CN109890202A - 增加和减少***素合成的植物和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于增加或减少***素合成的新植物和方法。本文公开的植物在***属植物中包含非天然比率和浓度的***素。本文公开的方法包括操纵***素的生物合成途径以产生具有非天然比率和浓度的***素的***属植物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月18日提交的美国临时申请第62/376,521号、2016年9月8日提交的美国临时申请第62/385,102号、2016年11月1日提交的美国临时申请第62/416,084号、2016年11月1日提交的美国临时申请第62/416,098号、2016年12月1日提交的美国临时申请第62/429,039号、2016年12月1日提交的美国临时申请第62/429,046号和2016年12月1日提交的美国临时申请第62/429,049号的优先权，并且每一个通过引用并入本文。
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技术领域
本公开涉及***工业。具体来说，本公开涉及新的人造***属植物。
背景技术
“***”一词是指一个开花植物属。***属植物包括多个种，包括***(Cannabissativa)、印度***(Cannabis indica)和莠草***(Cannabis ruderalis)。为了***纤维、种子和种子油、药用目的和娱乐活动而栽培***属植物的历史悠久。
根据一些报道，***由至少483种已知化学化合物组成，包括***素、萜类化合物、黄酮类化合物、含氮化合物、氨基酸、蛋白质、糖蛋白、酶、糖和相关化合物、碳氢化合物、醇类、醛类、酮类、酸类、脂肪酸类、酯类、内酯类、类固醇类、萜烯类、非***素酚类、维生素类和色素类。
***素在研究和商业化中具有特别的关注。通常，作为粗混合物的一部分(与***植物中发现的其他化学化合物一起)，从***植物中提取***素。大部分***植物物质的提取旨在提取***素，特别是四氢***酚(tetrahydrocannabinol，THC)。THC用于缓解疼痛、治疗青光眼和缓解恶心。THC也作为娱乐药物获得巨大的欢迎。其他感兴趣的***素包括***萜酚(Cannabigerol，CBG)，***萜酚酸(Cannabigerolic Acid，CBGA)、***二酚(Cannabidiol，CBD)、***酚(Cannabinol，CBN)、***环萜酚(Cannabichromene，CBC)、四氢次***酚(Tetrahydrocannabivarin，THCV)、次***萜酚(Cannabigerovarin，CBGV)和次***萜酚酸(Cannabigerovarinic Acid，CBGVA)。
已经开发了多种生长和栽培技术，用于增加***属植物中次级化合物的产生。这些技术包括户外栽培、室内栽培、水培、施肥、大气操纵(atmospheric manipulation)、克隆、杂交、Screen of Grow(SCROG)、Sea of Green(SOG)、摘心、整枝、打顶等。
虽然育种和耕作技术产生含有高浓度***素的植物，但这些技术不能提供所需的控制和生产水平。***素的研究仍然很新，让植物生产某些***素将有利于研究和开发。此外，分离数百种分子即使对于有经验的化学家来说也是具有挑战性和耗时的。
需要一种***属植物产生特定量的***素——在某些情况下较高，在其他情况下较低。具体来说，***属植物选择性地产生特定的***素而不是其他的。还需要***属植物产生非天然存在的比率和/或浓度的***素。还需要操纵***属植物中的生物合成途径。
发明详述
本文公开了新的***属植物。在一个实施方案中，***属植物产生非天然存在的比率和/或浓度的***素。在一个实施方案中，***属植物优选产生比第二***素更高量的第一***素。在一个实施方案中，***属植物优选产生比第二***素更低量的第一***素。在一个实施方案中，***属植物是人造的。
本文公开了一种生产***属植物的新方法。在一个实施方案中，本文公开的方法包括控制一种或多种***素的生物合成途径。在一个实施方案中，本文公开的方法包括操纵一种或多种***素合成酶的表达。
本文公开了一种新的***属植物，其包含：
总***素含量；
第一***素，其包含大于总***素含量干重的10％；
第二***素，其包含小于总***素含量干重的10％；
和***属植物基因组内修饰的遗传物质。
在一个实施方案中，第一***素选自***萜酚酸(Cannabigerolic Acid，CBGA)、***萜酚酸单甲醚(Cannabigerolic Acid monomethylether，CBGAM)、***萜酚(Cannabigerol，CBG)、***萜酚单甲醚(Cannabigerol monomethylether，CBGM)、次***萜酚酸(Cannabigerovarinic Acid，CBGVA)、次***萜酚(Cannabigerovarin，CBGV)、***环萜酚酸(Cannabichromenic Acid，CBCA)、***环萜酚(Cannabichromene，CBC)、次***环萜酚酸(Cannabichromevarinic Acid，CBCVA)、次***环萜酚(Cannabichromevarin，CBCV)、***二酚酸(Cannabidiolic Acid，CBDA)、***二酚(Cannabidiol，CBD)、***二酚单甲醚(Cannabidiol monomethylether，CBDM)、***二酚-C4(Cannabidiol-C4，CBD-C4)、次***二酚酸(Cannabidivarinic Acid，CBDVA)、次***二酚(Cannabidivarin，CBDV)，Cannabidiorcol(CBD-C1)、四氢***酚酸A(Tetrahydrocannabinolic acid A，THCA-A)、四氢***酚酸B(Tetrahydrocannabinolic acid B，THCA-B)、四氢***酚酸(Tetrahydrocannabinolic Acid，THCA)、四氢***酚(Tetrahydrocannabinol，THC)、四氢***酚酸C4(Tetrahydrocannabinolic acid C4，THCA-C4)、四氢***酚C4(Tetrahydrocannabinol C4，THC-C4)、四氢次***酚酸(Tetrahydrocannabivarinic acid，THCVA)、四氢次***酚(Tetrahydrocannabivarin，THCV)、Tetrahydrocannabiorcolicacid(THCA-C1)、Tetrahydrocannabiorcol(THC-C1)、Δ7-顺式-异-四氢次***酚(Δ7-cis-iso-tetrahydrocannabivarin)、Δ8-四氢***酚酸(Δ8-tetrahydrocannabinolic acid，Δ8-THCA)、Cannabivarinodiolic Acid(CBNDVA)、Cannabivarinodiol(CBNDV)、Δ8-四氢***酚(Δ8-Tetrahydrocannabinol，Δ8-THC)、Δ9-四氢***酚(Δ9-Tetrahydrocannabinol，Δ9-THC)、***环酚酸(Cannabicyclolic acid，CBLA)、***环酚(Cannabicyclol，CBL)、次***环酚(Cannabicyclovarin，CBLV)、Cannabielsoic acid A(CBEA-A)、Cannabielsoic acid B(CBEA-B)、Cannabielsoin(CBE)、Cannabivarinselsoin(CBEV)、Cannabivarinselsoinic Acid(CBEVA)、Cannabielsoic Acid(CBEA)、Cannabielvarinsoin(CBLV)、Cannabielvarinsoinic Acid(CBLVA)、***酚酸(Cannabinolic acid，CBNA)、***酚(Cannabinol，CBN)，次***酚酸(CannabivarinicAcid，CBNVA)、***酚甲醚(Cannabinol methylether，CBNM)、***酚-C4(Cannabinol-C4，CBN-C4)、次***酚(Cannabivarin，CBV)、***酚-C2(Cannabino-C2，CBN-C2)、Cannabiorcol(CBN-C1)、Cannabinodiol(CBND)、Cannabinodiolic Acid(CBNDA)、Cannabinodivarin(CBDV)、Cannabitriol(CBT)、10-乙氧基-9-羟基-Δ6a-四氢***酚(10-Ethoxy-9-hydroxy-Δ6a-tetrahydrocannabinol)、8,9-二羟基-Δ6a(10a)-四氢***酚(8,9-Dihydroxy-Δ6a(10a)-tetrahydrocannabinol，8,9-Di-OH-CBT-C5)、Cannabitriolvarin(CBTV)、Ethoxy-cannabitriolvarin(CBTVE)、脱氢***呋喃(Dehydrocannabifuran，DCBF)、***呋喃(Cannbifuran，CBF)、Cannabichromanon(CBCN)、***二吡喃环烷(Cannabicitran，CBT)、10-氧代-Δ6a(10a)-四氢***酚(10-Oxo-Δ6a(10a)-tetrahydrocannabinol，OTHC)、Δ9-顺式-四氢***酚(Δ9-cis-tetrahydrocannabinol，cis-THC)、Cannabiripsol(CBR)、3,4,5,6-tetrahydro-7-hydroxy-alpha-alpha-2-trimethyl-9-n-propyl-2,6-methano-2H-1-benzoxocin-5-methanol(OH-iso-HHCV)、三羟基-δ-9-四氢***酚(Trihydroxy-delta-9-tetrahydrocannabinol，triOH-THC)、麻醉椒素、表没食子儿茶素没食子酸酯、十二烷基-2E,4E,8Z,10Z-四烯酸异丁酰胺和十二烷基-2E,4E-二烯酸异丁酰胺。
在一个实施方案中，第二***素选自***萜酚酸(CBGA)、***萜酚酸单甲醚(CBGAM)、***萜酚(CBG)、***萜酚单甲醚(CBGM)、次***萜酚酸(CBGVA)、次***萜酚(CBGV)、***环萜酚酸(CBCA)、***环萜酚(CBC)、次***环萜酚酸(CBCVA)、次***环萜酚(CBCV)、***二酚酸(CBDA)、***二酚(CBD)、***二酚单甲醚(CBDM)、***二酚-C4(CBD-C4)、次***二酚酸(CBDVA)、次***二酚(CBDV)、Cannabidiorcol(CBD-C1)、四氢***酚酸A(THCA-A)、四氢***酚酸B(THCA-B)、四氢***酚酸(THCA)、四氢***酚(THC)、四氢***酚酸C4(THCA-C4)、四氢***酚C4(THC-C4)、四氢次***酚酸(THCVA)、四氢次***酚(THCV)、Tetrahydrocannabiorcolic acid(THCA-C1)、Tetrahydrocannabiorcol(THC-C1)，Δ7-顺式-异-四氢次***酚、Δ8-四氢***酚酸(Δ8-THCA)、Cannabivarinodiolic Acid(CBNDVA)、Cannabivarinodiol(CBNDV)、Δ8-四氢***酚(Δ8-THC)、Δ9-四氢***酚(Δ9-THC)、***环酚酸(CBLA)、***环酚(CBL)、次***环酚(CBLV)、Cannabielsoic acid A(CBEA-A)、Cannabielsoic acid B(CBEA-B)、Cannabielsoin(CBE)、Cannabivarinselsoin(CBEV)、Cannabivarinselsoinic Acid(CBEVA)、Cannabielsoic Acid(CBEA)、Cannabielvarinsoin(CBLV)、Cannabielvarinsoinic Acid(CBLVA)、***酚酸(CBNA)、***酚(CBN)、次***酚酸(CBNVA)、***酚甲醚(CBNM)、***酚-C4(CBN-C4)、次***酚(CBV)、***酚-C2(CBN-C2)、Cannabiorcol(CBN-C1)、脱氢***二酚(CBND)、脱氢***二酚酸(CBNDA)、Cannabinodivarin(CBDV)、***三酚(CBT)、10-乙氧基-9-羟基-Δ6a-四氢***酚、8,9-二羟基-Δ6a(10a)-四氢***酚(8,9-Di-OH-CBT-C5)、次***三酚(CBTV)、乙氧基***三酚(CBTVE)、脱氢***呋喃(DCBF)、***呋喃(CBF)、Cannabichromanon(CBCN)、***二吡喃环烷(CBT)、10-氧代-Δ6a(10a)-四氢***酚(OTHC)、Δ9-顺式-四氢***酚(cis-THC)、Cannabiripsol(CBR)、3,4,5,6-tetrahydro-7-hydroxy-alpha-alpha-2-trimethyl-9-n-propyl-2,6-methano-2H-1-benzoxocin-5-methanol(OH-iso-HHCV)、三羟基-δ-9-四氢***酚(triOH-THC)、麻醉椒素、表没食子儿茶素没食子酸酯、十二烷基-2E,4E,8Z,10Z-四烯酸异丁酰胺和十二烷基-2E,4E-二烯酸异丁酰胺。
在一个实施方案中，第一***素选自THC、D9-THC、D8-THC、THCA、THCV、D8-THCV、D9-THCV、THCVA、CBD、CBDA、CBDV、CBDVA、CBC、CBCA、CBCV、CBCVA、CBG、CBGA、CBGV、CBGVA、CBN、CBNA、CBNV、CBNVA、CBND、CBNDA、CBNDV、CBNDVA、CBE、CBEA、CBEV、CBEVA、CBL、CBLA、CBLV、或CBLVA。
在一个实施方案中，第二***素选自THC、D9-THC、D8-THC、THCA、THCV、D8-THCV、D9-THCV、THCVA、CBD、CBDA、CBDV、CBDVA、CBC、CBCA、CBCV、CBCVA、CBG、CBGA、CBGV、CBGVA、CBN、CBNA、CBNV、CBNVA、CBND、CBNDA、CBNDV、CBNDVA、CBE、CBEA、CBEV、CBEVA、CBL、CBLA、CBLV、或CBLVA。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBC。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBC。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBD。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBD。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBG。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBG。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBCA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBCA。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBDA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBDA。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生CBGA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBGA。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生THCA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的THCA。
在一个实施方案中，***属植物包含以相对于总***素含量非天然存在的比率产生THCV。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的THCV。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBCV。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBCV。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBDV。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBDV。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBGV。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBGV。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生THCVA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的THCVA。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBCVA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBCVA。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBDVA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBDVA。
在一个实施方案中，***属植物包含相对于总***素含量以非天然存在的比率产生CBGVA。在一个实施方案中，***属植物包含非天然存在的浓度的CBGVA。
本文中所使用的术语“***素”是指属于通常发现于***属植物中的一类次级化合物的化合物。在一个实施方案中，***素发现于植物，例如***属植物。在一个实施方案中，***素被称为植物***素。在一个实施方案中，***素发现于哺乳动物。在一个实施方案中，***素被称为内源性***素。在一个实施方案中，***素制备于实验室装置中。在一个实施方案中，***素被称为合成***素。在一个实施方案中，***素作用于细胞受体，例如G蛋白偶联受体(例如，5-羟色胺受体、***素受体、TRPV1、阿片受体等)，从而引起大脑或身体的反应。在一个实施方案中，***素作为激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂等影响其他化合物在一种或多种受体上的活性。
在许多情况下，***素由于其化学名称在名称中包含文本字符串“*cannabi*”可被识别。
在本公开的上下文中，当提及特定的***素时，其酸和/或脱羧形式中的每一种都被认为是单个分子以及酸和/或脱羧形式的混合物。
本文中所使用的术语“次级化合物”是指生物体存活所需的非关键化合物。在一个实施方案中，次级化合物并不直接参与生物体的生长。在一个实施方案中，次级化合物不直接参与生物体的发育。在一个实施方案中，次级化合物不直接参与生物体的繁殖。在一个实施方案中，次级化合物是***素。在一个实施方案中，次级化合物是萜烯。
本文中所使用的术语“总***素含量”指一个样品(如植物、植物部分、来自植物的粗提取物等)中可鉴定的***素的全部量。在一个实施方案中，总***素含量指***属植物中***素的总量。在一个实施方案中，总***素含量指***属植物毛状体内的***素的总量。在一个实施方案中，总***素含量以质量表示，例如克。在一个实施方案中，总***素含量以摩尔表示。在一个实施方案中，总***素含量以分子量表示。在一个实施方案中，总***素含量以干重表示。
在本申请的上下文中所使用的术语“人造”指由人类工程化或有目的地创造，与不受人类影响的天然存在于“自然界”中的相反。在一个实施方案中，人造植物指通过操纵植物的基因编码从而以非天然存在的方式表达一种或多种特征所生产的植物。
本文中所使用的术语“天然存在的”指自然界中物化的、出现的、发生的或合成的。在一个实施方案中，天然存在的指在植物中合成的次级化合物。在一个实施方案中，天然存在的指在***属植物中合成的一批***素。在一个实施方案中，天然存在的指植物中化合物的浓度。在一个实施方案中，天然存在的指***属植物中***素的浓度。在一个实施方案中，天然存在的指植物中次级化合物对所有次级化合物的比率。在一个实施方案中，天然存在的指***属植物中第一***素相对于总***素含量的比率。
本文中所使用的术语“天然存在的比率”指一种或多种化合物相对于天然存在的***属植物中另外一种或多种化合物的比例。在一个实施方案中，天然存在的比率是第一***素的量相对于***属植物中总***素含量。在一个实施方案中，天然存在的比率以摩尔比表示。在一个实施方案中，天然存在的比率以质量比表示。在一个实施方案中，质量比和/或摩尔比通过色谱法和/或光谱法测量，例如HPLC、GC和/或质谱法。在一个实施方案中，天然存在的比率以干重表示。
本文中所使用的术语“非天然存在的比率”指一种或多种化合物相对于组合物(例如由人创造的植物、植物衍生物质如粗提取物)中的另外一种或多种化合物的比例。在一个实施方案中，非天然存在的比率是第一***素的量相对于总***素含量，并且其在天然存在的***属植物中未观察到。在一个实施方案中，非天然存在的比率以摩尔比表示。在一个实施方案中，非天然存在的比率以干重比表示。在一个实施方案中，非天然存在的比率以质量比表示。在一个实施方案中，质量比和/或摩尔比通过色谱法和/或光谱法测量，例如HPLC、GC和/或质谱法。在一个实施方案中，非天然存在的比率是对***属植物遗传修饰的结果。在一个实施方案中，非天然存在的比率包含非天然存在的浓度的第一***素，并包含非天然存在的浓度的总***素含量。在一个实施方案中，非天然存在的比率包含天然存在的比率的第一***素和非天然存在的浓度的总***素含量。在一个实施方案中，非天然存在的比率包含非天然存在的比率的第一***素的和非天然存在的浓度的总***素含量。
本文中所使用的术语“天然存在的浓度”指一种或多种化合物相对于整个天然存在的参考样品的量(例如百分比质量、质量、摩尔等)。例如，本公开所述未修饰的***属植物中THC的百分比。在一个实施方案中，天然存在的浓度是***属植物样品中***素的质量百分比。在一个实施方案中，天然存在的浓度是干燥或加工的***属植物花中***素的质量。在一个实施方案中，天然存在的浓度是***属植物粗提取物中的第一***素的干重。
本文中所使用的术语“非天然存在的浓度”指一种或多种化合物相对于人造组合物中的整个样品的量(例如百分比质量、质量、摩尔等)。例如，本公开所述修饰的***属植物中THC的百分比。在一个实施方案中，非天然存在的浓度是第一***素的分子量相对于总***素含量。在一个实施方案中，通过摩尔数测量并以摩尔浓度表示非天然存在的浓度。在一个实施方案中，通过百分比质量测量非天然存在的浓度。在一个实施方案中，通过干重测量非天然存在的浓度。在一个实施方案中，非天然存在的浓度是对***属植物遗传修饰出现的结果。
在一个实施方案中，***属植物包含第一***素和第二***素，第一***素包含总***素含量干重的10-50％，第二***素包含总***素含量干重的0-10％。
在一个实施方案中，***属植物包含第一***素和第二***素，第一***素包含总***素含量干重的15-45％，第二***素包含总***素含量干重的0.5-7.5％。
在一个实施方案中，***属植物包含第一***素和第二***素，第一***素包含总***素含量干重的20-40％，第二***素包含总***素含量干重的1-5％。
在一个实施方案中，***属植物包含第一***素和第二***素，第一***素包含总***素含量干重的25-35％，第二***素包含总***素含量干重的1.5-2.5％。
在一个实施方案中，***属植物包含第三***素。在一个实施方案中，***属植物包含第四***素。在一个实施方案中，***属植物包含超过四种***素。
本文中所使用的术语“总质量”指给定参考样品的物质的全部量。在一个实施方案中，总质量通过分子质量测量。在一个实施方案中，总质量通过质量测量，例如克。在一个实施方案中，总质量是***属植物的干重。在一个实施方案中，总质量是来自***属植物的粗提取物的干重。在一个实施方案中，总质量是去除所有水分后来自***属植物的纯化提取物的干重。
本文公开了生产***属植物的新方法，包括比较两种植物的基因序列、将序列差异与感兴趣表型相关联、以及修饰植物的基因组以增强所需表型的表达。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括操纵***素的生物合成途径。
本文公开了包含修饰遗传物质的新的***属植物，其中修饰的遗传物质影响与产生次级化合物相关的酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码CBCA合酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码CBDA合酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码THCA合酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码戊基二羟基苯酸(olivetolic acid)环化酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码丁烯酮(tetraketide)合酶。在一个实施方案中，修饰的遗传物质编码芳香族异戊烯转移酶(aromatic prenyltransferase)。
本文公开了通过破坏促进***素合成的酶来调节***属植物中***素生物合成的新方法。在一个实施方案中，破坏包括突变基因。在一个实施方案中，破坏包括干扰基因的表达。在一个实施方案中，破坏包括切割基因组内的基因。
本文中所使用的术语“破坏”是指抑制参与***素生物合成的酶和/或化合物。在一个实施方案中，破坏包括抑制酶的表达。在一个实施方案中，破坏包括增加启动子的产生。
本文中所使用的术语“植物”是指植物界的多细胞真核生物，包括天然存在的、完全人造的、或其一些组合。在一个实施方案中，植物来自***属。在一个实施方案中，植物是植物的部分，例如叶、根、茎等。在一个实施方案中，植物是干燥的，例如在烘箱中脱水。
本文中所使用的术语“***属”指在生物分类学***内归类于***属的生物。在一个实施方案中，***属植物包括物种***(Cannabis sativa)。在一个实施方案中，***属植物包括物种印度***(Cannabis indica)。在一个实施方案中，***属植物包括物种莠草***(Cannabis ruderalis)。在一个实施方案中，***属植物包括多个品种。
在本公开的上下文中所使用的术语“花”是指***属植物(包括雄性、雌性和/或者雌雄同株植物)的繁殖结构。术语“花”还包括开花过程中所涉及或产生的任何部分和化合物。
在一个实施方案中，术语花包括在开花期结束时产生的芽。在一个实施方案中，术语花包括产生次级化合物(如***素、萜烯类等)的毛状体。在一个实施方案中，术语花包括用于娱乐的商售的和/或医学用途或加工的植物材料。
本文中所使用的术语“THC”指四氢***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生THC。
本文中所使用的术语“THCA”是指四氢***酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对THCA进行脱羧，形成THC、D8-THC、D9-THC和其他潜在的***素。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生THCA。
本文中所使用的术语“THCV”指四氢次***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，通过修饰***属植物从而以可控水平产生THCV。
本文中所使用的术语“THCVA”指四氢次***酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对THCVA进行脱羧，形成THCV、D8-THCV、D9-THCV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生THCVA。
本文中所使用的术语“D8-THC”指Δ8-四氢***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生D8-THC。
本文中所使用的术语“D8-THCV”指Δ8-四氢次***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生D8-THCV。
本文中所使用的术语“D9-THC”指Δ9-四氢***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生D9-THC。
本文中所使用的术语“D9-THCV”指Δ9-四氢次***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生D9-THCV。
本文中所使用的术语“CBD”指***二酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBD。
本文中所使用的术语“CBDA”指***二酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBDA进行脱羧，形成CBD和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBDA。
本文中所使用的术语“CBDV”指次***二酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBDV。
本文中所使用的术语“CBDVA”指次***二酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBDVA进行脱羧，形成CBDV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBDVA。
本文中所使用的术语“CBC”指***环萜酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBC。
本文中所使用的术语“CBCA”指***环萜酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBCA进行脱羧，形成CBC和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，通过修饰***属植物从而以可控水平产生CBCA。
本文中所使用的术语“CBCV”指次***环萜酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBCV。
本文中所使用的术语“CBCVA”指次***环萜酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBCVA进行脱羧，形成CBCV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBCVA。
本文中所使用的术语“CBG”指***萜酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBG。
本文中所使用的术语“CBGA”指***萜酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBGA进行脱羧，形成CBG和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBGA。
本文中所使用的术语“CBGV”指次***萜酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBGV。
本文中所使用的术语“CBGVA”指次***萜酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBGVA进行脱羧，形成CBGV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBGVA。
本文中所使用的术语“CBN”指***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBN。
本文中所使用的术语“CBNA”指***酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBNA进行脱羧，形成CBN和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNA。
本文中所使用的术语“CBNV”或“CBV”指次***酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNV。
本文中所使用的术语“CBNVA”指次***酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBNVA进行脱羧，形成CBNV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNVA。
本文中所使用的术语“CBND”指canabinodiol，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBND。
本文中所使用的术语“CBNDA”指Cannabinodiolic acid，其结构式如下：
用加热、光照等对CBNDA进行脱羧，形成CBND和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNDA。
本文中所使用的术语“CBNDV”指Cannabivarinodiol，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNDV。
本文中所使用的术语“CBNDVA”指Cannabivarinodiolic acid，其结构式如下：
用加热、光照等对CBNDVA进行脱羧，形成CBNDV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBNDVA。
本文中所使用的术语“CBL”指***环酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBL。
本文中所使用的术语“CBLA”指***环酚酸，其结构式如下：
用加热、光照等对CBLA进行脱羧，形成CBL和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBLA。
本文中所使用的术语“CBLV”指次***环酚，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBLV。
本文中所使用的术语“CBLVA”指Cannabielvarinsoinic acid，其结构式如下：
用加热、光照等对CBLVA进行脱羧，形成CBLV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBLVA。
本文中所使用的术语“CBE”指Cannabielsoin，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBE。
本文中所使用的术语“CBEA”指Cannabielsoic acid，其结构式如下：
用加热、光照等对CBEA进行脱羧，形成CBE和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBEA。
本文中所使用的术语“CBEV”指Cannabivarinselsoin，其结构式如下：
在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBEV。
本文中所使用的术语“CBEVA”指Cannabivarinselsoinic acid，其结构式如下：
用加热、光照等对CBEVA进行脱羧，形成CBEV和其他可能的***素衍生物。在本公开的上下文中，修饰***属植物从而以可控水平产生CBEVA。
本文中所使用的术语“干重”是指在除去样品中几乎所有水分之后样品的质量。任何适合除去水分的方法都是可以接受的。示例性的除去水分的方法包括：将植物置于脱水器中、将植物置于烘箱中、将植物置于装有干燥剂的容器中、和/或将植物置于灯下。
在一个实例中，将植物压碎并测定结构上不同的化合物的数量。在一个实施方案中，样品的丰度(例如化合物的质量百分比或数量)通过本领域中已知的技术测定。示例性的用于测定丰度(例如化合物质量百分比或化合物数量)的技术包括薄层色谱、高效液相色谱、气相色谱、气相色谱质谱、超临界流体色谱等。
在一个实施方案中，计算混合物中化合物(例如，在除去几乎所有水分后干燥花中的第一***素)的干重百分比通过以下公式进行：
(第一***素的总质量÷去除水分后的样品总质量)*100％
本文中所使用的术语“基因组”指生物体遗传物质的完整序列。生物体的基因组包含通过生物体内的自然过程和反应来构建生物体的所有必要信息。改变或修饰基因组的某些部分会影响生物体如何表达某些特性或特征。在一个实施方案中，改变生物体的基因组，以相对于总***素含量的非天然存在的比率产生第一***素。在一个实施方案中，改变生物体的基因组，以相对于第二***素含量的非天然存在的比率产生第一***素。在一个实施方案中，改变生物的基因组，以***属植物中非天然存在的浓度产生第一***素。
本文中所使用的术语“遗传物质”指在生物体中发现的指导和/或命令生物体内生物过程的信息。遗传物质包括RNA、DNA、由DNA和/或RNA组成的任何结构(例如基因、蛋白质等)、DNA和/或RNA的衍生物(例如mRNA、cDNA等)、或其任意组合。生物体的基因组含有通过生物体内的自然过程和反应来构建生物体的所有必要信息。
本文中所使用的术语“修饰的遗传物质”指从天然存在的遗传物质(例如DNA和/或RNA，编码或非编码)改变而来的遗传物质。在一个实施方案中，修饰的遗传物质是突变的DNA。在一个实施方案中，修饰的遗传物质是改变的对应于酶的遗传序列。
本文中所使用的术语“CBCA合酶”指作为催化剂将CBGVA转化为CBCVA、和/或将CBGA转化为CBCA的酶。
本文中所使用的术语“CBCA合酶表达基因”指编码酶CBCA合酶的基因。
本文中所使用的术语“CBDA合酶”指作为催化剂将CBGVA转化为CBDVA、和/或将CBGA转化为CBDA的酶。
本文中所使用的术语“CBDA合酶表达基因”指编码酶CBDA合酶的基因。
本文中所使用的术语“THCA合酶”指作为催化剂将CBGVA转化为THCVA、和/或将CBGA转化为THCA的酶。
本文中所使用的术语“THCA合酶表达基因”指编码酶THCA合酶的基因。
本文中所使用的术语“戊基二羟基苯酸环化酶”指作为催化剂形成戊基二羟基苯酸的酶。
本文中所使用的术语“丁烯酮合酶”指作为催化剂形成戊基二羟基苯酸的酶。
本文中所使用的术语“芳香族异戊烯转移酶”指作为催化剂将前体底物转化为CBGA和/或CBGVA的酶。在一个实施方案中，前体底物是戊基二羟基苯酸和香叶基二磷酸。在一个实施方案中，前体底物是divarinolic acid和香叶基二磷酸(germany diphosphate)。
本文中所使用的术语“戊基二羟基苯酸”指结构式如下的化合物：
戊基二羟基苯酸参与CBGA的生物合成，其中通过异戊烯转移酶酶类将戊基二羟基苯酸与香叶基二磷酸结合。在一个实施方案中，异戊烯转移酶是芳香族异戊烯转移酶。
本文中所使用的术语“divarinolic acid”指结构式如下的化合物：
Divarinolic acid参与CBGVA的生物合成，其中通过异戊烯转移酶酶类将divarinolic acid与香叶基二磷酸结合。在一个实施方案中，异戊烯转移酶是芳香族异戊烯转移酶。
在一个实施方案中，本文公开的植物包含修饰的遗传物质，其中修饰的遗传物质包括编码***素合成酶的核酸序列。
本文中所使用的术语“核酸序列”指通过共价键结合在一起的一系列核苷酸。核酸序列通常由一系列字母表示，每个字母代表一个核苷酸。在一个实施方案中，RNA核苷酸中U对应尿嘧啶，G对应鸟嘌呤，C对应胞嘧啶，A对应腺嘌呤。在一个实施方案中，DNA核苷酸中T对应胸腺嘧啶，G对应鸟嘌呤，C对应胞嘧啶，A对应腺嘌呤。
在一个实施方案中，核酸序列编码功能性蛋白质。在一个实施方案中，核酸序列不编码功能性蛋白质。在一个实施方案中，核酸序列指DNA内核苷酸的顺序。在一个实施方案中，核酸序列指RNA内核苷酸的顺序。在本领域内，当提及核酸序列时，术语“核苷酸序列”也可与之互换使用。
本文中所使用的术语“***素合成酶”指***属植物中作为催化剂产生一种或多种***素的蛋白质。
本公开上下文中的***素合成酶的实例包括但不限于：聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)、戊基二羟基苯酸环化酶(olivetolic acid cyclase，OAC)、丁烯酮合酶(tetraketide synthase，TKS)、III型PKS、查耳酮合酶(chalcone synthase，CHS)、异戊烯转移酶、THCA合酶、CBDA合酶、CBCA合酶、GPP合酶、FPP合酶、柠檬烯(Limonene)合酶、芳香族异戊烯转移酶、香叶基磷酸盐：戊基二羟基苯酸盐(olivetolate)香叶基转移酶。
本文公开了一种控制***属植物中***素合成的方法，包括：
操纵编码***素合成酶基因的表达。
本文中所使用的术语“控制”指指导、管理、引导、和/或操纵***属植物中产生的一种或多种***素的量。在一个实施方案中，控制包括修饰***属植物以产生非天然存在的浓度的第一***素。在一个实施方案中，控制包括修饰***属植物以产生非天然存在的比率的第一***素。在一个实施方案中，控制包括修饰***属植物以产生非天然存在的浓度的第二***素。在一个实施方案中，控制包括修饰***属植物以产生非天然存在的比率的第二***素。
本文中所使用的术语“基因的表达”指植物利用遗传物质的信息产生功能性基因产物的能力。在本公开的上下文中，表达意味着包括植物从植物的遗传物质产生蛋白质(例如酶)和各种其他分子的能力。在一个实施方案中，植物表达用于***素生物合成的***素合成酶。在一个实施方案中，植物从DNA模板产生RNA。
本文中所使用的术语“操纵基因的表达”指有意改变***属植物的基因组以控制某些特性的表达。
在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的CBDA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的THCA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的CBCA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的戊基二羟基苯酸环化酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的丁烯酮合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较少的芳香族异戊烯转移酶。
在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的CBDA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的THCA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的CBCA合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的戊基二羟基苯酸环化酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的丁烯酮合酶。在一个实施方案中，操纵植物的基因组以表达较多的芳香族异戊烯转移酶。
本文中所使用的术语“编码”指存储遗传信息和使用遗传信息以产生功能性基因产物。在一个实施方案中，基因编码蛋白质。在一个实施方案中，基因编码催化剂。在一个实施方案中，DNA链包括编码***属植物生长速率的遗传物质。在一个实施方案中，mRNA链编码蛋白质，例如***素合成酶。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括：
选择第一***属植物；
选择第二***属植物，其中第一***属植物比第二***属植物产生更多的第一***素；
从第一***属植物中收集遗传物质；
从第二***属植物中收集遗传物质；
将来自第一***属植物的遗传物质与来自第二***属植物的遗传物质进行比较；并
鉴定与来自第二***属植物的遗传物质中存在的基因序列同源的来自第一***属植物的遗传物质中存在的基因序列中的差异。
本文中所使用的术语“选择第一***属植物”指选择产生特定量(通过干重测量)的第一***素的***属植物。在一个实施方案中，本文公开的方法包括选择第二***属植物。在一个实施方案中，选择包括通过定量分析粗提取物、HPLC、光谱测定技术等来选择***属植物。
在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自不同的物种。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自相同的物种。第一***属植物与第二***属植物来自不同的品种。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自相同的品种。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自相同的祖先。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自相同的亲本。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自相同的属。在一个实施方案中，第一***属植物与第二***属植物来自不同的属。
本文中所使用的术语“收集遗传物质”指收集生物体中发现的指导和/或命令生物体内生物过程的信息。在一个实施方案中，收集遗传物质包括从***属植物中提取粗提取物。提取的实例包括但不限于有机提取法、基于过滤器的旋转篮形式、磁珠法、液液提取法、直接裂解法。在一个实施方案中，收集遗传物质包括提取RNA。在一个实施方案中，收集遗传物质包括提取DNA。
在一个实施方案中，收集遗传物质包括从***属植物制备植物材料的水溶液，将水溶液与水饱和酚和氯仿混合，并将样品通过离心形成上部水相和下部有机相。在一个实施方案中，加入变性剂(如硫氰酸胍)使蛋白质变性，导致核酸分配在水相中，蛋白质分配在有机相中。在一个实施方案中，pH值决定纯化哪些核酸，所需的核酸用醇沉淀。
在一个实施方案中，本公开的方法包括对遗传信息测序。
本文中所使用的术语“对遗传信息测序”指测定生物样品中核苷酸和/或核酸的存在、数量、和/或顺序。在一个实施方案中，对遗传物质测序有助于观察基因可变剪接转录产物、转录后修饰、基因融合、突变/SNP、基因表达的变化的能力。在一个实施方案中，对遗传信息测序测定RNA序列。除mRNA转录产物外，对RNA测序可提供有关RNA群的信息，包括总RNA、小RNA(如miRNA)、tRNA、rRNA和核糖体谱。在一个实施方案中，对遗传信息测序测定DNA序列。
本文中所使用的术语“鉴定差异”指发现遗传物质中的变异。例如，鉴定第一***属植物和第二***属植物之间的差异。在一个实施方案中，鉴定差异包括寻找第一***属植物和第二***属植物之间编码酶的遗传序列。在一个实施方案中，鉴定差异包括寻找第一***属植物和第二***属植物之间关于毛状体发育的遗传物质。
本文中所使用的术语“同源的”指编码来自共同祖先的特性的遗传物质的不同版本。在一个实施方案中，第一***属植物和第二***属植物有共同的祖先但具有不同的基因。在一个实施方案中，第一***属植物和第二***属植物有共同的祖先基因序列但有可鉴定的序列水平差异。
本文中所使用的术语“同功的(analogous)”指编码相同功能但具有非重叠祖先的遗传物质的不同版本。在一个实施方案中，细菌在两个独立的时间通过两种遗传上独立的机制发展出对抗生素的抗性。在遗传学领域，深祖先同源性和水平基因转移模糊了何时使用一个术语而不是另一个术语的绝对正确性。因此，在本公开的上下文中，两个术语都是可接受的。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较第一***属植物的组装转录组与第二***属植物的组装转录组。
本文中所使用的术语“转录组”指在一个细胞或一群细胞内表达的信使RNA序列。在一个实施方案中，与产生次级化合物相关的基因与***属植物的组装转录组相同。
本文中所使用的术语“组装转录组”指收集一个细胞或一群细胞内蛋白质合成过程中使用的RNA序列的数据。在一个实施方案中，如果组装是理论上完美的，它将由给定组织样品中存在的所有RNA组成。在本公开的上下文中，转录组可以由一个或多个序列组成。在本公开的上下文中，收获的***属植物的组装转录组包含数千至数百万个RNA块(chunk)区段或片的部分、。此外，这些小片段可以生成更大的基因序列支架和重叠群。
本文中所使用的术语“比较基因丰度”指第一植物的RNA序列相对于第二植物的RNA序列的分析。在一个实施方案中，比较基因丰度包括比较倍数变化。在一个实施方案中，倍数变化用于测量基因表达水平的变化。在一个实施方案中，倍数变化通过RPKM测量。
本文中所使用的术语“RPKM”指“每千碱基每百万映射的读段的读段(reads)”。术语RPKM指通过对总读段长度与测序读段的数量进行标准化，从RNA测序数据中量化基因表达的方法。在一个实施方案中，RPKM计算为比较测序覆盖值提供了标准化方法。RPKM值校正样品测序深度和基因长度的差异。
在一个示例中，RPKM可以通过以下公式计算：
读段数/(基因长度/1000*总读段数/1,000,000)；
其中，“读段数”指映射到基因序列的读段数量；
其中，“基因长度”指基因序列的长度；并且
其中，“总读段数”指样本映射的读段的总数量。
例如，用于纯粹假设和说明目的的CBG样本相较于CBGV样本的倍数变化数据可以说明以下关系：
基因A：2x
基因B：1x
基因C：1000x
基因D：1.3x
基因E：100x
在上述说明性实例中，由于读段的相对丰度，基因C最有可能解释表型差异，而基因E次之。
进行上述比较所需的计算可以通过本领域可用的软件进行，例如Trinity工作流程或其他各种类似的软件包。
RPKM是一种方法，其他方法包括但不限于“每千碱基每百万映射的读段的片段(FPKM)”和“每千碱基百万的转录产物(TPM)”。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括将来自第一***属植物的组装转录组的第一基因序列与来自第二***属植物的组装转录组的第二基因序列进行比较。
本文中所使用的术语“比较”指分析第一基因序列和第二基因序列以测定两组基因序列的差异和相似性。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更多的基因。
本文中所使用的术语“表达更多”意味着基因存在于两种植物的基因组中，并且该基因在一种植物中受到调节，与该基因在另一植物相比从所讨论的基因产生更多单位的功能性蛋白质或基因产物(也称为上调)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更少的基因。
本文中所使用的术语“表达更少”意味着基因存在于两种植物的基因组中，并且该基因在一种植物中受到调节，与该基因在另一植物相比从所讨论的基因产生更少单位的功能性蛋白质或基因产物(也称为下调)。
本文中所使用的术语“调节”意指修饰或影响蛋白质或RNA表达的遗传机制，其进一步命令基因的表达。在一个实施方案中，通过引入启动子和/或其他调节元件(例如提高蛋白质转录的增强子和阻遏蛋白)来调节基因表达。在一个实施方案中，通过提高mRNA的翻译来调节基因表达。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较基因序列在A)第一***属植物组装转录组和B)第二***属植物组装转录组中各自发现的基因序列的表达数。
本文中所使用的术语“表达数”指基因转录产生mRNA并最终产生功能性蛋白质的次数。在一个实施方案中，表达数可以确定***素合成基因表达的次数。
本文中所使用的术语“***素合成基因”指编码参与产生次级化合物(例如在***属植物中发现的一种或多种***素)的蛋白质和/或酶的遗传物质。
在一个实施方案中，***素合成基因编码CBCA合酶。在一个实施方案中，***素合成基因编码CBDA合酶。在一个实施方案中，***素合成基因编码THCA合酶。在一个实施方案中，***素合成基因编码丁烯酮合酶。在一个实施方案中，***素合成基因编码芳香族异戊烯转移酶。在一个实施方案中，***素合成基因编码戊基二羟基苯酸环化酶。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定CBCA合酶表达基因的表达数。在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定CBDA合酶表达基因的表达数。在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定THCA合酶表达基因的表达数。在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定芳香族异戊烯转移酶表达基因的表达数。在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定丁烯酮合酶表达基因的表达数。在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定戊基二羟基苯酸环化酶表达基因的表达数。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较第一植物的组装转录组的基因拷贝的丰度和第二植物的组装转录组的基因拷贝的丰度。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更多的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更少的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更少的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更少的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更多的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更多的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更多的基因；并低表达至少一个在第一***属植物中比在第二***属植物中表达更少的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较第一***属植物的基因组与第二***属植物的基因组。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较在A)第一***属植物基因组和B)第二***属植物基因组中各自发现的基因序列的基拷贝数。
本文中所使用的术语“拷贝数”指特定基因序列在基因组中重复的次数。在一个实施方案中，比较DNA序列可以确定哪种植物具有较少的编码CBCA合酶的序列拷贝数。在一个实施方案中，比较DNA序列可以确定哪种植物具有较少的编码CBDA合酶的序列拷贝数。在一个实施方案中，比较DNA序列可以确定哪种植物具有较少的编码THCA合酶的序列拷贝数。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括比较第一***属植物的组装基因组的基因序列的丰度和第二***属植物的组装基因组的基因序列的丰度。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物的基因组中比在第二***属植物的基因组中存在更多拷贝的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括鉴定至少一个在第一***属植物的基因组中比在第二***属植物的基因组中存在更少拷贝的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，该基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，该基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，该基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源；并过表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，该基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源。
本文中所使用的术语“过表达”指增加一种***属植物中基因的活性，导致产生更多功能性单位的蛋白质和/或基因产物。在一个实施方案中，过表达包括引入启动子、***基因、和/或抑制阻遏蛋白。
本文中所使用的术语“低表达”指降低一种植物中基因的活性，导致产生更少功能性单位的蛋白质和/或基因产物。在一个实施方案中，低表达包括引入阻遏蛋白、缺失基因、和/或促进负责阻遏的基因。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括与来自第二***属植物的遗传物质中存在的基因序列同源的来自第一***属植物的遗传物质中存在的基因序列中的差异，其中所述差异是编码***素合成酶的基因序列。
在一个实施方案中，***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、芳香族异戊烯转移酶、戊基二羟基苯酸环化酶、或丁烯酮合酶中的一种。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码***素合成酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码芳香族异戊烯转移酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码CBCA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码CBDA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码THCA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码戊基二羟基苯酸环化酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括过表达编码丁烯酮合酶的基因序列。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码***素合成酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码芳香族异戊烯转移酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码CBCA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码CBDA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码THCA合酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码戊基二羟基苯酸环化酶的基因序列。在一个实施方案中，本文公开的方法包括低表达编码丁烯酮合酶的基因序列。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：
构建靶向编码***素合成酶的核酸序列的核酸内切酶；
将所述核酸内切酶引入***属植物的基因组中；并
操纵所述***素合成酶在基因组内的表达。
本文中所使用的术语“核酸内切酶”指能够切割多聚核苷酸链内磷酸二酯键的分子。在一个实施方案中，核酸内切酶切割DNA链中的磷酸二酯键。在一个实施方案中，核酸内切酶切割RNA链中的磷酸二酯键。在一个实施方案中，核酸内切酶是CRISPR/Cas9复合物。在一个实施方案中，核酸内切酶是锌指核酸酶。
本文中所使用的术语“构建核酸内切酶”指产生能切割多聚核苷酸链内磷酸二酯键以进行遗传修饰的分子。在一个实施方案中，构建核酸内切酶旨在将基因从基因组中切割出。在一个实施方案中，切割导致DNA序列突变，使其不能发挥编码功能，例如产生蛋白质。在一个实施方案中，构建核酸内切酶包括用于辅助切割的额外结构。在一个实例中，掺入了向导RNA。
本文中所使用的术语“切割”是指破坏两个原子之间的一个或多个化学键，导致两个原子分离。在本公开的上下文中，切割包括本领域已知的技术和生物体中的天然过程。在一个实例中，切割键包括分解代谢，通过氧化作用将较大的分子分解成较小的亚基。在一个实例中，切割键包括水解作用。
本文中所使用的术语“靶向核苷酸序列”指设计一种核酸内切酶以识别特定的核苷酸序列。识别特定的核苷酸序列使得基因编辑精确、有效、灵活，例如通过向导/指向小的DNA序列、靶向特定基因等。在一个实施方案中，核酸序列是DNA序列。在一个实施方案中，核酸序列是RNA序列。
在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码***素合成酶的DNA序列。
在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码CBCA合酶的DNA序列。在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码CBDA合酶的DNA序列。在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码THCA合酶的DNA序列。在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码丁烯酮合酶的DNA序列。在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码芳香族异戊烯转移酶的DNA序列。在一个实施方案中，靶向核酸序列包括指导核酸内切酶识别编码戊基二羟基苯酸环化酶的DNA序列。
本文中所使用的术语“引入核酸内切酶”指将核酸内切酶加入到***属植物中。在一个实施方案中，引入核酸内切酶包括使用通过转基因的体内技术。在一个实施方案中，核酸内切酶在体外构建并引入***属植物的基因组中。
本文中所使用的术语“体内”指活生物体内的一种或多种生物学过程。在一个实施方案中，术语“体内”指转基因。
本文中所使用的术语“转基因”是将制备的基因引入活生物体。转基因技术的实例包括但不限于生物弹道(biolistics)、土壤杆菌介导的转化和原生质体转染。
本文中所使用的术语“体外”指活生物体外的一种或多种生物学过程。在一个实施方案中，核酸内切酶在人工培养基中构建。在一个实施方案中，人工培养基是试管。在一个实施方案中，人工培养基是一个培养皿。在一个实施方案中，人造培养基是烧瓶。在一个实施方案中，体外制备包含编码核酸内切酶的基因序列的细菌。
在一个实施方案中，核酸内切酶在体外制备。在一个实施方案中，通过用包含编码核酸内切酶的基因序列的细菌接种植物来实现引入核酸内切酶。一旦接种，细菌就会使得植物细胞之后产生核酸内切酶。在一个实施方案中，接种包括将植物置于真空室中(真空室中含有包含核酸内切酶的细菌溶液)，并除去空气，将包含核酸内切酶的细菌溶液流入植物中。在一个实施方案中，接种包括用核酸内切酶喷洒植物。在一个实施方案中，“喷洒”包括生物弹道微粒轰击。
在一个实施方案中，核酸内切酶是CRISPR/Cas9***。
本文中所使用的术语“CRISPR”是首字母缩略词，指DNA序列的成簇的规律间隔的短回文重复序列。CRISPR是一系列重复的DNA序列，在重复序列之间具有独特的DNA序列。从独特的DNA链转录而来的RNA可作为指导切割的向导。CRISPR被用作为基因编辑的工具。在一个实施方案中，CRISPR与Cas9蛋白联合使用。
本文中所使用的术语“Cas”指CRISPR相关蛋白，作为酶在特定的序列切割基因组。Cas9指本领域已知的一组特定的蛋白质。由CRISPR制备的RNA序列指导Cas9酶切割基因组中发现的某些序列。其他类别的Cas也是可以接受的。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9在已知的Cas9蛋白结构域切割一条或两条染色体链。在一个实施方案中，两条染色体链中的一条被突变。在一个实施方案中，两条染色体链中的两条均被突变。
本文中所使用的术语“染色体链”是指染色体内的DNA序列。当CRISPR/Cas9***切割染色体链时，链被切割使得有可能突变一条或两条链，可是模板链，也可是编码链。
本文中所使用的术语“DNA模板链”指用于合成mRNA的DNA序列。在一个实施方案中，DNA模板链编码***素合成酶的基因。在一个实施方案中，***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、丁烯酮合酶、芳香族异戊烯转移酶或芳香族异戊烯转移酶。
本文中所使用的术语“DNA编码链”指对应于密码子的DNA序列，其最终翻译成蛋白质。在一个实施方案中，DNA编码链编码***素合成酶的基因。在一个实施方案中，***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、丁烯酮合酶、芳香族异戊烯转移酶或芳香族异戊烯转移酶。
在一个实施方案中，染色体DNA的任一链都可是“编码链”或“模板链”。在一个实施方案中，DNA链的固有结构与决定哪条链是编码链和哪条链是模板链相关。
本文中所使用的术语“突变的”指改变遗传序列中的一个或多个核苷酸，引起天然存在的遗传序列的改变。遗传序列的变化反过来影响由遗传序列生成的蛋白质或酶的预期功能。DNA切割或突变的替代方法包括TALENS、锌指核酸酶等。
在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割两条链，诱导非同源末端连接(NHEJ)，然后是***/缺失(INDEL)，导致蛋白质突变并变成非功能性。在一个实施方案中，非功能性是由引起提前终止密码子的无义突变引起的。
在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割两条链，导致发生同源定向修复(HDR)。在一个实施方案中，供体DNA链***到切割的链之间的间隔以防止随机突变。在一个实施方案中，供体DNA链是编码芳香族异戊烯转移酶的DNA序列。在一个实施方案中，供体链是非编码DNA序列。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括将供体DNA链******属植物的基因组中。
在一个实施方案中，供体DNA链是编码芳香族异戊烯转移酶的基因序列。
本文中所使用的术语“供体DNA链”指***基因组的遗传物质、DNA链、基因等。供体DNA链可以是编码或非编码的。在一个实施方案中，将供体DNA链***DNA切割位点以防止DNA修复中发生突变。在一个实施方案中，将供体DNA链***DNA切割位点以诱导突变。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括RNA向导。
本文中所使用的术语“RNA向导”指识别遗传物质的特定序列并指导核酸内切酶去哪里切割的RNA链。
在一个实施方案中，RNA向导指导核酸内切酶切割编码***素合成酶的染色体链。
在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***切割编码***素合成酶的染色体链。
在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***靶向CBDA合酶表达基因。在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***靶向CBCA合酶表达基因。在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***靶向THCA合酶表达基因。在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***靶向戊基二羟基苯酸环化酶的表达基因。在一个实施方案中，RNA向导指导CRISPR/Cas9***靶向丁烯酮合酶的表达基因。
在本公开的上下文中，核酸内切酶的其他实例包括来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogeness)和其它的SpCas9。此外，SpCas9具有不同于NGG的前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)序列，这可能提供其他优势。在一个示例中，SpCas9具有较小的编码序列。
与CRISPR或RNA向导一起发挥作用的其他蛋白质实例包括Cpf1(可用于切割DNA链产生粘性末端(overhanging end)而非平齐末端)、或C2c2(与RNA向导一起切割RNA)。
本文中所使用的术语“PAM”指紧接在核酸内切酶所靶向的DNA序列后的短DNA碱基对序列。在一个实施方案中，核酸内切酶是CRISPR/Cas9***。
本文中所使用的术语“NGG”指具有一个可变核碱基后接两个G的3核碱基序列。“N”表示任何核碱基，“G”表示鸟嘌呤核碱基。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括核酸内切酶和RNA向导。在一个实施方案中，本文公开的方法包括体外转录的向导RNA。在一个实施方案中，本文公开的方法包括体内转录的向导RNA。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括将Cas9酶和向导RNA表达盒引入基因组。
在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割功能性THCA合酶表达基因的序列。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割功能性CBDA合酶表达基因的序列。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割功能性CBCA合酶表达基因的序列。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割功能性丁烯酮合酶表达基因的序列。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9***切割功能性戊基二羟基苯酸环化酶表达基因的序列。
在本公开的上下文中，切割功能性基因的序列引起突变、序列改变、重排等，破坏或改变从该基因表达的酶或蛋白质的功能性。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括通过干扰***素合成基因的表达来操纵基因组内酶的表达。
本文中所使用的术语“干扰表达”指阻碍基因组表达功能性基因产物的能力。在一个实施方案中，通过敲低(knockdown)实现干扰表达。在一个实施方案中，通过敲除实现干扰表达。
本文所使用的术语“敲除”指功能性地阻止基因编码酶、蛋白质、分子和/或化合物的过程。在一个实施方案中，敲除包含基因以不编码酶。在一个实施方案中，编码***素合成酶的基因被功能性地切割，例如突变、序列改变等。在一个实施方案中，编码***素合成酶的基因被从DNA链中除去。
本文所使用的术语“敲低”指干扰将遗传信息变成酶、蛋白质、分子或化合物的转录、转录后、翻译前、翻译等的过程。在一个实施方案中，敲低包括干扰参与***素生物合成的遗传信息，例如编码***素合成酶的基因。在一个实施方案中，本文公开的方法包括通过RNAi干扰表达。
本文所使用的术语“RNAi”是指RNA干扰。RNAi是一种通过干扰信使RNA(即mRNA)进行基因沉默的方法。在一个实施方案中，miRNA(微小RNA)和siRNA(小干扰RNA)分子与mRNA的特定序列结合，从而降解mRNA，并阻止某些蛋白质或酶的翻译。RNA诱导的沉默复合体(RISC)包含切割靶mRNA的argonaute蛋白质(一种核酸内切酶)。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括干扰***素合成酶的表达。在一个实施方案中，***素合成酶是CBCA合酶。在一个实施方案中，***素合成酶是CBDA合酶。在一个实施方案中，***素合成酶是THCA合酶。在一个实施方案中，***素合成酶是丁烯酮合酶。在一个实施方案中，***素合成酶是戊基二羟基苯酸环化酶。在一个实施方案中，本文公开的方法包括引入额外的***素合成酶的拷贝。
本文所使用的术语“引入额外的拷贝”指在***属植物中加入更多编码特定酶拷贝的基因。在一个实施方案中，引入额外的拷贝包括用CRISPR/Cas9复合体接种***属植物。
在一个实施方案中，将***素合成基因额外的拷贝引入***属植物中。在一个实施方案中，将***素合成基因额外的拷贝引入植物基因组中。在一个实施方案中，***素合成基因编码芳香族异戊烯转移酶。在一个实施方案中，本文公开的方法包括增加前体底物的可用性。
本文所使用的术语“前体底物”指用于后续反应和过程中以产生其他化合物的化合物。在一个实施方案中，CBGVA是前体底物。在一个实施方案中，CBGVA被转化形成CBGV。在其他实施方案中，CBGVA被转化为THCVA、CBDVA和/或CBCVA。在其他实施方案中，THCVA、CBDVA和CBCVA被用作后续反应和过程中的前体底物。
在本公开的上下文中，前体底物可以指参与***素生物合成的任何/所有酶和/或蛋白质。在一个实施方案中，芳香族异戊烯转移酶是前体底物。
本文所使用的术语“增加前体底物的可用性”指允许更多前体底物在后续的反应中发生反应以形成其他分子和/或化合物。在一个实施方案中，前体底物是CBGVA。在一个实施方案中，本文公开的方法包括使CBGVA脱羧。在一个实施方案中，本文公开的方法包括使CBGVA脱羧以形成CBGV。在一个实施方案中，前体底物是CBGA。在一个实施方案中，本文公开的方法包括使CBGA脱羧。在一个实施方案中，本文公开的方法包括使CBGA脱羧以形成CBG。
在一个实施方案中，脱羧包括加热。在一个实施方案中，脱羧包括光照。
本文公开了通过本文公开的方法产生的植物。在一个实施方案中，本文公开的植物产生非天然比率的***素。在一个实施方案中，本文公开的植物产生非天然浓度的***素。
在一个实施方案中，一种植物通过控制***属植物中第一***素合成的方法产生，包括：
操纵编码***素合成酶基因的表达。
在一个实施方案中，一种植物，通过以下方法产生：
选择第一***属植物；
选择第二***属植物，其中第一***属植物比第二***属植物产生更多的第一***素；
从第一***属植物中收集遗传物质；
从第二***属植物中收集遗传物质；
将来自第一***属植物的遗传物质与来自第二***属植物的遗传物质进行比较；并
鉴定与来自第二***属植物的遗传物质中存在的基因序列同源的来自第一***属植物的遗传物质中存在的基因序列中的差异。
在一个实施方案中，一种植物，通过以下方法产生：
构建靶向编码***素合成酶的核酸序列的核酸内切酶；
将核酸内切酶引入***属植物的基因组中；并
操纵基因组内***素合成酶的表达。
在一个实施方案中，一种植物，通过以下方法产生：
操纵编码***素合成酶基因的表达；包括：
选择第一***属植物；
选择第二***属植物，其中第一***属植物比第二***属植物产生更多的第一***素；
从第一***属植物中收集遗传物质；
从第二***属植物中收集遗传物质；
将来自第一***属植物的遗传物质与来自第二***属植物的遗传物质进行比较；并
鉴定与来自第二***属植物的遗传物质中存在的基因序列同源的来自第一***属植物的遗传物质中存在的基因序列中的差异；并进一步包括：
构建靶向编码***素合成酶的核酸序列的核酸内切酶；
将核酸内切酶引入***属植物的基因组中；并
操纵基因组内***素合成酶的表达。
实施例
实施例1
***物种植物中可控的***素合成的一般考虑是通过多分支途径实现的。酶促过程负责每个单独的分支。如果植物仅产生这些酶或基因产物的一个子集，为了单一优选合成产物，可指定目前的多分支途径。
实施例2
本文公开了在一种在***属植物中增强作为单一感兴趣的***素的CBGA的产生的说明性实例。***物种植物中CBGA的合成在THCA、CBDA和/或CBCA合成过程的中间步骤发生。CBGA具体用作被特定***素合成酶(例如THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶)利用的底物。这些酶有效地将CBGA转化为终产物。因此，当存在这些酶时，CBGA不会大量存在。
为了提高CBGA的产生，使用基因组编辑技术来减少/消除植物中产生的功能性***素合成酶的量。使用THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶的mRNA序列进行比对以找到CRISPR靶序列。这些基因有大量的序列同源性，这意味着一个优化的比对可以同时切割产生这些酶的基因。
当鉴定出序列同源性位点时，在计算机上设计RNA表达盒并开发成合成的dsDNA构建体。RNA表达构建体由一个组成型Pol III启动子(拟南芥(Arabidopsis thaliana)U6))组成，所述启动子驱动含有感兴趣的靶的sgRNA分子的表达。
将合成的dsDNA构建体连接到含有第二表达盒的土壤杆菌植物转染载体质粒中。第二表达盒赋予真核密码子优化版本的SpCas9蛋白的表达。SpCas9的表达通过组成型活性(active)CaMV35s启动子实现。
将含有两个表达盒的连接的质粒转化到大肠杆菌中并铺板。
分离单菌落并生长用于随后通过质粒DNA的微量制备提取。从这一过程分离的质粒通过测序、PCR和凝胶电泳检测。分离并检查单个质粒样品。将质粒转化到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中。分离单菌落。土壤杆菌(Agrobacterium)菌株含有解除武装(disarmed)的Ti质粒，其在土壤杆菌介导的植物转染过程中赋予其毒力功能。用两种抗生素对两种质粒进行选择，一种抗生素对应一种质粒。通过这种方式双重选择的菌落在加双重抗生素的LB培养基生长至植物接种所需的量。
实施例3
本文公开了用实施例2中获得的用双重抗生素处理制备的细菌或载体小规模接种的说明性实例。
通过从平板刮取收集土壤杆菌细胞并悬浮于接种培养基中。将细胞重悬浮至OD600为0.02-0.5的目标密度。接种液由1/4MS植物培养基、1/2AB盐(17.2mM K2HPO4、8.3mMNaH2PO4、18.7mM NH4Cl、2mM KCl)、0.3％蔗糖和50mM MES、200μM乙酰丁香酮组成，pH约5.5。在植物接种之前，将细胞在该接种混合物中在室温培养2-6小时。
将***(Cannabis sativa)的插条或新生根克隆倒置浸没在土壤杆菌接种混合物中并置于真空室中。给浸没的植物施加-5Hg的轻真空30秒并缓慢释放真空。经处理的植物或通过生根激素生根、或简单地生长(如果已经生根)。数周之后对成年植物进行化学成分评价。
由这些过程产生的植物既可作为生产植物，也可作为后续生长周期的营养繁殖材料。
实施例4
本文公开了用实施例2中获得的用双重抗生素处理制备的细菌或载体大规模接种的说明性实例。
在平板上生长足够量的转化的土壤杆菌细胞，通过刮取收获，以产生OD600为0.02-0.1的接种液30L。接种液由去离子水组成，pH调节为5.5。具有60-70个植物(每个植物均用磁性金属架支撑)的苗圃平台置于含有接种液的钢制真空室中。每株植物的上2/3浸没在接种液中。给室施加真空(-5的Hg，30秒)。将植物从真空室中取出并在温室中生长1-2周，然后在商业田室外种植。对这些植物进行化学分析以评价处理的效果。
由这些过程产生的植物既可作为生产植物，也可作为后续生长周期的营养繁殖材料。
实施例5
本文公开了提高方案模块化的一个说明性实例。前面的实施例提供了如何在***植物中提高CBGA产生的方法。使用不同CRISPR切割位点、可选基因敲除、或敲低程序的同样的方法，可以导致提高任意感兴趣的***素。例如：仅减少CBDA合酶会导致产生更多的THCA和CBCA，同样，仅减少THCA合酶会产生更多的CBDA和CBCA，而同时减少THCA合酶和CBD合酶会提高产生的CBCA和CBGA水平。最后，通过靶向合成途径中的其他步骤，例如负责异戊烯化、环化或聚酮合成步骤的基因；均可指定提高其他多种***素的产生，如THCVA、CBDVA、CBCVA、CBGVA等。
上述提高CBGA的说明性实例用于说明此通用方法，该方法可应用于提高本文公开的***属植物中的其他***素的产生。
实施例6
本文公开了生长CBD产生提高的***属植物的说明性实例。
使用上文实施例4中描述的方法产生了靶向提高CBD产生的一批植物(60,000株)。提高的(即修饰的)***属植物生长在Colorado地区东部的200英亩的***农场中，在此它们被均匀分成一组天然的非提高植物(对照)，其中所有植物都暴露于相同的生长条件。
为了评估提高的植物和对照植物之间的差异，随机从16株提高的植物中获取植物顶部枝条的插条，这些植物均匀分布在整个***农场中。通过用异丙醇提取植物插条，过滤掉不溶性植物材料，并通过分析型SFC分析提取物，来测量这16株提高的植物的CBD水平。
结果显示，提高的植物中的CBD产生相对于非提高对照植物中的CBD产生大约翻倍，而提高的植物的总优势(potency)保持不变。
实施例7
本文公开了生长CBG产生提高的***属植物的说明性实例。
使用上文实施例4中描述的方法产生了靶向提高CBG产生的一批植物(30,000-40,000株)。提高的(即修饰的)***属植物生长在Colorado地区东部的30英亩的***农场中，在此它们被均匀分成一组天然的非提高植物(对照)，其中所有植物都暴露于相同的生长条件。
为了评估提高的植物和对照植物之间的差异，随机从16株提高的植物中获取植物顶部枝条的插条，这些植物均匀分布在整个***农场中。通过用异丙醇提取植物插条，过滤掉不溶性植物材料，并通过分析型SFC分析提取物，来测量这16株提高的植物的CBG水平。
结果显示，提高的植物中的CBG产生相对于非提高对照植物中的CBG产生大约翻倍，而提高的植物的总优势保持不变。
实施例8
本文公开了通过同源性CRISPR双切THCA合酶和CBDA合酶用于***载体的一个说明性实例，所述载体称为“Ebbu”载体。
以下是设计用于切割THCA和CBDA合酶编码序列的sgRNA分子的说明性实例。基于基因之间的高水平同源性使用单切割。基于THCA和CBDA合酶的当前的比对工作，位置在PAM序列末端、反向互补方向距起始密码子452bp处。
来自反向互补比对的原始抓取(CCN)位点
GCCGGAGCTA CCCTTGGAGA AGTTTATTAT TGGG(SEQ ID NO:1)
以上的注释：
PAMrc:CCG；GAGCTACCCTTGGAGAAGTT TATTATTGGG(SEQ ID NO:2)
SumRevC:CCGG AG CTACCCTTG G AG AAGTT(SEQ ID NO:3)
SumlnCutOrient:AACTTCTCCAAGGGTAGCTCCGG(SEQ ID NO:4)
校正方向的注释：gRNA PAM
AACTTCTC C AAG G G TAG CTC CGG(SEQ ID NO:4)
将以下序列添加到CRISPR表达盒中：
AACTTCTC C AAG G G TAG CTC(SEQ ID NO:5)
NCBI BLAST OK/No：是的，没有其他具有同源性的基因。
组装序列：
CACAATTCCACACAACATACGAGCCCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGAACTTCTCCAAGGGTAGCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTAAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACG(SEQIDNO:6)
尽管本发明已经参考各种示例性实施方案进行了描述，应理解这些实施方案仅是对本发明原理和应用的说明。本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明范围的情况下，可以对示例性实施方案进行各种修改。
此外，应理解本文中不同实施方案的各种特性和/或特征可以彼此组合。因此，应理解可以对说明性实施方案进行多种修改，并且可以在不脱离本发明范围的情况下设计其他安排。
此外，考虑到本公开发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员而言是明显的。说明书和实施例旨在仅被视为示例性的，其范围和精神由权利要求指定。
最后，应注意的是，本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示，除非清楚明确地限定一个指示除外，反之亦然。本文所使用的术语“包括”或“包含”及其语法变体旨在是非限制性的，使得一个或多个项目的叙述不排除可以替换或添加到(一个或多个)所述项目中的其他类似项目。
Claims (19)
1.一种***属植物，其包含：
总***素含量；
第一***素，其包含大于总***素含量干重的10％；
第二***素，其包含小于总***素含量干重的10％；和
***属植物基因组内修饰的遗传物质。
2.权利要求1的植物，其中所述第一***素选自THC、D9-THC、D8-THC、THCA、THCV、D8-THCV、D9-THCV、THCVA、CBD、CBDA、CBDV、CBDVA、CBC、CBCA、CBCV、CBCVA、CBG、CBGA、CBGV、CBGVA、CBN、CBNA、CBNV、CBNVA、CBND、CBNDA、CBNDV、CBNDVA、CBE、CBEA、CBEV、CBEVA、CBL、CBLA、CBLV或CBLVA。
3.权利要求1的植物，其中所述第二***素选自THC、D9-THC、D8-THC、THCA、THCV、D8-THCV、D9-THCV、THCVA、CBD、CBDA、CBDV、CBDVA、CBC、CBCA、CBCV、CBCVA、CBG、CBGA、CBGV、CBGVA、CBN、CBNA、CBNV、CBNVA、CBND、CBNDA、CBNDV、CBNDVA、CBE、CBEA、CBEV、CBEVA、CBL、CBLA、CBLV或CBLVA。
4.权利要求1的植物，其中所述修饰的遗传物质是编码***素合成酶的遗传序列。
5.权利要求4的植物，其中所述***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、芳香族异戊烯转移酶、丁烯酮合酶或戊基二羟基苯酸环化酶。
6.一种控制***属植物中第一***素合成的方法，包括：
选择第一***属植物；
选择第二***属植物，其中所述第一***属植物比所述第二***属植物产生更多的第一***素；
从第一***属植物中收集遗传物质；
从第二***属植物中收集遗传物质；
将来自第一***属植物的遗传物质与来自第二***属植物的遗传物质进行比较；并
鉴定与来自第二***属植物的遗传物质中存在的基因序列同源的来自第一***属植物的遗传物质中存在的基因序列中的差异。
7.权利要求6的方法，包括将第一***属植物的组装转录组与第二***属植物的组装转录因组进行比较。
8.权利要求7的方法，包括过表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，所述基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源。
9.权利要求8的方法，包括低表达存在于第一***属植物遗传物质中的基因序列，所述基因序列与存在于第二***属植物遗传物质中的基因序列同源。
10.权利要求9的方法，其中所述基因序列编码***素合成酶。
11.权利要求10的方法，其中所述***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、芳香族异戊烯转移酶、丁烯酮合酶或戊基二羟基苯酸环化酶。
12.一种植物，其通过权利要求11的方法产生。
13.一种控制***属植物中第一***素合成的方法，包括：
构建靶向编码***素合成酶的核酸序列的核酸内切酶；
将核酸内切酶引入***属植物的基因组中；和
操纵基因组内***素合成酶的表达。
14.权利要求13的方法，包括RNA向导。
15.权利要求14的方法，其中所述核酸内切酶是CRISPR/Cas9***。
16.权利要求15的方法，包括干扰***素合成酶的表达。
17.权利要求16的方法，其中所述***素合成酶选自THCA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶、芳香族异戊烯转移酶、丁烯酮合酶或戊基二羟基苯酸环化酶。
18.权利要求17的方法，包括增加前体底物的可用性。
19.一种植物，其通过权利要求18的方法产生。
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