具有从MCI发展到AD的更高风险的MCI患者。ApoE4携带者对几种AD治疗例如对乙酰胆碱酯酶抑制剂他克林的响应不同，这提高了患者了解其基因型的重要性(Cacabelos等，2012)。

此外，ApoE状态可用于预测其他疾病(带有ApoE4同种型的个体具有发生心血管疾病(CVD)的更高风险并且也具有患***癌的更高风险(美国专利5,945,289))。另一方面，已显示在丙型肝炎感染期间ApoE4基因型针对严重肝损伤具有保护性，在HIV感染的个体中提高病毒载量并加快疾病进展，并且提高由单纯性疱疹病毒感染造成的AD的风险(WO03/ 060158 A2)。与衰老相关的黄斑变性的治疗也从ApoE4同种型获益(Bakbak等，2015)。

ApoE基因型作为阿兹海默氏病的风险标志物首次描述在Mayeux等，1998和US 5,508,167中。通过不同的基因分型方法检测个体中ApoE的遗传状态，存在各种不同的可能性。

已证实，ApoE4远远比apoE3和apoE2对蛋白水解更加敏感，并且在AD患者和apoE4转基因小鼠的脑中已发现apoE4的羧基端截短的形式。已提出apoE4片段化是AD病理发生中的早期事件(Brecht W.J.等，2004.“神经元特异性载脂蛋白e4蛋白水解与转基因小鼠脑中 τ磷酸化的提高相关”(Neuron-specific apolipoprotein e4 proteolysis is associated with increased tau phosphorylation in brains of transgenic mice)， PNAS 24,2527–2534).

在AD患者的脑中已发现了几种特定的、可能具有神经毒性的羧基端截短的apoE4片段：

分子量为19 kDa的片段ApoE41-165(Huang Y.等，2001，“阿兹海默氏病脑中存在 的载脂蛋白E片段在神经元中诱导神经纤维缠结样细胞内包含物”(Apolipoprotein E fragments present in Alzheimer’s disease brains induce neurofibrillary tangle-like intracellular inclusions in neurons)，98,8838–8843)，

片段ApoE41-185(Dafnis I.等，2010.“载脂蛋白E4片段可以促进淀粉样肽β42的 细胞内积累”(An apolipoprotein E4 fragment can promote intracellular accumulation of amyloid peptide beta 42)，115,873–884)，

片段ApoE41-191和ApoE41-260(Tanaka M. 2006，“羧基端截短对人类载脂蛋白E4 的结构和脂类相互作用的影响”(Effect of carboxyl-terminal truncation on structure and lipid interaction of human apolipoprotein E4)，Biochemistry.45 (13):4240-7)

片段ApoE41-272(Chang S.等，2005，Proc Natl Acad Sci USA.“载脂蛋白E4片段 的脂类和受体结合区协调作用以引起线粒体功能障碍和神经毒性”(Lipid-and receptor- binding regions of apolipoprotein E4 fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity)，102(51):18694-9)

片段ApoE41-259、ApoE41-229和ApoE41-202(Dafnis I等，2015，“同种型和羧基端 截短对载脂蛋白E结合并激活磷脂转移蛋白的能力的影响”(Influence of Isoforms and Carboxyl-Terminal Truncations on the Capacity of Apolipoprotein E To Associate with and Activate Phospholipid Transfer Protein)，Biochemistry.54 (38):5856-66；Vezeridis 等，2011，“含有apoE的HDL的生物发生所需的apoE4的结构域” (Domains of apoE4 required for the biogenesis of apoE-containing HDL)，Ann Med.43(4):302-11)

片段ApoE41-231(Chou C.Y.等，2006，“人类载脂蛋白E3和E4中的结构和功能变 异”(Structural and functional variations in human apolipoprotein E3 and E4)，J Biol Chem.281(19):13333-44)

片段ApoE41-251和ApoE41-266(Dong L.M.1994，“人类载脂蛋白E：第61位精氨酸 在介导E3和E4同种型的脂蛋白偏好性中的作用”(Human apolipoprotein E.Role of arginine 61 in mediating the lipoprotein preferences of the E3 and E4 isoforms)，J Biol Chem.269(35):22358-65)

此外，还调查了N-端截短的ApoE4片段：

片段ApoE472-299(Chou C.Y.等，2006，“人类载脂蛋白E3和E4中的结构和功能变 异”(Structural and functional variations in human apolipoprotein E3 and E4)，J Biol Chem.281(19):13333-44；Chou C.Y.等，2005，“人类载脂蛋白E3和E4中的结构变异： 二级结构、三级结构和尺寸分布”(Structural variation inhuman apolipoprotein E3 and E4:secondary structure,tertiary structure,and size distribution)，Biophys J.88(1):455-66).

标准的基因分型方法使用来自于外周静脉血或口腔上皮细胞的分离的DNA来分析APOE基因多态性。在传统上，更常用的方法是PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)分析。然而，由于可能的不完全的限制性酶消化，它是耗时且易错的方法。PCR加上测序或质谱术是有效的方法，但是需要昂贵的专用仪器。ARMS-PCR(扩增阻滞突变***-PCR)和SSP-PCR(简单序列特异性引物-PCR)方法需要通过琼脂糖凝胶进行分析，因此限制了可以同时检查的样品的数目。通过荧光解链曲线进行的实时PCR检测是简单且快速的方法，但是引物二聚体的形成可能使解链曲线的解释复杂化。通过荧光解链曲线、使用FRET(荧光共振能量转移)或进行的实时PCR检测是非常有效的方法，尽管成本高。还演化出更多且更快速的基于DNA的ApoE测试(例如Calero等，2009；Zhong等，2016)，但它们都依赖于上面提到的技术。

还存在可用的基于表型的测定法：例如等电聚焦或2D凝胶电泳，由于ApoE同种型的翻译后变化，它们是相当易错的方法。另一种方法是免疫化学测定法，其描述在美国专利US 6,027,896中，并且是基于同种型E2和E3而不是E4中可诱导的半胱氨酸残基的存在。体液中的ApoE水平也可以使用可商购的免疫测定法、通常为夹心类型的ELISA来测量。这些测定法测量体液中的所有ApoE、仅仅ApoE4或两者。

已显示，来自于脑脊液(CSF)的ApoE结合到聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯和玻璃管(Hesse等，2000，Holmquist 1982)。使用这些结果，Hesse等人解释了在不同实验中CSF中ApoE水平的测量值的差异，并将ApoE与那些材料的结合定义为免疫测定法的干扰因素。Holmquist，1982描述了提取并纯化的血清ApoC和ApoE与塑料管和玻璃吸管的结合，并强调了在ApoE免疫测定法中由样品制备造成的误差可能性。在双抗体免疫测定法中，脱脂的人类血清载脂蛋白强烈吸附到玻璃和塑料表面这一事实是误差来源(例如夹心ELISA；Holmquist 1982； 等，1993)。

等，1993显示了丛生蛋白强烈结合到聚苯乙烯微孔板。通过添加Tween-20，增强了丛生蛋白的这种非特异性结合能力。他们创造了一种单一抗体免疫测定法，其中他们将血浆或血清样品在聚苯乙烯微孔板上的PBS-T(含有0.2％Tween-20的PBS)中预温浴。然后，使用丛生蛋白特异性抗体检测并定量固定化的丛生蛋白。

本发明利用了ApoE、特别是ApoE4的这种强烈结合聚合物和玻璃表面的能力，从而创造了一种使用血液、血浆或血清样品的简单且成本效益高的单一抗体免疫测定方法。

如上所述，Hesse等，2000显示了来自于直接采用的CSF的ApoE结合到聚合物或玻璃管，并且可以在洗脱后检测(例如通过SDS洗脱和随后的western印迹分析)。然而，在CSF中存在0.15-0.45mg/ml的平均总蛋白浓度。相反，血浆和血清具有比CSF高100至500倍的蛋白浓度，为60-80mg/ml。对于免疫测定法来说，通常用浓度为0.5至2mg/ml的阻断蛋白(例如牛血清白蛋白)饱和所述结合表面，以抑制样品蛋白与所述表面的非特异性结合。血清中的ApoE浓度在30至400μg/ml的范围内(Bury等，1986)。因此，血浆/血清中估算的ApoE4量仅为总血浆/血清蛋白的0.02-0.5％，并且预期人们不能测量特异性针对ApoE4的信号。令人吃惊的是，我们可以证实来自于血浆、血清和甚至是全血的ApoE4特异性且可定量地结合到固体表面，即使在所述样品中存在高出超过200至5000倍的总蛋白浓度的情况下。

此外，令人吃惊的是，在反应缓冲液中存在阻断蛋白(例如0.5-2mg/ml的牛血清白蛋白(BSA))的情况下，ApoE4特异性且可定量地结合到固体表面。阻断蛋白例如BSA的存在甚至可以增强ApoE4与所述固相的结合。

增强ApoE4与聚合物和玻璃表面的特异性结合的一种因素是使用去污剂。去污剂在免疫测定法中通常用于阻止样品蛋白与固相的非特异性结合。Hesse等人显示，ApoE在0.2％Tween-20存在下结合到聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯和玻璃管(Hesse等，2000)。

发明内容

本发明的主题内容是一种方法，其用于(a)ApoE4状态的鉴定，和/或(b)血液样品中ApoE4水平的定量。其中个体是ApoE4阳性还是ApoE4阴性的确定(a)依赖于对象的血液样品具有高于一定阈值的ApoE4水平，所述阈值由内部截止对照定义。血液样品中ApoE4水平的定量(b)通过将内部标准品与所述样品一起运行并使用标准曲线计算ApoE4浓度来实现。

本发明的实施方式的详细描述

本发明的主题是一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的(体外)方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相，或者将ApoE4固定化到所述固相并将所述结合剂结合到ApoE4。

本发明的主题是一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的(体外)方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物被固定化到所述固相，其中所述固相未覆盖有任何结合剂或捕获分子，并且其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

在本发明的情形中，所述ApoE4-结合剂复合物通过ApoE4固定化到所述固相，特别是将ApoE4固定化到所述固相，并将所述结合剂结合到ApoE4。

本发明的另一个主题是一种测定法，所述测定法是基于在去污剂存在下将被分析物(ApoE4或其片段)结合到固相，并通过带有可检测标记物的ApoE4特异性结合剂检测这种被固定化的被分析物。

所述ApoE4特异性结合剂可以被直接或间接标记。

本发明的另一个主题是一种用于检测ApoE4或其片段的方法，其中将对象的血液样品与固相相接触，由此将ApoE4固定化到所述固相。

所述血液样品选自全血、血清和血浆。血浆在本文中被定义为EDTA血浆、肝素血浆和/或枸橼酸盐血浆。

在本发明的情形中，术语“ApoE4的片段”包括ApoE4的较短的拼接变体和截短的ApoE4蛋白或肽或ApoE4的一部分(Rohn等，2013；Love等，2015)。

这些片段长度为至少6个氨基酸，前提是第158位氨基酸(精氨酸，R)被包含在所述片段内，其中所述第158位氨基酸的序列参考SEQ ID NO.1。

在本发明的特定实施方式中，所述片段选自SEQ ID.NO.1-15的序列。

当在本文中使用时，术语“对象”是指活人或非人生物体，优选为人类对象，其中所述对象是健康的、表观健康的、患有认知缺损的、患有痴呆症特别是阿兹海默氏病(AD)的对象。

在根据本发明的方法的一个实施方式中，ApoE4或其片段与所述固相的结合在没有能够将ApoE4或其片段结合/连接到所述固相的连接分子的相互作用的情况下进行。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，在用所述样品接触所述固相时，所述接触在没有所述连接分子的相互作用的情况下进行。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，ApoE4或其片段与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

本文中使用的去污剂选自阴离子型去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、阳离子型去污剂(例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))、两性离子型去污剂(例如CHAPS)和非离子型去污剂(例如Tween-20、TritonX-100)。

非离子型去污剂的实例包括环氧化物-脂肪酸酯例如Tween-20(聚氧化乙烯-失水山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween-80(聚氧化乙烯-失水山梨糖醇单油酸酯)、Triton(烷基-聚醚-醇混合物，例如Triton X-100、Triton X-114)、Brij 35和Brij 58(聚氧化乙烯月桂基醚)、Nonidet P-40(聚氧化乙烯辛基酚醚)、Lubrol PX(聚乙烯氧化物-烷基醚加成物)、Berol EMU 043(具有10个氧化乙烯单元的C16、C18脂肪醇)，脱氧BIGCHAP，毛地黄皂素，HECAMEG，N-D-葡萄糖-N-甲基烷基酰胺(MEGA-8、9、10)，正辛基-D-吡喃葡萄糖苷，消旋的-1-油酰基-甘油，F-68，蔗糖单月桂酸酯，来自于皂树树皮的皂苷，等等。

两性离子型去污剂包括但不限于CHAPS、CHAPSO、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、磺基甜菜碱SB 12和磺基甜菜碱SB 14。

阳离子型去污剂的实例包括苄索氯铵、十六烷基氯化吡啶单水合物、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)等。

作为阴离子型去污剂的实例，可以提到的有十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LiDS)、胆酸钠、脱氧胆酸钠、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、1-癸烷磺酸钠盐、1-十二烷基磺酸钠盐、无水1-庚烷磺酸钠盐、无水1-己烷磺酸钠盐、1-壬烷磺酸钠盐、1-辛烷磺酸钠盐、无水1-戊烷磺酸钠盐等。

在根据本发明的方法的一个实施方式中，所述试剂中去污剂的浓度优选为0.0001至10％w/v，特别优选为0.01至1％w/v。本领域技术人员了解，可以考虑为每种特定去污剂使用特定的浓度范围。

在根据本发明的方法的优选实施方式中，Tween-20以0.001-10％、优选地0.01-1％、最优选地0.2-0.5％的浓度使用。在根据本发明的方法的另一个实施方式中，TritonX-100以0.001-0.5％、优选地0.01-0.2％、最优选地0.05-0.1％的浓度使用。

在本发明中，去污剂对于ApoE4或其片段与所述固相的结合来说是必需的，但是它们不充当连接分子或结合分子。去污剂必须存在于所述反应缓冲液中，因为在不含去污剂的样品缓冲液中不存在ApoE4与所述固相的结合(参见实施例4)。

在根据本发明的方法的优选实施方式中，所述结合剂特异性结合ApoE4或其片段。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述结合剂是结合亲和常数为至少10⁷M^-1、优选为10⁸M^-1的抗体或功能性抗体片段或非IgG支架，优选的亲和常数高于10⁹M^-1，最优选地高于10¹⁰M^-1。

在本发明的上下文中，“结合剂分子”是可用于结合来自于样品的靶分子或感兴趣的分子即被分析物(在本发明的上下文中，ApoE4及其片段)的分子。因此，结合剂分子必须在空间上和根据表面特点例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在两方面充分塑形，以特异性结合所述靶分子或感兴趣的分子。在此，所述结合可以例如由捕获分子与所述靶分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或上述相互作用中的两者或更多者的组合来介导。在本发明的上下文中，结合剂分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合剂分子是抗体，包括其对靶或感兴趣的分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

所述ApoE4抗体可以具有本领域中已知的形式。实例是人类抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体。在本发明的优选实施方式中，根据本发明的抗体是重组生产的抗体例如IgG这种典型的全长免疫球蛋白或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段，例如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化例如通过dHLX结构域的二聚化所形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段，scFv片段，多聚体化的多价或/和多特异性scFv片段，二价和/或双特异性双体抗体，(双特异性T-细胞衔接物)，三功能抗体，多价抗体例如来自于G之外的类别的；单结构域抗体，例如源自于骆驼和鱼类免疫球蛋白的纳米抗体，以及大量其他抗体或抗体片段。

除了抗ApoE4抗体之外，在本领域中公知其他生物聚合物支架也复合靶分子，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、镜像异构适体、抗运载蛋白(anticalin)和芋螺毒素(conotoxin)。

非Ig支架可以是蛋白质支架并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合到配体或抗原。非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架(例如在US 2010/0028995中所描述的)、纤连蛋白支架(例如在EP 1266025中所描述的)、基于脂钙蛋白的支架(例如在WO 2011/154420中所描述的)、泛素支架(例如在WO 2011/073214中所描述的)、转铁蛋白支架(例如在US 2004/0023334中所描述的)、蛋白A支架(例如在EP 2231860中所描述的)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中所描述的)、微生物蛋白(优选为形成胱氨酸结的微生物蛋白)支架(例如在EP 2314308中所描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/023685中所描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中所描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1941867中所描述的)。非Ig支架可以是肽或寡核苷酸适体。适体通常通过从大的随机序列组合中筛选来产生，并且是短链寡核苷酸(DNA、RNA或XNA；Xu等，2010；Deng等，2014)或附连到蛋白质支架的短的可变肽结构域(Li等， 2011)。

可用于确定ApoE4或其片段的水平的结合剂对ApoE4表现出至少10⁷M^-1、优选地10⁸M^-1的亲和常数，优选的亲和常数高于10⁹M^-1，最优选地高于10¹⁰M^-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过施加较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这种措施不超出本发明的范围。

在根据本发明的方法的更优选实施方式中，所述结合剂用可检测标记物标记，以便在结合到ApoE4之后被检测。

在本发明的优选实施方式中，所述结合剂的标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。然后通过适合的方法测量结合到所述被分析物的标记的抗体的量。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述结合剂的标记物选自与荧光染料或化学发光染料、特别是花菁类型的染料相组合的稀土金属穴状化合物或稀土金属螯合物。

用于确定ApoE4或其片段的水平的优选检测方法包括采取各种不同形式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法和快速测试形式例如免疫层析条检验。

在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花菁染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯甲酰亚胺类例如Hoechst 33258、菲啶类例如德克萨斯红、亚吉瓦黄、AlexaFluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括使用基于在Kirk-Othmer，《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)中为化学发光材料所描述的物理原理的染料。优选的化学发光染料是吖啶酯类。

化学发光标记物可以是吖啶酯标记物、甾类标记物包括异鲁米诺标记物等。

酶标记物可以是乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸酐激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述固相选自聚合物表面(例如聚苯乙烯)、玻璃表面、纤维素和纤维素衍生物(例如硝基纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙)。在根据本发明的方法的另一个特定实施方式中，所述固相选自玻璃或聚合物表面，其中聚合物表面包括但不限于聚苯乙烯、聚二乙烯苯、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(苯乙烯-氧化乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、热解材料、上述物质的嵌段共聚物和共聚物、硅酮或二氧化硅。

任何材料都可用于这种表面/固相，只要它有助于实现本发明的目的即可。表面的优选实例包括聚合物表面和玻璃制成的表面。聚合物表面类别包括但不限于聚苯乙烯、聚二乙烯苯、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(苯乙烯-氧化乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、热解材料、上述物质的嵌段共聚物和共聚物、硅酮或二氧化硅、纤维素和纤维素衍生物(例如硝基纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙)。优选的表面材料是聚苯乙烯。

聚苯乙烯是一种疏水性聚合物，其可以由制造商容易地衍生。用于EIA的微量滴定板通常由下述材料制成：1)未改性的聚苯乙烯(例如pureGrade BRAND)，2)具有离子化和疏水表面的改性聚苯乙烯(例如lipoGrade BRANDThermo Scientific Microlite1+板)，3)为IgG的结合而优化的聚苯乙烯(亲水和疏水的；例如Greiner高结合性板，immuneGrade BRAND)，或3)具有亲水或低结合性表面的聚苯乙烯(例如ThermoScientific MultiSorp板、hydroGrade BRAND)。聚合物表面包括聚苯乙烯微孔板通过高能粒子(离子、电子、快中子和/或游离基)的物理轰击和/或通过紫外光子或在表面处或附近的化学反应(例如用酸处理或用有机硅烷处理)进行改性(Hegemann等，2003；WO 9203732；DE 2018523 A1)。用于本发明的优选固相是高结合性聚苯乙烯微孔板。

在本发明的另一个实施方式中，所述固相是未改性的(纯的)，或者通过高能粒子(离子、电子、快中子和/或游离基)的物理轰击和/或通过紫外光子或在表面处或表面附近的化学反应(例如用酸处理或用有机硅烷处理)进行改性，以成为亲水、疏水的或为IgG的结合而优化(高结合性：亲水和疏水的)。

在根据本发明的方法的另一个特定实施方式中，所述固相的表面以适合的形状使用，例如板、多孔板、管或珠子、片、薄膜、颗粒、磁性或非磁性粒子。在本发明的优选实施方式中，所述固相的表面形状是微量滴定板。

在根据本发明的方法的更特定实施方式中，将所述对象的血液样品与未饱和的固相相接触。这意味着所述固相在它与所述样品相接触时未用阻断剂和/或结合分子和/或稳定化蛋白和/或连接分子饱和/包被。

然而，在所述样品已与所述固相接触时，阻断剂或稳定化蛋白可以支持ApoE4或其片段与所述固相和结合剂的现有的结合，这意味着在所述固定化的ApoE4-结合剂复合物的检测期间(在所宣称的步骤b期间)所述稳定化/阻断分子/蛋白可以任选地存在。

在本发明的上下文中，术语“阻断剂”包括但不限于蛋白质溶液(例如牛血清白蛋白、来自于人类血清的白蛋白、乳蛋白、酪蛋白、鱼明胶的溶液)或完整血清(例如小牛血清)。

在根据本发明的方法的一个实施方式中，所述固体的表面未覆盖有任何结合剂或捕获分子。本文中使用的术语“结合剂”的定义提供在上文中。

在本发明的上下文中，“捕获分子”是可用于结合来自于样品的靶分子或感兴趣的分子即被分析物(在本发明的上下文中为肽)的分子。因此，捕获分子必须在空间上和根据表面特点例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在两方面充分塑形，以特异性结合所述靶分子或感兴趣的分子。在此，所述结合可以例如由所述捕获分子与所述靶分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或上述相互作用中的两者或更多者的组合来介导。在本发明的上下文中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述捕获分子是抗体，包括其对靶或感兴趣的分子具有足够亲和力的片段，并且包括重组抗体或重组抗体片段以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，稳定化蛋白支持所述血液样品中的ApoE4或其片段与所述固相的现有的结合，其中所述蛋白可以任选地被添加在所述反应缓冲液中。

免疫测定法的反应缓冲液通常含有稳定化/阻断蛋白(例如牛血清白蛋白、来自于人类血清的白蛋白、乳蛋白、酪蛋白、明胶、免疫球蛋白)。这些附加的蛋白阻止与所述固相的非特异性结合，并使结合配偶体(结合剂和抗原)以及结合剂-抗原的相互作用稳定。令人吃惊的是，向所述反应添加这些稳定化/阻断蛋白增强了ApoE4或其片段与所述固相的结合(参见实施例6)。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中。所述稳定化蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、来自于人类血清的白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、免疫球蛋白、稳定化氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸)等。优选的稳定化蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，BSA的浓度在0-10％、优选地0.2-5％、最优选地0.5-2.5％的范围内。

在根据本发明的方法的另一个特定实施方式中，所述血液样品中ApoE4之外的其他蛋白质的存在对ApoE4或它们的片段的检测没有任何影响。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，将所述对象的血液样品与固相相接触，以及将所述样品与至少一种特异性结合到ApoE4或其片段的结合剂相接触，在一步或两步程序中进行(参见实施例5)。

在本发明的上下文中，术语“一步程序”意味着ApoE4或其片段在所述固相上的固定化和ApoE4或其片段被标记的结合剂(例如抗体)的结合，在同一容器中同时进行。在这种程序期间，单独的ApoE4和随后特异性结合剂和/或ApoE4-结合剂复合物被固定化在所述固相上。

当在本文中使用时，术语“两步程序”意味着ApoE4或其片段在所述固相上的固定化和ApoE4或其片段特异性结合剂的结合，在逐步的时间点发生，并且任选地在温浴步骤之间具有清洗步骤。例如，可以首先将ApoE4固定化在所述固相上，随后，所述ApoE4特异性的标记的结合剂将结合固定化的ApoE4。另一种可能性是在第一步骤中将ApoE4与ApoE4特异性的标记的结合剂温浴以允许形成ApoE4-结合剂复合物，并在第二步骤中将ApoE4-结合剂复合物固定化在所述固相上。

在根据本发明的方法的另一个特定实施方式中，所述ApoE4-结合剂复合物被定性或定量检测，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定性检测指示了所述样品中ApoE4或其片段的存在，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定量检测指示了所述样品中ApoE4或其片段的浓度。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，ApoE4或其片段的浓度的定量检测指示了所述对象对ApoE4等位基因是纯合的还是杂合的。

在根据本发明的方法的另一个特定实施方式中，将所述ApoE4-结合剂复合物的存在与AD的发生/发病的风险相关联。

在根据本发明的方法的一个特定实施方式中，ApoE4的检测被用于确定发生阿兹海默氏病(AD)的风险。

本发明的另一个主题内容是用于预测阿兹海默氏病的发病风险以及在所有前面提到的疾病和感染中的医学意义的方法。

在根据本发明的方法的一个实施方式中，所述ApoE4-结合剂复合物中固定化的ApoE4的检测被用于在所述ApoE4-结合剂复合物中检测到的ApoE4水平高于一定阈值时将对象分类为ApoE4阳性或ApoE4阴性，其中所述阈值通过特定内部阳性对照来确定。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，所述ApoE4-结合剂复合物的高于一定阈值的水平预测了AD发病增加的风险，其中所述阈值由内部截止对照定义。

根据本发明的方法，对象的ApoE4阳性血液样品的测量值高于所述特定内部截止对照的水平(＝阈值)。在更优选的实施方式中，所述阈值比ApoE4阳性样品的水平低约1.5至100倍，优选地低1.5至20倍，最优选地低1.5至10倍。ApoE4阴性样品的测量值低于所述内部截止对照。在更优选的实施方式中，所述阈值比ApoE4阴性样品的水平高约10至10000倍，优选地高50至5000倍，最优选地高100至1000倍。

在本发明的上下文中，高于所述阈值的ApoE4水平指示了患者中ApoE4的存在以及因此AD的发生/发病的提高的风险。低于所述阈值的ApoE4水平指示了所述对象中不存在ApoE4以及因此AD的发生/发病的低风险。

在本发明的用于定性检测ApoE4-结合剂复合物的特定实施方式中，ApoE4或其片段的水平使用抗体或抗体的片段，使用免疫测定法来测量。ApoE4阳性和ApoE4阴性样品被由特定内部截止对照所定义的阈值分开，其中所有的ApoE4阴性样品仅显示出背景信号，并且所有的ApoE4阳性样品的测量值比所述截止对照高至少1.5倍(参见实施例5、6和7)。

本发明的另一个实施方式是所述被测量单位(即荧光、化学发光、酶反应等)的评估，其对应于所述检测到的ApoE4水平的水平，可以使用具有标准浓度的ApoE4校准物进行定量分析(参见实施例7)。利用定量分析，可以使用特定阈值水平将根据本发明的ApoE4阳性组进一步分成两个组，其对应于对ApoE4等位基因纯合或杂合的对象。这些特定阈值水平可以通过测量基因分型过的纯合或杂合样品来确定。

本发明的一个实施方式是ApoE4/ApoE4-结合剂复合物的存在与AD的发生/发病风险的关联。所述结果的评估指示了ApoE4阴性对象的AD发生/发病的低风险，并指示了ApoE4阳性对象的AD发生/发病的提高的风险。

在本发明的一个实施方式中，所述方法被用于与提高的ApoE4水平相关的疾病或病症的风险分层或实施治疗措施的分层。

在本发明的另一个实施方式中，所述疾病或病症选自认知缺损和神经变性疾病，包括痴呆症和/或阿兹海默氏病。

本发明的另一个主题内容是一种测定法，其能够执行所述用于检测ApoE4或其片段的方法。

在本发明的上下文中，测定法包含执行本发明的方法所需的所有试验组分。然而，当在本文中提到时，“测定法”不仅是含有所述试验组分的盒子或单元，而且是能够执行本发明所宣称的方法的所有相互作用的组分的功能性组合。

所述本发明的测定法也允许将本发明的方法作为全自动测定***来执行，例如在市场上可获得的平台(RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere)上执行。

在本发明的特定实施方式中，所述测定法能够执行在对象的血液样品中检测ApoE4或其片段的方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，以及

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相，或者将ApoE4固定化到所述固相并将所述结合剂结合到ApoE4。

在本发明的特定实施方式中，所述测定法能够执行在对象的血液样品中检测ApoE4或其片段的方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相，或者将ApoE4固定化到所述固相，其中所述固相未覆盖有任何结合剂或捕获分子，并且其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

在本发明的上下文中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物通过ApoE4固定化到所述固相，特别是将ApoE4固定化到所述固相，并将所述结合剂结合到ApoE4。

在本发明的一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中ApoE4与所述固相的结合在没有连接分子(其能够将ApoE4或其片段结合/连接到所述固相)的相互作用的情况下进行。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中在用所述样品接触所述固相时，所述接触在没有所述连接分子的相互作用的情况下进行。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中ApoE4与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

在本发明的一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述试剂中去污剂的浓度优选为0.0001至10％w/v，特别优选为0.01至1％w/v。本领域技术人员了解可以考虑为每种特定去污剂使用特定的浓度范围。

在本发明的优选实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中Tween-20以0.001-10％、优选地0.01-1％、最优选地0.2-0.5％的浓度使用。在根据本发明的方法的另一个实施方式中，Triton X-100以0.001-0.5％、优选地0.01-0.2％、最优选地0.05-0.1％的浓度使用。

在本发明的优选实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述结合剂特异性结合ApoE4或其片段。

在本发明的其他实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述结合剂是结合亲和常数为至少10⁷M^-1、优选地10⁸M^-1的抗体或功能性抗体片段或非IgG支架，优选的亲和常数高于10⁹M^-1，最优选地高于10¹⁰M^-1。

在本发明的更优选实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述结合剂用可检测标记物进行标记，以便在结合到ApoE4后被检测到。

在本发明的优选实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述结合剂的标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。然后通过适合的方法测量结合到所述被分析物的标记的抗体的量。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述结合剂的标记物选自与荧光染料或化学发光染料、特别是花菁类型的染料相组合的稀土金属穴状化合物或稀土金属螯合物。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述固相选自聚合物表面(例如聚苯乙烯)、玻璃表面、纤维素和纤维素衍生物(例如硝基纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙)。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述固相选自玻璃或聚合物表面，其中聚合物表面包括但不限于聚苯乙烯、聚二乙烯苯、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(苯乙烯-氧化乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、热解材料、上述物质的嵌段共聚物和共聚物、硅酮或二氧化硅。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述固相是未改性的(纯的)，或者通过高能粒子(离子、电子、快中子和/或游离基)的物理轰击和通过紫外光子和/或在表面处或附近的化学反应(例如用酸处理或用有机硅烷处理)进行改性，以成为亲水、疏水的或为IgG的结合而优化(高结合性：亲水和疏水的)。

在本发明的另一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述固相的表面以适合的形状使用，例如板、多孔板、管或珠子、片、薄膜、颗粒、磁性或非磁性粒子。在本发明的优选实施方式中，所述固相表面的形状是微量滴定板。

在本发明的更特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中将所述对象的血液样品与未饱和的固相相接触。这意味着所述固相在它与所述样品相接触时未用阻断剂和/或结合分子和/或稳定化蛋白和/或连接分子饱和/包被。

然而，在所述样品已与所述固相接触时，阻断剂或稳定化蛋白可以支持ApoE4或其片段与所述固相和结合剂的现有的结合，这意味着在所述固定化的ApoE4-结合剂复合物的检测期间(步骤b期间)所述稳定化/阻断分子/蛋白可以任选地存在。

在本发明的一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述固体的表面未覆盖有任何结合剂或捕获分子。本文中使用的术语“结合剂”的定义提供在上文中。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中稳定化蛋白支持所述血液样品中的ApoE4与所述固相的已有的结合，其中所述蛋白可以任选地被添加在所述反应缓冲液中。

在本发明的一个其他实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述稳定化蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、来自于人类血清的白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、免疫球蛋白、稳定化氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸)等。优选的稳定化蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中BSA的浓度在0-10％、优选地0.2-5％、最优选地0.5-2.5％的范围内。

在本发明的另一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述血液样品中ApoE4之外的其他蛋白质的存在对ApoE4或它们的片段的检测没有任何影响。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中将所述对象的血液样品与固相相接触，以及将所述样品与至少一种特异性结合到ApoE4或其片段的结合剂相接触，在一步或两步程序中进行(参见实施例5)。

在本发明的另一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述方法用于检测ApoE4或其片段，所述ApoE4-结合剂复合物被定性或定量检测，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定性检测指示了所述样品中ApoE4的存在，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定量检测指示了所述样品中ApoE4的浓度。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中ApoE4的浓度的定量检测指示了所述对象对ApoE4等位基因是纯合的还是杂合的。

在本发明的另一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中将所述ApoE4-结合剂复合物的存在与AD的发生/发病的风险相关联。

在本发明的一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中ApoE4或其片段的检测被用于确定发生阿兹海默氏病(AD)的风险。

在本发明的另一个特定实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中ApoE4或其片段的检测被用于预测阿兹海默氏病的发病风险以及在所有前面提到的疾病和感染中的医学意义。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物中固定化的ApoE4的检测被用于在所述ApoE4-结合剂复合物中检测到的ApoE4水平高于一定阈值时将对象分类为ApoE4阳性或ApoE4阴性，其中所述阈值通过特定内部阳性对照来确定。

在本发明的另一个实施方式中，所述测定法能够执行本发明的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物的高于一定阈值的水平预测了AD发病的高风险，其中所述阈值由内部截止对照定义。

根据本发明的方法，对象的ApoE4阳性血液样品的测量值高于截止值的水平，其中所述截止值通过测量ApoE4阴性样品和ApoE4阳性样品并计算比率来确定。

在一个实施方式中，所述比率如下计算：

[信号]_negCO+因子X乘以[信号]_posCO，其中所述因子>0并<1。

根据本发明的方法，在一个实施方式中，对象的ApoE4阳性血液样品的测量值高于截止值的水平(＝阈值)，其中所述阈值通过测量ApoE4阴性对照的信号并计算所述信号的1.5至100.000倍、更优选地所述信号的10至50.000倍、甚至更优选地所述信号的20至20.000倍、最优选地所述信号的50至10.000倍、最优选地所述信号的100至1000倍来确定。根据本发明的方法，对象的ApoE4阳性血液样品的测量值高于截止值的水平(＝阈值)，其中所述阈值通过测量ApoE4阳性对照的信号并将所述信号值乘以>0且<1、更优选地>0.01且<0.8、甚至更优选地>0.05且<0.5、最优选地>0.1且<0.25的因子来确定。

在本发明的特定实施方式中，一种测定法被用于确定ApoE4及其具有至少6个氨基酸的片段的水平，其中所述测定法的测定灵敏度能够检测/定量对象的血液样品中的ApoE4及其片段，并且<1ng/mL、优选地<5ng/mL、更优选地<10ng/mL、甚至更优选地<25ng/mL。

本发明的另一个主题内容是一种能够执行本发明的方法的测定法，其中ApoE4或其片段的水平使用免疫测定法来测量，所述免疫测定法包含针对ApoE4或其片段的一个或多个表位的一种或多种捕获探针。

在本发明的一个实施方式中，所述免疫测定法选自放射免疫测定法(RIA)、均相酶多重免疫测定法(EMIT)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、脱辅基酶蛋白再激活免疫测定法(ARIS)、试纸条免疫测定法和免疫层析测定法。

在本发明的另一个实施方式中，这种测定法可以是所谓的POC测试(床旁测试)，这是一种不需全自动测定***，允许在患者附近在不到1小时内进行的测试技术。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。

在本发明的另一个实施方式中，这种测定法是单一抗体免疫测定法，其使用任何类型的检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电致化学发光标记物，优选为全自动测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述***之一的测定法：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere

本发明的另一个主题内容是一种能够执行本发明的方法的测定法，其包含下述试验组分：

a.一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

b.固相(例如板、管、珠子、片)，

c.含有去污剂的反应缓冲液。

本发明的另一个实施方式是一种能够执行本发明的方法的测定法，其包含：

a.一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

b.聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

c.含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂。

所述测定法可以另外包含以下对照：

■至少一种下述对照是必需的：阴性对照，截止对照和阳性对照，

■对照可以是具有已知ApoE4浓度的样品(天然、纯化或重组的)。

本发明的另一个实施方式是一种测定法，其能够执行本发明的用于定量对象样品中的ApoE4或其片段的方法，所述测定法包含：

■一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

■聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

■含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂。

所述测定法可以另外包含一种或多种以下校准物：

■校准物可以是具有已知ApoE4浓度的样品(天然、纯化或重组的)。

本发明的另一个实施方式是一种能够执行检测ApoE4或其片段的方法的测定法，其由下述组分构成：

■一种针对包含在ApoE4或其具有至少6个氨基酸的片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

■聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

■含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂，

■对照和/或校准物，

■清洗缓冲液，

■测量试剂。

本发明的另一个主题内容是一种试剂盒，其用于检测对象的血液样品中的ApoE4或其片段。

当在本文中提到时，“试剂盒”是包含材料的组合的盒子，所述材料是执行本发明的方法、特别是检测对象血液样品中的ApoE4及其片段所必需的。

本发明的另一个主题内容是一种用于检测对象的血液样品中的ApoE4及其片段的试剂盒，其包含：

a.一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

b.固相(例如板、管、珠子、片)，

c.含有去污剂的反应缓冲液。

本发明的另一个实施方式是一种用于检测对象的血液样品中的ApoE4及其片段的试剂盒，其包含：

■一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

■聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

■含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂。

所述试剂盒可以另外包含对照：

■至少一种下述对照是必需的：阴性对照，截止对照和阳性对照，

■对照可以是具有已知ApoE4浓度的样品(天然、纯化或重组的)。

本发明的另一个实施方式是一种用于定量对象样品中的ApoE4或其片段的试剂盒，其包含：

■一种针对包含在ApoE4或其片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

■聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

■含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂。

所述试剂盒可以另外包含一种或多种校准物：

■校准物可以是具有已知ApoE4浓度的样品(天然、纯化或重组的)。

本发明的另一个实施方式是一种用于检测对象的血液样品中的ApoE4或其片段的试剂盒，其由下述组分构成：

■一种针对包含在ApoE4或其具有至少6个氨基酸的片段的序列中的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

■聚合物或玻璃固相，优选为高结合性聚苯乙烯微孔板，

■含有去污剂、优选为0.2％Tween-20的试剂，

■对照和/或校准物，

■清洗缓冲液，

■测量试剂。

本发明的另一个实施方式是使用结合剂来检测对象的血液样品中的ApoE4或其片段，其包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相，或者将ApoE4固定化到所述固相并将所述结合剂结合到ApoE4。

本发明的另一个实施方式是使用结合剂来检测对象的血液样品中的ApoE4或其片段，其包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相，或者将ApoE4固定化到所述固相，其中所述固相未覆盖有任何结合剂或捕获分子，并且其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

在本发明的上下文中，宣称将结合剂用于本发明的方法与要求保护的包括所有前述实施方式的本发明的方法是同义的。

下面的实施方式也是本发明的主题：

1.一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的(体外)方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物利用ApoE4固定化到所述固相。

2.一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的(体外)方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物被固定化到所述固相，其中所述固相未覆盖有任何结合剂或捕获分子，并且其中ApoE4或所述ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

3.根据实施方式1或2的方法，其中ApoE4或其片段被固定化到所述固相，并且所述结合剂被结合到ApoE4。

4.根据实施方式1至3的方法，其中所述ApoE4的片段的长度为至少6个氨基酸，前提是第158位氨基酸(精氨酸)被涵盖在所述片段内，其中所述第158位氨基酸的序列参考Seq ID NO.1。

5.根据实施方式1至4的方法，其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在没有能够将ApoE4或其片段结合到所述固相的连接分子的相互作用的情况下进行。

6.根据实施方式1至5的方法，其中在用所述样品接触所述固相时，所述接触在没有所述连接分子的相互作用的情况下进行。

7.根据实施方式1至6的方法，其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

8.根据实施方式1至7的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物被定性或定量检测。

9.根据实施方式1至8的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定量检测指示了所述样品中ApoE4的浓度，其中所述浓度为所述对象对ApoE4等位基因是纯合还是杂合提供了指示。

10.根据实施方式1至9的方法，其中所述结合剂是结合亲和常数为至少10⁷M^-1、优选为10⁸M^-1的抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，优选的亲和常数大于10⁹M^-1，最优选地大于10¹⁰M^-1。

11.根据实施方式1至10的方法，其中所述结合剂用标记物标记以便检测，其中所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物或放射性碘标记物。

12.根据实施方式1至11的方法，其中所述ApoE4的检测被用于在所述检测到的ApoE4水平高于一定阈值时将对象分类为ApoE4阳性或ApoE4阴性，其中所述阈值通过特定内部阳性对照来确定。

13.根据实施方式1至12的方法，其中所述固相选自聚合物表面(例如聚苯乙烯)、玻璃表面、纤维素和纤维素衍生物(例如硝基纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙)。

14.根据实施方式1至13的方法，其中所述固相选自玻璃或聚合物表面，其中聚合物表面包含但不限于聚苯乙烯、聚二乙烯苯、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(苯乙烯-氧化乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、热解材料、上述物质的嵌段共聚物和共聚物、硅酮或二氧化硅。

15.根据实施方式1至14的方法，其中将所述血液样品与未饱和的固相相接触。

16.根据实施方式1至15的方法，其中所述固相表面未覆盖有任何结合剂或捕获分子。

17.根据实施方式1至16的方法，其中所述反应缓冲液中任选的稳定化蛋白通过阻断非特异性结合位点并与ApoE4的构象相互作用，使所述血液样品中的ApoE4及其片段与所述固相的结合稳定，其中所述稳定化蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、来自于人类血清的白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、免疫球蛋白和稳定化氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸)，优选地所述稳定化蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

18.根据实施方式1-17的方法，其中作为稳定化蛋白的BSA的浓度在0-10％、优选地0.2-5％、最优选地0.5-2.5％的范围内。

19.根据实施方式1-18的方法，其中所述去污剂选自阴离子型去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、阳离子型去污剂(例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))、两性离子型去污剂(例如CHAPS)和/或非离子型去污剂(例如Tween-20、TritonX-100)。

20.根据实施方式1-19的方法，其中Tween-20的浓度选自0.001-10％、优选地0.01-1％、最优选地0.2-0.5％的范围。

21.根据实施方式1-20的方法，其中TritonX-100的浓度选自0.001-0.5％、优选地0.01-0.2％、最优选地0.05-0.1％的范围。

22.根据前述实施方式任一项的方法，其中所述血液样品选自全血、血清和枸橼酸盐血浆、肝素血浆、EDTA血浆。

23.根据前述实施方式任一项的方法，其中所述对象选自活的人类或非人类生物体，优选为人类对象，其中所述对象是健康、表观健康、患有认知缺损性痴呆症、特别是患有AD的对象。

24.一种试剂盒，其包含：

a.一种针对ApoE4的序列中所包含的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

b.固相，

c.含有去污剂的反应缓冲液。

25.根据前述实施方式任一项的试剂盒用于体外检测和/或定量在对象的血液样品中的ApoE4或其片段的用途。

26.根据前述实施方式任一项的方法用于与提高的ApoE4水平相关的疾病或病症的风险分层或实施治疗措施的分层的用途。

27.根据前述实施方式任一项的方法的用途，其中所述疾病或病症选自认知缺损和神经变性疾病，所述神经变性疾病包括痴呆症和/或阿兹海默氏病(AD)。

28.根据前述实施方式任一项的方法，其用于检测发生AD的风险，其中高于一定阈值的高水平的ApoE4预测了发生AD的提高的风险。

29.根据前述实施方式任一项的方法，其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物的存在与AD的发生/发病的风险相关。

实施例

1.实施例1

抗体的产生和它们的亲和常数的确定

-用于免疫的肽/偶联物：

合成了用于免疫的特定ApoE4肽和ApoE2/3特定对照肽，参见表1(JPTTechnologies,Berlin,Germany)。所述ApoE4肽被合成为带有附加的N-端半胱氨酸残基，用于将所述肽偶联到牛血清白蛋白(BSA)。使用Sulfolink偶联凝胶(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽共价连接到BSA。所述偶联程序按照Perbio的手册进行。

表1：

肽	ApoE区	描述	亲和常数[M<sup>-1</sup>]
				Cys-EDVRGRLVQYR	109-119 ApoE4	免疫原	2.1x 10<sup>9</sup>
EDVCGRLVQYR	109-119 ApoE2/3	对照肽	-

-小鼠的免疫、免疫细胞融合和筛选：

将Balb/c小鼠在第0和14天用100μg肽-BSA偶联物(乳化在100μl弗氏完全佐剂中)并在第21和28天用50μg(在100μl弗氏不完全佐剂中)免疫。在进行融合实验之前三天，动物接受溶解在100μl盐水中的50μg所述偶联物，作为一次腹膜内和一次静脉内注射液提供。

将来自于被免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞用1ml50％聚乙二醇在37℃融合30秒。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[增补有20％胎牛血清和HAT增补物的RPMI1640培养基]中生长来选择杂交克隆。在两周后，将所述HAT培养基用HT培养基替换进行三次传代，然后返回到正常的细胞培养基。

在融合后三周，对细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体进行初筛。将测试阳性的微量培养物转移到24孔板进行增殖。在重新试验后，使用有限稀释技术将所选的培养物克隆并再次克隆，并确定同种型(Lane等，1985；Ziegler等，1996)。

-单克隆抗体生产

抗体通过标准的抗体生产方法(Marx等，1997)来生产，并通过蛋白A来纯化。基于SDS凝胶电泳分析，所述抗体的纯度为>95％。

-亲和常数

为了确定所述抗体对ApoE4的亲和性，使用Biacore 2000***(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振，确定了重组ApoE4与固定化的抗体的结合的动力学。使用按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare)以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体，进行了所述抗体的可逆固定化。

-标记程序(示踪剂)

将100μg(100μl)抗体(1mg/ml，在PBS中，pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml，在乙腈中，InVent GmbH,Germany；EP 0 353971)混合并在室温温浴20min。标记的抗体通过凝胶过滤HPLC在SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化。将所述纯化的标记抗体在(300mmol/L磷酸钾，100mmol/L NaCl，10mmol/L Na-EDTA，5g/L牛血清白蛋白pH 7.0)中稀释。终浓度为每200μL大约800.000相对光单位(RLU)的标记化合物(大约20ng标记抗体)。吖啶酯化学发光使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量。

2.实施例2

具有已知基因型的血浆样品的测量。使用血浆和全血匹配，人们可以通过基因分型在遗传上分析ApoE状态，并使用本发明的ApoE4测定法测量所述匹配的血浆中的ApoE4水平。

2.1方法

-基因分型

来自于180个全血样品的遗传分析由Medigenomix(Ebersberg,Deutschland)进行。从所述样品分离DNA，并使用Sanger测序技术(Sanger&Coulson 1975)对ApoE基因进行测序。

-ApoE4测定法程序

ApoE4单一抗体测定法在一步程序中进行。将血浆样品一式两份直接吸取到96孔微量滴定板的孔中(Greiner，Lumitrac 600高结合性聚苯乙烯；每孔20μl样品)。向每块微量板添加ApoE4截止下限对照(重组ApoE4[4μg/ml]，在ApoE4阴性人类血浆中，每孔20μl，一式两份)。在孔中添加200μl含有吖啶酯标记的抗ApoE4抗体(示踪剂)的反应缓冲液(PBS，含有0.2％Tween-20、1％BSA、0.1％牛IgG、0.1％绵羊IgG和0.02％小鼠IgG，pH 7.4)。将所述微量板在室温温浴1h。通过用清洗溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗四次除去未结合的示踪剂。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,Berthold Technologies GmbH,Bad Wildbad)进行测量。

2.2结果

图1a示出了通过基因型区分的ApoE4测定法的结果。在所述截止对照的帮助下，人们可以从RLU值容易地区分ApoE4阳性和ApoE4阴性样品。所有ApoE4阴性样品具有低于3000RLU的RLU值，所有ApoE4阳性样品具有高于3000RLU的RLU值。所述阴性样品基本上仅仅显示出免疫测定法的背景信号并且没有ApoE4的信号。图1b示出了相应的ROC曲线。使用1的曲线下面积(AUC)，所述测定法精确地区分ApoE4阳性样品和阴性样品。

3.实施例3

在含有/不含去污剂的情况下ApoE4与不同聚合物和玻璃表面的结合的分析。

3.1方法

-血浆样品在聚合物或玻璃表面上的预温浴：

将每种ApoE4阳性血浆样品分成120μl的等分试样，将其在不同材料(聚苯乙烯(PS)、聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和玻璃)的管中温浴，每种材料两只管。在温浴前向一半的等分试样添加0.1％Triton X-100，另一半用等体积的PBS处理。将所有管在室温下温浴过夜。

-ApoE4单一抗体测定法

将20μl每种制备物以及未预温浴的对照吸取到Greiner高结合性微量滴定板的孔上。然后如实施例2中所述进行ApoE4测定法。将测量到的ApoE4浓度相对于相应对照样品的浓度(定义为100％)进行计算。

3.2结果

在聚合物或玻璃管中预温浴后，去污剂处理的样品显示出ApoE4水平的强烈降低，损失约50％(参见图2)。在所述样品在其上预温浴的表面的类型之间没有差异。所述未用去污剂处理的样品在预温浴后存在ApoE4信号的轻微损失，但不像使用去污剂时那样显著。

去污剂增强ApoE4与聚合物或玻璃表面的结合。

4.实施例4

去污剂是否充当ApoE4与固相之间的连接分子的分析。

4.1方法

-微量滴定板(MTP)的包被

向三块Greiner高结合性微量滴定板添加每孔300μl的ddH₂O、ddH₂O中的0.05％Triton X-100溶液或ddH₂O中的0.4％Triton X-100溶液(各一块板)。将所述板在室温下温浴过夜。随后，将MTP用1xPBS清洗三次，并直接用于ApoE4一步单一抗体测定法。

-ApoE4单一抗体测定法

将20μl ApoE4阳性和阴性样品的血浆以及截止对照(4μg/ml重组ApoE4，在人类血浆中)吸取到预处理过的Greiner高结合性微量滴定板的每个孔上。一半的孔添加200μl含有0.05％Triton X-100的示踪剂缓冲液(PBS，含有1％BSA、0.1％牛IgG、0.1％绵羊IgG和0.02％小鼠IgG，pH 7.4+吖啶酯标记的抗ApoE4抗体)，另一半添加不含去污剂的相同的示踪剂缓冲液(0％Triton X-100)。将所述微量板在室温下温浴1h。通过用清洗溶液(20mMPBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗四次除去未结合的示踪剂。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,Berthold Technologies GmbH,BadWildbad)进行测量。

4.2结果

如果去污剂充当ApoE4与固相之间的连接分子，则当在去污剂处理的板上在不含任何去污剂的测定缓冲液中进行ApoE4测定法时，应该存在强烈信号，甚至可能是浓度依赖性的。情况并非如此。当所述测定法在不含任何去污剂的测定缓冲液中进行时，所有样品以及截止对照在任何预处理过的板上均未显示出信号(参见图3)。ApoE4阳性和ApoE4阴性样品两者的信号在基线时都在相同水平上，并且因此不能彼此区分。相反，当所述测定法在含有去污剂的测定缓冲液中进行时，在ApoE4阳性样品和截止对照中存在显著信号。该信号也不依赖于偶联到MTP的Triton X-100的量。

去污剂是ApoE4测定法中缓冲液的必需组分。将去污剂包被在MTP上并添加样品和无去污剂的缓冲液不产生显著信号。这显示出更需要去污剂处于其可移动的形式而不是作为可能的连接分子被固定化。

5.实施例5

一步和两步测定法程序的比较。

5.1方法

-一步测定法程序

所述ApoE4单一抗体测定法如实施例2中所述来进行。在一步程序中，将样品和示踪抗体在室温下在一起温浴1小时。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,Berthold Technologies GmbH,Bad Wildbad)来测量。向每块微孔板添加了ApoE4下限截止对照(重组ApoE4[4μg/ml]，在ApoE4阴性人类血浆中；每孔20μl，一式两份)。

-两步测定法程序

在两步测定法程序中，将血浆样品一式两份直接吸取到96孔微量滴定板的孔中(Greiner，Lumitrac 600高结合性聚苯乙烯，每孔20μl样品)。向每块微孔板添加ApoE4下限截止对照(重组ApoE4[4μg/ml]，在ApoE4阴性人类血浆中；每孔20μl一式两份)。向孔添加200μl反应缓冲液(PBS，含有0.2％Tween-20、1％BSA、0.1％牛IgG、0.1％绵羊IgG和0.02％小鼠IgG，pH 7.4)。将所述微孔板在室温温浴过夜(＝步骤1)。随后，将微孔板用清洗缓冲液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗四次，并在孔中添加200μl含有吖啶酯标记的抗ApoE4抗体的反应缓冲液。将所述微孔板在室温温浴2小时(＝步骤2)，并用清洗缓冲液再次清洗4次。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,BertholdTechnologies GmbH,Bad Wildbad)来测量。

为了更直接地比较所述两种测定法程序变化形式，将所述RLU值变换成相对单位“截止对照的倍数”。

5.2结果

在这里，将短的(1h)一步程序与长的(过夜/2h)两步程序进行比较。一步测定法的相对光单位(RLU)比两步测定法的RLU低大约10倍(参见表2)。但对于每种ApoE4阳性样品和截止对照来说该比率都是如此。在任何测定法形式中，ApoE4阴性样品的值都保持同等地低。在每种测定法中样品相对于内部截止对照的值大致相同(参见图4)，并且每种测定法能够将ApoE4阳性样品与ApoE4阴性样品区分开。

表2：

6.实施例6

阻断/稳定化剂(BSA)对ApoE4与固相的结合的影响。

6.1方法

所述ApoE4测定法在两步程序中进行，其中第一步(ApoE4结合到固相)在存在或不存在BSA的情况下进行。第二步(抗ApoE4抗体与固定化的ApoE4的结合)在含有1％BSA的测定缓冲液中进行。

将血浆样品和ApoE4下限截止对照(在ApoE4阴性人类血浆中的重组ApoE4[4μg/ml])直接吸取到96孔微量滴定板的孔中(Greiner，Lumitrac 600高结合性聚苯乙烯；每孔20μl样品)。向孔添加200μl含有1％BSA或不含BSA(0％BSA)的反应缓冲液(PBS，含有0.2％Tween-20、0.1％牛IgG、0.1％绵羊IgG和0.02％小鼠IgG，pH 7.4)。将所述微孔板在室温温浴1小时(＝步骤1)。随后，将微孔板用清洗缓冲液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗四次，并在孔中添加200μl含有1％BSA和吖啶酯标记的抗ApoE4抗体的反应缓冲液。将所述微孔板在室温温浴1小时(＝步骤2)，并用清洗缓冲液再次清洗4次。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,Berthold Technologies GmbH,BadWildbad)来测量。

为了更直接地比较所述两种测定法的变化形式，将所述RLU值转换成相对单位“截止对照的倍数”。

6.2结果

在不含BSA的缓冲液中温浴的样品的信号明显低于在反应混合物中含有BSA的情况(参见表3，图5)。使用所述截止对照，两种测定法变化形式都能区分ApoE4阳性样品和ApoE4阴性样品。因此，BSA对于ApoE4结合来说不是必需的，但令人吃惊的是，它强烈增加ApoE4与固相的结合，并因此可以被可选地添加到反应缓冲液以提高信号。这个结果是令人吃惊地，因为BSA通常被用于阻断非特异性信号，并且在添加BSA后通常伴有较低的信号。

表3：

7.实施例7

血浆样品中ApoE4的定量。

7.1方法

所述ApoE4测定法如实施例2中所述来进行。为了定量血浆中的ApoE4水平，使用了校准物。将重组ApoE4以逐步方式在ApoE4阴性人类血浆中稀释，产生在0.01–21.87μg/ml范围内的校准曲线。样品的ApoE4浓度使用所述校准曲线的线性回归来计算。将显示出高于最高标准品的值的RLU值的样品在ApoE4阴性人类血浆中稀释并重新测量。具有4μg/ml的确定浓度的截止对照也被测量，作为所述标准曲线的对照。

7.2结果

在0.01–21.87μg/ml的范围内，ApoE4被线性稀释(参见图6)。表4示出了测量到的RLU值和计算的ApoE4浓度。ApoE4阳性样品具有9.7–30.4μg/ml范围内的浓度。所有ApoE4阴性样品的浓度总是<0.1μg/ml(测定法背景)。截止对照的浓度为4μg/ml，与使用在测量之前稀释的校准物测量到的完全相同。

表4：

8.实施例8

用蛋白质预包被对ApoE4与固相的结合的影响。

8.1方法

将96孔微量滴定板(Greiner，Lumitrac 600高结合性聚苯乙烯)用每孔300μl人类血清(ApoE4阴性)或含有6.5mM KH₂PO₄、3.5mM Na₂HPO₄x2H₂O、3％Karion(糖)和0.5％BSA的饱和溶液在室温下预包被18h。在温浴后，将微量板用清洗溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗4次。

然后，在一步程序中进行所述ApoE4测定法(如实施例2中所述)。

将血浆样品(ApoE4阳性和ApoE4阴性)和重组ApoE4-样品(重组ApoE4，在ApoE4阴性人类血浆中)直接吸取到96孔微量滴定板的孔中(每孔20μl样品)。在孔中添加200μl含有吖啶酯标记的抗ApoE4抗体的反应缓冲液(PBS，含有0.2％Tween-20、0.1％牛IgG、0.1％绵羊IgG和0.02％小鼠IgG，pH 7.4)。随后，将微孔板用清洗溶液(20mM PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗4次。发光(以相对光单位(RLU)为单位)使用MTP照度计(Centro LB960,Berthold Technologies GmbH,Bad Wildbad)来测量。

8.2结果

如图7(A)中所示，ApoE4阳性EDTA血浆样品在未处理的固相上给出显著信号。相反，用含有蛋白质的溶液(BSA或人类血清)预处理的孔不给出信号。

类似地，如图7(B)中所示，含有不同浓度的重组ApoE4的ApoE4阴性EDTA血浆样品在未处理的孔上给出显著信号，但当它们在蛋白质预处理的孔中温浴时，不给出信号。

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序列

SEQ ID NO:1

人类ApoE4(功能性蛋白,1-299)

SEQ ID NO:2(人类preApoE4 1-317，包括信号肽)

SEQ ID NO.:3(Apo E4片段1-165)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAG

SEQ ID NO.:4(ApoE4片段1-185)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLV

SEQ ID NO.:5(ApoE4片段1-191)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRV R

SEQ ID NO.:6(ApoE4片段1-202)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQP

SEQ ID NO.:7(ApoE4片段1-229)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRL

SEQ ID NO.:8(ApoE4片段1-231)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLD E

SEQ ID NO.:9(片段ApoE4 1-251)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIR

SEQ ID NO.:10(片段ApoE4 1-259)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQA

SEQ ID NO.:11(片段ApoE4 1-260)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQAR

SEQ ID NO.:12(片段ApoE4 1-266)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFE

SEQ ID NO.:13(片段ApoE4 1-271)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVE D

SEQ ID NO.:14(片段ApoE4 1-272)

KVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDM

SEQ ID NO.:15(ApoE4 72-299)

KAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

附图说明

图1：

(A)具有已知ApoE基因型的血浆样品的测量。血浆ApoE4浓度与遗传状态相关(ApoE4阴性样品的值低，ApoE4阳性样品的值高；统计分析：Mann-Whitney检验)。

(B)使用基因型进行的ApoE4测定法的ROC分析(AUC–曲线下面积)。

图2：

在添加和不添加去污剂的情况下在不同材料的管中预温浴后ApoE4水平的测量(PS–聚苯乙烯，PP–聚丙烯，PET–聚对苯二甲酸乙二酯)。

图3：

在含有/不含去污剂(Triton X-100)的情况下在MTP的预处理后MTP中ApoE4水平的测量。测定缓冲液含有Triton X-100(0.05％)或不含任何去污剂(0％)，样品在一步程序中测量。在这里示出了截止对照(A)、两种ApoE4阳性样品D1(B)和D2(C)和ApoE4阴性样品D3(D)。

图4：

一步和两步ApoE4测定法的比较。虚线显示了截止对照的值。每个具有低于这种截止值的值的样品是ApoE4阴性的，每个具有高于所述阈值的值的样品是ApoE4阳性的。

图5：

在存在(1％)/不存在(0％)BSA的情况下ApoE4与固相的结合的分析。虚线示出了相应的测定法变化形式中截止对照(C)的值。

图6：

ApoE4标准品在0.01至21.87μg/ml的范围内的线性回归。

图7：

在用蛋白质溶液(牛血清白蛋白或人类血清)预处理固相后ApoE4水平的测量。

(A)ApoE4阳性和ApoE4阴性天然EDTA血浆样品的测量。

(B)重组ApoE4溶液的测量。

SEQUENCE LISTING

<110> sphingotec GmbH

<120> METHOD FOR THE DETECTION OF APOLIPOPROTEIN E4

<130> S75097WO

<150> EP 16 193 587.9

<151> 2016-10-12

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met

260 265 270

Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly

275 280 285

Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His

290 295

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys

1 5 10 15

Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu

20 25 30

Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu

35 40 45

Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln

50 55 60

Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala

65 70 75 80

Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu

85 90 95

Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser

100 105 110

Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp

115 120 125

Val Arg Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

145 150 155 160

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg

165 170 175

Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu

180 185 190

Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val

195 200 205

Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg

210 215 220

Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly

225 230 235 240

Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu

245 250 255

Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala

260 265 270

Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu

275 280 285

Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala

290 295 300

Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His

305 310 315

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly

165

<210> 4

<211> 185

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val

180 185

<210> 5

<211> 191

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

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Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

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100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

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Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

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Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

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Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

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Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

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Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu

225 230

<210> 9

<211> 251

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

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Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg

245 250

<210> 10

<211> 259

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

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Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

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Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

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Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

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Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

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225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala

<210> 11

<211> 260

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala Arg

260

<210> 12

<211> 266

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu

260 265

<210> 13

<211> 271

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp

260 265 270

<210> 14

<211> 272

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln

1 5 10 15

Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln

35 40 45

Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met

50 55 60

Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu

65 70 75 80

Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu

85 90 95

Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg

100 105 110

Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln

115 120 125

Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu

130 135 140

Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala

145 150 155 160

Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala

180 185 190

Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln

195 200 205

Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg

210 215 220

Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg

225 230 235 240

Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala

245 250 255

Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met

260 265 270

<210> 15

<211> 228

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu

1 5 10 15

Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg

20 25 30

Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg

35 40 45

Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val

50 55 60

Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp

65 70 75 80

Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg

85 90 95

Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro

100 105 110

Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala

115 120 125

Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg

130 135 140

Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu

145 150 155 160

Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala

165 170 175

Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser

180 185 190

Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu

195 200 205

Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro

210 215 220

Ser Asp Asn His

225

Claims (24)

1.一种用于在对象的血液样品中检测载脂蛋白E同种型4(ApoE4)或其片段的(体外)方法，所述方法包括下述步骤：

a.将所述样品与固相相接触，

将所述样品同时或顺序地与至少一种特异性结合到ApoE4的结合剂相接触，由此形成ApoE4-结合剂复合物，其中所述结合剂是抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，和

b.检测所述ApoE4-结合剂复合物，其中所述ApoE4-结合剂复合物被固定化到所述固相，其中所述固相未覆盖有任何结合剂或捕获分子，并且其中ApoE4或所述ApoE4-结合剂复合物与所述固相的结合在去污剂存在下进行。

2.根据权利要求1的方法，其中ApoE4或其片段被固定化到所述固相，并且所述结合剂被结合到ApoE4。

3.根据权利要求1至2的方法，其中所述ApoE4的片段的长度为至少6个氨基酸，前提是第158位氨基酸(精氨酸)被包含在所述片段内，其中所述第158位氨基酸的序列参考Seq IDNO.1。

4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物被定性或定量检测。

5.根据权利要求1至4的方法，其中所述ApoE4-结合剂复合物的定量检测指示了所述样品中ApoE4的浓度，其中所述浓度为所述对象对ApoE4等位基因是纯合还是杂合提供了指示。

6.根据权利要求1至5的方法，其中所述结合剂是结合亲和常数为至少10⁷M^-1、优选为10⁸M^-1的抗体或功能性抗体片段或非IgG蛋白质支架，优选的亲和常数大于10⁹M^-1，最优选地大于10¹⁰M^-1。

7.根据权利要求1至6的方法，其中所述结合剂用标记物标记以便检测，其中所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物或放射性碘标记物。

8.根据权利要求1至7的方法，其中所述ApoE4的检测被用于在所述检测到的ApoE4水平高于一定阈值时将对象分类为ApoE4阳性或ApoE4阴性，其中所述阈值通过特定内部阳性对照来确定。

9.根据权利要求1至8的方法，其中所述固相选自聚合物表面(例如聚苯乙烯)、玻璃表面、纤维素和纤维素衍生物(例如硝基纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙)。

10.根据权利要求1至9的方法，其中所述固相选自玻璃或聚合物表面，其中聚合物表面包含但不限于聚苯乙烯、聚二乙烯苯、苯乙烯-丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物、聚(苯乙烯-氧化乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、聚烯烃、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、聚二甲基硅氧烷、热解材料、上述物质的共聚物和嵌段共聚物，硅酮或二氧化硅。

11.根据权利要求1至13的方法，其中将所述血液样品与未饱和的固相相接触。

12.根据权利要求1至11的方法，其中所述反应缓冲液中任选的稳定化蛋白通过阻断非特异性结合位点并与ApoE4的构象相互作用，使所述血液样品中的ApoE4及其片段与所述固相的结合稳定，其中所述稳定化蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、来自于人类血清的白蛋白、酪蛋白、乳蛋白、免疫球蛋白和稳定化氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸)，优选地所述稳定化蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。

13.根据权利要求1-12的方法，其中作为稳定化蛋白的BSA的浓度在0-10％、优选地0.2-5％、最优选地0.5-2.5％的范围内。

14.根据权利要求1-13的方法，其中所述去污剂选自阴离子型去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、阳离子型去污剂(例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))、两性离子型去污剂(例如CHAPS)和/或非离子型去污剂(例如Tween-20、Triton X-100)。

15.根据权利要求1-14的方法，其中Tween-20的浓度选自0.001-10％、优选地0.01-1％、最优选地0.2-0.5％的范围。

16.根据权利要求1-15的方法，其中TritonX-100的浓度选自0.001-0.5％、优选地0.01-0.2％、最优选地0.05-0.1％的范围。

17.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述血液样品选自全血、血清和枸橼酸盐血浆、肝素血浆、EDTA血浆。

18.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述对象选自活人或非人类生物体，优选为人类对象，其中所述对象是健康的、表观健康的、患有认知缺损性痴呆症的、特别是患有AD的对象。

19.一种试剂盒，其包含：

a.一种针对ApoE4的序列中所包含的表位的结合剂，其中所述结合剂用可检测标记物标记，

b.固相，

c.含有去污剂的反应缓冲液。

20.根据前述权利要求任一项的试剂盒在对象的血液样品中体外检测和/或定量ApoE4的用途。

21.根据前述权利要求任一项的方法在与提高的ApoE4水平相关的疾病或病症的风险分层或实施治疗措施的分层中的用途。

22.根据前述权利要求任一项的方法的用途，其中所述疾病或病症选自认知缺损和神经变性疾病，所述神经变性疾病包括痴呆症和/或阿兹海默氏病(AD)。

23.根据前述权利要求任一项的方法，其用于检测发生AD的风险，其中高于一定阈值的提高的ApoE4水平预测了发生AD的提高的风险。

24.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述ApoE4或ApoE4-结合剂复合物的存在与AD的发生/发病的风险相关。