CN109863243A - 用于治疗粘多糖症的腺相关病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新型腺相关病毒衍生的载体和包含其的药物组合物，用于治疗溶酶体贮积症，并且特别是用于治疗粘多糖症ⅢD型。

Description

用于治疗粘多糖症的腺相关病毒载体
技术领域
本发明涉及用于所关注的蛋白质的表达的多核苷酸和载体及其在基因治疗中的应用。本发明还涉及有助于治疗粘多糖症(mucopolysaccharidoses)(MPS)、特别是用于治疗粘多糖症类ⅢD型(mucopolysaccharidoses type IIID)或圣菲利波综合症D型(Sanfilippo Dsyndrome)的载体和核酸序列。
背景技术
溶酶体是在动物细胞的细胞质中发现的细胞器，其包含超过50种水解酶，其在破坏的细胞组分的再循环期间或在吞噬病毒和细菌之后分解生物分子。该细胞器包含多种类型的水解酶，包括蛋白酶，核酸酶，糖苷酶，脂肪酶，磷脂酶，磷酸酶和硫酸酯酶。所有酶都是酸性水解酶。
溶酶体贮积症(LSD)是由影响一种或多种溶酶体酶的遗传缺陷引起的。这些遗传性疾病通常由溶酶体中存在的特定酶活性的缺乏引起。在较小程度上，这些疾病可能是由于溶酶体生物发生中涉及的蛋白质缺乏所致。
LSD是个体罕见的，尽管这些疾病作为一组在总人口中相对常见。LSD的总患病率为约每5,000活产儿中有1例。然而，总人口中的一些群体特别受到高发生率的LSD的折磨。例如，来自犹太中欧和东欧(德系)个体后代的戈谢病和泰萨克斯病(Gaucher and Tay-Sachs disease)的患病率分别为每600产儿中有1例和每3,900产儿中有1例。
粘多糖症(MPS)是七种(I-VⅡ)LSD疾病的组，其特征在于葡糖胺聚糖(GAG)代谢中涉及的特定溶酶体酶的缺失或缺乏。所有MPS都有一个常染色体隐性遗传模式，除了具有X染色体连锁遗传的MPSⅡ(亨特病)。
在7种MPS中，Ⅲ型粘多糖症(MPSⅢ或圣菲利波综合征)是最常见的，据报道，出生患病率范围为每100,000个产儿中有0.28至4.1例。该综合征是由参与GAG硫酸乙酰肝素(HS)降解的其中一种酶的缺乏引起的。已经定义了圣菲利波的四种亚型，每种亚型由不同酶的缺乏引起：A型(MPSⅢA)，B型(MPSⅢB)，C型(MPSⅢC)和D型(MPSⅢD)。已经鉴定了编码这些酶的基因并且已经报道了各种突变。
MPSⅢD是由N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶(GNS，EC 3.1.6.14)的活性缺乏引起的。GNS催化HS的N-乙酰基-D-葡糖胺6-硫酸酯单元的6-硫酸酯基团的水解。由于非降解性HS的持续积累，发生进行性细胞损伤，导致多***疾病。MPSⅢD是已知MPS中最罕见的形式，迄今为止在文献中仅描述了31名患者。已经在人GNS基因中鉴定出22种不同的突变，导致GNS酶活性的缺乏。
MPSⅢD患者似乎遵循圣菲利波综合征临床表现的一般模式，其特征在于进行性中枢神经***(CNS)变性和相对温和的体细胞疾病。在正常发育的早期阶段之后，疾病的最初迹象通常表现的形式为言语和发育迟缓。随后是在婴儿期出现其他症状，可能包括精神运动技能的进行性丧失，言语丧失，不安行为，多动，睡眠障碍，与环境接触丧失和精神发育迟滞。除神经症状外，MPSⅢD患者中还常见其他非神经性合并症，如上呼吸道感染，多毛症，巨头畸形，肝肿大，关节活动度降低和面部粗糙特征。最后，MPSⅢD演变为卧床不起的阶段。患者间的疾病进展速度和表型特征现状差异很大，报告的预期寿命范围从低至14岁到第四十年不等。这种可变性可能与多种因素有关，例如突变的性质，种族或患者接受的医疗保健的差异。
到目前为止，没有针对MPSⅢD的特定疗法，并且该疾病的控制是有征兆的并且旨在改善患者及其家属的生活质量。至于其他MPS，在过去数年中已有两种主要的治疗选择：酶替代疗法(ERT)和造血干细胞移植(HSCT)。基于正常细胞分泌大量甘露糖-6-磷酸酯(M6P)标记的可溶性溶酶体酶如GNS的事实，两种治疗策略的设计都依赖于交叉矫正(cross-correction)的可能性，其随后可通过质膜上的M6P受体通过其他细胞从细胞外区室取出，并靶向溶酶体。此外，存在残留酶活性的阈值，通常非常低，超过该阈值，细胞能够应对底物内流，并且受试者不受疾病的影响，表明恢复正常活性不是改变临床病程的必要条件。
对于MPSⅢD，已经在该疾病的山羊模型中测试了ERT，参见Thompson,et al.,JInherit Metab Dis.1992；15(5):760-8。在该研究中，在2、3和4周龄时，将1mg/Kg剂量的重组山羊GNS(rcGNS)静脉内施用于MPSⅢD山羊。最后一次给药后5天，在肝脏中观察到溶酶体贮积液泡和糖醛酸(GAG HS的成分)的量显著减少，通过输注rcGNS证明体细胞校正。形态学研究和糖醛酸的定量显示CNS没有改善。除了这项研究，到目前为止还没有进行过其他关于ERT对MPSⅢD疗效的研究。
具有人重组酶的ERT可商购获得用于MPSⅠ，Ⅱ和Ⅵ。报告的ERT的益处包括当静脉输注酶时，随着尿GAG***和肝脏及脾脏体积的减少，改善关节活动性，行走能力，肺和呼吸功能。然而，由于对输注的蛋白质超敏性，在静脉内产品给药期间医学支持必须可获得。这些可能危及患者生命的过敏反应，包括呼吸窘迫，缺氧，低血压，荨麻疹和/或咽喉或舌头血管性水肿，并可能需要干预，如复苏或急诊气管切开术，以及通过吸入β-肾上腺素能激动剂，肾上腺素或静脉注射皮质类固醇的治疗。ERT的其他缺点包括：1)在儿科患者中进行1-3小时长时间的静脉输注的困难性，其中许多患有精神疾病，2)患者可能对尚未知临床意义的酶的抗体呈阳性的事实，但可能会限制产品长期功效，以及3)治疗的高成本，其还包括家庭护理的成本。无论安全性的考虑或成本如何，在推荐剂量下，静脉注射ERT不能改善MPS神经疾病，因为酶不能有效地通过血脑屏障(BBB)。
静脉内递送ERT的替代方案是向脑脊液(CSF)提供外源酶以直接到达CNS。在MPSⅢA的动物模型中的实验，表明了向鞘内空间施用重组酶可以穿透脑组织并促进溶酶体贮存材料的清除并改善行为。已经对MPSⅢA(NCT01155778)和MPSⅡ(NCT00920647)进行了测试鞘内酶递送的临床试验。尽管存在鞘内ERT的潜在益处，但是治疗所需的永久性鞘内药物递送装置的植入与实质性风险和缺点相关，并且每位患者/年治疗本身具有非常高的经济成本。
使用骨髓衍生干细胞(骨髓移植，BMT)的造血干细胞移植(HSCT)已被证明在其他MPS患者的体细胞和神经病理学这两方面的治疗是有效的。通过HSCT进行校正的原理是供体单核细胞能够穿过毛细血管壁，甚至在BBB处，之后它们分化成组织巨噬细胞，在CNS的情况下为小胶质细胞，并分泌缺乏的酶以递送到各种细胞。然而，骨髓移植已被证明在MPSⅢ患者中是不成功的(即使在症状前阶段治疗)，并且它不被认为是对该疾病的治疗选择。关于脐带血衍生的干细胞移植，尚不清楚这种方法是否导致保护MPSⅢ患者的CNS免于变性。
底物剥夺治疗(SDT)旨在降低GAG合成的速率，因此，如果任何剩余活性残留，这可能足以防止GAG的过度积累或至少减缓积累速率。金雀异黄素(Genistein)是一种大豆异黄酮，被建议通过降低表皮生长因子受体(EGFR)的激酶活性来作为HS生产的抑制剂。参见Piotrowska E,et al.,Eur J Hum Genet.2006；14(7):846-52。最近的研究表明，金雀异黄素抑制患有各种粘多糖症的患者(Ⅰ型，Ⅱ型,ⅢA型和ⅢB型)的成纤维细胞中GAG的合成。参见Piotrowska E,et al.,同上。当静脉内施用时，预期金雀异黄素能够穿过BBB，允许治疗CNS病理。支持这一观点的是，一项开放标签试验研究，其中向5名MPSⅢA和5名MPSⅢB患者施用富含金雀异黄素的大豆提取物12个月，导致体细胞和神经学参数的显著改善。然而，随后的研究显示，在向MPSⅢA，MPSⅢB和MPSⅢC患者施用12个月的金雀异黄素后，失能量表(disability scale)和行为评分(behaviour score)都没有改善。
鉴于目前MPSⅢD治疗选择的局限性，需要替代方法。体内基因治疗提供了一次性治疗MPSⅢD和其他遗传性疾病的可能性，具有终身有益效果的前景。
特别地，腺相关病毒(AAV)载体介导的基因转移作为许多体内基因治疗应用的选择方法迅速出现，这归因于这些载体的高转导效率和缺乏致病性。AAV载体可以转导有丝***期后细胞，并且一些临床前和临床研究已经证明了AAV载体介导的基因转移的潜力，以有效地驱动对多种疾病的治疗性转基因的持续表达。
基于使用AAV的多种基因治疗方法已被证明对改善MPSⅢ小鼠模型的疾病是有效的。鉴于这些综合征的强神经变性成分，最相关的研究集中于向CNS递送治疗载体。在用甘露醇预处理以渗透BBB后，将编码N-乙酰氨基葡萄糖苷酶α(NAGLU)的AAV2载体单次静脉输注至MPSⅢB的小鼠模型导致显著延长的存活、改善的行为表现和脑溶酶体病理学的减少，虽然只实现了体细胞病理学的部分矫正。参见McCarty,et al.,Gene Ther.2009；16(11):1340-52。能够穿过BBB的静脉内施用的AAV9载体最近已证明在增加酶活性并促进CNS和身体器官中溶酶体贮积病理学的校正的方面是有效的，导致MPSⅢA和MPSⅢB小鼠模型中的改善的行为表现和寿命的延长。尽管实现CNS校正所需的剂量通常非常高，但目前正在进行使用给药于外周肢静脉的AAV9的MPSⅢA的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(NCT02716246)。
到达CNS的另一种方法是将AAV直接给予脑实质。已经在MPSⅢ的小鼠和狗模型中测试了AAV载体向脑中的立体定向给药。由于AAV从注射部位扩散有限，该方法需要多次注射以改善载体生物分布。尽管在用4次注射编码NAGLU的AAV5载体处理的MPSⅢB狗的整个脑中检测到酶活性，但溶酶体病理学得到改善但未完全校正，表明用该方法实现的酶活性水平不足以应对GAG储存。用编码磺酰胺酶和硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)的AAVrh10载体处理的MPSⅢA小鼠显示改善的硫酸乙酰肝素分解代谢和炎症减少的迹象，但仅在限制的或接近注射点的区域。参见Tardieu M,et al,.Hum Gene Ther.2014；25(6):506-16。尽管有这些限制，但分别使用AAVrh10和AAV5载体对MPSⅢA(NCT02053064)和MPSⅢB(ISRCTN19853672)进行了两项临床试验。脑越大，用实质内注射覆盖整个器官体积就越困难，并且向人类递送需要在多个部位载体给药，使得递送在技术上具有挑战性并且需要开发特定的外科手术程序。
尽管已经为其他形式的MPSⅢ开发了多种治疗策略，但是上述方法都没有应用于MPSⅢD。因此，需要用于治疗MPSⅢD的新方法。
发明内容
本发明提供了用于治疗粘多糖症，特别是粘多糖症ⅢD型(MPSⅢD)或圣菲利波D综合征的新型多核苷酸和载体。
在第一方面，本发明涉及包含表达盒的多核苷酸，其中所述表达盒包含与编码GNS蛋白的核苷酸序列或其功能等效变体可操作地连接的转录调控区。
在第二方面，本发明提供了含有根据本发明的多核苷酸的新载体。在一个具体实施例中，所述载体是用于治疗粘多糖症ⅢD型的新型重组载体。所述重组载体特别是腺相关病毒载体(AAV)。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的多核苷酸或载体。
此外，本发明的另一方面涉及本发明的多核苷酸或本文所述的载体，或本文所述的药物组合物，用作药物，特别是用于治疗粘多糖症ⅢD型。
本发明还提供了产生根据本发明的腺相关病毒载体的方法。
附图说明
图1.产生pAAV-CAG-hGNS和AAV9-CAG-hGNS。(A)质粒pAAV-CAG-hGNS及其组分的示意图。(B)含有hGNS编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图2.产生pAAV-CAG-ohGNS-型式1和AAV9-CAG-ohGNS-型式1。(A)质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式1及其组分的示意图。(B)含有ohGNS-型式1编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图3.产生pAAV-CAG-ohGNS-型式2和AAV9-CAG-ohGNS-型式2。(A)质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式2及其组分的示意图。(B)含有ohGNS-型式2编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图4.产生pAAV-CAG-ohGNS-型式3和AAV9-CAG-ohGNS-型式3。(A)质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式3及其组分的示意图。(B)含有ohGNS-型式3编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图5.产生pAAV-CAG-omGNS和AAV9-CAG-omGNS。(A)质粒pAAV-CAG-omGNS及其组分的示意图。(B)含有omGNS编码序列的腺相关载体的基因组的示意图。
图6.pAAV-CAG-hGNS，pAAV-CAG-ohGNS-型式1，pAAV-CAG-ohGNS-型式2和pAAV-CAG-ohGNS-型式3的体外测试。用4μg的pAAV-CAG-hGNS，pAAV-CAG-ohGNS-v1，pAAV-CAG-ohGNS-v2或pAAV-CAG-ohGNS-v3瞬时转染HEK293细胞。(A)来自不同构建体的GNS表达的定量RT-PCR定量。(B)和(C)通过不同表达盒介导的培养基或细胞提取物中GNS活性水平的比较。值是每种条件下3个孔的平均值±SEM。与用pAAV-CAG-hGNS转染的细胞相比，*P<0.05,***P<0.001。“NT”未转染。
图7.静脉内注射AAV-CAG-hGNS，AAV-CAG-ohGNS-型式1，AAV-CAG-ohGNS-型式2或AAV-CAG-ohGNS-型式3至MPSⅢD小鼠。(A)和(B)野生型(健康)小鼠(WT)，未经处理的Gns-/-小鼠和通过尾静脉注射接受AAV9-CAG-hGNS，AAV-CAG-ohGNS-型式1，AAV-CAG-ohGNS-型式2或AAV-CAG-ohGNS-型式3载体的1×1010载体基因组的Gns-/-小鼠的肝脏和血清中的GNS活性。(C)与(A)中相同组群的肝脏中葡糖胺聚糖(GAG)的定量。值是每组2-5只动物的平均值±SEM。对于血清，AAV-CAG-ohGNS-型式1的n＝1。与用AAV-CAG-hGNS处理的Gns-/-小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图8.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。野生型(健康)小鼠(WT)，未经处理的Gns-/-小鼠和用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或AAV9-CAG-omGNS通过脑池内(IC)注射在CSF中施用的Gns-/-小鼠大脑中的GNS活性。WT GNS活性设定为100％。值是每组4-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-小鼠相比，*P<0.05。
图9.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送至雄性小鼠。(A)野生型(健康)小鼠(WT)和未治疗的Gns-/-雄性小鼠和使用5x1010vg的对照载体(AAV9-null)或5x1010vg的AAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的大脑不同部位(Ⅰ-Ⅴ部分)中葡糖胺聚糖(GAG)的定量。(B)在与(A)中相同的动物群体中染色溶酶体标记物LAMP-2后，在脑的不同区域中获得的信号强度的定量。(C)从与(A)中相同的动物群体获得的脑提取物中的其他溶酶体酶的活性。IDUA，艾杜糖苷酶，α-L-，GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶，GUSB，葡糖醛酸酶，β，B-HEXO，己糖胺酶B。值是每组4-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，**P<0.01,***P<0.001。
图10.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送至雄性小鼠。短期研究。6个月大的健康野生型(WT)雄性小鼠和在2个月龄时用5×1010vg的AAV9-Null或AAV9-Gns载体注射的Gns-/-同窝小鼠的大脑皮质的超微结构分析。治疗载体的递送完全清除了扩大的溶酶体(由白色箭头指示)的外周神经元胶质细胞(由星号表示)。比例尺：10μm。
图11.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送至雄性鼠。短期研究。(A和B)直方图表示在来自野外型(健康)和使用5x1010vg对照载体(AAV-null)或5x1010vg AAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的额叶，顶叶和枕叶皮质，上丘和丘脑的切片中对星形胶质细胞标记物GFAP(A)和小胶质细胞标记物BSI-B4(B)进行免疫染色后测量的信号强度。结果显示为每组5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，**P<0.01,****P<0.0001。
图12.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。野生型(健康)小鼠，未经治疗的Gns-/-雄性小鼠和使用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或AAV9-CAG-omGNS通过脑池内(IC)注射，在CSF中施用的Gns-/-雄性小鼠的肝脏中GNS活性。WT GNS活性设定为100％。值是每组4-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，***P<0.001。
图13.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。循环中的GNS活性—表示为6个月大的雄性小鼠中WT活性的百分比，即在向GNS缺陷动物的CSF中递送5×1010vgAAV9-CAG-omGNS或AAV9-Null后4个月。年龄匹配的未处理的Gns-/-小鼠也作为对照。WT GNS活性设定为100％。值是每组5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，***P<0.001。
图14.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。(A)野生型(健康)小鼠，未经治疗的Gns-/-雄性小鼠或使用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的身体器官中糖胺聚糖(GAG)的定量。(B)从与(A)中相同的动物群获得的肝提取物中的其他溶酶体酶的活性。IDUA，艾杜糖苷酶，α-L-，SGSH，N-磺基葡糖胺磺基水解酶，NAGLU，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，α，HGSNAT，乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶，GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶，GUSB，葡萄糖醛酸酶，β，B-HEXO，己糖胺酶B。WT酶活性设定为100％。值是每组4-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图15.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。野生型(健康)，未治疗的Gns-/-雄性小鼠和使用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5×1010vg的AAV9-CAG-omGNS载体在2个月龄时在CSF中施用的Gns-/-雄性小鼠中，相对于全身体重的肝脏(A)和脾脏(B)的湿重，并在4个月后进行分析。值是n＝8-13只动物/组的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，***P<0.001。
图16.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。通过透射电子显微镜分析从6个月大的健康WT和在CSF中施用5x1010vg的(null)空对照载体(AAV9-Null)或等效剂量的编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的载体的Gns-/-雄性小鼠获得的器官的肝细胞(肝)和纤毛支气管细胞(肺)的超微结构。扩大的溶酶体由箭头指示。比例尺：肝脏，10μm；肺，5μm。
图17.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。短期研究。通过旷场试验评估纯野生型(健康)，未处理的Gns-/-雄性小鼠和在2个月龄时在CSF中施用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5×1010vg的AAV9-CAG-omGNS载体的Gns-/-雄性小鼠的运动和探索活性，并在4个月后进行分析。行走的总距离，间歇时间(休息时间，restingtime)。结果显示为平均值±SEM，每组n＝15-18只动物。
图18.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送-长期研究。(A)在野生型(健康)小鼠(WT)和未处理的Gns-/-雄性小鼠和使用5x1010vg对照载体(AAV9-null)或5x1010vgAAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠中的脑的不同部分(第Ⅰ-Ⅳ部分)中葡糖胺聚糖(GAG)的定量。小鼠在2个月龄时进行处理并在10个月后进行分析。值是每组5只小鼠的平均值±SEM。(B)直方图表示在用识别溶酶体标记物LAMP-2的抗体染色脑切片后，在脑的不同区域中获得的信号强度。值是每组3-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图19.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。(A和B)对在来自野生型(健康)和在2个月龄时使用5x1010vg对照载体(AAV-null)或5x1010vgAAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的额叶，顶叶和枕叶皮层，上丘和丘脑的切片中的星形胶质细胞标记物GFAP(A)和小胶质细胞标记物BSI-B4(B)免疫染色后测量的信号强度的定量，并在10个月后进行分析。结果显示为每组3-5只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图20.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。(A)来自野生型(健康)和未处理的Gns-/-雄性小鼠或使用5x1010vg对照载体(AAV-null)或5x1010vg AAV9-CAG-omGNS在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的身体器官中糖胺聚糖(GAG)的定量。小鼠在2个月龄时进行处理，并在10个月后进行分析。(B)溶酶体酶的活性不受从与(A)中相同的动物群获得的肝提取物中的突变影响。IDUA，艾杜糖苷酶，α-L-，SGSH，N-磺基葡糖胺磺基水解酶，NAGLU，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，α，HGSNAT，乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶，GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶，GUSB，葡萄糖醛酸酶，β，B-HEXO，己糖胺酶B。WT酶活性设定为100％。值是每组4-8只小鼠的平均值±SEM。与用AAV9-Null处理的Gns-/-雄性小鼠相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
图21.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。旷场试验评估天然野生型(健康)，未处理的Gns-/-雄性小鼠和在2个月龄时在CSF中施用5x1010vg对照载体(AAV9-Null)或5x1010vg AAV9-CAG-omGNS载体的Gns-/-雄性小鼠的运动和探索活性，并在10个月后进行分析。行驶总距离，间歇时间和饲养总数。结果显示为平均值±SEM，每组n＝5-15只动物，与Gns-/-雄性小鼠相比，*P<0.05。
图22.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。野生型(健康)小鼠(WT)和使用5x1010vgAAV9-CAG-omGNS通过脑池内(IC)注射，在CSF中施用的Gns-/-小鼠的脑中的GNS活性。WT GNS活性设定为100％。在22个月龄时分析活性，即载体施用后20个月。值是每组4只小鼠的平均值±SEM。
图23.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。(A)野生型(健康)小鼠(WT)和使用5×1010载体基因组的AAV9-CAG-omGNS载体在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的脑中的糖胺聚糖(GAGs)含量。在载体递送后20个月进行分析。(B)在对与(A)中相同的动物群中溶酶体标记物LAMP-2染色后，脑的不同区域的信号强度的定量。(C)从与(A)中相同的动物群获得的脑提取物中的其他溶酶体酶的活性。GALNS半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶，GUSB，葡糖醛酸糖苷酶，β，B-HEXO，己糖胺酶B。值是每组4只小鼠的平均值±SEM。
图24.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。评估来自野生型(健康)和使用AAV9-CAG-omGNS载体的5×1010载体基因组在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的脑切片中的神经炎症，并在20个月后进行分析。直方图代表星形胶质细胞标记物GFAP(A)和小胶质细胞标记物BSI-B4(B)在额叶，顶叶和枕叶皮层，上丘和丘脑的部分中的信号强度。结果显示为每组4只小鼠的平均值±SEM。
图25.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。长期研究。来自野生型(健康)小鼠和在2个月龄时使用AAV9-CAG-omGNS载体的5×1010载体基因组在小脑延髓池中施用的Gns-/-雄性小鼠的身体器官中糖胺聚糖(GAG)的定量，并在22个月龄时进行分析。结果显示为每组4只小鼠的平均值±SEM。
图26.编码优化的鼠GNS(AAV9-CAG-omGNS)的AAV9载体的CSF内递送。Kaplan-Meier分析野生型(健康)，未处理的Gns-/-和在2个月龄时使用5×1010vg对照载体(AAV9-Null)或5×1010vg AAV9-CAG-omGNS载体在CSF中施用的Gns-/-雄性小鼠的存活率。对于WT，n＝20，对于未处理的Gns-/-小鼠n＝19，对于AAV9-空注射的Gns-/-小鼠n＝19，并且对于AAV9-CAG-omGNS注射的Gns-/-小鼠n＝20。
微生物保藏
质粒pAAV-CAG-hGNS(SEQ ID NO:5)，pAAV-CAG-ohGNS-型式1(SEQ ID NO:6)，pAAV-CAG-ohGNS-型式2(SEQ ID NO:7)和pAAV-CAG-ohGNS-型式3(SEQ ID NO:8)于2016年7月21日分别以登录号DSM 32342，DSM 32343，DSM 32344和DSM 32345存放在DSMZ–DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,Inhoffenstraβe 7B,D-38124Braunschweig,Federal Republic of Germany(德意志联邦共和国)。
定义
术语“核苷酸序列”或“分离的核苷酸序列”或“多核苷酸序列”或“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且分别指含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核酸分子，DNA或RNA。核酸可以是双链的，单链的，或含有双链或单链序列的部分。
术语“序列一致性％”，“一致性％”或“序列同源性％”是指在比对序列以实现最大序列一致性％后，与参考序列中的核苷酸或氨基酸相同的候选序列的核苷酸或氨基酸的百分比。在优选的实施例中，基于两个给定的SEQ ID NO或其部分的全长计算序列一致性。序列一致性％可以通过本领域建立的任何方法或算法确定，例如ALIGN，BLAST和BLAST 2.0算法。参见Altschul S,et al.,Nuc Acids Res.1977；25:3389-3402和Altschul S,etal.,JMol Biol.1990；215:403-410。
本文中，计算“序列一致性％”，“一致性％”或“序列同源性％”：将参考序列和候选序列比对后一致的核苷酸或氨基酸数除以参考序列中的核苷酸或氨基酸总数，并将结果乘以100。
任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，正如本领域技术人员清楚的。保守氨基酸取代是基于具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组包括甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组包括丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组包括天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组包括赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组包括半胱氨酸和甲硫氨酸。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中已除去所公开序列中的至少一个残基并在其位置***不同残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala至Ser；Arg至Lys；Asn至Gln或His；Asp至Glu；Cys至Ser或Ala；Gln至Asn；Glu至Asp；Gly至Pro；His至Asn或Gln；He至Leu或Val；Leu至He或Val；Lys至Arg；Gln至Glu；Met至Leu或He；Phe至Met、Leu或Tyr；Ser至Thr；Thr至Ser；Trp至Tyr；Tyr至Trp或Phe；和Val至He或Leu。
术语“编码”或“编码的”是指遗传密码，其决定核苷酸序列如何翻译成多肽或蛋白质。序列中核苷酸的顺序决定了沿着多肽或蛋白质的氨基酸顺序。
术语“蛋白质”是指由一个或多个氨基酸或多肽的线性链组成的大分子。蛋白质可能经历翻译后修饰，例如半胱氨酸残基至3-氧代丙氨酸的转化，糖基化或金属结合。蛋白质的糖基化是添加与氨基酸链共价连接的不同碳水化合物。
如本文所用，术语“转录调控区”是指能够调节一种或多种基因表达的核酸片段。本发明的多核苷酸的调控区可以包括启动子，加上响应序列，活化子和增强子序列，用于结合转录因子以帮助RNA聚合酶结合并促进表达，以及与阻遏蛋白结合以阻断RNA聚合酶附着并阻止表达的操纵子或沉默子序列。
术语“启动子”必须理解为用于控制一种或多种多核苷酸转录的核酸片段，例如，编码序列，其位于多核苷酸序列的5'上游，并且其通过存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点，转录起始位点和(但不限于)转录因子，阻遏子和本领域已知的任何其他核苷酸序列的结合位点进行结构鉴定，以直接或间接地起作用来调控来自启动子的转录量。
当启动子可以使用基因构建体在表达***中启动所述核苷酸序列的转录时(所述基因构建体包含使用合适的测定法，如RT-qPCR或Northern印迹(转录物的检测)，与感兴趣的核苷酸序列可操作地连接的所述启动子)，所述启动子被认为是活性的或被称为驱动与其可操作地连接的核苷酸序列的表达。还可以使用针对编码蛋白的合适测定法例如Western印迹或ELISA，在蛋白质水平下评估所述启动子的活性。如果可以检测到转录物，或者如果发现与使用构建体的转录相比(所述构建体唯一的不同之处在于它不含所述启动子)，转录物或蛋白质水平增加至少5％，10％，15％，20％，30％，40％60％，70％，80％，90％，100％，200％，300％，500％，1000％，1500％或2000％，则启动子被认为能够启动转录。
术语“组成型”启动子是指在大多数生理和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是优选根据生理或发育条件调控的启动子。诱导型启动子在药物递送或光照后可能是有活性的。因此，“组成型”启动子不受“诱导型”启动子意义的调控。“组织特异性”启动子优选在特定类型的细胞/组织中有活性。与“组织特异性”启动子相反，在本发明的上下文中使用的启动子是“广泛(ubiquitous)”启动子。广泛启动子可以定义为在许多或任何不同组织中有活性的启动子。通常，在上下文中“许多”意味着超过5或至少6，10，15，20或5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20种不同的组织。
术语“CAG”启动子是指包含鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子的启动子(Alexopoulou A.et al.BMC Cell Biology 2008；9(2):1-11)。更确切地说，所述CAG启动子包含(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白启动子，(iii)鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子，和(iv)兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3。
术语“可操作地连接”是指启动子序列相对于所关注的基因的功能关系和位置(例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接)。通常，可操作地连接的启动子与所关注的序列邻接。然而，增强子不必与所关注的序列邻接以控制其表达。
如本文所用，术语“转录后调控区”是指促进盒中包含的序列或所得基因产物的表达，稳定化或定位的任何多核苷酸。
如本文所用，术语“载体”是指能够将一种或多种所关注的多核苷酸递送和任选地表达到宿主细胞中的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体，裸DNA或RNA表达载体，质粒，粘粒或噬菌体载体，与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞，如生产者细胞。载体可以是稳定的并且可以自我复制。关于可以使用的载体类型没有限制。载体可以是克隆载体，适于繁殖和获得与多种外源生物合并的多核苷酸，基因构建体或表达载体。合适的载体包括原核表达载体(例如pUC18，pUC19，Bluescript及其衍生物)，mpl8，mpl9，pBR322，pMB9，CoIE1，pCR1，RP4，噬菌体和穿梭载体(例如pSA3和pAT28)，和基于病毒载体(例如腺病毒，腺相关病毒以及逆转录病毒和慢病毒)的真核表达载体，以及非病毒载体，例如pSilencer 4.1-CMV(LifeTechnologies Corp.,Carslbad,CA,美国)，pcDNA3，pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo，pCR3.1，pEFl/His，pIND/GS，pRc/HCMV2，pSV40/Zeo2，pTRACER-HCMV，pUB6/V5-His，pVAXl,pZeoSV2，pCI，pSVL和pKSV-10，pBPV-l，pML2d和pTDTl。
术语“重组质粒”或“质粒”是指通过能够将所关注的遗传物质转移至细胞的基因工程技术获得的小的，环状的，双链的，自我复制的DNA分子，其导致产生由靶细胞中的所述遗传物质(例如蛋白质多肽，肽或功能性RNA)编码的产物。此外，术语“重组质粒”或“质粒”还指通过在制备作为重组载体基因组的载体的病毒载体期间使用的基因工程技术获得的小的，环状的，双链的，自我复制的DNA分子。
术语“重组病毒载体”或“病毒载体”是指通过能够将所关注的遗传物质(例如DNA或RNA)转移至细胞的基因工程技术从天然存在的病毒获得的试剂，其导致产生由靶细胞中的所述遗传物质(例如蛋白质多肽，肽或功能性RNA)编码的产物。
术语“腺相关病毒”，“AAV病毒”，“AAV病毒粒子”，“AAV病毒颗粒”和“AAV颗粒”，在本文中用作同义词，是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选由特定AAV血清型的所有衣壳蛋白组成)和对应于AAV基因组的包封的多核苷酸组成的病毒颗粒。野生型AAV是指属于依赖病毒属细小病毒科(genus Dependovirus,family Parvoviridae)的病毒。野生型AAV基因组的长度约为4.7Kb，并且由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，其可以是正义的或反义的。野生型基因组包括在DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)和三个开放阅读框(ORF)。ORF rep编码AAV生命周期所必需的四种Rep蛋白。ORF cap包含编码以下衣壳蛋白的核苷酸序列：VP1，VP2和VP3，其相互作用形成二十面体对称的衣壳。最后，与Cap ORF重叠的AAP ORF编码看似促进衣壳组装的AAP蛋白。如果颗粒包含侧翼为AAV ITR的外源多核苷酸(即不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或“AAV病毒载体”或“AAV载体”。本发明还包括也被称为dsAAV或scAAV的双链AAV的用途。
如本文所用，术语“腺相关病毒ITR”或“AAV ITR”是指存在于AAV基因组的DNA链两端的反向末端重复。ITR序列是AAV基因组有效增殖所需的。这些序列的另一个特性是它们形成发夹结构的能力。该特征有助于它们的自我引发(self-priming)，其允许第二DNA链的不依赖于引物酶的合成。ITR也被证明是所需要的，其用于将野生型AAV DNA整合到宿主细胞基因组中(例如血清型2AAV的人类第19染色体中)并从其中拯救，以及用于将AAV DNA有效衣壳化成完全组装的脱氧核糖核酸酶抗性AAV颗粒。ITR序列长约145bp。优选地，ITR的整个序列用于AAV病毒载体的基因组中，尽管这些序列的某种程度的微小修饰是允许的。野生型ITR序列可以通过***，缺失或截短来改变，只要ITR介导所需的功能，例如，复制，缺口，病毒包装，整合和/或原病毒拯救等。用于修饰这些ITR序列的方法是本领域所熟知的。ITR可以来自任何野生型AAV，包括但不限于血清型1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12或任何其他已知或之后发现的AAV。AAV包括两个ITR，它们可以相同或不同。此外，两种AAV ITR可以来自与AAV衣壳相同的AAV血清型，或者可以是不同的。在优选的实施例中，5'和3'AAV ITR衍生自AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV7，AAV8和/或AAV9。优选地，ITR来自AAV2，AAV8和/或AAV9，AAV2是最优选的。在一个实施例中，选择AAV2ITR以产生假型AAV(即具有衍生自不同血清型的衣壳和ITR的AAV)。
如本文所用，表述“重组病毒基因组”是指AAV基因组，其中至少一种外源多核苷酸***天然存在的AAV基因组中。根据本发明的AAV的基因组通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复序列(ITR)和表达盒。
术语“基因疗法”是指将所关注的遗传物质(例如DNA或RNA)转移到细胞中以治疗或预防遗传或获得性疾病或病症。所关注的遗传物质编码其体内生产是令人希望的产物(例如蛋白质多肽，肽或功能性RNA)。例如，所关注的遗传物质可以编码具有治疗价值的酶，激素，受体或多肽。
如本文所用，术语“转导”或“转导了”是指通过病毒载体将外源核苷酸序列引入细胞的过程。
如本文所用，术语“转染”是指通过非病毒方法故意地将纯化的核酸引入真核细胞的过程。
如本文所用，术语“处理”或“治疗”是指施用本发明的化合物或组合物以控制疾病的进展。控制疾病进展被理解为实现有益或期望的临床结果，其包括但不限于症状的减轻，疾病持续时间的减少，病理状态的稳定(特别是为了避免额外的恶化)，疾病进展的延迟，病理状态的改善，和缓解(部分和全部)。与如果不进行治疗的预期存活相比，疾病进展的控制还涉及存活的延长。
术语“有效量”是指足以实现预期目的的物质的量。例如，用于增加N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)活性的AAV9载体的有效量是足以减少葡糖胺聚糖积累的量。用于治疗疾病或病症的表达载体的“治疗有效量”是足以减少或根除疾病或病症的迹象和症状的表达载体的量。给定物质的有效量将随如物质的性质，给药途径，接受该物质的动物的体型和种类以及给予该物质的目的等因素而变化。在每个个体情况下的有效量可以由技术人员根据本领域已建立的方法凭经验确定。
术语“个体”是指哺乳动物，优选人或非人哺乳动物，更优选小鼠，大鼠，其他啮齿动物，兔，狗，猫，猪，牛，马或灵长类动物，进一步更优选人。
具体实施方式
本发明提供了用于治疗粘多糖症，特别是粘多糖症Ⅲ型(mucopolysaccharidosestype III)(MPSⅢD)或圣菲利波D综合征(Sanfilippo D syndrome)的新型多核苷酸和载体。
因此，在第一方面，本发明涉及包含表达盒的多核苷酸(下文称为“本发明的多核苷酸”)，其中所述表达盒包含与编码GNS蛋白或其功能等效变体的核苷酸序列可操作地连接的转录调控区。
如前所述，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶(GNS)是在所有细胞中发现的溶酶体酶。它参与糖胺聚糖(GAG)硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)(HS)的分解代谢。该酶催化硫酸乙酰肝素的N-乙酰基-D-葡糖胺-6-硫酸酯单元的6-硫酸酯基团的水解。这种酶的缺乏导致未降解的底物积累和溶酶体贮积症粘多糖症ⅢD型(圣菲利波D综合征)。
本发明还考虑了编码本领域已知的GNS变体和片段的多核苷酸序列。因此，本发明应被解释为包括编码GNS功能等效变体的DNA。
如本文所用，术语“功能等效变体”是指与上文定义的GNS序列基本同源并且保留GNS的生物学活性的任何多肽。这些功能等效变体的序列可以通过***，取代或缺失一个或多个氨基酸从如上定义的GNS序列获得，并且基本上保留GNS的生物学活性。用于确定变体是否保留天然GNS的生物活性的方法是本领域技术人员公知的，并且包括在所述申请的实验部分中使用的任何测定法。特别地，本发明考虑的GNS功能等效变体具有GNS的至少一种功能，例如，正常化(normalize)或降低(reduce)糖胺聚糖(GAG)水平，特别是HS水平。
如本发明所附的实施例所示，GNS的优化或非优化编码序列已用于治疗MPSⅢD动物。结果显示载体施用后GNS活性恢复，其导致在动物模型中分析的所有中枢神经***区域中疾病的底物积累(GAG)特征几乎完全正常化。
适用于确定降低或正常化GAG水平的能力的方法详述于本发明的实施例部分。
在一个优选的实施例中，如果多肽显示出如上所述的功能，特别是如果它能够具有GNS野生型多肽能力至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％，能够水解硫酸乙酰肝素的N-乙酰基-D-葡糖胺6-硫酸酯单元的6-硫酸酯基团，则该多肽被认为是GNS的功能等效变体。
GNS的功能等效变体是与天然GNS基本同源的多肽。表述“基本上同源的(substantially homologous)”是指当所述蛋白质序列与GNS野生型序列具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的一致性程度时的蛋白质序列。使用本领域技术人员公知的计算机算法和方法确定两种多肽之间的一致性程度。两个氨基酸序列之间的一致性优选通过使用BLASTP算法[BLASTManual,Altschul,S.,et al,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]确定，尽管也可以使用其他类似的算法。
GNS的功能等效变体可以通过替换其编码多核苷酸内的核苷酸来获得，从而解释用于产生GNS的宿主细胞中的密码子偏好。
GNS的功能等效变体可以通过进行保守氨基酸改变并在上述功能测定之一或本领域已知的其他功能测定中测试所得变体来产生。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
在本发明的一个具体实施例中，编码本发明多核苷酸中包含的GNS蛋白或其功能等效变体的核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有70％至85％的一致性。在一个更具体的实施例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有75％至85％的一致性。在甚至更优选的实施例中，所述序列与SEQ ID NO:1具有75％至80％的一致性。在一个优选的实施例中，所述GNS核苷酸序列选自由SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组。
在本发明的另一个实施例中，由本发明的多核苷酸编码的GNS蛋白选自由人GNS和小鼠GNS组成的组。
形成本发明多核苷酸的一部分的表达盒可以进一步包含表达控制序列，其包括但不限于合适的转录调控序列(即起始，终止，启动子和增强子)，有效的RNA加工信号(例如剪接和多腺苷酸化(polyA)信号)，稳定细胞质mRNA的序列，增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)，增强蛋白质稳定性的序列，以及当需要时增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列是本领域已知的，并且可以根据本发明被使用。
根据本发明，本发明的多核苷酸包含表达盒，其中所述表达盒包含与编码GNS的核苷酸序列可操作地连接的转录调控区。在本发明的一个具体实施例中，所述转录调控区包含启动子。在本发明的另一个具体实施例中，本发明多核苷酸的转录调控区还包含与启动子可操作地连接的增强子。在更具体的实施例中，所述启动子是组成型启动子。在优选的实施例中，所述启动子是如SEQ ID NO:15所示的CAG启动子。
在另一个实施例中，表达盒的侧翼为AAV ITR。在一个更具体的实施例中，所述AAVITR是AAV2ITR。
本发明的多核苷酸的表达盒包含编码GNS的核苷酸序列或其功能等效变体。在一个实施例中，所述核苷酸序列是编码人GNS的核苷酸序列，其对应于登录号为NM_002076.3的NCBI数据库的序列，更具体地，它是SEQ ID NO:1。在一个优选的实施例中，核苷酸序列是编码人GNS的核苷酸序列的变体，优选是选自由SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的序列。
在另一个实施例中，形成本发明多核苷酸的一部分的表达盒还包含转录后调控区。如本文所用，术语“转录后调控区”是指有助于盒或所得基因产物中包含的序列的表达，稳定化或定位的任何多核苷酸。转录后调控区可以是，但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后区(Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptional region)(WPRE)。如本文所用，术语“土拨鼠乙型肝炎病毒后调控元件(woodchuck hepatitis B virus post-regulatoryelement)”或“WPRE”是指DNA序列，其在转录时产生能够增强基因表达的三级结构。
在另一个实施例中，表达盒还包含多腺苷酸化信号。
如本文所用，术语“多腺苷酸化信号”是指介导多腺嘌呤尾与mRNA的3'末端连接的核酸序列。合适的多腺苷酸化信号包括，但不限于SV40早期多腺苷酸化信号，SV40晚期多腺苷酸化信号，HSV胸苷激酶多腺苷酸化信号，鱼精蛋白基因多腺苷酸化信号，腺病毒5Elb多腺苷酸化信号，牛生长激素多腺苷酸化信号，人变异生长激素多腺苷酸化信号，兔β-球蛋白poly A信号等。在一个具体实施例中，多腺苷酸化信号是兔β-球蛋白poly A信号或其功能变体和片段。
本发明的多核苷酸可以结合到载体中。因此，另一方面，本发明涉及载体，本文中称为“本发明的载体”，其含有本发明的多核苷酸。在一个具体实施例中，所述载体是质粒。在另一个具体实施例中，所述载体是AAV载体，所述AAV载体含有包含根据本发明的多核苷酸的重组病毒基因组。
在本发明的多核苷酸的上下文中公开的所有实施例也适用于本发明的载体。
在一个更具体的实施例中，所述载体选自由以下各项组成的组：质粒pAAV-CAG-hGNS，登录号DSM 32342，如SEQ ID NO:5所示，质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式(version)1，登录号DSM 32343，如SEQ ID NO:6所示，质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式2，登录号DSM 32344，如SEQID NO:7所示，和质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式3，登录号为DSM 32345，如SEQ ID NO:8所示。
在另一个具体实施例中，本发明涉及腺相关病毒载体AAV载体，所述AAV载体含有重组病毒基因组，其中所述重组病毒基因组包含多核苷酸，其包含表达盒，所述表达盒包含与编码GNS的核苷酸序列或其功能等效变体可操作地连接的转录调控区。
根据本发明的AAV包括已知血清型AAV的任何血清型。通常，AAV的不同血清型具有显著同源性的基因组序列，提供相同系列的遗传功能，产生在物理和功能方面基本相同的病毒粒子，并通过实际上相同的机制复制和组装。特别地，本发明的AAV可以属于AAV(AAV1)，AAV2，AAV3(包括3A型和3B型)，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV，绵羊AAV和任何其他AAV的血清型1。不同AAV血清型的基因组序列的实例可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见GenBank登录号AF028704.1(AAV6)，NC006260(AAV7)，NC006261(AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在一个优选的实施例中，本发明的AAV载体是选自由AAV2，AAV5，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10和AAVrh10血清型组成的组的血清型。在一个优选的实施例中，本发明的所述AAV载体具有血清型9，AAV9。
在一个具体实施例中，所述AAV载体含有人或鼠GNS序列。在一个更具体的实施例中，根据本发明的AAV载体包含编码与SEQ ID NO:1具有70％至85％一致性的核苷酸序列的GNS。在一个更具体的实施例中，所述GNS编码核苷酸序列选自由SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组。
在一个具体实施例中，表达盒中的转录调控区包含启动子。在一个更具体的实施例中，所述启动子是组成型启动子。在一个更具体的实施例中，所述启动子是如SEQ ID NO:15所示的CAG启动子。
在本发明的另一个具体实施例中，AAV载体是AAV9-CAG-hGNS，SEQ ID NO:9，其含有与CAG启动子连接的核苷酸序列SEQ ID NO:1。在另一个实施例中，AAV载体是AAV9-CAG-ohGNS-型式1，SEQ ID NO:10，其含有与CAG启动子连接的核苷酸序列SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，AAV是AAV9-CAG-ohGNS-型式2，SEQ ID NO:11，其含有与CAG启动子连接的核苷酸序列SEQ ID NO:3。在另一个实施例中，AAV载体是AAV9-CAG-ohGNS-型式3，SEQ ID NO:12，其含有与CAG启动子连接的核苷酸序列SEQ ID NO:4。
在一个优选的实施例中，本发明的AAV含有重组病毒基因组，其包含含有表达盒的核苷酸序列，所述表达盒包含在5'至3'方向的，(i)5'AAV2ITR，(ii)CMV即刻早期增强子，(iii)鸡B-肌动蛋白启动子，(iv)鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子，(v)来自兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3，(vi)GNS cDNA或其功能等效变体，(vii)poly A信号，例如兔β-球蛋白poly A信号，和(viii)3'AAV2ITR。本领域技术人员将理解，载体基因组可包含其他序列(例如上文具体描述的序列之间的间插序列(intervening sequence))。组分(i)至(v)具有本领域技术人员通常理解的含义。
在一个优选的实施例中，重组病毒基因组包含核苷酸序列SEQ ID NO:9。具体地，5'AAV ITR包含核苷酸1-120，CMV增强子包含核苷酸194-557，B-肌动蛋白启动子包含核苷酸558-839，鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子包含核苷酸840-1804，来自兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3包含核苷酸1805-1906，人GNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信号包含核苷酸3619-4147，并且3'AAV2ITR包含SEQ ID NO:5的核苷酸4206-4313。
在一个优选的实施例中，重组病毒基因组包含核苷酸序列SEQ ID NO:10。具体地，5'AAV ITR包含核苷酸1-120，CMV增强子包含核苷酸194-557，B-肌动蛋白启动子包含核苷酸558-839，鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子包含核苷酸840-1804，来自兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3包含核苷酸1805-1906，人GNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信号包含核苷酸3619-4147，并且3'AAV2ITR包含SEQ ID NO:6的核苷酸4206-4313。
在一个优选的实施例中，重组病毒基因组包含核苷酸序列SEQ ID NO:11。具体地，5'AAV ITR包含核苷酸1-120，CMV增强子包含核苷酸194-557，B-肌动蛋白启动子包含核苷酸558-839，鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子包含核苷酸840-1804，来自兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3包含核苷酸1805-1906，人GNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信号包含核苷酸3619-4147，并且3'AAV2ITR包含SEQ ID NO:7的核苷酸4206-4313。
在一个优选的实施例中，重组病毒基因组包含核苷酸序列SEQ ID NO:12。具体地，5'AAV ITR包含核苷酸1-120，CMV增强子包含核苷酸194-557，B-肌动蛋白启动子包含核苷酸558-839，鸡β-肌动蛋白基因的第一内含子包含核苷酸840-1804，来自兔β-球蛋白基因的内含子2/外显子3包含核苷酸1805-1906，人GNS cDNA包含核苷酸1934-3592，兔β-球蛋白poly A信号包含核苷酸3619-4147，并且3'AAV2ITR包含SEQ ID NO:8的核苷酸4206-4313。
修饰的AAV序列也可用于本发明的上下文中。这种修饰序列，例如包括与已知的任何血清型的AAV ITR或VP具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或更多的核苷酸和/或氨基酸序列一致性的序列(例如具有约75-99％核苷酸或氨基酸序列一致性的序列)，并保持所述组分的功能。用于确定AAV ITR或VP的功能的测定法是本领域已知的。可以使用所述修饰序列代替野生型AAV ITR或VP序列。
本发明的AAV载体包含来自任何血清型的衣壳。通常，不同的AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供相同组的遗传功能，产生在物理和功能方面基本相同的病毒粒子，并且通过实际上相同的机制复制和组装。特别地，本发明的AAV可以属于AAV(AAV1)，AAV2，AAV3(包括3A型和3B型)，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，禽AAV，牛AAV，犬AAV，马AAV，绵羊AAV和任何其他AAV的血清型1。不同AAV血清型的基因组序列的实例可以在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。参见GenBank登录号AF028704.1(AAV6)，NC006260(AAV7)，NC006261(AAV8)和AX753250.1(AAV9)。在一个优选的实施例中，本发明的腺相关病毒载体是选自由AAV2，AAV5，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10和AAVrh10血清型组成的组的血清型。在一个更优选的实施例中，所述AAV是AAV血清型9，AAV9。
本发明的AAV载体的基因组缺少rep和cap开放阅读框。此类AAV载体只能被复制并包装到宿主细胞中的感染性病毒颗粒中，所述宿主细胞已经用编码和表达rep和cap基因产物的载体(即AAV Rep和Cap蛋白)转染，并且其中宿主细胞已经用编码和表达来自腺病毒的蛋白质的载体转染。
本发明的药物组合物
本发明的多核苷酸，载体或AAV载体可通过常规方法施用于人体或动物体，其需要在药物组合物中的配方。因此，在第二方面，本发明涉及药物组合物(下文中称为“本发明的药物组合物”)，其包含治疗有效量的本发明的多核苷酸，或本发明的载体或本发明的腺相关病毒(AAV)载体。药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。
在本发明的多核苷酸或本发明的载体或本发明的AAV载体的背景中公开的所有实施例也适用于本发明的药物组合物。
术语“治疗有效量”是指计算产生所需效果的本发明的多核苷酸，载体或AAV载体的量，并且除了其他原因之外，通常将通过本发明的多核苷酸，载体或AAV载体的自身特征和待获得的治疗效果来确定。因此，所述将对治疗疾病有效的量可通过本文所述的标准临床技术或本领域已知的方法确定。制剂中使用的精确剂量取决于施用途径。可以使用现有技术中熟知的技术从体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。在现有技术水平上具有正常经验的人员可以基于动物中的数据容易地优化对人的施用。
在一个具体实施例中，制剂的剂量可以作为病毒颗粒或作为基因组拷贝(“GC”)/病毒基因组(“vg”)测量或计算。
本领域已知的任何方法可用于确定每毫升本发明的病毒组合物的基因组拷贝(GC)数。进行AAV GC数滴定的一种方法如下：首先用DNase处理纯化的AAV载体样品，以从生产过程中消除未衣壳化的AAV基因组DNA或污染质粒DNA。然后对DNase抗性颗粒进行热处理以从衣壳中释放基因组。然后使用靶向病毒基因组特定区域的引物/探针组通过实时PCR定量释放的基因组。
本文可互换使用的术语“药学上可接受的载体”，“药学上可接受的稀释剂”，“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的运载体”是指无毒的固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包封材料，或任何常规类型的配方助剂。药学上可接受的载体在使用的剂量和浓度下对接受者基本上无毒，并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载体的数量和性质取决于所需的施用形式。药学上可接受的载体是已知的并且可以通过本领域熟知的方法制备。
药物组合物可以按照常规方法配制成适合于静脉内，皮下，肌肉内，脑脊液内(CSF)如脑池内(intracisternal)或脑室内(intra-cerebroventricular)，施用于人类的药物组合物。在一个优选的实施例中，药物组合物用于静脉内或脑脊液内(CSF)施用。
可以配制AAV载体用于通过注射(例如通过推注或连续输注)进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型形式(例如在安瓿中或在单剂量或多剂量容器中)与添加的防腐剂一起被提供。病毒组合物可以采取诸如油性或水性载体中的悬浮液，溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂(formulatory agent)，例如悬浮剂，稳定剂或分散剂。AAV制剂的液体制剂可通过常规方法用药学上可接受的添加剂制备，例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)，乳化剂(例如卵磷脂或***胶)，非水性载体(例如杏仁油，油性酯，乙醇或分馏植物油)，和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制剂还可含有缓冲盐。可替代地，组合物可以是粉末形式，用于在使用前用合适的载体(例如无菌无热原水)构建。当必要时，该组合物还可包括局部麻醉剂，例如利多卡因以减轻注射部位疼痛。当组合物将通过渗透施用时，可以用含有药物量的水或盐水溶液的渗透瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可以提供用于注射或无菌盐水溶液的水瓶，使得可以在施用前混合成分。优选地，药学上可接受的载体是盐溶液和洗涤剂，例如聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，Pluronic
本发明的组合物可以配制成用于递送给用于兽医目的的动物(例如家畜(牛，猪，其他动物))和其他非人哺乳动物受试者以及人受试者。本发明的药物组合物可以用生理学上可接受的载体配制，用于基因转移和基因治疗应用。
还包括佐剂与本发明的多核苷酸，载体或AAV载体组合使用或与其混合使用。考虑的佐剂包括，但不限于无机盐佐剂或无机盐凝胶佐剂，颗粒佐剂，微粒佐剂，粘膜佐剂。
佐剂可以作为与本发明的多核苷酸，载体或AAV载体的混合物，或组合使用施用于受试者。
本发明的药物组合物可以局部或全身施用。在一个实施例中，药物组合物在其细胞将被转导的组织或器官附近施用。在一个具体实施例中，本发明的药物组合物在侧脑室(lateral ventricle)局部施用。在另一个优选的实施例中，本发明的药物组合物被全身施用。
如本文所用，术语“全身地施用”和“全身施用”是指本发明的多核苷酸，载体，AAV载体或组合物可以以非局部方式施用于受试者。全身施用可以到达受试者整个体内的多个器官或组织，或者可以到达受试者的特定器官或组织。例如，静脉内施用可导致受试者中超过一种组织或器官的转导。本发明的药物组合物可以以单剂量施用，或者在本发明的具体实施例中，可以使用多剂量(例如，两次，三次，四次或更多次施用)来实现治疗效果。
因此，另一方面，本发明涉及根据本发明的多核苷酸，载体或AAV载体或根据本发明的药物组合物，用于医药。
在进一步方面，本发明涉及根据本发明的多核苷酸，载体或AAV载体或根据本发明第二方面的药物组合物，用于治疗粘多糖症ⅢD型。
因此，在另一方面，本发明涉及根据本发明的多核苷酸，载体或AAV载体或根据本发明的药物组合物，用于增加N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶活性。
另一方面，本发明提供了有此需要的受试者中治疗和/或预防粘多糖症ⅢD型的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明的多核苷酸，或根据本发明的载体，或根据本发明的重组载体或根据本发明的药物组合物。
如本文所用，术语“防止”，“预防了”和“预防”是指抑制受试者中疾病的开始或减少其发生。预防可以是完全的(例如，受试者中完全没有病理细胞)或部分的。预防还指对临床现状的敏感性降低。如本文所用，术语“处理”或“治疗”是指施用本发明的多核苷酸，载体或AAV载体或药物组合物，以在其临床症状出现后控制疾病的进展。控制疾病进展被理解为意味着实现有益或期望的临床结果，其包括但不限于症状的减轻，疾病持续时间的减少，病理状态的稳定(特别是为了避免额外的恶化)，延缓疾病进展，改善病理状态和缓解(部分和全部)。如果不进行治疗，与预期存活相比，疾病进展的控制还涉及存活期的延长。
如本文所用，术语“受试者”是指个体或动物，例如人类，非人类灵长类动物(例如黑猩猩和其他猿和猴子物种)，农场动物(例如鸟类，鱼类，牛，绵羊，猪，山羊和马)，家养哺乳动物(例如狗和猫)，或实验室动物(例如啮齿动物，如小鼠，大鼠和豚鼠)。该术语包括任何年龄或性别的受试者。在一个优选的实施例中，受试者是哺乳动物，优选人类。
获得本发明的AAV的方法
本发明还涉及获得本发明的AAV载体的方法。所述AAV载体可以通过将本发明的多核苷酸引入细胞中获得，所述细胞组成型地表达Rep和Cap蛋白，或者其中Rep和Cap编码序列在质粒或载体中提供。
因此，在另一方面，本发明涉及一种用于获得AAV载体的方法，包括以下步骤：
(i)提供一种细胞，其包含本发明的多核苷酸，AAV cap蛋白，AAV rep蛋白和任选的AAV依赖于其复制的病毒蛋白，
(ii)将细胞维持在适于组装所述AAV的条件下；和
(iii)纯化由细胞产生的腺相关病毒载体。
能够产生AAV载体的任何细胞都可用于本发明。
先前已经描述了该方法中使用的本发明的多核苷酸。在本发明的多核苷酸的背景下公开的任何实施例适用于获得本发明的AAV的方法的背景中。
如本文所用，术语“cap蛋白”是指具有天然AAV cap蛋白(例如VP1，VP2，VP3)的至少一种功能活性的多肽。cap蛋白功能活性的实例包括诱导衣壳形成，促进单链DNA积累，促进AAV DNA包装入衣壳(即衣壳化)，与细胞受体结合，和促进病毒粒子进入宿主细胞的能力。原则上，任何cap蛋白都可用于本发明的背景下。
在一个优选的实施例中，cap蛋白衍生自AAV9。
如本文所用，术语“衣壳”是指其中包装病毒基因组的结构。衣壳由多种由蛋白质制成的寡聚结构亚基组成。例如，AAV具有由三种衣壳蛋白VP1，VP2和VP3的相互作用形成的二十面体衣壳。
如本文所用，术语“rep蛋白”是指具有天然AAV rep蛋白的至少一种功能活性的多肽。rep蛋白的“功能活性”是与蛋白质的生理功能相关的任何活性，包括通过识别，结合和切割DNA复制的AAV原点(origin)以及DNA解旋酶活性来促进DNA的复制。其他功能包括来自AAV(或其他异源)启动子的转录调节和AAV DNA进入宿主染色体的位点特异性整合。在一个具体实施例中，AAV rep基因衍生自血清型AAV2。
如本文所用，表述“AAV依赖于其复制的病毒蛋白(viral proteins upon whichAAV is dependent for replication)”是指执行AAV依赖于其复制的功能的多肽(即“辅助功能(helper function)”)。辅助功能包括但不限于激活AAV基因转录，阶段特异性AAVmRNA剪接，AAV DNA复制，cap蛋白合成和AAV衣壳组装所需的那些功能。基于病毒的辅助功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，如腺病毒，疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。辅助功能包括但不限于腺病毒E1，E2a，VA和E4或疱疹病毒UL5，UL8，UL52和UL29，以及疱疹病毒聚合酶。
通过将所述基因合并至载体中，例如质粒，并将所述载体导入细胞中，可以将本发明的多核苷酸，或基因AAV rep，AAV cap和提供辅助功能的基因引入细胞中。基因可以合并至相同的质粒或不同的质粒中。在一个优选的实施例中，将本发明的多核苷酸合并至一个质粒中，将AAV rep和cap基因合并至另一个质粒中，并将提供辅助功能的基因合并至它们的质粒中。
通过使用本领域熟知的任何合适的方法，可以将含有本发明的多核苷酸和/或AAVrep和cap基因或提供辅助功能的基因的质粒引入细胞中。转染方法的实例包括但不限于用磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖，聚凝胺(polybrene)，电穿孔，显微注射，脂质体介导的融合，脂质转染，逆转录病毒感染和生物射弹转染。在一个具体实施例中，通过用磷酸钙共沉淀进行转染。当细胞缺乏任何AAV rep和cap基因以及提供腺病毒辅助功能的基因的表达时，可以将所述基因与本发明的多核苷酸同时引入细胞中。可替代地，可以在引入本发明的多核苷酸之前或之后将所述基因引入细胞中。
在一个具体实施例中，用三种质粒同时转染细胞，i)包含本发明多核苷酸的质粒，ii)包含AAV rep和cap基因的质粒和iii)包含提供辅助功能的基因的质粒。
本发明的方法的步骤(ii)包括将细胞维持在适于组装所述AAV的条件下。
培养细胞的方法和促进AAV载体颗粒释放(例如细胞的裂解)的示例性条件可以如本文实施例中所述进行。使生产细胞生长一段合适的时间，以促进AAV的组装和病毒载体释放进入培养基。通常，从病毒产生的角度测量培养时间。例如，就AAV而言，病毒产生通常在如本文所述的合适的生产细胞中提供辅助病毒功能时开始。
本发明的方法的步骤(iii)包括纯化由细胞产生的AAV载体。
从所述细胞或所述培养基中纯化AAV的任何方法均可用于获得本发明的AAV。在一个具体实施例中，本发明的AAV是在基于聚乙二醇沉淀步骤和两个连续氯化铯(CsCl)梯度的优化方法之后纯化的。
各种天然存在的和工程化的AAV，它们的编码核酸，AAV cap和rep蛋白，以及分离或产生，繁殖和纯化这种AAV的方法，特别是它们的衣壳(适于AAV生产中使用)在本领域中是已知的。
本发明进一步提供了一种分离的细胞，其包含编码GNS蛋白的本发明的多核苷酸序列或其功能等效变体。
在本发明的多核苷酸，载体或AAV载体和本发明的药物组合物的背景下公开的所有实施例均适用于本发明的治疗方法。
一般方法
1.重组AAV载体
本文描述的AAV载体通过三重转染获得。制备载体所需的材料是：HEK293细胞(表达腺病毒E1基因)，提供腺病毒功能的辅助质粒，提供来自血清型2的AAV rep基因和来自血清型9(AAV9)的cap基因的质粒，最后是具有AAV2ITR和所关注结构的主链质粒。
为了产生表达葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的AAV载体，将人或鼠葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的优化或未优化的编码序列克隆到在普遍存在的杂合CAG启动子的控制下的AAV主链质粒中。使用EndoFree Plasmid Megaprep试剂盒(Qiagen)进行大规模质粒生产。
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染(helper virus-free transfection)产生载体。参见Matsushita T,et al.,Gene Ther.1998；5:938-945和Wright J,et al.,Mol.Ther.2005；12:171-178。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，侧翼为血清型2AAV(如上所述)的病毒ITR；2)携带AAV rep2和cap9基因的质粒；3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayuso E,et al.,Gene Ther.2010；17:503-510。将载体针对PBS+0.001％Pluronic F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。
根据本领域熟知的分子生物学技术构建本发明的载体。
2.体外转染研究
使用Lipofectamine(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,CA,美国)，遵循制造商的说明，用4μg pAAV-CAG-hGNS，pAAV-CAG-ohGNS-v1，pAAV-CAG-ohGNS-v2或pAAV-CAG-ohGNS-v3转染HEK293细胞。48小时后，收获细胞和培养基并处理用于RNA和蛋白质提取。
使用RNeasy迷你试剂盒(Quiagen,Hilden,德国)遵循制造商的说明获得总RNA，并用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒(Roche)进行逆转录。使用针对以下各项具有特异性的引物通过定量实时PCR评估不同型式的人GNS基因的表达：hGNS(SEQID NO:19：Fw：5'AAA CTG GTC AAG AGG CTG GA 3'，SEQ ID NO:20：Rv：5'TGG TTT GAT CCCAGG TCC TC 3')，ohGNS-v1(SEQ ID NO:21：Fw：5'CCA ACA GCA GCA TCC AGT TT 3'，SEQID NO:22：Rv：5'CGT TGT CGC TGG TGT AGA AG 3')，ohGNS-v2(SEQ ID NO:23：Fw：5'CTGAAG AAA ACC AAG GCG CT 3'，SEQ ID NO:24：Rv：5'AGT TCC CCT CGA GAG TGT TG 3')和ohGNS-v3(SEQ ID NO:25：Fw：5’AAC TTC AAC ATC CAC GGC AC 3’，SEQ ID NO:26：Rv：ACTCCA GTC TCT TCA CCA GC 3’)。将值归一化为人RPLPP0的表达(SEQ ID NO:27：Fw：5'CTCTGG AGA AAC TGC TGC CT 3'，SEQ ID NO:28：Rv：5'CTG CAC ATC ACT CAG GAT TTC AA3')。使用Light480SYBRgreen I Master(Roche,Manheim,德国)在Light480(Roche,Manheim,德国)中进行实时PCR。
通过在250μl Mili-Q水中超声处理细胞获得蛋白质提取物，并使用Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,美国)定量蛋白质含量。在5μg细胞蛋白提取物和5μl培养基中测定N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶活性，并用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物(4-methylumbelliferone-derived fluorogenic substrate)(Moscerdam Substrates,Oegstgeest,荷兰)分别用蛋白质和体积的总量进行归一化(如前所述)。参见Wang He etal.,J Inher Metab Diss 1993；16:935-941。
3.动物
获得C57BL/6N-A/a胚胎干细胞，其携带通过国际小鼠表型分析联盟(International Mouse Phenotyping Consortium)(IMPC，www.mousephenotype.org)获得的Gns基因中的标记***的报道基因(LacZ)。将克隆在巴塞罗那自治大学(UniversitatAutònoma de Barcelona)(UAB)的动物生物技术和基因治疗中心(CBATEG)的转基因动物单元中显微注射到C57BL/6J胚细胞中，并将得到的雄性嵌合体与C57Bl/6N雌性一起繁殖以产生Gns敲除后代。通过PCR分析从尾剪切样品中确定基因组DNA的基因型，所述PCR分析扩增包含靶向突变的序列。正义链引物和反义链引物各自的序列为：正义链引物：5'-CCACACAGGGCAGTTCTCTT-3'(SEQ ID NO:13)。反义链引物：5'-GTGGGACCCAAGTCGATGTT-3'(SEQ ID NO:14)。用标准饮食(Harlan，Tekland)随意喂养小鼠，并维持在12小时的光-暗循环下(在上午9点光照)。
由于缺乏GNS活性，这些动物早在2个月龄时就表现出MPSIIID疾病的多种病理特征，包括GAG的积累和大脑不同区域和外周器官如肝脏，心脏，脾，肺和肾中溶酶体室的扩大。正如小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生所显示的那样，在大脑的不同区域检测到神经炎症。此外，当动物6个月大时，许多这些病理发现会加剧，这表明随着动物年龄的增长，病理会恶化。因此，Gns-/-小鼠在2个月龄时表现正常但在6个月时表现出低活性行为。最后，MPSIIID小鼠缩短了寿命。
4.对小鼠进行载体施用
对于静脉内载体递送，将不同型式的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶编码序列的AAV9载体的1×1010个载体基因组通过尾静脉注射以200μl总体积递送至小鼠。WT和未处理的Gns-/-动物用作对照。对于在CSF内递送AAV9-CAG-omGNS载体至小鼠，将5×1010vg的总剂量注射到2个月大的Gns-/-动物的小脑延髓池(cisterna magna)中。用5×1010vg对照非编码(AAV9-null)载体注射类似群的动物。在6、12和22个月龄时，即载体给药后4、10和20个月时，处死小鼠并收获组织。
5.样品收集
在处死时，将动物深度麻醉，然后用12ml PBS经心脏灌注以完全清除组织中的血液。收集全脑和多个体细胞组织(包括肝脏，脾，肾，肺，心脏和脂肪组织)，并在液氮中冷冻并储存在-80℃或浸入***中用于随后的组织学分析。
6.N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶活性和葡糖胺聚糖定量
在Mili-Q水中对肝脏和脑样品进行超声处理。如前所述，用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物(Moscerdam Substrates,Oegstgeest,荷兰)测定N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶活性。参见Wang He et al.,J Inher Metab Diss1993；16:935-941。将脑和肝脏活性水平针对蛋白质的总量归一化，使用Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,美国)定量。
对于葡糖胺聚糖(GAG)定量，对组织样品称重，并且然后用蛋白酶K消化，通过离心和过滤使提取物澄清。使用软骨素4-硫酸盐作为标准，使用Blyscan硫酸化葡糖胺聚糖试剂盒(Biocolor,Carrickfergus,CountyAntrim,英国)在组织提取物中测定GAG水平。将GAG水平针对组织湿重归一化。
7.其他溶酶体酶的活性
将脑和肝脏样品在500μl Mili-Q水中超声处理，并使用4-甲基伞形酮衍生的荧光底物在上清液中测定酶活性。在37℃下与4-甲基伞形基α-L-艾杜糖醛酸(iduronide)(Glycosynth)温育1小时，在15μg蛋白质中测定IDUA活性。参见Bacter et al.,Blood2002；99(5)1857-9。如前所述测量SGSH活性。参见Karpova et al.,J Inherit MetabDis.1996；19(3):278–285,Haurigot V,et al,.J Clin Invest.2013；1；pii:66778。简而言之，将30μg蛋白质与4-MU-αGlcNS在47℃下第一次温育17小时。第二次温育在0.2％BSA中10U/ml的α-葡萄糖苷酶(Sigma-Aldrich)的存在下在37℃下进行24小时。如前所述，对于NAGLU活性，将30μg组织蛋白提取物与4-甲基伞形基-α-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷(Moscerdam Substrates)在37℃下温育3小时。参见Marsh et al.,Clin Genet.1985；27(3):258-62,Ribera A,et al,.Hum Mol Genet.2015；24(7):2078-95。
从30μg蛋白质提取物中测定HGSNAT活性，所述蛋白质提取物与乙酰辅酶A和4-甲基伞形基-β-D-葡糖胺(MU-βGlcNH2，Moscerdam Substrates)在37℃下温育17小时。参见Voznyi et al.,J Inh Metab Dis1993；16:465-72。通过2步方案测定GALNS活性，其中使用10μg蛋白质提取物和4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷-6-硫酸钠盐(MU-βGal-6S)在37℃下第一次温育17小时。进行的第二步是加入Pi缓冲液(0.9MNa2HPO4/0.9M NaH2PO4缓冲剂，pH4.3+0.02％(w/v)叠氮化钠)和β-半乳糖苷酶(β-Gal-Ao，Sigma)并在37℃下温育混合物2小时。参见vanDiggelen et al.,Clin Chim Acta 1990；187:131-40。从与4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸(Sigma)一起在37℃下温育1小时的10μg蛋白质提取物中测定GUSB酶的活性。通过将0.1μg蛋白质提取物与4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(Sigma)在37℃温育1小时来测定HEXB活性。在通过增加pH终止反应后，用FLx800荧光计(BioTekInstruments)测量释放的荧光。将所有脑和肝脏活性水平针对蛋白质总量归一化，使用Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad,Hercules,CA,美国)定量。
8.组织学分析
将组织在***中固定12-24小时，包埋在石蜡中并切片。对于脑中LAMP2的免疫组织化学检测，将石蜡切片在pH6的柠檬酸盐缓冲液中进行热诱导表位修复，并且然后在4℃下与以1:500稀释的大鼠抗LAMP2抗体(Ab13524；Abcam,Cambridge,英国)温育过夜，并且随后与生物素化的以1:300稀释的兔抗大鼠抗体(Dako,Glostrup,丹麦)温育。对于脑样品中的GFAP免疫染色，将石蜡切片在4℃下与以1:1000稀释的兔抗GFAP抗体(Ab6673；Abcam,Cambridge,英国)温育过夜，并且随后与生物素化的以1:300稀释的山羊抗兔抗体(31820；Vector Laboratories,Burlingame,CA,美国)一起温育。通过用1:100稀释的ABC-过氧化物酶染色试剂盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,美国)温育切片来扩增LAMP2和GFAP信号，并使用3,3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)作为色原体进行观察。
为了染色脑样品中的小神经胶质细胞，将石蜡切片在4℃下与以1：100稀释的BSI-B4凝集素(L5391；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)一起温育过夜。使用3,3-二氨基联苯胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国)作为色原体使BSI-B4信号可视化。用光学显微镜(Eclipse 90i；Nikon,Tokyo,日本)获得明场图像。
使用对于所有动物相同的信号阈值设置，在每只动物的每个脑区域(原始放大倍数，×20)的3-5个图像中，使用NIS Elements Advanced Research 2.20软件定量LAMP2，GFAP和BSI-B4信号。然后，计算正面积的百分比，即在图像中的总组织区域上具有正信号的面积(以像素为单位)。
9.透射电子显微镜分析
用超剂量的异氟醚(Isofluo,Labs.Esteve,Barcelona,西班牙)处死小鼠，并通过下腔静脉灌注1ml 2.5％戊二醛和2％多聚甲醛。将一小部分(约1mm3)的大脑皮层，肝脏或肺的左侧叶切片并在4℃下在相同的固定剂中温育2小时。在冷的二甲砷酸盐(cacodylate)缓冲液中洗涤后，将样品在1％四氧化锇中后固定，在乙酸双氧铀水溶液中染色，然后通过梯度乙醇系列脱水并包埋在环氧树脂中。使用柠檬酸铅对来自树脂块的超薄切片进行染色，并在透射电子显微镜(H-7000；Hitachi,Tokyo,日本)中检查。
10.旷场试验(open filed test)
通过在上午9:00至下午1:00之间进行的旷场试验分析6和22个月大的小鼠的行为。将动物置于由2束光束(SedaCom32；Panlab)穿过的明亮环境室(brightly litchamber)(41×41×30cm)的左下角，其检测小鼠的水平和垂直运动。区域表面被分成三个方形的同心区域：中心(14×14cm)，外周(27×27cm)和边缘(41×41cm)。使用视频跟踪***(SmartJunior，Panlab)在测试的前3分钟内记录探索和运动活性。
11.统计分析
所有结果表述为平均值±SEM。使用单向ANOVA进行统计比较。使用Dunnett后测试进行对照组和处理组之间的多重比较，并使用Tukey后测试在所有组之间进行。如果P<0.05，则认为统计学显著。
实施例1：pAAV-CAG-hGNS的构建
人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(NCBI参考序列：NM_002076.3)的CDS用作起始材料并进行化学合成以用于所述的目的(GeneArt；Life Technologies)。接受CDS在质粒pMA-RQ(AmpR)内克隆，所述质粒在5'和3'的侧翼分别具有MluI和EcoRI限制性位点。
MluI/EcoRI人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶CDS片段是从pMA-RQ质粒切下的，并且随后克隆到AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。得到的质粒命名为pAAV-CAG-hGNS(登录号DSM 32342)。参见图1中的A和SEQ ID NO:5。
本文使用的AAV主链质粒pAAV-CAG先前已经产生并含有来自AAV2基因组的ITR，CAG启动子和来自兔β-球蛋白的polyA信号，以及用于克隆所关注的CDS的多克隆位点。CAG启动子是由CMV早期/中间增强子和鸡β-肌动蛋白启动子组成的杂合启动子。该启动子能够普遍地驱动有效的表达。
实施例2：pAAV-CAG-ohGNS-型式1的构建
设计并获得包含优化形式的葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶cDNA序列(ohGNS)的表达盒。通过消除隐蔽性剪接位点和RNA去稳定序列元件，进行序列优化以最大化人体内N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶蛋白产生的效率，以增加RNA稳定性，添加RNA稳定序列元件，密码子优化和G/C含量适应，避免稳定的RNA二级结构等变化。人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(NCBI参考序列：NM_002076.3)的CDS用作序列优化的起始点。
接受第一优化的CDS(GeneArt；Life Technologies)在质粒pMA-T(AmpR)内克隆，所述质粒在5'和3'的侧翼分别具有MluI和EcoRI限制性位点。
MluI/EcoRI优化的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶CDS片段是从pMA-T质粒切下的，并且随后克隆到AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。得到的质粒命名为pAAV-CAG-ohGNS-型式1(登录号DSM 32343)。参见图2中的A和SEQ ID NO:6。
实施例3：pAAV-CAG-ohGNS-型式2的构建
对人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(NCBI参考序列：NM_002076.3)的CDS进行序列优化(DNA2.0Inc)。接受优化的CDS在质粒pJ204(AmpR)内克隆，所述质粒在5'和3'的侧翼分别具有MluI和EcoRI限制性位点。
MluI/EcoRI优化的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶CDS片段是从pJ204质粒切下，并且随后克隆到AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。得到的质粒命名为pAAV-CAG-ohGNS-型式2(登录号DSM 32344)。参见图3中的A和SEQ ID NO:7。
实施例4：pAAV-CAG-ohGNS-型式3的构建
对人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(NCBI参考序列：NM_002076.3)的CDS进行序列优化(Genescript Inc)。接受优化的CDS在质粒pUC57(AmpR)内克隆，所述质粒在5'和3'的侧翼分别具有MluI和EcoRI限制性位点。
MluI/EcoRI优化的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶CDS片段是从pUC57质粒切下，并且随后克隆到AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。得到的质粒命名为pAAV-CAG-ohGNS-型式3(登录号DSM 32345)。参见图4中的A和SEQ ID NO:8。
实施例5：pAAV-CAG-omGNS的构建
对鼠葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(NCBI参考序列：NM_029364.3)的CDS进行序列优化(GeneArt；Life Technologies)。接受优化的CDS；SEQ ID NO:16在质粒pMA-RQ(AmpR)内克隆，所述质粒在5'和3'的侧翼分别具有MluI和EcoRI限制性位点。
MluI/EcoRI优化的鼠葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶CDS片段是从pMA-RQ质粒切下，并且随后克隆到AAV主链质粒pAAV-CAG的MluI和EcoRI限制性位点之间。得到的质粒命名为pAAV-CAG-omGNS。参见图5中的A和SEQ ID NO:17。
实施例6：AAV9-CAG-hGNS的产生
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染产生载体AAV9-CAG-hGNS(SEQ ID NO:9)。参见Matsushita et al.,Gene Ther.1998；5(7):938-45,Wright etal.,Mol Ther.2005；12(1)171-8。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后使用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，其侧翼具有AAV2ITR(pAAV-CAG-hGNS；SEQ ID NO:5)；2)携带AAV2rep和AAV9cap基因的质粒(pREP2CAP9)；和3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayuso et al.,Gene Ther.2010；17(4):503-10。将载体针对PBS+0.001％F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。参见图1中的B。
实施例7：AAV9-CAG-ohGNS-型式1的产生
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染产生载体AAV9-CAG-ohGNS-型式1(SEQ ID NO:10)。参见Matsushita et al.和Wright et al，同上。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后使用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，表达盒侧翼具有AAV2ITR(pAAV-CAG-ohGNS-型式1；SEQ ID NO:6)；2)携带AAV2rep和AAV9cap基因的质粒(pREP2CAP9)；和3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayusoet al.，同上。将载体针对PBS+0.001％F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。参见图2中的B。
实施例8：AAV9-CAG-ohGNS-型式2的生产
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染产生载体AAV9-CAG-ohGNS-型式2(SEQ ID NO:11)。参见Matsushita et al.和Wright et al，同上。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后使用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，表达盒侧翼具有AAV2ITR(pAAV-CAG-ohGNS-型式2；SEQ ID NO:7)；2)携带AAV2rep和AAV9cap基因的质粒(pREP2CAP9)；和3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayusoetal.，同上。将载体针对PBS+0.001％F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。参见图3中的B。
实施例9：AAV9-CAG-ohGNS-型式3的产生
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染产生载体AAV9-CAG-ohGNS-型式3(SEQ ID NO:12)。参见Matsushita et al.和Wright et al，同上。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后使用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，表达盒侧翼具有AAV2ITR(pAAV-CAG-ohGNS-型式3；SEQ ID NO:8)；2)携带AAV2rep和AAV9 cap基因的质粒(pREP2CAP9)；和3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayuso et al.，同上。将载体针对PBS+0.001％F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。参见图4中的B。
实施例10：AAV9-CAG-omGNS的产生
使用具有修饰的三种质粒通过HEK293细胞的无辅助病毒转染产生载体AAV9-CAG-omGNS(SEQ ID NO:18)。参见Matsushita et al.和Wright et al.，同上。将细胞在补充有10％FBS的DMEM中在滚瓶(RB)(Corning,Corning,NY,美国)中培养至70％汇合，然后使用以下物质共转染：1)携带表达盒的质粒，表达盒侧翼具有AAV2ITR(pAAV-CAG-omGNS；SEQIDNO:17)；2)携带AAV2rep和AAV9cap基因的质粒(pREP2CAP9)；和3)携带腺病毒辅助功能的质粒。使用如前所述的优化方案，通过两个连续的氯化铯梯度纯化载体。参见Ayuso et al.，同上。将载体针对PBS+0.001％F68透析，过滤，通过qPCR滴定并储存在-80℃直至使用。参见图5中的B和SEQ ID NO:18。
实施例11：pAAV-CAG-hGNS，pAAV-CAG-ohGNS-型式1，pAAV-CAG-ohGNS-型式2和pAAV-CAG-ohGNS-型式3的体外测试
用含有不同型式的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的4μg质粒pAAV-CAG-hGNS，pAAV-CAG-ohGNS-型式1，pAAV-CAG-ohGNS-型式2和pAAV-CAG-ohGNS-型式3转染HEK293细胞。
转染后48小时，收集细胞，提取总RNA并使用针对每个序列特异的引物通过定量RT-PCR测量葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的表达。用所有四种含葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的质粒转染导致葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶mRNA的检测。参见图6中的A。此外，在用治疗构建体转染的孔的培养基和细胞提取物中葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶活性均增加。参见图6中的B和6中的C。在这两种情况下，编码密码子优化型式的蛋白质的质粒(pAAV-ohGNS型式1至3)导致葡萄糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的生产水平比含有野生型序列的质粒统计上显著更高。参见图6中的B和图6中的C。
实施例12：向MPSⅢD小鼠静脉内注射AAV-CAG-hGNS，AAV-CAG-ohGNS-型式1，AAV-CAG-ohGNS-型式2或AAV-CAG-ohGNS-型式3
含有不同型式的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶表达盒的AAV-CAG-hGNS，AAV-CAG-ohGNS-型式1，AAV-CAG-ohGNS-型式2或AAV-CAG-ohGNS-型式3的总剂量为1x1010的载体基因组，通过尾静脉注射静脉内递送至2个月大的受MPSⅢD影响的小鼠。
在载体递送后2周进行分析。用所有四种含葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的载体转导导致葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶活性显著增加，超过MPSⅢD动物中测量的水平。葡萄糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶活性水平范围为肝脏中WT水平的1300％至2700％和血清中WT的900％至3300％。参见图7中的A和图7中的B。在肝脏中，用含有优化的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶型式3的表达盒达到的活性水平在统计学上高于通过含有野生型序列的载体介导的活性水平。参见图7中的A。在血清中，优化的人葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶的型式2和型式3均导致酶活性在统计学上显著增加。参见图7中的B。
与肝脏和血清中记录的高水平的葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶活性一致，在注射所有载体构建体的动物的肝脏中GAG含量完全正常化(normalized)。参见图7中的C。
实施例13：AAV9-CAG-omGNS的脑池内递送-短期研究
将总剂量为5×10 10载体基因组的AAV9-CAG-omGNS载体注射到2个月大的MPSⅢD动物的小脑延髓池(cisterna magna)中，总体积为5μl。载体施用后4个月，MPSⅢD处理的动物的脑中GNS的酶活性正常化，达到与健康动物中观察到的相似的值。参见图8。GNS活性的恢复导致所分析的所有CNS区域中疾病的底物积累特征的完全正常化，如通过野生型对照和治疗的Gns-/-小鼠中相似的GAG积累水平所示。参见图9中的A。同样地，用对溶酶体标记溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)(用作溶酶体区室大小的指标)具有反应性的抗体染色的脑切片的信号强度的定量，显示相对于在施用对照“Null(空)”载体的GNS缺陷小鼠中记录的值，在雄性Gns-/-处理的小鼠中LAMP2+区域减少约90％。参见图9中的B。
由于未降解的底物积累导致的正常溶酶体稳态的破坏可以改变与直接受突变影响的溶酶体酶不同的其他溶酶体酶的活性。参见Ribera et al.,Hum Mol Genet.2014；doi:10.1093/hmg/ddu727。IDUA(艾杜糖醛酸酶(iduronidase)，α-L-)，GALNS(半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶)，GUSB(葡萄糖醛酸酶(glucuronidase)，β)和HEXB(己糖胺酶B)的活性在未经处理的Gns-/-雄性小鼠或用对照“Null(空)”载体处理的Gns-/-雄性小鼠的大脑中发生了改变，但用AAV9-CAG-omGNS处理使这些活性恢复到健康野生型小鼠中观察到的水平，证明通过载体衍生的Gns表达恢复了溶酶体稳态。参见图9中的C。
通过透射电子显微镜对6个月大的雄性小鼠的大脑皮层进行超微结构分析，发现在Null(空)注射的GNS缺陷小鼠中含有电致发光物质的大液泡存在于被鉴定为神经周围神经胶质细胞的细胞的细胞质中。这些囊泡(其似乎是填充有贮积材料的溶酶体)，在来自健康野生型或AAV9-Gns处理的Gns-/-动物的样品中完全不存在，确认了基因转移后溶酶体区室的正常大小的恢复。参见图10。
神经炎症(特征为中枢神经***的神经胶质细胞活化)，是圣菲利波综合征的标志。与健康对照相比，在用Null(空)载体处理的Gns-/-小鼠中，用于检测星形细胞增生(GFAP)和小胶质细胞增生(BSIB4)的染色的信号强度增加。用AAV9-CAG-omGNS处理Gns-/-小鼠降低了所研究的所有脑区域中两种炎症标志物的阳性区域百分比。参见图11中的A和图11中的B。
施用于CSF的AAV9载体向外周泄漏并转导肝脏。参见Haurigot et al.,ClinInvest.2013；123(8):3254-3271。因此，用AAV9-CAG-omGNS处理的Gns-/-雄性小鼠肝脏中GNS的活性比健康动物中观察到的高约20倍。参见图12。当在肝脏中过表达时，可溶性溶酶体蛋白质被有效地分泌到血流中，使该器官变为循环酶的来源。参见Ruzo et al.,MolTher 2012；20(2):254-66。在用AAV9-CAG-omGNS载体处理的GNS缺陷小鼠的血清中，GNS活性比野生型同窝小鼠高20倍。参见图13。当通过定量不同器官中的GAG含量来评估体细胞治疗功效时，在大多数组织中包括肝脏，心脏，脾，肺，肾和脂肪组织中观察到完全正常化。参见图14中的A。
通过测量肝脏提取物中其他溶酶体酶的活性，进一步论证了CSF内AAV9-CAG-omGNS治疗对抗Gns-/-小鼠溶酶体病理的潜力。SGSH(磺胺酶)，NAGLU(N-乙酰氨基葡萄糖苷酶α)，HGSNAT(乙酰肝素-α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶)，IDUA，GUSB，GALNS，HEXB在未治疗的Gns-/-小鼠或用对照“Null(空)”载体处理的Gns-/-小鼠中相对于WT水平显著改变。用AAV9-CAG-omGNS处理完全正常化所有这些酶的活性。参见图14中的B。与GAG含量数据一致，在用AAV9-CAG-omGNS处理的Gns-/-小鼠中肝脏的重量正常化。参见图15中的A。在AAV9-CAG-omGNS处理的动物中脾脏的重量也正常化。参见图15中的B。最后，透射电子显微镜分析显示6个月大的AAV9-Null注射的GNS缺陷小鼠在其肝细胞和肺支气管纤毛细胞内呈现大量电致发泡液泡，而健康WT和AAV9-CAG-omGNS处理过的小鼠则没有。参见图16。
用旷场试验评估了CSF内施用AAV9-CAG-omGNS对行为的影响，其评估了未知环境中小鼠的一般运动和探索活性。与健康小鼠相比，关于在测试期间行进的总距离和它们休息的时间量方面，未处理的和AAV9-null处理的Gns-/-小鼠表现出降低的运动活性。脑池内施用AAV9-CAG-omGNS完全纠正了Gns-/-雄性小鼠的行为缺陷。参见图17。
实施例14：脑池内递送AAV9-CAG-omGNS-长期研究
为了评估单次施用AAV9-CAG-omGNS在调节MPSIIID的长期矫正中的治疗效果，一组GNS缺陷动物在2个月龄时用5×1010个载体基因组的AAV9-CAG-omGNS载体注射到小脑延髓池中，并在载体施用后10个月进行分析，即当小鼠1岁时。GNS基因转移降低了整个脑中的GAG含量；到12个月时，AAV9-CAG-omGNS处理的动物显示出与健康动物相同的GAG水平，提供了长期治疗功效的证据。参见图18中的A。
为了进一步评估治疗提供持久性疾病矫正的能力，对12个月大的动物的脑切片进行LAMP2的免疫组织化学检测。反映溶酶体GAG的病理贮积，未处理或Null(空)注射的Gns-/-雄性显示在所分析的所有脑区域中LAMP2信号强度显著增加。参见图18中的B。在AAV9-CAG-omGNS处理的小鼠中，在基因转移后观察到的GAG积累的减少转化为LAMP2阳性信号显著下降至不同区域的几乎WT水平，表明当GAG水平正常化时溶酶体区室的收缩。参见图18中的B。
当单个AAV9-CAG-omGNS载体施用后10个月分析星形胶质细胞增生和小神经胶质细胞增生时，接受AAV9-CAG-omGNS载体的GNS缺陷雄性小鼠显示在所研究的所有脑区中GFAP信号强度显著降低，如通过形态测定分析证明。参见图19中的A。类似地，用GNS编码载体处理将BSI-B4阳性信号降低至几乎与野生型健康动物中定量的水平一样低的水平。参见图19中的B。
在AAV9-CAG-omGNS递送后10个月，经处理的GNS缺陷小鼠在外周器官例如肝脏，心脏，脾，肺，肾和脂肪组织中显示正常或几乎正常的GAG含量。参见图20中的A。
与病理性HS积累的完全清除相一致，用AAV9-CAG-om GNS载体处理的GNS缺陷动物的肝脏显示出其他溶酶体酶的正常活性水平不受突变影响并且参与HS的分解代谢，如IDUA，SGSH，NAGLU和HGSNAT，或与HS途径无关，如GALNS，GUSB和β-HEXO。参见图20中的B。这些酶的活性在治疗年龄时(即在2个月大的年幼动物中)已经被扰乱，证明在疾病发展早期溶酶体内稳态的破坏。参见Roca et al.,Hum Mol Genet 2017；26(8):1535-51。因此，结果表明用基因疗法治疗持续逆转溶酶体生理的改变。
最后，当对动物进行行为测试时，单次施用AAV9-CAG-omGNS载体后10个月治疗效果的持续性也很明显。与在年龄匹配的未处理的MPSⅢD小鼠中观察到的降低的运动活性相反，1岁龄处理的Gns-/-雄性小鼠具有与健康同窝小鼠相同的行为。参见图21。
圣菲利波症的动物模型显著缩短了寿命。参见Haurigot V,et al,.J ClinInvest.2013；1；pii:66778；Ribera A,et al,.Hum Mol Genet.2015；24(7):2078-95。为了评估何时应是非常晚期疾病的治疗效果，在载体施用后20个月即当小鼠差不多2岁时，分析另一组在2个月龄时用5×1010个载体基因组的AAV9-CAG-omGNS处理的动物，并且大多数未经处理的MPSⅢD动物不再存活。在22个月大的处理过的MPSⅢD动物中，脑GNS活性保持在非常高的水平。参见图22。这种GNS活性治疗水平的维持解释了处理的MPSⅢD小鼠脑中GAG的正常水平，其显示出与健康野生型同窝小鼠的脑相似的GAG含量。参见图23中的A。因此，通过定量溶酶体标记物LAMP2-的信号强度，以形态测定评估的溶酶体区室的大小在所分析的任何CNS区域中没有统计学上显著增加。参见图23中的B。同样，不受突变影响的其他溶酶体酶的活性与健康野生型同窝小鼠中记录的活性相似，证实了旧的处理过的MPSⅢD小鼠中正常的溶酶体内稳态。参见图23中的C。22个月大的处理过的MPSⅢD小鼠的脑也显示非常低的GFAP和BSI-B4信号，表明在单次施用治疗性AAV9-CAG-omGNS载体后20个月，治疗对神经炎症的显著影响持续存在。参见图24中的A和图24中的B。最后，持续产生GNS导致经处理的MPSⅢD小鼠的外周器官中GAG含量的正常水平，其中肝，心脏，脾，肺和脂肪组织具有与健康年龄匹配的动物的外周器官相同的GAG含量。参见图25。
实施例15：脑池内递送AAV9-CAG-omGNS-存活研究
最后，评估了CSF内施用AAV9-CAG-omGNS载体对存活的影响。在18个月时，虽然所有野生型对照小鼠都存活，但100％的未治疗的Gns-/-小鼠和80％的AAV9-null治疗的Gns-/-小鼠死亡，表明GNS缺乏显著缩短了寿命。用AAV9-CAG-omGns施用的20只Gns-/-小鼠的组中只有2只在相同时间段内死亡，进一步提供了该疗法疗效的证据。参见图26。
序列表
<110> 埃斯蒂维实验室股份有限公司（Laboratorios del Dr. ESTEVE S.A.）
巴塞罗那自治大学（Universitat Autnoma de Barcelona）
<120> 用于治疗粘多糖症的腺相关病毒载体（ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FORTHE TREATMENT OF
MUCOPOLYSACCHARIDOSES）
<130> PCT2212.7
<150> EP16382450
<151> 2016-09-30
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
atgcggctcc tgcctctagc cccaggtcgg ctccggcggg gcagcccccg ccacctgccc 60
tcctgcagcc cagcgctgct actgctggtg ctgggcggct gcctgggggt cttcggggtg 120
gctgcgggaa cccggaggcc caacgtggtg ctgctcctca cggacgacca ggacgaagtg 180
ctcggcggca tgacaccgct aaagaaaacc aaagctctca tcggagagat ggggatgact 240
ttttccagtg cttatgtgcc aagtgctctc tgctgcccca gcagagccag tatcctgaca 300
ggaaagtacc cacataatca tcacgttgtg aacaacactc tggaggggaa ctgcagtagt 360
aagtcctggc agaagatcca agaaccaaat actttcccag caattctcag atcaatgtgt 420
ggttatcaga ccttttttgc agggaaatat ttaaatgagt acggagcccc agatgcaggt 480
ggactagaac acgttcctct gggttggagt tactggtatg ccttggaaaa gaattctaag 540
tattataatt acaccctgtc tatcaatggg aaggcacgga agcatggtga aaactatagt 600
gtggactacc tgacagatgt tttggctaat gtctccttgg actttctgga ctacaagtcc 660
aactttgagc ccttcttcat gatgatcgcc actccagcgc ctcattcgcc ttggacagct 720
gcacctcagt accagaaggc tttccagaat gtctttgcac caagaaacaa gaacttcaac 780
atccatggaa cgaacaagca ctggttaatt aggcaagcca agactccaat gactaattct 840
tcaatacagt ttttagataa tgcatttagg aaaaggtggc aaactctcct ctcagttgat 900
gaccttgtgg agaaactggt caagaggctg gagttcactg gggagctcaa caacacttac 960
atcttctata cctcagacaa tggctatcac acaggacagt tttccttgcc aatagacaag 1020
agacagctgt atgagtttga tatcaaagtt ccactgttgg ttcgaggacc tgggatcaaa 1080
ccaaatcaga caagcaagat gctggttgcc aacattgact tgggtcctac tattttggac 1140
attgctggct acgacctaaa taagacacag atggatggga tgtccttatt gcccattttg 1200
agaggtgcca gtaacttgac ctggcgatca gatgtcctgg tggaatacca aggagaaggc 1260
cgtaacgtca ctgacccaac atgcccttcc ctgagtcctg gcgtatctca atgcttccca 1320
gactgtgtat gtgaagatgc ttataacaat acctatgcct gtgtgaggac aatgtcagca 1380
ttgtggaatt tgcagtattg cgagtttgat gaccaggagg tgtttgtaga agtctataat 1440
ctgactgcag acccagacca gatcactaac attgctaaaa ccatagaccc agagctttta 1500
ggaaagatga actatcggtt aatgatgtta cagtcctgtt ctgggccaac ctgtcgcact 1560
ccaggggttt ttgaccccgg atacaggttt gacccccgtc tcatgttcag caatcgcggc 1620
agtgtcagga ctcgaagatt ttccaaacat cttctgtag 1659
<210> 2
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-型式1
<400> 2
atgagactgc tgcctctggc tcctggccgg ctgagaagag gcagccctag acatctgccc 60
agctgctctc cagccctgct gctgctggtg ctgggaggat gcctgggagt gtttggagtg 120
gccgctggca ccagacggcc caatgtggtg ctgctgctga ccgacgacca ggacgaagtg 180
ctgggcggca tgacccccct gaaaaagacc aaggccctga tcggcgagat gggcatgacc 240
ttcagcagcg cctatgtgcc cagcgccctg tgctgtccta gcagagccag catcctgacc 300
ggcaagtacc cccacaacca ccatgtcgtg aacaacaccc tggaaggcaa ctgcagcagc 360
aagagctggc agaagatcca ggaacccaac accttccccg ccatcctgag atccatgtgc 420
ggctaccaga ccttcttcgc cggaaagtac ctgaacgagt acggcgctcc tgacgctggc 480
ggactggaac atgtgcctct gggctggtcc tattggtacg ccctggaaaa gaacagcaag 540
tactacaact acaccctgag catcaacggc aaggcccgga agcacggcga gaactacagc 600
gtggactacc tgaccgatgt gctggccaac gtgtccctgg acttcctgga ctacaagagc 660
aacttcgagc ccttcttcat gatgatcgcc acccctgccc cccacagccc ttggacagct 720
gctcctcagt accagaaagc cttccagaac gtgttcgccc ccagaaacaa gaacttcaac 780
atccacggca ccaacaagca ctggctgatc cggcaggcca agacccccat gaccaacagc 840
agcatccagt ttctggacaa cgccttcaga aagcggtggc agaccctgct gtccgtggac 900
gacctggtgg aaaagctcgt gaagcggctg gagttcaccg gcgagctgaa caatacctac 960
atcttctaca ccagcgacaa cggctaccac accggccagt tcagcctgcc catcgacaag 1020
cggcagctgt acgagttcga catcaaggtg cccctgctcg tgcggggacc tggcatcaag 1080
cctaaccaga cctccaagat gctggtggcc aacatcgacc tgggccccac catcctggat 1140
atcgccggct acgacctgaa caagacccag atggacggca tgtccctgct gcctatcctg 1200
agaggcgcca gcaatctgac atggcggagc gacgtgctgg tggaatatca gggcgagggc 1260
cggaacgtga ccgaccctac atgtcctagc ctgagccctg gcgtgtccca gtgcttccct 1320
gattgcgtgt gcgaggacgc ctacaacaac acctacgcct gcgtgcggac catgtccgcc 1380
ctgtggaacc tgcagtattg cgagttcgat gaccaggaag tgttcgtgga agtgtacaac 1440
ctgaccgccg accccgacca gatcaccaat atcgccaaga ccatcgaccc cgagctgctg 1500
ggaaagatga actaccggct gatgatgctg cagagctgca gcggccctac ctgcagaaca 1560
ccaggcgtgt tcgaccccgg ctacagattc gaccccagac tgatgttcag caaccggggc 1620
tccgtgcgca ccagaagatt cagcaaacat ctgctctga 1659
<210> 3
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-型式2
<400> 3
atgaggctgc tgcccctggc ccccggaagg ttgcggcggg gttcgcctag acacctccct 60
tcatgctctc ccgccctgtt gctgctcgtg ctcggcggat gcctcggggt gttcggggtg 120
gccgcgggca cccggcgccc gaacgtcgtg ctgctgctga ccgacgacca agacgaggtg 180
ctcggtggca tgaccccgct gaagaaaacc aaggcgctga tcggtgaaat gggcatgacc 240
ttctcctccg catacgtgcc ctcggccctt tgctgtccgt cccgcgcgtc catcctgacc 300
gggaagtacc cgcataatca ccacgtcgtg aacaacactc tcgaggggaa ctgcagctcc 360
aagtcctggc agaagatcca agagcccaat accttccctg ctatcctgcg gtcgatgtgc 420
ggataccaga ccttctttgc cggaaagtat ctgaacgaat acggagcacc agatgccggt 480
ggactggaac atgtgccgct gggatggagc tattggtacg cactggagaa gaactccaag 540
tactacaatt acaccctgtc catcaacggg aaggcccgca agcacggcga aaactattcc 600
gtggactacc tcaccgacgt gctggccaac gtgtcgctgg atttccttga ctacaagtcc 660
aactttgagc ccttcttcat gatgatcgcc actccggcgc cccatagccc ctggaccgcc 720
gcgcctcagt accaaaaggc tttccagaac gtgttcgccc caagaaacaa gaacttcaat 780
attcacggaa ctaacaagca ctggctgatc agacaggcca aaactccaat gaccaactcg 840
agcatccagt tcctggacaa cgccttccgg aagcgctggc agaccctgct ctccgtggat 900
gacctggtgg aaaagctggt caagcggctg gagttcactg gggagttgaa caacacctat 960
atcttctaca cctccgacaa tggttaccac accggacagt tctcgctgcc aattgacaag 1020
cggcagctgt acgagttcga tattaaggtc ccacttcttg tgcgcgggcc gggaatcaag 1080
cccaaccaaa cttccaagat gctggtcgcc aacattgacc tgggtccgac tattctcgat 1140
atcgccggct acgacctgaa caagactcag atggacggca tgagcttgct gccgatcctg 1200
cgcggagcgt ccaacctgac ttggaggtcc gacgtcttgg tggaatacca gggcgaaggg 1260
cgcaacgtca ccgacccaac ttgcccttca ctgtcacccg gagtgtccca gtgcttcccc 1320
gactgcgtgt gtgaagatgc ctacaacaat acctacgcct gcgtgcgcac catgtccgct 1380
ctctggaacc tccagtactg cgaatttgac gaccaggagg tgttcgtgga agtgtacaac 1440
ctgacagccg atcctgacca aatcaccaac attgcaaaga ccatcgaccc tgagctgctg 1500
ggaaagatga actacaggct gatgatgctc cagagctgct ccggcccgac gtgccggacg 1560
ccgggagtgt ttgaccctgg ataccggttc gacccgagac tgatgttctc aaaccggggc 1620
tcggtccgga cccgaagatt cagcaaacac ctcctctga 1659
<210> 4
<211> 1659
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-型式3
<400> 4
atgcgactgc tgccactggc tcctggaaga ctgagacgag ggtcaccaag acatctgcct 60
agttgttcac ctgctctgct gctgctggtg ctgggcggct gcctgggcgt gttcggagtg 120
gcagcaggaa cccggcggcc caacgtggtg ctgctgctga cagacgatca ggacgaggtg 180
ctgggaggaa tgacccccct gaagaagaca aaggccctga tcggcgagat gggcatgacc 240
tttagctccg cctacgtgcc tagcgccctg tgctgtccaa gccgggcctc tatcctgacc 300
ggcaagtatc cacacaatca ccacgtggtg aacaatacac tggagggcaa ctgctctagc 360
aagtcttggc agaagatcca ggagcctaat accttcccag ccatcctgag aagcatgtgc 420
ggctaccaga cattctttgc cggcaagtac ctgaacgagt atggcgcccc agatgcagga 480
ggcctggagc acgtgccact gggatggagc tactggtatg ccctggagaa gaacagcaag 540
tactataact acacactgag catcaatggc aaggccagga agcacggcga gaactactcc 600
gtggactatc tgaccgatgt gctggccaac gtgagcctgg acttcctgga ttacaagtct 660
aactttgagc ccttctttat gatgatcgca accccagcac ctcacagccc atggacagcc 720
gccccccagt atcagaaggc cttccagaac gtgttcgccc ctcggaacaa gaacttcaac 780
atccacggca ccaacaagca ctggctgatc agacaggcca agaccccaat gacaaattcc 840
tctatccagt tcctggacaa cgcctttagg aagcggtggc agaccctgct gtccgtggac 900
gatctggtgg agaagctggt gaagagactg gagttcacag gcgagctgaa caacacctac 960
atcttttata caagcgataa cggctaccac accggccagt tctccctgcc catcgacaag 1020
aggcagctgt atgagtttga tatcaaggtg cctctgctgg tgcgcggccc cggcatcaag 1080
cctaatcaga catctaagat gctggtggcc aacatcgacc tgggaccaac catcctggac 1140
atcgcaggct acgatctgaa caagacacag atggatggca tgtccctgct gcctatcctg 1200
aggggagcaa gcaatctgac ctggcgctcc gacgtgctgg tggagtatca gggcgagggc 1260
aggaacgtga ccgatccaac atgcccaagc ctgtcccccg gcgtgtccca gtgtttccct 1320
gactgcgtgt gcgaggatgc ctacaacaat acctatgcct gcgtgcgcac aatgtctgcc 1380
ctgtggaatc tgcagtactg tgagttcgac gatcaggagg tgtttgtgga ggtgtataat 1440
ctgaccgccg accctgatca gatcaccaac atcgccaaga caatcgaccc agagctgctg 1500
ggcaagatga actaccggct gatgatgctg cagtcttgca gcggccctac ctgtagaaca 1560
ccaggcgtgt tcgaccccgg ctatcggttt gatcctagac tgatgttttc caatagaggc 1620
tccgtgagga ctcggcggtt tagtaagcac ctgctgtaa 1659
<210> 5
<211> 7894
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> pAAV-CAG-hGNS
<400> 5
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
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gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgct 7894
<210> 6
<211> 7894
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> pAAV-CAG-ohGNS-型式1
<400> 6
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
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gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
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ggactacaag agcaacttcg agcccttctt catgatgatc gccacccctg ccccccacag 2640
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ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
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aacaatatta ccgccagcca ttgcaacgga atcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 7860
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgct 7894
<210> 7
<211> 7894
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> pAAV-CAG-ohGNS-型式2
<400> 7
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgaggc tgctgcccct ggcccccgga aggttgcggc ggggttcgcc 1980
tagacacctc ccttcatgct ctcccgccct gttgctgctc gtgctcggcg gatgcctcgg 2040
ggtgttcggg gtggccgcgg gcacccggcg cccgaacgtc gtgctgctgc tgaccgacga 2100
ccaagacgag gtgctcggtg gcatgacccc gctgaagaaa accaaggcgc tgatcggtga 2160
aatgggcatg accttctcct ccgcatacgt gccctcggcc ctttgctgtc cgtcccgcgc 2220
gtccatcctg accgggaagt acccgcataa tcaccacgtc gtgaacaaca ctctcgaggg 2280
gaactgcagc tccaagtcct ggcagaagat ccaagagccc aataccttcc ctgctatcct 2340
gcggtcgatg tgcggatacc agaccttctt tgccggaaag tatctgaacg aatacggagc 2400
accagatgcc ggtggactgg aacatgtgcc gctgggatgg agctattggt acgcactgga 2460
gaagaactcc aagtactaca attacaccct gtccatcaac gggaaggccc gcaagcacgg 2520
cgaaaactat tccgtggact acctcaccga cgtgctggcc aacgtgtcgc tggatttcct 2580
tgactacaag tccaactttg agcccttctt catgatgatc gccactccgg cgccccatag 2640
cccctggacc gccgcgcctc agtaccaaaa ggctttccag aacgtgttcg ccccaagaaa 2700
caagaacttc aatattcacg gaactaacaa gcactggctg atcagacagg ccaaaactcc 2760
aatgaccaac tcgagcatcc agttcctgga caacgccttc cggaagcgct ggcagaccct 2820
gctctccgtg gatgacctgg tggaaaagct ggtcaagcgg ctggagttca ctggggagtt 2880
gaacaacacc tatatcttct acacctccga caatggttac cacaccggac agttctcgct 2940
gccaattgac aagcggcagc tgtacgagtt cgatattaag gtcccacttc ttgtgcgcgg 3000
gccgggaatc aagcccaacc aaacttccaa gatgctggtc gccaacattg acctgggtcc 3060
gactattctc gatatcgccg gctacgacct gaacaagact cagatggacg gcatgagctt 3120
gctgccgatc ctgcgcggag cgtccaacct gacttggagg tccgacgtct tggtggaata 3180
ccagggcgaa gggcgcaacg tcaccgaccc aacttgccct tcactgtcac ccggagtgtc 3240
ccagtgcttc cccgactgcg tgtgtgaaga tgcctacaac aatacctacg cctgcgtgcg 3300
caccatgtcc gctctctgga acctccagta ctgcgaattt gacgaccagg aggtgttcgt 3360
ggaagtgtac aacctgacag ccgatcctga ccaaatcacc aacattgcaa agaccatcga 3420
ccctgagctg ctgggaaaga tgaactacag gctgatgatg ctccagagct gctccggccc 3480
gacgtgccgg acgccgggag tgtttgaccc tggataccgg ttcgacccga gactgatgtt 3540
ctcaaaccgg ggctcggtcc ggacccgaag attcagcaaa cacctcctct gagaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 3780
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 3840
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcatt 4320
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4380
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4440
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4500
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4560
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4620
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4680
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4740
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4800
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4860
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4920
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4980
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5040
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5100
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5160
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5220
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5280
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5340
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5400
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5460
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5520
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5580
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5640
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5700
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5760
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 5820
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 5880
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 5940
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6000
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6060
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6120
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6180
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6240
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6300
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 6360
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 6420
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 6480
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6540
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 6600
tcaggcgatt ccaacatcca ataaatcata caggcaaggc aaagaattag caaaattaag 6660
caataaagcc tcagagcata aagctaaatc ggttgtacca aaaacattat gaccctgtaa 6720
tacttttgcg ggagaagcct ttatttcaac gcaaggataa aaatttttag aaccctcata 6780
tattttaaat gcaatgcctg agtaatgtgt aggtaaagat tcaaacgggt gagaaaggcc 6840
ggagacagtc aaatcaccat caatatgata ttcaaccgtt ctagctgata aattcatgcc 6900
ggagagggta gctatttttg agaggtctct acaaaggcta tcaggtcatt gcctgagagt 6960
ctggagcaaa caagagaatc gatgaacggt aatcgtaaaa ctagcatgtc aatcatatgt 7020
accccggttg ataatcagaa aagccccaaa aacaggaaga ttgtataagc aaatatttaa 7080
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 7140
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 7200
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 7260
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 7320
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 7380
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 7440
aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca 7500
cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgagcacgta 7560
taacgtgctt tcctcgttag aatcagagcg ggagctaaac aggaggccga ttaaagggat 7620
tttagacagg aacggtacgc cagaatcctg agaagtgttt ttataatcag tgaggccacc 7680
gagtaaaaga gtctgtccat cacgcaaatt aaccgttgtc gcaatacttc tttgattagt 7740
aataacatca cttgcctgag tagaagaact caaactatcg gccttgctgg taatatccag 7800
aacaatatta ccgccagcca ttgcaacgga atcgccattc gccattcagg ctgcgcaact 7860
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgct 7894
<210> 8
<211> 7894
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> pAAV-CAG-ohGNS-型式3
<400> 8
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgcgac tgctgccact ggctcctgga agactgagac gagggtcacc 1980
aagacatctg cctagttgtt cacctgctct gctgctgctg gtgctgggcg gctgcctggg 2040
cgtgttcgga gtggcagcag gaacccggcg gcccaacgtg gtgctgctgc tgacagacga 2100
tcaggacgag gtgctgggag gaatgacccc cctgaagaag acaaaggccc tgatcggcga 2160
gatgggcatg acctttagct ccgcctacgt gcctagcgcc ctgtgctgtc caagccgggc 2220
ctctatcctg accggcaagt atccacacaa tcaccacgtg gtgaacaata cactggaggg 2280
caactgctct agcaagtctt ggcagaagat ccaggagcct aataccttcc cagccatcct 2340
gagaagcatg tgcggctacc agacattctt tgccggcaag tacctgaacg agtatggcgc 2400
cccagatgca ggaggcctgg agcacgtgcc actgggatgg agctactggt atgccctgga 2460
gaagaacagc aagtactata actacacact gagcatcaat ggcaaggcca ggaagcacgg 2520
cgagaactac tccgtggact atctgaccga tgtgctggcc aacgtgagcc tggacttcct 2580
ggattacaag tctaactttg agcccttctt tatgatgatc gcaaccccag cacctcacag 2640
cccatggaca gccgcccccc agtatcagaa ggccttccag aacgtgttcg cccctcggaa 2700
caagaacttc aacatccacg gcaccaacaa gcactggctg atcagacagg ccaagacccc 2760
aatgacaaat tcctctatcc agttcctgga caacgccttt aggaagcggt ggcagaccct 2820
gctgtccgtg gacgatctgg tggagaagct ggtgaagaga ctggagttca caggcgagct 2880
gaacaacacc tacatctttt atacaagcga taacggctac cacaccggcc agttctccct 2940
gcccatcgac aagaggcagc tgtatgagtt tgatatcaag gtgcctctgc tggtgcgcgg 3000
ccccggcatc aagcctaatc agacatctaa gatgctggtg gccaacatcg acctgggacc 3060
aaccatcctg gacatcgcag gctacgatct gaacaagaca cagatggatg gcatgtccct 3120
gctgcctatc ctgaggggag caagcaatct gacctggcgc tccgacgtgc tggtggagta 3180
tcagggcgag ggcaggaacg tgaccgatcc aacatgccca agcctgtccc ccggcgtgtc 3240
ccagtgtttc cctgactgcg tgtgcgagga tgcctacaac aatacctatg cctgcgtgcg 3300
cacaatgtct gccctgtgga atctgcagta ctgtgagttc gacgatcagg aggtgtttgt 3360
ggaggtgtat aatctgaccg ccgaccctga tcagatcacc aacatcgcca agacaatcga 3420
cccagagctg ctgggcaaga tgaactaccg gctgatgatg ctgcagtctt gcagcggccc 3480
tacctgtaga acaccaggcg tgttcgaccc cggctatcgg tttgatccta gactgatgtt 3540
ttccaataga ggctccgtga ggactcggcg gtttagtaag cacctgctgt aagaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 3780
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 3840
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcatt 4320
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4380
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4440
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4500
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4560
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4620
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4680
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4740
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4800
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4860
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4920
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4980
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5040
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5100
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5160
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5220
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5280
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5340
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5400
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5460
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5520
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5580
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5640
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5700
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5760
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 5820
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 5880
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 5940
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6000
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6060
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6120
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6180
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6240
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6300
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 6360
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cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6540
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tcaggcgatt ccaacatcca ataaatcata caggcaaggc aaagaattag caaaattaag 6660
caataaagcc tcagagcata aagctaaatc ggttgtacca aaaacattat gaccctgtaa 6720
tacttttgcg ggagaagcct ttatttcaac gcaaggataa aaatttttag aaccctcata 6780
tattttaaat gcaatgcctg agtaatgtgt aggtaaagat tcaaacgggt gagaaaggcc 6840
ggagacagtc aaatcaccat caatatgata ttcaaccgtt ctagctgata aattcatgcc 6900
ggagagggta gctatttttg agaggtctct acaaaggcta tcaggtcatt gcctgagagt 6960
ctggagcaaa caagagaatc gatgaacggt aatcgtaaaa ctagcatgtc aatcatatgt 7020
accccggttg ataatcagaa aagccccaaa aacaggaaga ttgtataagc aaatatttaa 7080
attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt 7140
tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata 7200
gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac 7260
gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa 7320
tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc 7380
cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg 7440
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cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtactatg gttgctttga cgagcacgta 7560
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<210> 9
<211> 4313
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9-CAG-hGNS
<400> 9
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
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atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
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ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
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caagaacttc aacatccatg gaacgaacaa gcactggtta attaggcaag ccaagactcc 2760
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cctctcagtt gatgaccttg tggagaaact ggtcaagagg ctggagttca ctggggagct 2880
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gccaatagac aagagacagc tgtatgagtt tgatatcaaa gttccactgt tggttcgagg 3000
acctgggatc aaaccaaatc agacaagcaa gatgctggtt gccaacattg acttgggtcc 3060
tactattttg gacattgctg gctacgacct aaataagaca cagatggatg ggatgtcctt 3120
attgcccatt ttgagaggtg ccagtaactt gacctggcga tcagatgtcc tggtggaata 3180
ccaaggagaa ggccgtaacg tcactgaccc aacatgccct tccctgagtc ctggcgtatc 3240
tcaatgcttc ccagactgtg tatgtgaaga tgcttataac aatacctatg cctgtgtgag 3300
gacaatgtca gcattgtgga atttgcagta ttgcgagttt gatgaccagg aggtgtttgt 3360
agaagtctat aatctgactg cagacccaga ccagatcact aacattgcta aaaccataga 3420
cccagagctt ttaggaaaga tgaactatcg gttaatgatg ttacagtcct gttctgggcc 3480
aacctgtcgc actccagggg tttttgaccc cggatacagg tttgaccccc gtctcatgtt 3540
cagcaatcgc ggcagtgtca ggactcgaag attttccaaa catcttctgt aggaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
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gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 4313
<210> 10
<211> 4313
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9-CAG-ohGNS-型式1
<400> 10
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgagac tgctgcctct ggctcctggc cggctgagaa gaggcagccc 1980
tagacatctg cccagctgct ctccagccct gctgctgctg gtgctgggag gatgcctggg 2040
agtgtttgga gtggccgctg gcaccagacg gcccaatgtg gtgctgctgc tgaccgacga 2100
ccaggacgaa gtgctgggcg gcatgacccc cctgaaaaag accaaggccc tgatcggcga 2160
gatgggcatg accttcagca gcgcctatgt gcccagcgcc ctgtgctgtc ctagcagagc 2220
cagcatcctg accggcaagt acccccacaa ccaccatgtc gtgaacaaca ccctggaagg 2280
caactgcagc agcaagagct ggcagaagat ccaggaaccc aacaccttcc ccgccatcct 2340
gagatccatg tgcggctacc agaccttctt cgccggaaag tacctgaacg agtacggcgc 2400
tcctgacgct ggcggactgg aacatgtgcc tctgggctgg tcctattggt acgccctgga 2460
aaagaacagc aagtactaca actacaccct gagcatcaac ggcaaggccc ggaagcacgg 2520
cgagaactac agcgtggact acctgaccga tgtgctggcc aacgtgtccc tggacttcct 2580
ggactacaag agcaacttcg agcccttctt catgatgatc gccacccctg ccccccacag 2640
cccttggaca gctgctcctc agtaccagaa agccttccag aacgtgttcg cccccagaaa 2700
caagaacttc aacatccacg gcaccaacaa gcactggctg atccggcagg ccaagacccc 2760
catgaccaac agcagcatcc agtttctgga caacgccttc agaaagcggt ggcagaccct 2820
gctgtccgtg gacgacctgg tggaaaagct cgtgaagcgg ctggagttca ccggcgagct 2880
gaacaatacc tacatcttct acaccagcga caacggctac cacaccggcc agttcagcct 2940
gcccatcgac aagcggcagc tgtacgagtt cgacatcaag gtgcccctgc tcgtgcgggg 3000
acctggcatc aagcctaacc agacctccaa gatgctggtg gccaacatcg acctgggccc 3060
caccatcctg gatatcgccg gctacgacct gaacaagacc cagatggacg gcatgtccct 3120
gctgcctatc ctgagaggcg ccagcaatct gacatggcgg agcgacgtgc tggtggaata 3180
tcagggcgag ggccggaacg tgaccgaccc tacatgtcct agcctgagcc ctggcgtgtc 3240
ccagtgcttc cctgattgcg tgtgcgagga cgcctacaac aacacctacg cctgcgtgcg 3300
gaccatgtcc gccctgtgga acctgcagta ttgcgagttc gatgaccagg aagtgttcgt 3360
ggaagtgtac aacctgaccg ccgaccccga ccagatcacc aatatcgcca agaccatcga 3420
ccccgagctg ctgggaaaga tgaactaccg gctgatgatg ctgcagagct gcagcggccc 3480
tacctgcaga acaccaggcg tgttcgaccc cggctacaga ttcgacccca gactgatgtt 3540
cagcaaccgg ggctccgtgc gcaccagaag attcagcaaa catctgctct gagaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 3780
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 3840
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 4313
<210> 11
<211> 4313
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9-CAG-ohGNS-型式2
<400> 11
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgaggc tgctgcccct ggcccccgga aggttgcggc ggggttcgcc 1980
tagacacctc ccttcatgct ctcccgccct gttgctgctc gtgctcggcg gatgcctcgg 2040
ggtgttcggg gtggccgcgg gcacccggcg cccgaacgtc gtgctgctgc tgaccgacga 2100
ccaagacgag gtgctcggtg gcatgacccc gctgaagaaa accaaggcgc tgatcggtga 2160
aatgggcatg accttctcct ccgcatacgt gccctcggcc ctttgctgtc cgtcccgcgc 2220
gtccatcctg accgggaagt acccgcataa tcaccacgtc gtgaacaaca ctctcgaggg 2280
gaactgcagc tccaagtcct ggcagaagat ccaagagccc aataccttcc ctgctatcct 2340
gcggtcgatg tgcggatacc agaccttctt tgccggaaag tatctgaacg aatacggagc 2400
accagatgcc ggtggactgg aacatgtgcc gctgggatgg agctattggt acgcactgga 2460
gaagaactcc aagtactaca attacaccct gtccatcaac gggaaggccc gcaagcacgg 2520
cgaaaactat tccgtggact acctcaccga cgtgctggcc aacgtgtcgc tggatttcct 2580
tgactacaag tccaactttg agcccttctt catgatgatc gccactccgg cgccccatag 2640
cccctggacc gccgcgcctc agtaccaaaa ggctttccag aacgtgttcg ccccaagaaa 2700
caagaacttc aatattcacg gaactaacaa gcactggctg atcagacagg ccaaaactcc 2760
aatgaccaac tcgagcatcc agttcctgga caacgccttc cggaagcgct ggcagaccct 2820
gctctccgtg gatgacctgg tggaaaagct ggtcaagcgg ctggagttca ctggggagtt 2880
gaacaacacc tatatcttct acacctccga caatggttac cacaccggac agttctcgct 2940
gccaattgac aagcggcagc tgtacgagtt cgatattaag gtcccacttc ttgtgcgcgg 3000
gccgggaatc aagcccaacc aaacttccaa gatgctggtc gccaacattg acctgggtcc 3060
gactattctc gatatcgccg gctacgacct gaacaagact cagatggacg gcatgagctt 3120
gctgccgatc ctgcgcggag cgtccaacct gacttggagg tccgacgtct tggtggaata 3180
ccagggcgaa gggcgcaacg tcaccgaccc aacttgccct tcactgtcac ccggagtgtc 3240
ccagtgcttc cccgactgcg tgtgtgaaga tgcctacaac aatacctacg cctgcgtgcg 3300
caccatgtcc gctctctgga acctccagta ctgcgaattt gacgaccagg aggtgttcgt 3360
ggaagtgtac aacctgacag ccgatcctga ccaaatcacc aacattgcaa agaccatcga 3420
ccctgagctg ctgggaaaga tgaactacag gctgatgatg ctccagagct gctccggccc 3480
gacgtgccgg acgccgggag tgtttgaccc tggataccgg ttcgacccga gactgatgtt 3540
ctcaaaccgg ggctcggtcc ggacccgaag attcagcaaa cacctcctct gagaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 3780
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 3840
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 4313
<210> 12
<211> 4313
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9-CAG-ohGNS-型式3
<400> 12
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgcc accatgcgac tgctgccact ggctcctgga agactgagac gagggtcacc 1980
aagacatctg cctagttgtt cacctgctct gctgctgctg gtgctgggcg gctgcctggg 2040
cgtgttcgga gtggcagcag gaacccggcg gcccaacgtg gtgctgctgc tgacagacga 2100
tcaggacgag gtgctgggag gaatgacccc cctgaagaag acaaaggccc tgatcggcga 2160
gatgggcatg acctttagct ccgcctacgt gcctagcgcc ctgtgctgtc caagccgggc 2220
ctctatcctg accggcaagt atccacacaa tcaccacgtg gtgaacaata cactggaggg 2280
caactgctct agcaagtctt ggcagaagat ccaggagcct aataccttcc cagccatcct 2340
gagaagcatg tgcggctacc agacattctt tgccggcaag tacctgaacg agtatggcgc 2400
cccagatgca ggaggcctgg agcacgtgcc actgggatgg agctactggt atgccctgga 2460
gaagaacagc aagtactata actacacact gagcatcaat ggcaaggcca ggaagcacgg 2520
cgagaactac tccgtggact atctgaccga tgtgctggcc aacgtgagcc tggacttcct 2580
ggattacaag tctaactttg agcccttctt tatgatgatc gcaaccccag cacctcacag 2640
cccatggaca gccgcccccc agtatcagaa ggccttccag aacgtgttcg cccctcggaa 2700
caagaacttc aacatccacg gcaccaacaa gcactggctg atcagacagg ccaagacccc 2760
aatgacaaat tcctctatcc agttcctgga caacgccttt aggaagcggt ggcagaccct 2820
gctgtccgtg gacgatctgg tggagaagct ggtgaagaga ctggagttca caggcgagct 2880
gaacaacacc tacatctttt atacaagcga taacggctac cacaccggcc agttctccct 2940
gcccatcgac aagaggcagc tgtatgagtt tgatatcaag gtgcctctgc tggtgcgcgg 3000
ccccggcatc aagcctaatc agacatctaa gatgctggtg gccaacatcg acctgggacc 3060
aaccatcctg gacatcgcag gctacgatct gaacaagaca cagatggatg gcatgtccct 3120
gctgcctatc ctgaggggag caagcaatct gacctggcgc tccgacgtgc tggtggagta 3180
tcagggcgag ggcaggaacg tgaccgatcc aacatgccca agcctgtccc ccggcgtgtc 3240
ccagtgtttc cctgactgcg tgtgcgagga tgcctacaac aatacctatg cctgcgtgcg 3300
cacaatgtct gccctgtgga atctgcagta ctgtgagttc gacgatcagg aggtgtttgt 3360
ggaggtgtat aatctgaccg ccgaccctga tcagatcacc aacatcgcca agacaatcga 3420
cccagagctg ctgggcaaga tgaactaccg gctgatgatg ctgcagtctt gcagcggccc 3480
tacctgtaga acaccaggcg tgttcgaccc cggctatcgg tttgatccta gactgatgtt 3540
ttccaataga ggctccgtga ggactcggcg gtttagtaag cacctgctgt aagaattcga 3600
gctcggtacc cgggaatcaa ttcactcctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg 3660
ctggtgtggc caatgccctg gctcacaaat accactgaga tctttttccc tctgccaaaa 3720
attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 3780
ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggaagg acatatggga 3840
gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta gagtttggca acatatgccc 3900
atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg tcatcagtat atgaaacagc 3960
cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac ttgaggttag atttttttta 4020
tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa attttcctta catgttttac 4080
tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat agctgtccct cttctcttat 4140
ggagatccct cgacctgcag cccaagctgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4200
ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4260
tgaggccgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cag 4313
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> GNS 正义引物 （GNS sense primer）
<400> 13
ccacacaggg cagttctctt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> GNS 反义引物
<400> 14
gtgggaccca agtcgatgtt 20
<210> 15
<211> 646
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> CAG 启动子
<400> 15
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480
gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540
agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600
cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646
<210> 16
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> omGNS
<400> 16
atgagactgc ctagcgccgc tggccccaga cccggcagac ctagaaggct gcctgccctg 60
ctgctgctgc ctctcctggg cggatgtctg ggccttgtgg gagccgctag aaggcccaac 120
gtgctgctgc tgctgacaga cgaccaggat gccgagctgg gcggcatgac ccccctgaaa 180
aagaccaagg ccctgatcgg cgagaagggc atgaccttca gcagcgccta cgtgcccagc 240
gccctgtgct gtcccagcag agccagcatc ctgaccggca agtaccccca caaccaccac 300
gtggtgaaca acaccctgga aggcaactgc agcagcaagg cctggcagaa gatccaagaa 360
ccctacacct tccccgccat cctgaagtcc gtgtgcggct accagacctt cttcgctggc 420
aagtacctga acgagtacgg cgctcccgac gctggcggcc tggaacatat ccccctgggc 480
tggtcctatt ggtacgccct ggaaaagaac agcaagtact acaactacac cctgagcatc 540
aacggcaagg ccagaaagca cggcgagaac tacagcgtgg actacctgac cgacgtgctg 600
gccaacctga gcctggactt cctggactac aagagcaaca gcgagccatt cttcatgatg 660
atcagcaccc ctgcccccca cagcccttgg acagccgccc ctcagtacca gaaagccttc 720
cagaacgtga tcgcccccag aaacaagaac ttcaacatcc acggcaccaa caagcactgg 780
ctgatcagac aggccaagac ccccatgacc aacagctcta tcagattcct ggacgacgcc 840
ttcaggcgga gatggcagac cctgctgtcc gtggacgacc tggtggaaaa gctggtgaaa 900
agactggaca gcaccggcga gctggacaac acctacatct tctacaccag cgacaacggc 960
taccacaccg gccagttcag cctgcccatc gacaagagac agctgtacga gttcgacatc 1020
aaggtgcccc tgctcgtgcg cggacccggc atcaagccca accagaccag caagatgctg 1080
gtgtccaaca tcgacctggg ccccaccatc ctggacctgg ccggctacga cctgaacaag 1140
acccagatgg acggcatgag cctgctgcct atcctgaagg gcgacagaaa cctgacctgg 1200
cgctctgacg tgctggtgga ataccagggc gagggcagaa acgtgaccga ccctacctgc 1260
cccagcctgt ctcctggcgt gtcccagtgc ttccccgact gtgtgtgcga ggacgcctac 1320
aacaacacat acgcctgcgt gcggaccctg agcagcctgt ggaacctgca gtactgcgag 1380
ttcgatgacc aagaagtgtt cgtcgaagtc tacaacatca ccgccgaccc cgaccagatc 1440
accaatatcg ccaagagcat cgaccccgag ctgctgggca agatgaacta cagactgatg 1500
atgctgcaga gctgcagcgg ccctacctgc agaacccctg gcgtgttcga ccccggctac 1560
agattcgacc tgagactgat gttcaactcc cacggcagcg tgcgcaccag aagattcagc 1620
aagcaccccc tgtga 1635
<210> 17
<211> 7887
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> pAAV-CAG-omGNS
<400> 17
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgct agcgccacca tgagactgcc tagcgccgct ggccccagac ccggcagacc 1980
tagaaggctg cctgccctgc tgctgctgcc tctcctgggc ggatgtctgg gccttgtggg 2040
agccgctaga aggcccaacg tgctgctgct gctgacagac gaccaggatg ccgagctggg 2100
cggcatgacc cccctgaaaa agaccaaggc cctgatcggc gagaagggca tgaccttcag 2160
cagcgcctac gtgcccagcg ccctgtgctg tcccagcaga gccagcatcc tgaccggcaa 2220
gtacccccac aaccaccacg tggtgaacaa caccctggaa ggcaactgca gcagcaaggc 2280
ctggcagaag atccaagaac cctacacctt ccccgccatc ctgaagtccg tgtgcggcta 2340
ccagaccttc ttcgctggca agtacctgaa cgagtacggc gctcccgacg ctggcggcct 2400
ggaacatatc cccctgggct ggtcctattg gtacgccctg gaaaagaaca gcaagtacta 2460
caactacacc ctgagcatca acggcaaggc cagaaagcac ggcgagaact acagcgtgga 2520
ctacctgacc gacgtgctgg ccaacctgag cctggacttc ctggactaca agagcaacag 2580
cgagccattc ttcatgatga tcagcacccc tgccccccac agcccttgga cagccgcccc 2640
tcagtaccag aaagccttcc agaacgtgat cgcccccaga aacaagaact tcaacatcca 2700
cggcaccaac aagcactggc tgatcagaca ggccaagacc cccatgacca acagctctat 2760
cagattcctg gacgacgcct tcaggcggag atggcagacc ctgctgtccg tggacgacct 2820
ggtggaaaag ctggtgaaaa gactggacag caccggcgag ctggacaaca cctacatctt 2880
ctacaccagc gacaacggct accacaccgg ccagttcagc ctgcccatcg acaagagaca 2940
gctgtacgag ttcgacatca aggtgcccct gctcgtgcgc ggacccggca tcaagcccaa 3000
ccagaccagc aagatgctgg tgtccaacat cgacctgggc cccaccatcc tggacctggc 3060
cggctacgac ctgaacaaga cccagatgga cggcatgagc ctgctgccta tcctgaaggg 3120
cgacagaaac ctgacctggc gctctgacgt gctggtggaa taccagggcg agggcagaaa 3180
cgtgaccgac cctacctgcc ccagcctgtc tcctggcgtg tcccagtgct tccccgactg 3240
tgtgtgcgag gacgcctaca acaacacata cgcctgcgtg cggaccctga gcagcctgtg 3300
gaacctgcag tactgcgagt tcgatgacca agaagtgttc gtcgaagtct acaacatcac 3360
cgccgacccc gaccagatca ccaatatcgc caagagcatc gaccccgagc tgctgggcaa 3420
gatgaactac agactgatga tgctgcagag ctgcagcggc cctacctgca gaacccctgg 3480
cgtgttcgac cccggctaca gattcgacct gagactgatg ttcaactccc acggcagcgt 3540
gcgcaccaga agattcagca agcaccccct gtgatgagcg gccgcgaatt cgagctcggt 3600
acccgggaat caattcactc ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt 3660
ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg 3720
ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 3780
tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 3840
tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct 3900
ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc 3960
tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg 4020
ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag 4080
atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc cctcttctct tatggagatc 4140
cctcgacctg cagcccaagc tgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag 4200
gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 4260
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc attaatgaat 4320
cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 4380
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 4440
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 4500
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4560
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4620
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4680
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 4740
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4800
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4860
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4920
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4980
aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 5040
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 5100
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 5160
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 5220
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 5280
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 5340
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 5400
ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 5460
tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 5520
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 5580
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 5640
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 5700
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 5760
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 5820
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 5880
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 5940
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 6000
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 6060
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 6120
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 6180
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 6240
gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 6300
agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg 6360
tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt 6420
cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg 6480
tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 6540
gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 6600
attccaacat ccaataaatc atacaggcaa ggcaaagaat tagcaaaatt aagcaataaa 6660
gcctcagagc ataaagctaa atcggttgta ccaaaaacat tatgaccctg taatactttt 6720
gcgggagaag cctttatttc aacgcaagga taaaaatttt tagaaccctc atatatttta 6780
aatgcaatgc ctgagtaatg tgtaggtaaa gattcaaacg ggtgagaaag gccggagaca 6840
gtcaaatcac catcaatatg atattcaacc gttctagctg ataaattcat gccggagagg 6900
gtagctattt ttgagaggtc tctacaaagg ctatcaggtc attgcctgag agtctggagc 6960
aaacaagaga atcgatgaac ggtaatcgta aaactagcat gtcaatcata tgtaccccgg 7020
ttgataatca gaaaagcccc aaaaacagga agattgtata agcaaatatt taaattgtaa 7080
gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc 7140
aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga 7200
gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag 7260
ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt 7320
ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 7380
gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 7440
cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 7500
cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtact atggttgctt tgacgagcac gtataacgtg 7560
ctttcctcgt tagaatcaga gcgggagcta aacaggaggc cgattaaagg gattttagac 7620
aggaacggta cgccagaatc ctgagaagtg tttttataat cagtgaggcc accgagtaaa 7680
agagtctgtc catcacgcaa attaaccgtt gtcgcaatac ttctttgatt agtaataaca 7740
tcacttgcct gagtagaaga actcaaacta tcggccttgc tggtaatatc cagaacaata 7800
ttaccgccag ccattgcaac ggaatcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 7860
agggcgatcg gtgcgggcct cttcgct 7887
<210> 18
<211> 4306
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> AAV9-CAG-omGNS
<400> 18
attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60
ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120
ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840
agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080
gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140
ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200
gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260
tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320
ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380
cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440
cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500
gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560
gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620
ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680
ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740
gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800
gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860
gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920
aacgcgtgct agcgccacca tgagactgcc tagcgccgct ggccccagac ccggcagacc 1980
tagaaggctg cctgccctgc tgctgctgcc tctcctgggc ggatgtctgg gccttgtggg 2040
agccgctaga aggcccaacg tgctgctgct gctgacagac gaccaggatg ccgagctggg 2100
cggcatgacc cccctgaaaa agaccaaggc cctgatcggc gagaagggca tgaccttcag 2160
cagcgcctac gtgcccagcg ccctgtgctg tcccagcaga gccagcatcc tgaccggcaa 2220
gtacccccac aaccaccacg tggtgaacaa caccctggaa ggcaactgca gcagcaaggc 2280
ctggcagaag atccaagaac cctacacctt ccccgccatc ctgaagtccg tgtgcggcta 2340
ccagaccttc ttcgctggca agtacctgaa cgagtacggc gctcccgacg ctggcggcct 2400
ggaacatatc cccctgggct ggtcctattg gtacgccctg gaaaagaaca gcaagtacta 2460
caactacacc ctgagcatca acggcaaggc cagaaagcac ggcgagaact acagcgtgga 2520
ctacctgacc gacgtgctgg ccaacctgag cctggacttc ctggactaca agagcaacag 2580
cgagccattc ttcatgatga tcagcacccc tgccccccac agcccttgga cagccgcccc 2640
tcagtaccag aaagccttcc agaacgtgat cgcccccaga aacaagaact tcaacatcca 2700
cggcaccaac aagcactggc tgatcagaca ggccaagacc cccatgacca acagctctat 2760
cagattcctg gacgacgcct tcaggcggag atggcagacc ctgctgtccg tggacgacct 2820
ggtggaaaag ctggtgaaaa gactggacag caccggcgag ctggacaaca cctacatctt 2880
ctacaccagc gacaacggct accacaccgg ccagttcagc ctgcccatcg acaagagaca 2940
gctgtacgag ttcgacatca aggtgcccct gctcgtgcgc ggacccggca tcaagcccaa 3000
ccagaccagc aagatgctgg tgtccaacat cgacctgggc cccaccatcc tggacctggc 3060
cggctacgac ctgaacaaga cccagatgga cggcatgagc ctgctgccta tcctgaaggg 3120
cgacagaaac ctgacctggc gctctgacgt gctggtggaa taccagggcg agggcagaaa 3180
cgtgaccgac cctacctgcc ccagcctgtc tcctggcgtg tcccagtgct tccccgactg 3240
tgtgtgcgag gacgcctaca acaacacata cgcctgcgtg cggaccctga gcagcctgtg 3300
gaacctgcag tactgcgagt tcgatgacca agaagtgttc gtcgaagtct acaacatcac 3360
cgccgacccc gaccagatca ccaatatcgc caagagcatc gaccccgagc tgctgggcaa 3420
gatgaactac agactgatga tgctgcagag ctgcagcggc cctacctgca gaacccctgg 3480
cgtgttcgac cccggctaca gattcgacct gagactgatg ttcaactccc acggcagcgt 3540
gcgcaccaga agattcagca agcaccccct gtgatgagcg gccgcgaatt cgagctcggt 3600
acccgggaat caattcactc ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt 3660
ggccaatgcc ctggctcaca aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg 3720
ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat 3780
tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 3840
tcatttaaaa catcagaatg agtatttggt ttagagtttg gcaacatatg cccatatgct 3900
ggctgccatg aacaaaggtt ggctataaag aggtcatcag tatatgaaac agccccctgc 3960
tgtccattcc ttattccata gaaaagcctt gacttgaggt tagatttttt ttatattttg 4020
ttttgtgtta tttttttctt taacatccct aaaattttcc ttacatgttt tactagccag 4080
atttttcctc ctctcctgac tactcccagt catagctgtc cctcttctct tatggagatc 4140
cctcgacctg cagcccaagc tgtagataag tagcatggcg ggttaatcat taactacaag 4200
gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc 4260
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcag 4306
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> hGNS 正义引物（hGNS sense primer）
<400> 19
aaactggtca agaggctgga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> hGNS 反义引物
<400> 20
tggtttgatc ccaggtcctc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v1正义引物（ohGNS-v1 sense primer）
<400> 21
ccaacagcag catccagttt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v1 反义引物
<400> 22
cgttgtcgct ggtgtagaag 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v2正义引物（ohGNS-v2 sense primer）
<400> 23
ctgaagaaaa ccaaggcgct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v2 反义引物
<400> 24
agttcccctc gagagtgttg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v3正义引物（ohGNS-v3 sense primer）
<400> 25
aacttcaaca tccacggcac 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> ohGNS-v3 反义引物
<400> 26
actccagtct cttcaccagc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 RPLPP0正义引物 （human RPLPP0 sense primer）
<400> 27
ctctggagaa actgctgcct 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（ Artificial Sequence）
<220>
<223> 人 RPLPP0 反义引物
<400> 28
ctgcacatca ctcaggattt caa 23
PCT/RO/134表

Claims (16)

1.一种包含表达盒的多核苷酸，其中所述表达盒包含与编码GNS蛋白的核苷酸序列或其功能等效变体可操作地连接的转录调控区。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中编码GNS的所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有70％至85％的一致性。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中编码GNS的所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述转录调控区包含启动子。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中所述启动子是组成型启动子。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述启动子是CAG启动子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达盒的侧翼是腺相关病毒ITR。
8.一种载体，包含权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸的序列。
9.根据权利要求8所述的载体，其中所述载体是质粒或腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸。
10.根据权利要求8或9所述的载体，其中所述载体选自由以下各项组成的组：质粒pAAV-CAG-hGNS，登录号DSM32342，如SEQ ID NO:5所示，质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式1，登录号DSM32343，如SEQ ID NO:6所示，质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式2，登录号DSM32344，如SEQ IDNO:7所示，和质粒pAAV-CAG-ohGNS-型式3，登录号DSM32345，如SEQ ID NO:8所示。
11.根据权利要求9所述的载体，其中所述载体是血清型9的腺相关病毒载体，AAV9。
12.根据权利要求9或11所述的载体，其中所述载体包含重组病毒基因组，其中所述重组病毒基因组包含选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的组的编码GNS的核苷酸序列。
13.一种药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸或权利要求8至12中任一项所述的载体。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，根据权利要求8至12中任一项所述的载体或根据权利要求13所述的药物组合物，用于在药物中应用。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，根据权利要求8至12中任一项所述的载体或根据权利要求13所述的药物组合物，用于在治疗粘多糖症ⅢD型中应用。
16.一种获得权利要求9、11或12所述的载体的方法，包括以下步骤：
(i)提供包含本发明的多核苷酸、AAV cap蛋白、AAV rep蛋白和可选的AAV依赖于其进行复制的病毒蛋白的细胞，
(ii)在适于组装所述AAV的条件下维持所述细胞；和
(iii)纯化由所述细胞产生的腺相关病毒载体。
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