CN109868329B - 刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物鉴定及检验技术领域，具体涉及刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法。本发明提供用于鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物对(序列如SEQ ID NO.1‑2所示)以及探针(序列如SEQ ID NO.3所示)。本发明提供的靶序列、特异性引物和探针具有高度的刺盘孢属真菌的普适性以及属特异性，能够有效区分刺盘孢属真菌与其它微生物，本发明提供的刺盘孢属真菌的鉴定方法具有通用性强、特异、灵敏、准确、快速、操作简单的优势，适于广泛推广应用。

Description

刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物鉴定及检验技术领域，具体涉及鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物对、探针以及鉴定刺盘孢属真菌的方法。

背景技术

刺盘孢属(Colletotrichum，又名炭疽菌属)，由Corda在1831年建立，隶属于小丛壳目(Glomerellales)、小丛壳科(Glomerellaceae)。该属中大多数都是植物病原真菌，可以侵害多种农作物、经济作物和观赏植物等，形成以炭疽病为主的多种病害，被认为是世界十大重要植物病原真菌之一(Dean et al.2012)。其中造成重大经济损失的病原菌包含咖啡浆果刺盘孢Colletotrichum kahawae subsp.kahawae、暹罗刺盘孢C.siamense、胶孢刺盘孢C.gloeosprioides、果生刺盘孢C.fructicola、平头刺盘孢C.truncatum、尖孢刺盘孢C.acutatum、博宁刺盘孢C.boninense、菜豆刺盘孢C.lindemuthianium、镰形刺盘孢C.falcatum等。其中，咖啡浆果刺盘孢C.kahawae subsp.kahawae已被列入中国和亚洲其他国家以及拉丁美洲的一些国家检疫名录中，该种是造成整个非洲广泛种植的***咖啡浆果病害的罪魁祸首，能够造成毁灭性的咖啡浆果炭疽病害，损失高达30％-70％，甚至绝产，是重要植物检疫对象。

刺盘孢属病菌是检疫口岸检出频次最高的有害植物病原真菌之一。区分和鉴定刺盘孢属真菌对口岸检疫人员来说不仅任务繁重，而且是一个很大的挑战。有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分析和科学控制是防范外来物种的核心内容，其中，有害生物鉴定是其中的首要环节。对咖啡浆果刺盘孢及其近缘种进行有效识别，对于控制其危害，及时阻断其传播、扩散，起着至关重要的作用。目前，进出境口岸对检疫性刺盘孢种类鉴定的主要流程是菌株分离、形态观察、序列测定和分析，但是这样的操作远远不能满足口岸部门对于有害病原菌高效、精准的检出要求。

尽管现有技术中已有一些利用分子生物学手段进行刺盘孢属某些物种的特异性检测和鉴定，如：巢式PCR快速检测胶胞炭疽菌的体系建立及应用(CN201810429586.1)、一种定量检测芒果炭疽菌的方法(CN201810062983.X)、一种检测胶孢炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(CN201510030095.6)、一种检测平头炭疽菌的环介导等温扩增引物组合物及其应用(CN201510031690.1)。但是，这些方法每次只能检测一种刺盘孢属物种，普适性较差，在检疫性鉴定应用方面存在缺陷，不能满足口岸日常检测筛查的需要。因此，建立刺盘孢属的属水平病原菌的特异、灵敏、快速和有效的分子检测方法在实践和应用研究中是十分必要的。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种普遍适用于各种刺盘孢属真菌的特异、灵敏、快速的刺盘孢属真菌的鉴定方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明通过对刺盘孢属真菌物种、同科近缘属以及其它常见真菌(尤其是常见植物病原真菌)的基因组序列进行大量的分析和比对，确定了在刺盘孢属真菌中高度保守且具有属特异性的、能够很好地适用于各种刺盘孢属真菌的特异性靶序列以及特异性引物对和探针，该特异性引物对可以单独用于刺盘孢属真菌的PCR鉴定，也可结合特异性探针使用利用荧光定量PCR进行刺盘孢属真菌的鉴定。上述特异性引物或特异性引物探针组合能够实现刺盘孢属真菌的特异、灵敏、准确、快速鉴定。

具体地，第一方面，本发明提供一种用于鉴定刺盘孢属真菌的靶序列，其位于28SrDNA上，含有序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对特异性结合或扩增的核苷酸序列。

本发明中，上述靶序列可通过序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到，或者含有序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对能够特异性结合的核苷酸序列同时能够采用如SEQ ID NO.1-2所示的引物对或如SEQ ID NO.1-2所示的引物对经一个或多个碱基的缺失、替换或***得到的引物对扩增得到。

上述靶序列在刺盘孢属真菌中具有较高的保守性，尤其在特定位置具有高度的保守性，同时具有刺盘孢属真菌的属特异性，能够普遍通用于不同种刺盘孢属真菌的鉴定。

上述特异性靶序列在不同的刺盘孢属真菌中存在部分位点的核苷酸序列差异，例如：当目标菌株为Colletotrichum truncatum CBS 151.35时，上述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(GenBank登录号JN940819第310-378位)，当目标菌株为Colletotrichumcliviae CGMCC 3.17358时，上述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

第二方面，本发明提供所述的靶序列在鉴定刺盘孢属真菌中的应用。

上述靶序列在鉴定刺盘孢属真菌中的应用为通过检测待测样本中是否含有所述靶序列，判断待测样本中是否含有刺盘孢属真菌或是否为刺盘孢属真菌。

优选地，所述应用包括：检测待测样本的总DNA中是否含有所述靶序列；如果含有所述靶序列，则待测样本含有或疑似含有刺盘孢属真菌，或者，是或疑似是刺盘孢属真菌；如果不含有所述靶序列，则待测样本不含有或疑似不含有刺盘孢属真菌，或者不是或疑似不是刺盘孢属真菌。

第三方面，本发明提供鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物对，包括序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。上述特异性引物对与刺盘孢属靶序列具有高度的结合特异性和优异的扩增效率，能够保证PCR检测的特异性、灵敏度和准确性。上述特异性引物可以单独使用进行PCR检测，或者与特异性探针配合使用，进行荧光定量PCR检测。

具体序列如下：

正向引物(CLF)：SEQ ID NO.1：5'-AGAGGGTTAAACAGCACG TGAAA-3'；

反向引物(CLR)：SEQ ID NO.2：5'-GATTCACCGGACG CAAGTCT-3'。

第四方面，本发明提供含有所述鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物对(SEQ IDNO.1-2所示)和序列如SEQ ID NO.3所示的探针的引物探针组合。上述特异性探针能够更好地与所述特异性引物对配合，进一步提高荧光PCR扩增的扩增效率，更好地保证荧光定量PCR检测的特异性、灵敏度和准确性。

为满足荧光检测的需要，所述探针的一个末端标记有荧光报告基团，另一个末端标记有荧光淬灭基团。

优选地，所述探针的5'末端标记有荧光报告基团，3'末端标记有荧光淬灭基团。

作为本发明的一种实施方式，所述探针的5'端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团MGB。

具体序列如下：

探针(CLP)：SEQ ID NO.3：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCG CTT-MGB-3'。

上述探针CLP在完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；在进行刺盘孢属鉴定的PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，发出荧光信号，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，可进行PCR产物形成的高效检测。

本发明提供的上述靶序列、特异性引物对、引物探针组合能够普遍适用于多种刺盘孢属真菌的鉴定。

第五方面，本发明提供所述特异性引物对或所述引物探针组合在制备鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒或鉴定刺盘孢属真菌中的应用。

本发明中，所述鉴定刺盘孢属真菌包括鉴定待测菌是否为刺盘孢属真菌或鉴定待测样品中是否含有刺盘孢属真菌。

优选地，所述特异性引物对或所述引物探针组合的应用包括如下任意一种：

(1)鉴定刺盘孢属真菌；

(2)制备用于鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒；

(3)检测待测样本是否含有刺盘孢属真菌；

(4)制备用于检测待测样本是否含有刺盘孢属真菌的试剂盒。

第六方面，本发明提供一种鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒，包含所述特异性引物对或所述引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、阳性模板中的一种或多种。

上述dNTPs、PCR反应缓冲液、Mg²⁺、DNA聚合酶各组分可以单独包装，或制备为预混液。

所述预混液可制备为不同的浓度，如2×PCR预混液。

所述预混液可以将包括dNTPs、PCR反应缓冲液、Mg²⁺、DNA聚合酶的PCR扩增组分混合制备或采用商品化的PCR预混液，例如ABI公司的2×

Universal PCR MasterMix。

本发明还提供上述试剂盒的如下任意一种应用：

(1)鉴定待测样本是否为刺盘孢属真菌；

(2)鉴定待测样本是否含有刺盘孢属真菌。

第七方面，本发明提供一种鉴定刺盘孢属真菌的方法，以待测样品的DNA为模板，利用所述特异性引物对或所述引物探针组合进行PCR扩增，根据扩增产物判断所述待测样品是否为刺盘孢属真菌或所述待测样品是否含有刺盘孢属真菌。

作为本发明的一种实施方式，以待测样本的DNA为模板，利用所述特异性引物对进行PCR扩增，检测PCR扩增产物；如果检测到特异性扩增产物，则待测样本为/候选为刺盘孢属真菌，或者，含有/疑似含有刺盘孢属真菌；如果未检测到特异性扩增产物，则待测样本不是/疑似不是刺盘孢属真菌，或者，不含/疑似不含刺盘孢属真菌。

作为本发明的另一种实施方式，以待测样本的DNA为模板，利用所述引物探针组合进行实时荧光PCR扩增，检测荧光信号，如果荧光信号显示符合阳性扩增曲线，则待测样本为或候选为刺盘孢属真菌，或者，含有或疑似含有刺盘孢属真菌；如果荧光信号显示不符合阳性扩增曲线，则待测样本不是/疑似不是刺盘孢属真菌，或者，不含/疑似不含刺盘孢属真菌。

以上任一所述特异扩增产物可为69bp的扩增产物。

优选地，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异性引物对的浓度为0.4～0.9μM，所述探针的浓度为0.3～0.9μM。采用上述引物和探针的浓度，能够更好地提高PCR扩增反应的扩增效率，进而提高检测的特异性、灵敏度和准确性。

优选地，所述实时荧光PCR的反应条件为：95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。

本发明中，所述待测样本可为植物样品、真菌纯培养样品、土壤样品等。

优选地，所述植物样本具体可为叶片、茎秆、根、果实等。

本发明进一步优化了实时荧光PCR的反应体系，获得了最优的引物浓度和探针浓度。

本发明针对现有技术中依赖形态学检测和测序对刺盘孢属真菌进行鉴定的方法存在的技术问题(费时、繁琐、专业性要求高等缺点)，根据刺盘孢属物种的遗传学和分子生物学特征，开发了刺盘孢属保守的、属特异性靶序列以及其特异性引物对和探针，利用开发的特异性引物对和探针对刺盘孢属真菌进行检测鉴定，进而提供了一种操作简单、快速、灵敏、准确的鉴定刺盘孢属真菌的方法。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)高普适性：对比现有技术适于特定的一种刺盘孢属真菌，本发明对多种刺盘孢属真菌具有高度的普适性，包括如表1所示的50余种重要的刺盘孢真菌(Colletotrichum＝C.)；

表1本发明适用的刺盘孢属真菌

(2)检测过程快速简单：本发明提供的检测方法仅需少量DNA样品，利用荧光PCR仪仅需1小时就可完成PCR扩增，直接得到检测结果；

(3)特异性强：本发明提供的针对刺盘孢属真菌的特异性引物对具有高度的属特异性，能够高效进行目标基因片段的扩增，可与本发明提供的特异性荧光探针配合进行检测，有效地避免假阳性和假阴性；

(4)灵敏度高：本发明提供的针对刺盘孢属真菌的特异性引物对具有优异的扩增效率，与本发明提供的特异性荧光探针配合，能够显著提高检测的灵敏度；

(5)交叉污染低：本发明提供的荧光定量PCR检测方法的整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，消除了PCR产物的污染；

(6)本发明提供的荧光定量PCR检测方法可以实现刺盘孢属真菌的定量检测。

本发明提供的靶序列、特异性引物对和探针以及检测方法，在检疫口岸，能够对含有刺盘孢属真菌的样品进行快速准确筛查，防止病菌随种子及其它繁殖材料进出口、调运而传播蔓延，对于植物病原性刺盘孢属真菌的检测、防控以及促进农业生产的健康发展具有重要的意义，具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为实施例2中不同引物浓度的扩增曲线对比图，其中，编号1～10分别为实验组1～10，编号0为空白对照组。

图2为实施例3中不同探针浓度的扩增曲线对比图，其中，编号1～10分别为实验组1～10，编号0为空白对照组。

图3为实施例4中实时荧光PCR检测刺盘孢属真菌的特异性分析结果图。

图4为实施例5中用于灵敏度分析的不同模板DNA含量的扩增曲线对比图，其中，编号1～6分别为实验组1～6(3个重复)的扩增曲线。

图5为实施例5中DNA模板浓度与荧光定量检测的Ct值呈负相关结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所有涉及的菌株，均可以从商业途径或保藏机构获得。

实施例1鉴定刺盘孢属真菌的靶序列、特异性引物和探针的筛选和确定

从NCBI数据库获取刺盘孢属、同科不同属以及其它常见真菌(如：Diaporthe、Curvularia、Fusarium等，见表2)的28s rDNA、ITS、GAPDH等序列，结合申请人测序得到的刺盘孢属真菌以及其它真菌的大量序列，进行序列比对和分析，寻找在多种不同的刺盘孢属真菌中具有高度保守性、同时在与刺盘孢属亲缘关系较近的其它属真菌存在明显差异的序列，经筛选，确定普遍适用于刺盘孢属真菌鉴定的且具有属特异性的靶序列，其位于28SrDNA上，对应GenBank登录号JN940819第310-378位的位置，当目标菌株为C.truncatum CBS151.35时，上述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，当目标菌株为C.cliviae CGMCC3.17358时，上述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。针对该保守区域设计多条特异性引物和探针，筛选并确定具有优异的靶序列结合和扩增效率、高度特异性和灵敏度的特异性引物和探针。

引物和探针设计采用软件设计辅助人工优化和筛选，本发明经过大量实验发现经引物设计软件设计、并打分较高的引物和探针或根据常规的引物、探针设计原则设计的引物和探针并不能完全满足本发明对于鉴定引物的刺盘孢属真菌通用性和特异性的要求，很多软件设计或根据常规的引物探针设计原则设计的引物和探针仅在部分刺盘孢属真菌中具有较好的扩增效果，但在其它刺盘孢属真菌中扩增效果不佳。因此，本发明根据不同刺盘孢属真菌的基因序列，进行了人工优化设计和大量引物探针组合的筛选对比，最终确定了如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对和如SEQ ID NO.3所示的探针的最佳引物探针组合。

实施例2不同引物浓度对鉴定结果的影响

本实施例的目的在于分析反应体系中不同引物浓度对刺盘孢属真菌鉴定结果的影响，以获得鉴定时采用的最优引物浓度。

(1)待测菌DNA制备：

将咖啡浆果刺盘孢IMI 319418的基因组DNA进行梯度稀释后作为荧光定量PCR扩增的模板。

(2)用于检测刺盘孢属真菌的引物探针组：

正向引物CLF：5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物CLR：5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针CLP：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3'(SEQ ID NO.3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

(3)用于检测刺盘孢属真菌的PCR反应体系：

反应体系(10μL)：5μL 2×

Universal PCR Master Mix，XμL引物CLF(10μmol/L)，XμL引物CLR(10μmol/L)，0.5μL探针CLP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，探针CLP终浓度为0.5μmol/L；

建立不同的实验组，各实验组以反应体系中引物浓度作为变量，其余组分的浓度和实验条件均相同：

实验组1中，X为0.1，引物CLF终浓度为0.1μmol/L，引物CLR终浓度为0.1μmol/L；

实验组2中，X为0.2，引物CLF终浓度为0.2μmol/L，引物CLR终浓度为0.2μmol/L；

实验组3中，X为0.3，引物CLF终浓度为0.3μmol/L，引物CLR终浓度为0.3μmol/L；

实验组4中，X为0.4，引物CLF终浓度为0.4μmol/L，引物CLR终浓度为0.4μmol/L；

实验组5中，X为0.5，引物CLF终浓度为0.5μmol/L，引物CLR终浓度为0.5μmol/L；

实验组6中，X为0.6，引物CLF终浓度为0.6μmol/L，引物CLR终浓度为0.6μmol/L；

实验组7中，X为0.7，引物CLF终浓度为0.7μmol/L，引物CLR终浓度为0.7μmol/L；

实验组8中，X为0.8，引物CLF终浓度为0.8μmol/L，引物CLR终浓度为0.8μmol/L；

实验组9中，X为0.9，引物CLF终浓度为0.9μmol/L，引物CLR终浓度为0.9μmol/L；

实验组10中，X为1.0，引物CLF终浓度为1.0μmol/L，引物CLR终浓度为1.0μmol/L；

空白对照组：用等体积水代替模板，作为空白对照。

(4)用于检测刺盘孢属真菌的实时荧光PCR反应条件：

依次95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。

实验结果如图1所示，实验组1～10均能检测到阳性扩增曲线；其中，实验组3～10的阳性扩增曲线的形状和趋势较好，表明PCR反应体系中正向引物和反向引物的浓度为0.3～1.0μmol/L的PCR扩增效率较高，适于刺盘孢属真菌的鉴定。

实施例3不同探针浓度对鉴定结果的影响

(1)待测菌DNA制备：

将咖啡浆果刺盘孢IMI 319418的基因组DNA进行梯度稀释后作为荧光定量PCR的模板。

(2)用于检测刺盘孢属真菌的引物探针组：

正向引物CLF：5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物CLR：5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针CLP：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3'(SEQ ID NO.3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

(3)用于检测刺盘孢属的PCR反应体系：

反应体系(10μL)：5μL 2×

Universal PCR Master Mix，0.7μL引物CLF(10μmol/L)，0.7μL引物CLR(10μmol/L)，YμL探针CLP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物CLF终浓度为0.7μmol/L，引物CLR终浓度为0.7μmol/L；

建立不同的实验组，各实验组以反应体系中探针浓度作为变量，其余组分的浓度和实验条件均相同：

实验组1中，Y为0.1，探针CLP终浓度为0.1μmol/L；

实验组2中，Y为0.2，探针CLP终浓度为0.2μmol/L；

实验组3中，Y为0.3，探针CLP终浓度为0.3μmol/L；

实验组4中，Y为0.4，探针CLP终浓度为0.4μmol/L；

实验组5中，Y为0.5，探针CLP终浓度为0.5μmol/L；

实验组6中，Y为0.6，探针CLP终浓度为0.6μmol/L；

实验组7中，Y为0.7，探针CLP浓度为0.7μmol/L；

实验组8中，Y为0.8，探针CLP终浓度为0.8μmol/L；

实验组9中，Y为0.9，探针CLP终浓度为0.9μmol/L；

实验组10中，Y为1.0，探针CLP终浓度为1.0μmol/L；

空白对照组：用等体积水代替模板，作为空白对照。

(4)用于检测刺盘孢属的实时荧光PCR反应条件：

依次95℃反应10 min，1个循环；95℃反应15 s，60℃反应1min，40个循环。

实验结果如图2所示，实验组1～10均能显示出阳性扩增曲线；其中实验组3～9的阳性扩增曲线的形状和趋势较好，表明PCR反应体系中探针浓度为0.3～0.9μmol/L的PCR扩增效率较高，适于刺盘孢属真菌的鉴定。

实施例4实时荧光PCR检测刺盘孢属真菌的特异性

本实施例利用实施例1确定的特异性引物和探针以及实施例2和3确定的反应体系，检测不同的刺盘孢属真菌，分析检测的特异性。本实施例的检测对象为如表1所示的51种刺盘孢属真菌和28种非刺盘孢属微生物，其中，菌株编号以CBS开头的菌株来源于荷兰Westerdijk菌种保藏中心，CGMCC菌株来源于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，BCC菌株来源于泰国微生物菌种保藏中心，IMI菌株的DNA来源于英国微生物菌种保藏中心，LC菌株为发明人分离鉴定，保藏于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室蔡磊课题组(http://www.mycolab.org.cn/templates/T_second/index.aspx？nodeid＝554)。

表2用于特异性检测的刺盘孢属和非刺盘孢属真菌的菌株信息

(1)待测菌DNA的准备：

提取表1中51种刺盘孢属真菌和28种非刺盘孢属微生物的基因组DNA，将基因组DNA分别稀释后作为荧光定量PCR扩增的待测菌DNA模板。

(2)用于检测刺盘孢属的引物探针组：

正向引物CLF：5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物CLR：5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针CLP：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3'(SEQ ID NO.3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

(3)用于检测刺盘孢属的PCR反应体系：

反应体系(10μL)：5μL 2×

Universal PCR Master Mix，0.5μL引物CLF(10μmol/L)，0.5μL引物CLR(10μmol/L)，0.5μL探针CLP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物CLF终浓度为0.5μmol/L，引物CLR终浓度为0.5μmol/L，探针CLP终浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替模板，作为空白对照。

(4)用于检测刺盘孢属的实时荧光PCR反应条件：

依次95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。

实验结果显示，51种刺盘孢属真菌的荧光信号均显示符合阳性扩增曲线，刺盘孢属以外的待测菌均无法扩增，说明实施例1提供的最佳引物探针组合(SEQ ID NO.1-3)具有良好的特异性，仅能检出刺盘孢属真菌。部分待测菌的扩增结果如图3所示。

实施例5实时荧光PCR检测刺盘孢属真菌的灵敏度

(1)待测菌DNA制备：

将Colletotrichum jasmini-sambac CBS 130420的基因组DNA进行梯度稀释后作为模板。

(2)用于检测刺盘孢属真菌的引物探针组：

正向引物CLF：5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物CLR：5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针CLP：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3'(SEQ ID NO.3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

(3)用于检测刺盘孢属真菌的PCR反应体系：

反应体系(10μL)：5μL 2×

Universal PCR Master Mix，0.7μL引物CLF(10μmol/L)，0.7μL引物CLR(10μmol/L)，0.5μL探针CLP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物CLF终浓度为0.7μmol/L，引物CLR终浓度为0.7μmol/L，探针CLP终浓度为0.5μmol/L；

建立不同的实验组，各实验组以模板中的DNA含量作为变量，其余组分和条件均相同：

实验组1中，模板的DNA含量为68ng；

实验组2中，模板的DNA含量为6.8ng；

实验组3中，模板的DNA含量为680pg；

实验组4中，模板的DNA含量为68pg；

实验组5中，模板的DNA含量为6.8pg；

实验组6中，模板的DNA含量为680fg；

实验组7中，模板的DNA含量为68fg；

实验组8中，模板的DNA含量为6.8fg；

空白对照组：用等体积水代替模板，作为空白对照。

(4)用于检测刺盘孢属真菌的实时荧光PCR反应条件：

依次95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。

实验结果如图4和图5所示。实验组1～8及空白对照组的3次重复实验的扩增曲线对比图如图4所示，结果表明，实验组1～6均显示阳性扩增曲线，即最低检测限为680fg模板DNA/体系。DNA模板浓度与Ct值的相关性如图5所示，可见模板浓度越高，Ct值越小。

实施例6实时荧光PCR检测样品中是否含有刺盘孢属真菌

本实施例提供本发明提供的鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物和探针以及检测方法在鉴定刺盘孢属真菌中的应用。

(1)待测菌DNA制备：

模拟环境样品，分别制备样品1和样品2

样品1：分别取如表3所示的28个菌株的DNA样品1μl放至1个新的离心管中，混匀，模拟环境样品的总DNA。然后从中取1μl DNA作为待检对象。用咖啡浆果刺盘孢IMI 319418的DNA作为阳性对照，Chordomyces antarcticus CBS 120045作为阴性对照，无菌水代替模板作为空白对照。

表3模拟环境微生物混合菌群的真菌物种信息

序号	菌株编号	物种	序号	菌株编号	物种
						1	CBS 120045	Chordomyces antarcticus	15	LC0185	Curvularia alcornii
2	CBS 428.76	Cylindrotrichum clavatum	16	LC0744	Diaporthe lithocarpus
						3	CBS 421.95	Kylindria peruamazonensis	17	LC6150	Diaporthe pseudophoenicicola
4	CBS 346.76	Monilochaetes guadalcanalensis	18	CGMCC 3.17536	Diaporthe compacta
						5	CBS 968.72	Musicillium theobromae	19	LC6154	Diaporthe unshiuensis
6	CBS 113362	Plectosphaerella alismatis	20	CBS 525.77	Didymella pinodes
						7	CBS 139623	Plectosphaerella populi	21	LC11639	Fusarium incarnatum
8	CBS 125296	Reticulascus clavatus	22	LC11735	Leptosphaeria spegazzinii
						9	CBS 101319	Reticulascus tulasneorum	23	LC11508	Penicillium chrysogenum
10	CBS 110278	Sodiomyces alkalinus	24	CBS 134.96	Phoma delphinii
						11	CBS 137618	Sodiomyces tronii	25	LC1636	Phoma segeticola
12	CBS 136360	Sporoschismopsis angustata	26	CBS 111645	Phyllosticta parthenocissi
						13	CBS 121802	Stachylidium bicolor	27	CBS 502.50	Septoria linicola
14	LC0224	Cercospora gossypi	28	LC11567	Verticillium dahliae

表3中CBS菌株来源于荷兰Westerdijk菌种保藏中心，CGMCC菌株来源于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，LC菌株为发明人分离鉴定，保藏于中国科学院微生物研究所蔡磊课题组

(http://www.mycolab.org.cn/templates/T_second/index.aspx？nodeid＝554)。

样品2：将10μl样品1(混合的28个菌株的DNA样品)转移至新的离心管中，然后加入随机挑选的如表4所示的15个刺盘孢属真菌的DNA样品(每个刺盘孢属菌株的DNA取1μl)，混匀，从中取1μl作为待检对象。用咖啡浆果刺盘孢IMI 319418的DNA作为阳性对照，Chordomyces antarcticus CBS 120045作为阴性对照，无菌水代替模板作为空白对照。

表4实施例6中用于检测的15个刺盘孢属真菌

序号	菌株编号	刺盘孢属物种	序号	菌株编号	刺盘孢属物种
						1	LC3649	C.acutatum	9	IMI 319418	C.kahawae subsp.kahawae
2	CGMCC 3.14356	C.boninense	10	CBS 523.97	C.lindemuthianum
						3	CGMCC 3.18118	C.camelliae-japonicae	11	CBS 132882	C.proteae
4	CGMCC 3.15106	C.caudasporum	12	CGMCC 3.14174	C.siamense
						5	LC3659	C.dematium	13	LC6284	C.truncatum
6	CBS 147945	C.falcatum	14	CBS 125478	C.vietnamense
						7	CBS 130416	C.fructicola	15	CBS 132135	C.yunnanense
8	CBS 953.97	C.gloeosporioides

表4中CBS菌株来源于荷兰Westerdijk菌种保藏中心，IMI菌株的DNA来源于英国微生物菌种保藏中心，LC菌株为发明人分离鉴定，保藏于中国科学院微生物研究所蔡磊课题组(http://www.mycolab.org.cn/templates/T_second/index.aspx？nodeid＝554)。

(2)用于检测刺盘孢属的引物探针组：

正向引物CLF：5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'(SEQ ID NO.1)；

反向引物CLR：5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'(SEQ ID NO.2)；

探针CLP：5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3'(SEQ ID NO.3)，探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。

(3)用于检测刺盘孢属的PCR反应体系：

反应体系(10μL)：5μL 2×

Universal PCR Master Mix，0.7μL引物CLF(10μmol/L)，0.7μL引物CLR(10μmol/L)，0.5μL探针CLP(10μmol/L)，1μL模板，用灭菌双蒸水补至10μL。反应体系中，引物CLF终浓度为0.7μmol/L，引物CLR终浓度为0.7μmol/L，探针CLP终浓度为0.5μmol/L。用等体积水代替模板作为空白对照。

(4)用于检测刺盘孢属的实时荧光PCR反应条件：

依次95℃反应10min，1个循环；95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。

实验结果表明，阳性对照以及含有刺盘孢属真菌DNA的样品2能够检测到阳性扩增曲线，阴性对照、空白对照以及不含有刺盘孢属DNA的样品1未检测到阳性扩增曲线。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 刺盘孢属特异性引物筛查检疫鉴定方法

<130> KHP191111415.4

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagggttaa acagcacgtg aaa 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattcaccgg acgcaagtct 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgttaaaagg gaagcgctt 19

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagggttaa acagcacgtg aaattgttaa aagggaagcg cttgtgacca gacttgcgtc 60

cggtgaatc 69

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagggttaa acagcacgtg aaattgttaa aagggaagcg cttgtgacca gacttgcgcc 60

cggtgaatc 69

Claims (7)

1.鉴定刺盘孢属真菌的特异性引物探针组合，其特征在于，包含特异性引物对和序列如SEQ ID NO.3所示的探针；所述特异性引物对包含序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

2.权利要求1所述的引物探针组合在制备鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒或鉴定刺盘孢属真菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定刺盘孢属真菌包括鉴定待测菌是否为刺盘孢属真菌或鉴定待测样品中是否含有刺盘孢属真菌。

4.一种鉴定刺盘孢属真菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物探针组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应缓冲液、Mg²⁺、DNA聚合酶、阳性模板中的一种或多种。

6.一种鉴定刺盘孢属真菌的方法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物探针组合进行PCR扩增，根据扩增产物判断所述待测样品是否为刺盘孢属真菌或所述待测样品是否含有刺盘孢属真菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系中，所述特异性引物对的浓度为0.4～0.9μM，所述探针的浓度为0.3～0.9μM。

Images