CN109876190A - 三维生物打印墨水的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用。在本发明中以明胶、海藻酸钠和I型胶原蛋白制备胶原水凝胶，加载小牛煅烧骨粉，制备得到的三维生物打印墨水，具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构。通过本发明，解决了相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题，采用本发明实施例的三维生物打印墨水制成的植骨材料，相对于多孔磷灰石陶瓷作为打印墨水制得的植骨材料而言提高了生物相容性，相对于小牛煅烧骨制得的植骨材料而言提高了植骨材料产品的可塑性和临床操作性。

Description

三维生物打印墨水的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物活性复合植骨材料领域，具体而言，涉及一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用。

背景技术

在羟基磷灰石家族成员中，纳米羟基磷灰石(Hydroxyapatite，简称为HA)的晶体结构与骨组织中的矿物质微粒结构基本相同，磷酸钙(Tricalcium Phosphate，简称为TCP)在骨组织中也占有一定比例，其降解速率远大于HA，在体内易于降解。降解速率除与化学组分有关外，还与其与体液间的接触面积相关。多孔磷灰石陶瓷的最佳设计原则在于兼顾降解速率及有利于新生骨组织的长入，即300um-500um的大孔、兼具微米级的小孔结构。尽管钙磷陶瓷的成型制作技术有了大的发展，如计算机控制的三维陶瓷打印技术。然而在读取天然骨组织的结构信息时，仍受到测量表征技术及加工技术的限制，缩短与天然骨组织的差距仍是一个长期的努力目标。

小牛煅烧骨(Deprotein Bovine Bone，简称为DBB)是现有骨修复材料之一，既保留了无机钙磷矿物质，又基本保留了骨组织的多孔结构，在临床应用中得到了较好的评价。但小牛煅烧骨强度较差，由于经高温烧成，完全失去了胶原蛋白，纳米晶体发生了改变，不易降解；直接应用在三维打印中也不易塑型。

随着骨组织三维生物打印技术的发展，使用细胞与生物活性基质材料共同打印水凝胶与明胶构成的生物墨水，可构建出预设的微结构，并具有较高的细胞存活率(＞90％)。为保证水凝胶能顺利挤出，基质材料需具备一定的流动性，细丝落入打印平台中因自身重力和上层结构堆积会发生形变，难以构建高精度复杂模型。虽然目前研究中可采用化学交联等方法促使水凝胶快速成型，但过量交联已证实会影响细胞的迁移、增殖以及分化。此外，受限于打印材料的黏度，钙磷(Ca-P)材料通常为纳米级，因此缺乏微米级小孔。

为构建具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构，还要有合适的降解速率维持新生组织的生长，研究可快速成型、可混合细胞的小牛煅烧骨生物打印墨水就是目前生物三维打印中至关重要的内容。

发明内容

本发明提供了一种三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用，以至少解决相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题。

第一方面，本发明实施例提供了一种三维生物打印墨水的制备方法，包括：

步骤1，配制海藻酸钠水溶液；

步骤2，向所述海藻酸钠水溶液中加入明胶，制成海藻酸钠-明胶均一的水凝胶；

步骤3，选用牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；

步骤4，选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料进行改性，煅烧后，获得煅烧骨粉；

步骤5，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白和所述煅烧骨粉，搅拌均匀，制备得到三维生物打印墨水。

可选地，所述步骤3包括：

选取牛筋腱，清洗干净，使用粉碎机，将大块的牛筋腱切成小尺寸的牛筋腱；

使用闪式提取技术处理牛筋腱，向提取物中加入乙酸，得到天然胶原粗料，再经过离心，透析步骤的纯化分离，获得I型胶原蛋白粗料；

将所述I型胶原蛋白粗料通过胃蛋白酶处理，获得去端肽的无免疫原性的I型胶原蛋白，即为所述I型胶原蛋白。

可选地，所述步骤4包括：

选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水洗净，以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；

以磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或磷酸为改性剂，对基本去除胶原蛋白的骨原料的骨盐进行改性，使其骨盐的钙磷原子比Ca/P降至1.5～1.67；

经800℃-1100℃高温煅烧，去除免疫原性，即得所述煅烧骨粉。

可选地，所述步骤5包括：

将水凝胶/I型胶原蛋白的质量比0.2-0.5的比例，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白，混合均匀，获得胶原水凝胶；

选用孔隙率达70％-80％、粒度为60-100目的煅烧骨粉，按照煅烧骨粉/胶原水凝胶相对质量比0.10-0.25的比例，将煅烧骨粉加入胶原水凝胶，混合均匀，并调整粘度范围为30-107mPa/s，pH至6.5-7.5，即得所述三维生物打印墨水。

第二方面，本发明实施例提供了一种三维生物打印墨水，所述三维生物打印墨水是通过第一方面所述的方法制备的。

第三方面，本发明实施例提供了一种第二方面所述的三维生物打印墨水在三维打印植骨材料中的应用，包括：

在无菌环境中，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型，冷冻干燥，得到植骨材料产品。

可选地，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型包括：

将所述三维生物打印墨水经灭菌处理后，加载细胞和生物因子；

使用加载了细胞和生物因子的三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型；

其中，三维生物打印塑型时的环境温度为37℃左右。

可选地，在所述三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl₂溶液。

通过本发明实施例提供的三维生物打印墨水、三维生物打印墨水的制备方法及其应用，以明胶、海藻酸钠和I型胶原蛋白制备胶原水凝胶，加载小牛煅烧骨粉，制备得到的三维生物打印墨水，具有良好的生物相容性、一定的机械强度及三维多孔的立体结构。三维生物打印墨水中，胶原蛋白复合煅烧骨有利于成骨细胞的粘附增殖，胶原蛋白其在几个星期内成分将被缓慢吸收，无屏障作用。采用CaCl₂溶液作为交联剂能够在3-5分钟时间里将墨水转变为均质固相，固化时间适宜，且产品具有一定的强度和弹性。通过本发明，解决了相关技术中的植骨材料产品的生物相容性或可塑性不佳的问题，采用本发明实施例的三维生物打印墨水制成的植骨材料，相对于多孔磷灰石陶瓷作为打印墨水制得的植骨材料而言提高了生物相容性，相对于小牛煅烧骨制得的植骨材料而言提高了植骨材料产品的可塑性和临床操作性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是根据本发明实施例的胶原蛋白红外特征谱图；

图2是根据本发明实施例的胶原凝胶小牛煅烧骨三维生物打印植骨材料的结构示意图；

图3是根据本发明实施例的证实支架羟基磷灰石包括HA和βTCP的X射线衍射图谱，其中DBB/Col为小牛煅烧骨和胶原蛋白组，DBB为小牛煅烧骨组；

图4是根据本发明实施例的材料多孔特性的示意图；

图5是根据本发明实施例的三维生物打印体结构中细胞紧密依附于磷灰石颗粒生长的示意图；

图6是根据本发明实施例的三维生物打印支架网络中细胞均匀分布生长的示意图；

图7是根据本发明实施例的三维生物打印支架网络中细胞成骨向分化的示意图。

具体实施方式

下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明更好的理解。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

实施例1

在本实施例中提供了一种三维生物打印植骨材料的三维生物打印墨水的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，配制海藻酸钠水溶液；

选用分子量在5000-50000左右的海藻酸钠溶解于蒸馏水，同时机械搅拌，超声混匀，配制水溶液浓度10-30mg/ml。

步骤2，利用步骤1的水溶液制成海藻酸钠-明胶均一的水凝胶；

一定量的明胶调节步骤1得到的水溶液的黏度，再将混合液在加热下搅拌形成水凝胶，冷却至室温。改变明胶/海藻酸钠的比例，可调节胶体存放过程中的变形量。

步骤3，选用新鲜的牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；

选取新鲜的牛筋腱，清洗干净，使用粉碎机，将大块的牛筋腱切成小尺寸原料；使用闪提技术处理牛筋腱，再用一定量乙酸，初步得到天然胶原粗料，再经过离心，透析步骤的纯化分离，获得I型胶原粗料；将制备的I型胶原粗料再通过胃蛋白酶处理，获得去端肽的无免疫原性的I型胶原蛋白。I型胶原蛋白，由三条肽链组成，其中有α(Ⅰ)、α(Ⅱ)链，一条β链。最终获得胶原蛋白一般是白色粉状物，相对分子质量从约2kD至300kD不等，不溶于冷水、稀酸、稀碱溶液，具有良好的保水性和乳化性，其红外特征谱图详见图1，其中曲线a代表胶原蛋白组，曲线b代表去端肽胶原组。

步骤4，选用新生小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料行改性，煅烧改性后彻底去除骨材料的免疫原性，获得煅烧骨粉；

选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端为骨原料，经去离子水洗净，以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白。以磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或磷酸为改性剂，对骨的基质(骨盐)进行改性，使骨基质的Ca/P原子比降至1.5～1.67。经800℃-1100℃高温煅烧，彻底去除免疫原性；同时，由骨块煅烧前后的X射线衍射(XRD)图谱可见骨基质晶相由HA改变为HA/β-TCP的双相结构。电子扫描电镜(SEM)观察表明，煅烧骨粉既含有300μm～500μm的大孔、又含有微米级的微孔结构。

步骤5，向步骤2制备的水凝胶中加入I型胶原蛋白和煅烧骨粉，搅拌均匀制备三维生物打印墨水。

将水凝胶按照质量比0.2-0.5比例混合I型胶原蛋白，获得胶原水凝胶。选用孔隙率(体积比)达70％-80％，粒度为60-100目的小牛煅烧骨粉，按照煅烧骨粉/胶原水凝胶相对质量比0.10-0.25的比例，将煅烧骨粉加入胶原水凝胶，混合均匀制备成三维生物打印墨水，通过调整混合比例和环境温度的方式，调整粘度范围为30-107mPa/s；调整pH至6.5-7.5。此外，改变煅烧骨粉的加入比例，可调节胶体存放过程中的变形量及强度。

实施例2

在本实施例中还提供了一种由实施例1提供的三维生物打印植骨材料的三维生物打印墨水的制备方法制备而来的三维生物打印墨水。

其中，在使用上述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl₂溶液。

本实施例的三维生物打印墨水具备的胶原凝胶体系以明胶/酸钠与I型胶原蛋白形成互穿的网络结构为支架，多孔Ca-P骨粉充填于这种网络结构中，体系中细胞和生物因子则以蛋白凝胶体为载体，大大改善植骨材料的生物活性、机械性能，为骨缺损修复治疗提供一种新型修复材料。

实施例3

在本实施例中还提供了一种三维生物打印墨水在三维生物打印植骨材料中的应用，包括：

在无菌环境中，使用实施例1制备的三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型，-20℃条件下冷冻干燥，获得系列个性化三维骨胶原材料制成的植骨材料。

其中，在所述三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl₂溶液。

实施例4

在本实施例中还提供了另一种三维生物打印墨水在三维生物打印植骨材料中的应用，包括：

将实施例1制备的三维生物打印墨水经灭菌处理后，与生物因子或细胞混合，即制得具有生物活性因子或细胞的三维生物打印墨水；使用该墨水可以打印成各种生物活性植骨材料。

其中，在所述三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl₂溶液。生理体温37℃下经100mmol/L CaCl2溶液交联3-5分钟可转变为均质固相，具有一定强度和弹性。

材料的固化时间对于三维生物打印影响较大，应当具有适宜的固化时间，时间过短将导致过早凝固，堵塞打印喷头；固化时间过长，则导致塑型不理想。理想的固化时间应当在7-10分钟这一区间内。这是由于骨粉具有大量孔隙，吸附水分，实验表明，加入10％-25％的小牛煅烧骨粉时，抗压强度0.1-0.3Mpa左右，具有羟基磷灰石/β磷酸三钙两种物相(图3)，孔隙率60％-80％，孔径大小约在150μm-500um(图4)。体外生物相容性试验表明，三维生物打印体支架网络中，成骨细胞均匀分布支架结构中(图5)，并且细胞紧密依附于磷灰石颗粒生长(图6)，并向成骨向分化(图7)。

本实施例所制备的生物活性植骨材料具有一定形态和机械强度，同时能缓释促进骨形成的生物活性因子，又能满足临床骨缺损修复个性化的设计要求，为颌面部骨等缺损的修复治疗提供一种新型修复材料。

在实施例3和实施例4中，选择明胶、海藻酸钠制作水性凝胶体，以生物相容性好的CaCl₂为交联剂形成藻酸钠贯穿网络结构(明胶与海藻酸钠贯穿网络结构的形成除CaCl2的交联作用外，还有Mg2+与胶体的络合作用共同形成水凝胶)，并利用这种凝胶网络结构加载I型胶原蛋白和多孔的小牛煅烧骨粉。可以通过调整胶体成分与浓度，调整三维生物打印操作温度与交联时间，加入细胞与生物活性因子，并调整I型胶原蛋白和小牛煅烧骨粉的加入比例，可形成系列三维生物打印植骨材料，并具有优良的生物活性，生物相容性、机械耐受性及缓释性能。可广泛用于牙周、种植的骨修复修复及牙槽嵴萎缩吸收的修复与再建。

综上所述，本发明的上述实施例针对现有三维生物打印植骨材料强度较差，难于降解，生物活性较差，缺乏天然微孔结构等不足，选用改性煅烧骨颗粒为基体，以藻酸钠-明胶混合I型胶原蛋白获得胶原水凝胶，将胶原水凝胶采用生物相容性好的CaCl₂交联，细胞和生物因子则可以加载在胶原水凝胶中。由此打印得到的植骨材料强度较高，易于降解同时具有骨诱导特性。

需要明确的是，本发明并不局限于上文所描述的特定配置和处理。为了简明起见，这里省略了对已知方法的详细描述。在上述实施例中，描述和示出了若干具体的步骤作为示例。但是，本发明的方法过程并不限于所描述和示出的具体步骤，本领域的技术人员可以在领会本发明的精神后，作出各种改变、修改和添加，或者改变步骤之间的顺序。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种三维生物打印墨水的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1，配制海藻酸钠水溶液；

步骤2，向所述海藻酸钠水溶液中加入明胶，制成海藻酸钠-明胶均一的水凝胶；

步骤3，选用牛筋腱作为原料，提取胶原蛋白后，去除端肽，获得I型胶原蛋白；

步骤4，选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，通过改性剂对骨原料进行改性，煅烧后，获得煅烧骨粉；

步骤5，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白和所述煅烧骨粉，搅拌均匀，制备得到三维生物打印墨水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3包括：

选取牛筋腱，清洗干净，使用粉碎机，将大块的牛筋腱切成小尺寸的牛筋腱；

使用闪式提取技术处理牛筋腱，向提取物中加入乙酸，得到天然胶原粗料，再经过离心，透析步骤的纯化分离，获得I型胶原蛋白粗料；

将所述I型胶原蛋白粗料通过胃蛋白酶处理，获得去端肽的无免疫原性的I型胶原蛋白，即为所述I型胶原蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4包括：

选用小牛骨关节头或胫骨的骨骺端作为骨原料，经去离子水洗净，以物理或生物化学的方法基本去除胶原蛋白；

以磷酸氢二铵、磷酸二氢铵或磷酸为改性剂，对基本去除胶原蛋白的骨原料的骨盐进行改性，使其骨盐的钙磷原子比Ca/P降至1.5～1.67；

经800℃-1100℃高温煅烧，去除免疫原性，即得所述煅烧骨粉。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5包括：

将水凝胶/I型胶原蛋白的质量比0.2-0.5的比例，向所述水凝胶中加入所述I型胶原蛋白，混合均匀，获得胶原水凝胶；

选用孔隙率达70％-80％、粒度为60-100目的煅烧骨粉，按照煅烧骨粉/胶原水凝胶相对质量比0.10-0.25的比例，将煅烧骨粉加入胶原水凝胶，混合均匀，并调整粘度范围为30-107mPa/s，pH至6.5-7.5，即得所述三维生物打印墨水。

5.一种三维生物打印墨水，其特征在于，所述三维生物打印墨水是通过权利要求1至4中任一项所述的方法制备的。

6.一种权利要求5所述的三维生物打印墨水在三维打印植骨材料中的应用，其特征在于包括：

在无菌环境中，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型，冷冻干燥，得到植骨材料产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，使用所述三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型包括：

将所述三维生物打印墨水经灭菌处理后，加载细胞和生物因子；

使用加载了细胞和生物因子的三维生物打印墨水进行三维生物打印塑型；

其中，三维生物打印塑型时的环境温度为37℃左右。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，在所述三维生物打印塑型时采用的交联剂为100mmol/L的CaCl₂溶液。