CN109884007B - 一体化同步dna纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一体化同步DNA纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像方法，属于活细胞成像技术领域。本发明由金纳米颗粒(AuNP)负载三套DNA链构成的一体化同步DNA纳米器件，由活细胞内microRNA和/或端粒酶触发，人类8‑羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人源脱嘌呤/脱嘧啶(AP)核酸内切酶APE 1(APE1)驱动，释放荧光信号，实现活细胞多靶标同时成像。该一体化同步DNA纳米器件集成所有反应模块，能够避免分离模块进胞效率不同及扩散限制的胞浆中的运动差异，且无须细胞外源性补给任何物质，能同时实现活细胞内多靶标的精准成像分析。

Description

一体化同步DNA纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像 方法

技术领域

本发明属于活细胞成像技术领域，具体涉及一种一体化同步DNA纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像方法。

背景技术

活细胞内多种生物分子及相应的互作网络协同调控着生物体内各项新陈代谢过程。因此，同时监测胞内多个生物靶标、获取全面信息，在生化分析、临床诊断等实际应用中具有重要意义。脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acids,DNA)由于其遵循碱基互补配对原则、精确可编程的突出优势，成为探针构建材料中的黑马。基于DNA的纳米器件具有灵活多样化的结构，广泛应用于多靶标监测和成像。

现有的DNA纳米器件包括分子机器人、分子马达及DNA步移机器等，理论上可以应用于活细胞内多靶标表达差异的同时监测。但是，其中的大多数器件由多个分离的模块组成，不同模块进胞效率不同，导致胞内化学计量信息丢失，进而导致信号差异，干扰准确监测成像、产生误判。另外，研究者发现，大分子和纳米尺度结构在哺乳类细胞胞浆中和其他溶液中的扩散系数存在数个数量级的差异。因此，多个模块、细胞外源性能量物质或核酸探针共同进入活细胞，会使反应体系复杂化、限制反应速率。同时，这些DNA纳米器件缺少信号校准模块，不能响应单细胞之间异质性，抗复杂胞浆环境干扰能力差，导致成像结果不可靠，限制单细胞领域的研究应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一体化同步DNA纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像方法，能够克服分离模块结构进胞效率不同且胞浆内扩散限制导致反应动力学受限、缺少信号校准功能等现有技术的缺点。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一体化同步DNA纳米器件，包括修饰在金纳米颗粒AuNP表面的三套DNA链，其中，每套DNA链由具备两种DNA链组成：一种为发生运动过程的单链DNA，即SD链；另一种为带有特定化学标记碱基的茎环结构DNA链，即HD链，HD链的环状部分包含一个8-氧-7-氢脱氧鸟嘌呤，3’端的巯基通过共价键连接于金纳米颗粒AuNP表面，5’端修饰荧光分子FAM、Cy5或TAMRA。

优选地，SD链包括R-SD链、T-SD链和C-SD链；

R-SD链的5’端的16个碱基和Block DNA链的3’端的16个碱基互补形成双链；当目标物microRNA-21存在时，microRNA-21的22个碱基通过链置换反应和Block DNA链的22个碱基互补形成双链，释放出R-SD链；

T-SD链，T-SD-S链(T-SD-S是端粒酶延伸引物链)的5’端为端粒酶引物，当目标物端粒酶存在时，被延伸出TTAGGG重复序列成为T-SD链；

C-SD链，5’端部分碱基与C-HD链的环状部分碱基互补，其运动直接由酶hOGG1和APE1触发。

进一步优选地，释放后的R-SD链的5’端的14个碱基与对应R-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链；T-SD链的5’端的14个碱基与对应T-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链；C-SD链的5’端的14个碱基与对应C-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链。

进一步优选地，SD链和HD链形成DNA双链后，HD链上的损伤碱基oG位点能被酶hOGG1作用形成脱嘌呤/脱嘧啶AP位点，再由APE 1酶切后，释放出荧光。

本发明还公开了上述的一体化同步DNA纳米器件在活细胞成像中的应用。

进一步地，所述的一体化同步DNA纳米器件能够在不同活细胞样本中原位对多种目标物中的单个检测或多个检测同时成像。

本发明还公开了基于上述的一体化同步DNA纳米器件的活细胞多靶标成像方法，包括以下步骤：

1)将所述的一体化同步DNA纳米器件通过共培养法导入活细胞内；

2)将导入有一体化同步DNA纳米器件的活细胞在37℃下温育培养4h，然后通过激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞不同荧光通道的信号，实现对多种靶标同时同步的精确成像。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明由金纳米颗粒(AuNP)负载三套DNA链构成的一体化同步DNA纳米器件。该一体化结构集成所有反应模块，能够避免分离模块进胞效率不同及扩散限制的胞浆中的运动差异，且无须细胞外源性补给任何物质，能同时实现活细胞内多靶标的精准成像分析。具体优势如下：

1)本发明所述的一体化同步DNA纳米器件，将针对多种目标物特异设计的DNA探针及反映细胞内工具酶活性的DNA探针集成于金纳米颗粒表面，一体化结构同步进入细胞，不受进胞效率差异等因素影响，提高成像准确度。

2)本发明所述的同步DNA纳米器件，可利用一体化探针实现活细胞内不同靶标的同时监测，实现多靶标协同作用的深入准确研究。

3)本发明所述的一体化同步DNA纳米器件由活细胞内特异性目标物触发、细胞内源性酶驱动，无须细胞外源性补给能量物质、反应因子等，反应体系简单，反应效率高。

4)本发明所述的DNA纳米器件，在粘性胞浆内反应速率高于分离模块反应模式(异步进胞-游离-扩散-组装-酶切)，反应动力学加快、多靶标成像灵敏度提高。

5)本发明所述的DNA马达，一体化结构中包括信号校准模块，能反映不同细胞样本中非目标物导致的信号差异，实现精准成像。

6)本发明所述的一体化DNA纳米器件由金纳米颗粒和DNA构成，细胞毒性低，通过与细胞进行温育即可实现细胞内多靶标的同时监测。

附图说明

图1为本发明的一体化同步DNA纳米器件和现有技术中的分离模块DNA纳米器件在粘性细胞胞浆中的反应过程差异原理图；

图2为扩散限制条件下一体化同步DNA纳米器件和分离模块探针的反应动力学比较；其中，A为一体化同步DNA纳米器件的作用原理；B为不同粘度的扩散限制环境中两种DNA探针的反应速率比较；C为利用STED(受激发射损耗)荧光显微镜对两种DNA纳米器件的单颗粒荧光变化分析；

图3为一体化同步DNA纳米器件的反应动力学研究；其中，A为证明DNA纳米器件为颗粒内反应，非颗粒间反应；B为不同SD链修饰密度对DNA纳米器件反应动力学的影响；C和D分别为检测范围及特异性；

图4为不同设计的一体化同步DNA纳米器件在活细胞(HeLa)中的miR-21监测结果；其中，A为不同设计的DNA纳米器件在一种细胞样本中成像结果及对应流式结果；B为一种设计的DNA纳米器件在APE1活性不同的细胞样本中的成像结果；

图5为一体化同步DNA纳米器件对三种APE1活性不同的细胞(HeLa)样本中多靶标的同时成像结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

参见图1，为本发明提供的一体化同步DNA纳米器件与分离模块DNA纳米器件对比的活细胞内工作原理图，图1对比了本发明中一体化同步DNA纳米器件和分离模块DNA纳米器件在粘性细胞胞浆中的反应过程差异，可以看出，一体化DNA纳米器件同步进胞，细胞内源性工具酶hOGG1及APE1在胞浆内快速扩散，一体化同步DNA纳米器件原位同步反应，分离模块探针进胞效率不同、需要提高外源物质，反应过程复杂且效率低。

参见图2，具体描述了一体化同步DNA纳米机器的反应过程，并利用实时荧光强度曲线和STED荧光显微镜对一体化和分离模块两种DNA纳米器件在不同粘度的扩散限制条件下的反应速率进行监测，结果显示，本发明所述的一体化同步DNA纳米器件，在粘性扩散限制条件下，反应速率高于分离模块反应模式，说明本发明中的一体化DNA纳米器件反应速率明显高于分离模块反应过程。

参见图3，对miR-21触发的一体化DNA纳米器件反应参数进行优化，并测试其检测范围及特异性，其中，A为证明DNA纳米器件为颗粒内反应，非颗粒间反应；B为不同SD链修饰密度对DNA纳米器件反应动力学的影响；C和D分别为检测范围及特异性。可以获得最佳反应条件以应用于后续活细胞多靶标成像。

具体结合两个实施例对本发明做出进一步的解释和说明：

实施例1：利用不同设计的一体化同步DNA纳米器件对活细胞内单目标物miR-21进行成像。

以***细胞HeLa细胞系为基本模型，将20μL一体化同步DNA纳米器件探针加入预培养在八孔共聚焦培养皿中的HeLa细胞(0.2mL，1×10⁶mL^-1)中，37℃温育4小时。接着PBS清洗后，利用激光共聚焦荧光显微镜进行成像。在目标物miR-21阳性的细胞中，miR-21把封住R-SD的Block链置换下来，释放出单链R-SD，其5’端14个碱基与对应R-HD链的环状部分14个碱基互补成双链，其中R-HD链上的损伤碱基oG位点能被酶hOGG1作用形成脱嘌呤/脱嘧啶AP位点，再由APE 1酶切后，释放出FAM荧光。

另外，反映细胞内工具酶活性的DNA探针，即具有信号校准功能的C-SD链与对应C-HD链的环状部分14个碱基也互补成双链，其中C-HD链上的损伤碱基oG位点能被酶hOGG1作用形成AP位点，再由APE 1酶切后，释放出TAMRA荧光，用于细胞内“工具酶”hOGG1和APE1的分析研究。

结果参见图4，从图中可以看出，特异性一体化DNA纳米器件荧光强度远高于阴性对照荧光强度，对应流式实验统计数据也验证了相同的结果；另外，具有信号校准功能的DNA纳米器件，能够反映胞内两种工具酶的活性差异，实现准确成像。

实施例2：利用一体化同步DNA纳米器件对不同活细胞内多靶标同时成像。

以***细胞HeLa细胞系为基本模型，将20μL一体化同步DNA纳米器件探针加入预培养在八孔共聚焦培养皿中的HeLa细胞(0.2mL，1×10⁶mL^-1)中，37℃温育4小时。接着PBS清洗后，利用激光共聚焦荧光显微镜进行成像。目标物miR-21存在时，通过链置换反应和Block DNA链互补形成双链，释放出R-SD链；T-SD-S链，5’端的引物在目标物端粒酶存在时被延伸成为T-SD链。R-SD链、T-SD链和C-SD链5’端14个碱基与对应R-HD链、T-HD链和C-HD链的环状部分14个碱基互补成双链；三套SD链和HD链形成DNA双链后，其中HD链上的损伤碱基oG位点能被酶hOGG1作用形成脱嘌呤/脱嘧啶AP位点，再由APE 1酶切后，释放出对应荧光信号FAM、Cy5或TAMRA。TAMRA荧光用于细胞内“工具酶”hOGG1和APE1的分析研究。

结果如图5所示，从图5中可以看出，一体化同步DNA纳米器件能够在不同细胞样本中，实现对两种目标物miR-21及端粒酶的同时成像。端粒酶抑制剂EGCG处理的细胞中，Cy5荧光变弱、其余两个荧光信号基本不变；工具酶APE1抑制剂处理的细胞样本中，三荧光信号均明显下降。此结果表明，本发明中一体化DNA纳米器件可实现活细胞内多靶标的同时精准成像。

上述两个实施例中所用的DNA序列如下表1所示：

表1

注：(1)下划线字母代表DNA损伤碱基；

(2)斜体字母代表miR-21的错配碱基。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 西安交通大学

<120> 一体化同步DNA纳米器件及其活细胞多靶标成像应用和成像方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagcttatca gact 14

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaacatcag tctgataagc taa 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaacatcag tctgataagc taaa 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 8

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gacgcaaccc taacctaagc gtc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gacgccagtg tacgagatgc gtc 23

Claims (4)

1.一体化同步DNA纳米器件，其特征在于，包括修饰在金纳米颗粒AuNP表面的三套DNA链，其中，每套DNA链由具备两种DNA链组成：一种为发生运动过程的单链DNA，即SD链；另一种为带有特定化学标记碱基的茎环结构DNA链，即HD链，HD链的环状部分包含一个8-氧-7-氢脱氧鸟嘌呤，3’端的巯基通过共价键连接于金纳米颗粒AuNP表面，5’端修饰荧光分子FAM、Cy5或TAMRA；

SD链包括R-SD链、T-SD链和C-SD链；

R-SD链的5’端的16个碱基和Block DNA链的3’端的16个碱基互补形成双链；当目标物microRNA-21存在时，microRNA-21的22个碱基通过链置换反应和Block DNA链的22个碱基互补形成双链，释放出R-SD链；

T-SD链，T-SD-S链的5’端为端粒酶引物，当目标物端粒酶存在时，被延伸出TTAGGG重复序列成为T-SD链；

C-SD链，5’端部分碱基与C-HD链的环状部分碱基互补，其运动由酶hOGG1和APE1触发；

释放后的R-SD链的5’端的14个碱基与对应R-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链；T-SD链的5’端的14个碱基与对应T-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链；C-SD链的5’端的14个碱基与对应C-HD链的环状部分的14个碱基互补成双链；

SD链和HD链形成DNA双链后，HD链上的损伤碱基oG位点能被酶hOGG1作用形成脱嘌呤/脱嘧啶AP位点，再由APE 1酶切后，释放出荧光。

2.权利要求1所述的一体化同步DNA纳米器件在活细胞成像中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的一体化同步DNA纳米器件能够在不同活细胞样本中原位对多种目标物中的单个检测或多个检测同时成像。

4.基于权利要求1所述的一体化同步DNA纳米器件的活细胞多靶标成像方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将所述的一体化同步DNA纳米器件通过共培养法导入活细胞内；

2)将导入有一体化同步DNA纳米器件的活细胞在37℃下温育培养4h，然后通过激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞不同荧光通道的信号，实现对多种靶标同时同步的精确成像。

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