CN109852587A - 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。该方法包括：1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS‑iPSC；2)将所述CS‑iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。本发明制备的间充质干细胞或神经干细胞可以作为有效的平台进行高效高通量的个性化药物筛选，为疾病研究、开发疾病模型、研究疾病的发病机制并进行疾病治疗奠定基础。在个性化治疗和转化医学中具有巨大的应用前景。

Description

一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。

背景技术

科凯恩氏综合征(Cockayne syndrome，CS)又称侏儒征、视网膜萎缩和耳聋综合征，或小头、纹状体小脑钙化和白质养分不良综合征。该症由英国医生科凯恩(EdwardAlfred Cockayne)于1936年首次发现，是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，发病率约为百万分之2左右。研究显示科凯恩氏综合征发病与ERCC6/CSB、ERCC8/CSA基因突变相关，上述基因的突变致使科凯恩氏综合征病人表现出包括面容苍老、头小、驼背、皮肤对光敏感，皮下脂肪缺失、白内障、视神经萎缩、耳聋等一系列提前衰老的典型症状，患者平均寿命仅12岁。分子机制研究表明，ERCC6、ERCC8主要参与了DNA损伤修复。核苷酸切除修复是紫外(UV)照射产生DNA损伤的最主要修复途径，可分为全基因组修复(global genome repair，GGR)和转录偶联修复(transcription-coupled repair，TCR)。GGR修复全基因组上的DNA损伤，而TCR只能处于修复转录过程中的DNA损伤。ERCC6-ERCC8复合体主要参与TCR修复通路，ERCC6-ERCC8复合体能够识别DNA损伤位点，并招募下游的蛋白对DNA损伤位点进行切割及修复。大约三分之二的CS病人是ERCC6基因突变。ERCC6基因突变影响DNA损伤的修复，造成基因组的不稳定性，引发病人对紫外的敏感性及紫外诱导的细胞凋亡水平增加。

虽然利用模式动物，如小鼠等能够部分再现CS疾病表型，有助于研究CS的发病机制。但由于种属差异较大，人和模式动物的遗传背景不同，因此通过基因敲除等产生的CS小鼠疾病模型并不能真正反映病人的生理状况，如CS病人不产生皮肤癌，而CS小鼠模型会产生严重的皮肤癌。此外，在模式动物中筛选的治疗CS的药物在临床上可能并不适用，不能有效地缓解CS症状。目前对于CS早衰及神经退行的机理研究处于停滞状态，主要原因就是很难获得合适的实验材料。因此，构建人类CS疾病特异的细胞模型将有助于解决这一问题，将为理解CS疾病的细胞表型及分子机制提供线索。

近年来，诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)技术的出现和发展为多种罕见类疾病的基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC是通过将特定转录因子(如OCT4，SOX2，KLF4，c-MYC等)导入体细胞，使其转变成为具有自我更新及多向分化潜能的干细胞。iPSC衍生的成体干细胞不仅可用于细胞移植，器官再生，还可以构建疾病模型，以便于研究疾病发病机制，筛选新的药物及开发新的治疗方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。

第一方面，本发明要求保护一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。

本发明所提供的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，可包括如下步骤：

(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)，记为CS-iPSC；

(A2)将所述CS-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)。

第二方面，本发明要求保护一种经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法。

本发明所提供的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞，可包括如下步骤：

(B1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞(无法正常表达全长ERCC6蛋白)，记为CS-iPSC；

(B2)对所述CS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变，得到能表达全长ERCC6蛋白的诱导多能干细胞，记为GC-iPSC；

(B3)将所述GC-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞(正常表达全长ERCC6蛋白)。

其中，所述重编程指不改变基因序列的情况下，通过表观遗传修饰(如DNA甲基化)来改变细胞命运的过程。目前重编程主要指两个过程：其一，分化的细胞逆转恢复到全能性状态的过程；其二，从一种分化细胞转化为另一种分化细胞的过程。本发明中的重编程主要涉及其一。

进一步地，前述第一方面中的步骤(A1)和前述第二方面中的步骤(B1)中，所述重编程均可为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入(如电转)所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC。

更进一步地，所述共同导入的方法可包括如下步骤：将表达OCT3/4基因的Episomal载体、表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体和表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞。所述表达OCT3/4基因的Episomal载体具体为pCXLE-hOCT3/4-shp53-F质粒；所述表达SOX2基因和KLF4基因的Episomal载体为pCXLE-hSK质粒；所述表达L-Myc基因和LIN28基因的Episomal载体为pCXLE-hUL质粒。为了便于阳性克隆的筛选，还可以同时导入含有标记基因的质粒，如pCXLE-EGFP质粒(该质粒携带并表达EGFP基因)。四种质粒的质量配比可为1:1:1:1。所述培养具体可为：先在成纤维细胞培养基中培养1天后换液，用所述成纤维细胞培养基继续培养至第5天后转接到含有预先用丝裂霉素灭活处理过的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层体系中用人类诱导多能干细胞培养基培养至第3周，获得所述CS-iPSC。其中，所述人类诱导多能干细胞培养基的组成如下：基础培养基为DMEM/F12培养基(GIBCO，货号为11330-032)，20％(体积百分含量)Knockout血清替代物(GIBCO，货号为10828-028)，1mM GlutaMAX(Invitrogen，货号为35050-061)，0.1mM非必需氨基酸(GIBCO，货号为11140-050)，55μMβ-巯基乙醇(GIBCO,货号为21985-023)，10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml。所述成纤维细胞培养基的组成如下：基础培养基为DMEM培养基(HyClone，货号为SH30243.01)，10％(体积百分含量)胎牛血清(Gemcell，货号为100-500)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml。

在本发明中，前述第一方面和第二方面中所述的科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变具体为c.643 G>T(位于ERCC6基因的第4外显子)和/或c.3776 C>A(位于ERCC6基因的第18外显子)。

相应的，在前述第二方面中的步骤(B2)中，所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”具体为将所述c.643 G>T矫正为c.643 G>G，和/或将所述c.3776 C>A矫正为c.3776 C>C。

ERCC6基因的c.643 G>T和c.3776 C>A这两个突变而导致的CS疾病属于常染色体隐性遗传，这两个突变均为无义突变，突变后会导致ERCC6肽链合成提前终止，使病人机体内的DNA修复不能正常进行，进而导致CS疾病的发生。因此，所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”只要确保“分别来自于母亲和父亲的同源的两条染色体至少有一条既不存在c.643 G>T，也不存在c.3776 C>A(即全长ERCC6蛋白可正常表达)”即可。

所述c.643 G>T是指ERCC6基因(Gene ID:2074)的基因编码序列(CDS序列)的第643位发生了从G到T的突变。所述c.3776 C>A是指ERCC6基因Gene ID:2074)的基因编码序列(CDS序列)的第3776位发生了从C到A的突变。所述ERCC6蛋白由所述ERCC6基因(Gene ID:2074)表达。

进一步地，前述第二方面中的步骤(B2)可利用CRISPR/Cas9技术进行。具体可为：将gRNA表达质粒、Cas9表达质粒和重组模板共同转入所述CS-iPSC，并培养至获得所述GC-iPSC。

在本发明的一个实施例中，所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”为将所述c.643 G>T矫正为c.643 G>G。相应的，所述gRNA表达质粒中的gRNA的识别区域序列(即间隔序列spacer对应的编码序列)为SEQ ID No.1；所述重组模板为SEQ IDNo.2所示的单链寡脱氧核苷酸。所述gRNA表达质粒具体为ERCC6-gRNA-mCherry；所述ERCC6-gRNA-mCherry为将含有SEQ ID No.1所示的DNA片段***到gRNA-mCherry载体(Addgene,货号为#78544)的酶切位点AflII间后得到的重组质粒。所述Cas9表达质粒为Cas9-GFP；所述Cas9-GFP购自美国Addgene公司，货号为#59766。其中，所述gRNA表达质粒、所述Cas9表达质粒和所述重组模板的质量配比为1:2:2。所述培养具体可为：将成功转入所述gRNA表达质粒、所述Cas9表达质粒和所述重组模板的所述CS-iPSCs转接到含有预先用丝裂霉素灭活处理过的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层体系中用人类诱导多能干细胞培养基培养2周，获得所述GC-iPSCs。

对所述GC-iPSCs进行阳性鉴定的方法具体为用PCR技术扩增出包含突变位点的片段，通过DNA测序技术最终得到基因突变将所述c.643 G>T矫正为c.643 G>G的克隆，即为阳性克隆。PCR引物序列如下：ERCC6-F1：5’-AGAACAAGTCCACCTTTC-3’；ERCC6-R1：5’-CACCCTCCACTGACTACA-3’。

进一步地，前述第一方面和第二方面中，所述成纤维细胞可为皮肤成纤维细胞。所述成体干细胞可为间充质干细胞(MSC)或神经干细胞(NSC)。

当所述成体干细胞为间充质干细胞时，在前述第一方面中的步骤(A2)和前述第二方面中的步骤(B3)中，可按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为间充质干细胞：

(a1)将无饲养层培养的所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行拟胚体分化(如分化3天)，获得拟胚体；(a2)按照以下两种分化方法分别获得普通级别的间充质干细胞(方法一)，以及临床级别的间充质干细胞(方法二)：

方法一：将所述拟胚体接种于基质胶(Matrigel)包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞(具体可培养至纤维状细胞出现(培养时间如2周)；再经过一次传代(4-5天传代一次)后)，利用流式细胞术分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞(分别记为CS-MSCs，GC-MSCs)。

方法二：将所述拟胚体接种于玻璃粘连蛋白Vitronectin(Gibco,A14700))包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞(具体可培养至纤维状细胞出现(培养时间如2周)；再经过一次传代(4-5天传代一次)后)，利用流式细胞术分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞(分别记为CS-MSCs，GC-MSCs)。

步骤(a2)方法一中，所述培养是在间充质干细胞培养基1中进行的。所述间充质干细胞培养基1为在基础培养基αMEM培养基(Invitrogen，货号12571071)中加入胎牛血清(Gemcell，货号为100-500)、青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)、重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)和TGFβ(Human-zyme，HZ1131)后得到的培养基。其中，所述胎牛血清(Invitrogen，10091148)在所述间充质干细胞培养基1中的体积百分含量为10％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000Units/ml,链霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)在所述间充质干细胞培养基1中的含量为10ng/ml；所述TGFβ(Human-zyme，HZ1131)在所述间充质干细胞培养基1中的含量为5ng/ml。

步骤(a2)方法二中，所述培养是在间充质干细胞培养基2中进行的。所述间充质干细胞培养基2为在MSC基础培养基(Dakewe,货号为DKW34-BM20500)中加入血清替代物(Helios,GMP级别,货号为HPCFDCGL50)、TGFβ(Human-Zyme，HZ1131)、重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)、EGF(Peprotech，货号为AF-100-15)、PDGF(Peprotech，货号为100-00AB)、青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)后得到的培养基。其中，所述血清替代物(Helios,GMP级别,货号为HPCFDCGL50)在所述间充质干细胞培养基2中的体积百分含量为5％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基2中终浓度为10000Units/ml,链霉素在所述间充质干细胞培养基2中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)在所述间充质干细胞培养基2中的含量为6ng/ml；所述TGFβ(Human-zyme，HZ1131)在所述间充质干细胞培养基2中的含量为5ng/ml；所述EGF(Peprotech，货号为AF-100-15)在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml；所述PDGF(Peprotech，货号为100-00AB)在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml。

当所述成体干细胞为神经干细胞时，在前述第一方面中的步骤(A2)和前述第二方面中的步骤(B3)中，可按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为神经干细胞：

(b1)在人类诱导多能干细胞培养基(配方见上文)中对所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行诱导培养，得到诱导培养后细胞；

(b2)在神经干细胞诱导培养基1中对所述诱导培养后细胞进行第一次分化培养，得到第一次分化培养后细胞；

(b3)在神经干细胞诱导培养基2中对所述第一次分化培养后细胞进行第二次分化培养，得到所述神经干细胞(分别记为CS-NSCs，GC-NSCs)。

所述神经干细胞基础诱导培养基为在Advanced DMEM/F12(GIBCO,货号为12634-028)培养基中添加Neurobasal培养基(GIBCO,货号为12348-017)、N2(Invitrogen，货号为17502-048)、B27(Invitrogen，货号为17504-044)、GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)、人白血病抑制因子hLIF(Millipore,货号为LIF1050)、CHIR99021(Stemgent，货号为04-0004)和SB431542(Cellagen technology，货号为C7243-5)得到的培养基；所述Advanced DMEM/F12培养基在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为48.5％；所述Neurobasal培养基在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为48.5％；所述N2在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为1％；所述B27在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为2％；所述GlutaMAX在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为2mM；所述CHIR99021在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为3μM；所述SB431542在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为2μM；所述人白血病抑制因子hLIF在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为10ng/ml。

其中，所述神经干细胞诱导培养基2为在神经干细胞基础诱导培养基中添加Compound E(γ分泌酶抑制剂XXI，具体如EMD Millipore公司货号为565790的产品)、CHIR99021、SB431542得到的培养基；所述Compound E在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为0.1μM；额外添加1μM的CHIR99021，使CHIR99021在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为4μM；额外添加1μM的SB431542，使SB431542在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为3μM。

所述神经干细胞诱导培养基1为在所述神经干细胞诱导培养基2中添加Dorsomorphin(Sigma,货号为P5499)得到的培养基，所述Dorsomorphin在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为2μM。

所述人类诱导多能干细胞培养基为在基础培养基(如DMEM/F12培养基)上添加Knockout血清替代物、非必需氨基酸、GlutaMAX、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子FGF2得到的培养基；所述Knockout血清替代物在所述人类诱导多能干细胞培养基中的体积分数为20％；所述非必需氨基酸在所述诱导多能干细胞培养基中的浓度为0.1mM；所述GlutaMAX在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为1mM；所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml；所述β-巯基乙醇在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为55μM；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为10ng/ml。

在步骤(b3)中，还可包括如下步骤：将所述第二次分化培养得到的细胞在所述神经干细胞基础诱导培养基中传代培养，得到所述神经干细胞。具体地，所述传代培养为每4-5天传代一次，连续传至第三代。

在步骤(b1)中，所述诱导培养的时间可为1-3天；所述诱导培养的具体时间为2天。

在步骤(b2)中，所述第一次分化培养的时间可为1-3天；所述第一次分化培养的时间具体为2天。

在步骤(b3)中，所述第二次分化培养的时间可为4-6天；所述第二次分化培养的时间为5天。

第三方面，本发明要求保护由前述第一方面所述方法制备得到的所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞以及由前述第二方面所述方法制备得到的所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。所述成体干细胞可为间充质干细胞或神经干细胞。

第四方面，本发明要求保护一种制备前文所述CS-iPSC的方法。该方法包括前文所述的步骤(A1)。

第五方面，本发明要求保护由前文第四方面所述方法制备得到的所述CS-iPSC。

第六方面，本发明要求保护一种制备前文所述GC-iPSC的方法。该方法包括前文所述的步骤(B1)-(B2)。

第七方面，本发明要求保护由前文第六方面所述方法制备得到的所述GC-iPSC。

第八方面，本发明要求保护用于制备前文所述的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的试剂盒，含有前文所述人类诱导多能干细胞培养基、所述间充质干细胞培养基1、所述间充质干细胞培养基2、所述神经干细胞基础诱导培养基、所述神经干细胞诱导培养基1、所述神经干细胞诱导培养基2和所述的神经干细胞基础诱导培养基中的至少一种。

第九方面，本发明要求保护前文第一至八方面所述的方法或所述的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(A)制备用于筛选和/或鉴定用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品；或用于筛选和/或鉴定用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物；

(B)制备用于研究科凯恩氏综合征发病机制的产品；

(C)制备用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的产品；或用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征；

(D)制备科凯恩氏综合征的细胞模型。

本发明获得的多能干细胞具有如下优点：1)在体外具有自我更新和分化成三个胚层的潜能，因而可以定向分化成受疾病累积的细胞系；2)获得的多能干细胞无外源基因整合，具有安全性，利用现有的基因打靶技术可以针对患者自体来源的诱导型多能干细胞进行基因突变的基因组原位校正，从而在基因水平清除内源性致病因素；3)患者自体来源的诱导多能干细胞，避免了配型和排斥反应的困扰。

本发明利用iPSC技术将CS疾病人来源的皮肤成纤维细胞，通过非整合附加型质粒电转的方法使其重编程为其特异性的诱导多能干细胞，并将其定向分化成间充质干细胞或神经干细胞，这些细胞在体外表现出对于UV的极度敏感，更易发生细胞凋亡，为CS疾病发生的早衰及神经退行提供了一定的线索。另外，这些携带病人基因突变的间充质干细胞或神经干细胞可以作为有效的平台进行高效高通量的个性化药物筛选，为疾病研究、开发疾病模型、研究疾病的发病机制并进行疾病治疗奠定基础。在个性化治疗和转化医学中具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为CS疾病特异的成纤维细胞突变位点的鉴定。通过基因组DNA PCR及测序，鉴定CS疾病特异的成纤维细胞中外显子4及外显子18上的突变位点。

图2为CS疾病特异及突变位点校正的诱导多能干细胞特性鉴定。A：利用CRISPR/Cas9基因编辑***校正ERCC6基因c.643 G>T突变的策略。B：通过基因组DNA PCR及测序鉴定c.643 G>T突变位点已被校正。C：RT-PCR鉴定CS疾病特异及突变位点校正的诱导多能干细胞中多能干细胞标志物SOX2、OCT4、NANOG的表达。D：免疫荧光染色鉴定CS疾病特异及突变位点校正的诱导多能干细胞中多能干细胞标志物SOX2、OCT4、NANOG的表达。E：CS疾病特异及突变位点校正的诱导多能干细胞均能在体内形成畸胎瘤，均能分化形成外胚层，中胚层，内胚层的细胞。F：CS疾病特异及突变位点校正的诱导多能干细胞保持正常的核型。G：qPCR鉴定重编程过程中外源质粒EBNA-1元件的整合。ERCC6^mut代表CS疾病特异的成纤维细胞或CS-iPSCs，ERCC6^GC代表GC-iPSCs。

图3为CS疾病特异及突变位点校正的间充质干细胞及神经干细胞的分化及鉴定。A：流式细胞术鉴定CS疾病特异及突变位点校正的间充质干细胞的细胞表面标志物CD105、CD73、CD90的表达。B：免疫荧光染色鉴定CS疾病特异及突变位点校正的神经干细胞中分子标志物Nestin、PAX6、SOX2的表达。ERCC6^mut代表CS-MSCs或CS-NSCs，ERCC6^GC代表GC-MSCs或GC-NSCs。

图4为CS疾病特异及突变位点校正的间充质干细胞及神经干细胞的表型鉴定。A：CS疾病特异及突变位点校正的间充质干细胞的生长曲线显示，随着传代次数增加，CS-MSCs相较于GC-MSCs出现生长阻滞。B：衰老特异的SA-beta-Gal染色及SA-beta-Gal阳性细胞比率的统计分析显示，随着传代次数增加，CS-MSCs相较于GC-MSCs出现SA-beta-Gal染色阳性比例显著增加的现象，提前进入衰老状态。C：免疫荧光分析显示CS-MSCs在10J/m²UV照射后DNA嘧啶二聚体——CPD的信号强度显著增加。D：免疫荧光分析显示CS-NSCs在5J/m²照射后DNA上环丁烷嘧啶二聚体——CPD的信号强度显著增加。E：流式细胞术显示CS-MSCs在10J/m²UV照射后Annexin V阳性的凋亡细胞的比例显著增加。F：流式细胞术显示CS-NSCs在5J/m²UV照射后Annexin V阳性的凋亡细胞的比例显著增加。ERCC6^mut代表CS-MSCs或CS-NSCs，ERCC6^GC代表GC-MSCs或GC-NSCs。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37℃，5％CO₂。

1、细胞系如下：

CS病人皮肤成纤维细胞。正常对照野生型成纤维细胞(GM00038)为美国的CoriellCell Repository产品。

2、质粒如下：

下述实施例中的pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(#27077)、pCXLE-hSK(#27078)、pCXLE-hUL(#27080)和pCXLE-EGFP(#27082)均为Addgene产品。

3、下述实施例中的用于免疫荧光的抗体如下(使用比例)：

抗人OCT4抗体(sc-5279)，Santa Cruz Biotechnology(1：100)。

抗人SOX2抗体(sc-17320)，Santa Cruz Biotechnology(1：100)。

抗人NANOG抗体(ab21624)，Abcam(1：100)。

抗人Nestin抗体(MAB5326)，Millipore(1：250)。

抗人PAX6抗体(PRB-278P)，Covance(1：250)。

抗人TUJ1抗体(T2220)，Sigma(1：100)。

抗人FOXA2抗体(8186)，Cell Signaling Technology(1：100)。

抗人SMA抗体(A5228)，Sigma(1：100)。

抗人CPD抗体(TMD-2)，Cosmo Bio(1：100)。

4、用于流式细胞术分选MSC的荧光标记抗体如下：

荧光素FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体，BD Biosciences，货号：555595(1：100)。

荧光素PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体，BD Biosciences，货号：550257(1：100)。

荧光素APC标记的抗人细胞表面识别分子CD105抗体，BD Biosciences，货号：17-1057-42(1：100)。

荧光素APC标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555751(1：100)。

荧光素PE标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555749(1：100)。

荧光素FITC标记同型对照抗体，BD Biosciences，货号：555742(1：100)。

5、实施例中的培养基配方如下：

1)成纤维细胞培养基配方：基础培养基为DMEM培养基(HyClone，货号为SH30243.01)，10％(体积百分含量)胎牛血清(Gemcell，货号为100-500)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml。

2)人类诱导多能干细胞培养基配方：基础培养基为DMEM/F12培养基(GIBCO，货号为11330-032)，20％(体积百分含量)Knockout血清替代物(GIBCO，货号为10828-028)，1mMGlutaMAX(Invitrogen，货号为35050-061)，0.1mM非必需氨基酸(GIBCO，货号为11140-050)，55μMβ-巯基乙醇(GIBCO,货号为21985-023)，加入青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063)，使所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml；10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002)。

3)间充质干细胞(MSC)培养基1配方：基础培养基为αMEM培养基(Invitrogen，12571071)；10％(体积百分含量)胎牛血清(Invitrogen，10091148)；1％青霉素/链霉素(GIBCO，15070-063，所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml)；10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子FGF2(Joint Protein Central，货号为BBI-EXP-002))；5ng/ml TGFβ(Human-zyme，HZ1131)。

间充质干细胞培养基2配方：MSC基础培养基(Dakewe,货号为DKW34-BM20500)；5％血清替代物(Helios,GMP级别,货号为HPCFDCGL50)；5ng/ml TGFβ(Human-Zyme，HZ1131)；6ng/ml重组人成纤维细胞生长因子FGF2(JointProtein Central，货号为BBI-EXP-002)；10ng/ml EGF(Peprotech，货号为AF-100-15)；10ng/ml PDGF(Peprotech，货号为100-00AB)；青霉素/链霉素(GIBCO，货号为15070-063，所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml)。

4)神经干细胞诱导培养基1配方：48.5％(体积百分含量)Advanced DMEM/F12培养基(GIBCO,货号为12634-028)、48.5％(体积百分含量)Neurobasal培养基(GIBCO,货号为12348-017)、1％(体积百分含量)N2(Invitrogen，货号为17502-048)、2％(体积百分含量)B27(Invitrogen，货号为17504-044)、2mM GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)、10ng/ml人白血病抑制因子hLIF(Millipore,货号为LIF1050)、4μM CHIR99021(Stemgent，货号为04-0004)、3μM SB431542(Cellagentech，货号C7243-5)、0.1μM Compound E(EMD Millipore，货号为565790)、2μM Dorsomorphin(Sigma，货号为P5499)。

5)神经干细胞诱导培养基2配方：48.5％(体积百分含量)Advanced DMEM/F12培养基(GIBCO,货号为12634-028)、48.5％(体积百分含量)Neurobasal培养基(GIBCO,货号为12348-017)、1％(体积百分含量)N2(Invitrogen，货号为17502-048)、2％(体积百分含量)B27(Invitrogen，货号为17504-044)、2mM GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)、10ng/ml人白血病抑制因子hLIF(Millipore,货号为LIF1050)、4μM CHIR99021(Stemgent，货号为04-0004)、3μM SB431542(Cellagentech，货号C7243-5)、0.1μM Compound E(EMD Millipore，货号为565790)。

6)神经干细胞基础诱导培养基配方：48.5％(体积百分含量)Advanced DMEM/F12培养基(GIBCO,货号为12634-028)、48.5％(体积百分含量)Neurobasal培养基(GIBCO,货号为12348-017)、1％(体积百分含量)N2(Invitrogen，货号为17502-048)、2％(体积百分含量)B27(Invitrogen，货号为17504-044)、2mM GlutaMAX(Invitrogen，35050-061)、10ng/ml人白血病抑制因子hLIF(Millipore,货号为LIF1050)、3μM CHIR99021(Stemgent，货号为04-0004)、2μM SB431542(Cellagentech，货号C7243-5)

6、实施例中的细胞培养方法如下：

1)成纤维细胞的培养

用成纤维细胞培养基培养，隔天换液，每3-4天传一次代。传代时按1:3或1:4传代。

2)诱导多能干细胞的培养

饲养层体系：将诱导多能干细胞接种至预先铺好的经过丝裂霉素(美国Sigma公司产品，货号：M0503)灭活处理的小鼠胚胎成纤维细胞(美国Invitrogen公司产品，货号：S1520-100)的培养板中，使用诱导多能干细胞培养基与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养，每5-7天传一次代。

无饲养层体系1：将诱导多能干细胞接种至预先用细胞外基质基质胶(Growthfactor reduced-Matrigel，美国BD Biosciences产品，货号：354277)包被的培养板中，使用mTeSR培养基(美国StemCell Technologies产品)培养，每5-7天传一次代。用于普通级别的间充质干细胞分化(方法一)。

无饲养层体系2：将诱导多能干细胞接种至预先用细胞外基质Vitronectin(Gibco,A14700))包被的培养板中，使用mTeSR培养基(美国StemCell Technologies产品)培养，每5-7天传一次代。用于临床级别的间充质干细胞分化(方法二)。操作环境为GMP级别的干细胞培养间。

3)间充质干细胞的培养

将流式细胞术分选得到的间充质干细胞接种至预先用明胶Gelatin(Sigma，V900863-500G)包被的培养板中，用间充质干细胞培养基培养。每4-5天传一次代。

4)神经干细胞的培养

将神经干细胞接种至预先用Matrigel包被的培养板中，用神经干细胞基础诱导培养基培养。每4-5天传一次代。

实施例1、携带CS病人特异基因突变的诱导多能干细胞系的建立及其鉴定

为了原代培养获得CS病人来源的皮肤成纤维细胞，在病人签署知情同意书后，本发明对携带ERCC6杂合突变(c.643G>T，p.E215X(母源)；c.3776C>A，p.S1259X(父源)。该突变具有典型CS致病突变的特点，突变为累及ERCC6基因的杂合无义突变，导致ERCC6肽链合成提前终止，使病人机体内的DNA修复不能正常进行，进而导致CS疾病的发生)的CS病人进行诊断性皮肤活检并留取部分皮肤组织，进行原代培养得到皮肤成纤维细胞。通过PCR扩增携带突变的片段并进行DNA测序，对突变位点进行鉴定。

鉴定用正向引物(c.643G>T)F1：5’-AGAACAAGTCCACCTTTC-3’；

鉴定用反向引物(c.643G>T)R1：5’-CACCCTCCACTGACTACA-3’。

鉴定用正向引物(c.3776C>A)F2：5’-TCCTTTGAAAGATGACCCTC-3’；

鉴定用反向引物(c.3776C>A)R2：5’-ACAGCCCTCTATGCACCA-3’。

进行PCR及DNA测序后鉴定了两个突变位点的存在(图1)。

本发明涉及将CS病人来源的成纤维细胞进行重编程。重编程具体方法如下：

1)将携带ERCC6基因突变(c.643G>T，p.E215X(母源)；c.3776C>A，p.S1259X(父源))的CS病人来源的成纤维细胞扩大培养。

2)待细胞长到合适密度，消化，计数，取1.5×10⁶细胞，离心收集。

3)准备电转液：82μL P2 primary cell solution(Lonza)，18μL supplementary1(Lonza)到1.5ml EP管中，再加入1.5μg pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，1.5μg pCXLE-hSK，1.5μg pCXLE-hUL和1.5μg pCXLE-EGFP，混匀。

4)用上述混合的电转液将收集好的细胞重悬，转移到电转杯中，正确放入电转仪中，进行电转。

5)电转完成后，从电转杯中吸出细胞悬液，加入到事先加成纤维细胞培养基预热的六孔板的一个孔中，摇晃均匀，放回培养箱中培养。

6)第二天换液，观察电转效率。

7)持续用成纤维细胞培养基培养至第5天，消化接种至预先铺好的经过丝裂霉素灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养板中，使用人类诱导多能干细胞培养基持续培养。

8)大约培养至三周就会有类似于胚胎干细胞的小克隆长出。

9)将小克隆挑至预先铺好的经过丝裂霉素灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养板中扩大培养，经鉴定获得iPSC(ERCC6 G643T-iPSC，具体鉴定结果见实施例2相关部分)。

步骤3)中，按照P1Primary Cell 4D-Nucleofector Kit(Lonza)说明书配制细胞悬液。步骤4)中用到的电转仪是4D电转仪(Lonza，4D-Nucleofector^TMSystem)。

实施例2、靶向校正CS-iPSC携带的ERCC6基因突变

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对实施例1获得的iPSC(ERCC6 G643T-iPSC)携带的基因突变c.643G>T进行靶向清除，最终得到消除基因突变c.643G>T的iPSC，并进行多能干细胞特征的鉴定。

具体步骤如下：

1、靶向校正CS-iPSC携带的ERCC6基因突变c.643G>T

1)细胞培养

在基质胶(Matrigel)包被的培养板中培养所述实施例1获得的CS-iPSCs，培养基为mTESR。待克隆密度达到70％-80％，TrypLE消化，计数，收集5×10⁶个细胞。

2)电转液制备

将8μg Cas9-GFP质粒，8μg基因矫正的重组模板和4μg相应基因矫正的gRNA-mCherry质粒混匀，用opti-MEM(life technology)定容至100μl，得到电转液，置于1.5mlEP管中。相应基因矫正的gRNA-mCherry质粒为ERCC6-gRNA-mCherry；相应基因矫正的重组模板为SEQ ID No.2所示的单链寡脱氧核苷酸。所述ERCC6-gRNA-mCherry的构建方法如下：首先利用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(NEB，货号为M0532)将合成的ERCC6 gRNA oligo(ERCC6 gRNA-mCherry-F和ERCC6-gRNA-mCherry-R)退火延伸成为双链DNA，然后利用Gibson Assemly Master Mix(NEB，货号为E2611)将所述ERCC6gRNA双链DNA经同源重组连接进入用限制性内切酶AflII酶切纯化后的gRNA-mCherry载体(Addgene,货号为#78544)，从而构建成为所述ERCC6-gRNA-mCherry载体。

ERCC6 gRNA-mCherry-F：

5’-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGATCACGCCAGTCTGGAGTAGG-3’；

ERCC6-gRNA-mCherry-R：

5’-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCCTACTCCAGACTGGCGTGATCC-3’。

所述ERCC6-gRNA-mCherry的结构描述如下：将含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(gRNA的识别区域序列，即间隔序列spacer对应的编码序列)***到gRNA-mCherry质粒的酶切位点AflII间后得到的重组质粒。

其中，所述Cas9-GFP质粒(货号：#63592)和gRNA-mCherry空载体(货号：#62340)均为Addgene公司产品。

3)电转

用步骤2)中获得的电转液重悬步骤1)中收集的相对应的细胞，然后转移到电转杯里，并放入电转仪(Lonza 4D nucleofector)中，进行电转，电转程序选择CM113(具体步骤参考Lonza 4D nucleofector说明书)，分别得到电转后的细胞悬液(5×10⁶细胞/100μl)。

4)分别将电转后的细胞悬液加入到Matrigel包被的培养板中，用mTESR培养，放回培养箱中。电转24小时后，观察电转效率。用荧光显微镜观察绿色荧光和红色荧光，双阳性比例大于1％，即可进行下一步实验。

5)电转48小时后，TrypLE消化收集细胞，用流式细胞仪分选双阳性细胞。将分选得到的细胞置入到预先铺好经过丝裂霉素灭活处理的MEF的六孔板的孔中，用人类诱导多能干细胞培养基培养，放回培养箱中。

6)持续用人类诱导多能干细胞培养基培养约14天，即可看到由单细胞形成的小克隆，用PCR技术扩增出包含突变位点的片段，再进行DNA测序分析。

经鉴定，最终成功获得基因突变c.643G>T矫正为c.643G>G的克隆，即为阳性克隆，简称为GC-iPSC。PCR引物序列如下：ERCC6-F1：5’-AGAACAAGTCCACCTTTC-3’；ERCC6-R2：5’-CACCCTCCACTGACTACA-3’。

具体的基因突变校正方案和鉴定结果如图2中A、B所示。

2、CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞特性鉴定

上述得到的克隆状细胞扩大培养后需要鉴定其是否诱导型多能干细胞。

首先，通过RT-PCR和免疫荧光检测干细胞标记物NANOG，OCT4，SOX2的表达(图2中C和D)。结果显示CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞均正常表达干细胞的标志物，说明CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞保持良好的多能干性。

其次，通过将所得多能干细胞注射进免疫缺陷小鼠皮下，检测其是否具有分化成三个胚层的潜能(图2中E)。结果显示CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞均能在体内形成畸胎瘤，具有分化成三个胚层的潜能，说明CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞保持良好的多能干性。

再次，核型检测也证明这些细胞具有正常的核型(图2中F)。结果显示CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞均保持染色体的稳定性。

最后，本发明检测了其中外源基因的整合性，证明所得到的诱导多能干细胞是不存在外源基因***的(图2中G，其中GM0038是野生型成纤维细胞重编程得到的iPSC)。结果显示电转后4天的成纤维细胞的EBNA-1的拷贝数很多，而CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞EBNA-1的拷贝数极低，说明CS疾病特异及突变校正的诱导多能干细胞几乎无外源基因***。

具体实验方法包括：

1)RT-PCR：使用TRIzol试剂(Invitrogen)和GoScript Reverse TranscriptionSystem(Promega)进行总RNA提取和cDNA合成。使用0.1μg cDNA进行PCR。引物如下：

18S正向引物：5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'；

18S反向引物：5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。

NANOG正向引物：5'-ACA ACT GGC CGA AGA ATA GCA-3'；

NANOG反向引物：5'-GGT TCC CAG TCG GGT TCA C-3'。

OCT4正向引物：5'-GGG TTT TTG GGA TTA AGT TCT TCA-3'；

OCT4反向引物：5'-GCC CCC ACC CTT TGT GTT-3'。

SOX2正向引物：5'-CAA AAA TGG CCA TGC AGG TT-3'；

SOX2反向引物：5'-AGT TGG GAT CGA ACA AAA GCT ATT-3'。

2)免疫荧光检测干细胞标记物NANOG，OCT4，SOX2的表达：将上述所得的诱导多能干细胞以小克隆接种到用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上，待其贴壁后，先用4％多聚甲醛固定30分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次，再用含0.04％TritonX-100的PBS通透30分钟，PBS洗3次。然后用10％的驴血清封闭1个小时。一抗(抗人鼠源OCT4抗体、抗人羊源SOX2抗体、抗人兔源NANOG抗体)按照适当比例稀释后于4度孵育过夜。第二天，再用PBS洗3次后加入适当比例稀释的二抗孵育1个小时。Hoechst 33342(Invitrogen)染细胞核。PBS洗3次后，用封片剂(Vector)封片。之后就可以在激光共聚焦显微镜下进行观察，拍照。

3)畸胎瘤实验：将上述诱导多能干细胞接种到没有饲养层的Matrigel包被的培养板上培养，待细胞长满，消化计数，取4×10⁶细胞用含20％(体积百分含量)Matrigel，80％(体积百分含量)mTesR的混合液重悬，打入免疫缺陷小鼠皮下。大约8周后，即可有黄豆大小的畸胎瘤长成。脱颈处死小鼠后，将畸胎瘤取出，于4％多聚甲醛中固定两天使其充分固定后，于30％(30g/100mL)蔗糖溶液中脱水。待其充分脱水后，使用Compound O.C.T包埋剂进行包埋。然后在冰冻切片机上进行切片，厚度为12μm。组织切片晾干后，即可进行免疫荧光检测三个胚层标记物的表达：TUJ1(外胚层标记物)、FOXA2(内胚层标记物)和α-SMA(中胚层标记物)。免疫荧光操作步骤如上所述。使用一抗比例见前述抗体列表：抗人兔源TUJ1抗体、抗人兔源FOXA2抗体、抗人鼠源SMA抗体。

4)核型分析：用秋水仙素处理40分钟使细胞阻滞在中期后，收集细胞，用0.075MKCl低渗液在37℃处理30分钟，再用含甲醇：冰醋酸＝3:1(体积比)的固定液固定两次。固定好的细胞即可进行滴片。按适当密度将细胞滴到载玻片上，马上在90℃水浴锅上用水汽蒸10秒左右，放入70℃烘箱烤3个小时。胰酶消化25-45s后，生理盐水漂洗后，在37℃用Gimsa染液染色5-10分钟，自来水晾干，显微镜观察。

5)外源基因整合检测：在iPSCs中通过qPCR分析EBNA-1拷贝数。用电转pCXLE-hOCT3/4-shp53-F，pCXLE-hSK和pCXLE-hUL后4天的人成纤维细胞用作阳性对照，商品化的H9人胚胎干细胞(H9)以及诱导多能干细胞系GM0038用作阴性对照。质粒pCXLE-hFbx15-cont2用来产生FBXO15和EBNA-1的拷贝数与循环阈值的标准曲线。引物如下：

EBNA1正向引物：5'-ATC AGG GCC AAG ACA TAG AGA TG-3'；

EBNA1反向引物：5'-GCC AAT GCA ACT TGG ACG TT-3'。

FBXO15正向引物：5'-GCC AGG AGG TCT TCG CTG TA-3'；

FBXO15反向引物：5'-AAT GCA CGG CTA GGG TCA AA-3'。

实施例3、CS特异的诱导多能干细胞定向分化产生间充质干细胞

利用干细胞定向诱导分化技术对实施例1，2获得的CS-iPSCs及GC-iPSCs进行分化，得到CS-MSCs及GC-MSCs，具体方法如下：

方法一：将CS特异及突变校正的诱导多能干细胞进行拟胚体(EB)分化，分化3天，将EB接种于基质胶(Matrigel)(Invitrogen公司)包被的6孔板中用间充质干细胞培养基1进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞类群(这三个蛋白为MSC的markers)(图3中A)，即为普通级别的CS特异及突变校正的间充质干细胞(记为CS-MSCs，GC-MSCs)。

方法二：将CS特异及突变校正的诱导多能干细胞进行拟胚体(EB)分化，分化3天，将EB接种于玻璃粘连蛋白Vitronectin(Gibco,A14700)包被的6孔板中用间充质干细胞培养基2进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。再经过一次传代后，利用流式细胞术分选其中的CD73、CD90和CD105均为阳性的细胞类群(这三个蛋白为MSC的markers)(图3中A)，即为临床级别的CS特异及突变校正的间充质干细胞(记为CS-MSCs，GC-MSCs)。操作环境为GMP级别的干细胞培养间。

实施例4、CS特异的诱导多能干细胞定向分化产生神经干细胞

利用干细胞定向诱导分化技术对实施例1，2获得的CS-iPSCs及GC-iPSCs进行分化，得到CS-NSCs及GC-NSCs，具体方法如下：

1、诱导多能干细胞定向分化为神经干细胞

分别将CS特异及突变校正的诱导多能干细胞定向分化为神经干细胞。具体步骤如下：

(1)将实施例1，2获得两种的诱导多能干细胞的小克隆接种到用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上，用人类诱导多能干细胞培养基培养大约2天，至其密度达到20％左右，得到1次培养后的细胞。

(2)将1次培养后的细胞在神经干细胞诱导培养基1继续培养，每天换液，持续培养2天，得到2次培养后的细胞。

(3)将2次培养后的细胞在神经干细胞诱导培养基2继续培养，每天换液，持续培养5天，得到3次培养后的细胞。

(4)然后将3次培养后的细胞以单细胞转到Matrigel(美国BD Biosciences产品，货号：354277)包被的培养板中用神经干细胞基础诱导培养基进行培养，每4-5天传代一次，连续传至第三代，即可得到CS病人特异及突变基因校正的神经干细胞，分别记为CS-NSCs,GC-NSCs。

2、神经干细胞的鉴定

通过免疫荧光检测获得的CS-NSCs、GC-NSCs标记物Nestin、PAX6和SOX2的表达情况。具体实验步骤参照实例1中的免疫荧光染色步骤。一抗及稀释比例如下：抗人Nestin抗体(Millipore公司，货号MAB5326，1:250)、抗人PAX6抗体(Covance公司，货号PRB-278P，1:250)、抗人SOX2抗体(Santa Cruz Biotechnology公司,货号sc-17320，1：100)。

结果如图3中B所示：可见分化得到的CS-NSCs，GC-NSCs均表达神经干细胞的特异性标记物。

实施例5、携带CS病人特异基因突变的间充质干细胞及神经干细胞的表型

伴随着细胞传代，间充质干细胞会出现复制性衰老的表型，因此体外的连续细胞传代模型，可以检测细胞是否发生早衰。因此利用实施例3产生的携带CS疾病特异基因突变的间充质干细胞，可以模拟CS疾病细胞表型的发生。经过连续传代，携带CS病人特异基因突变的间充质干细胞呈现出典型的早衰表型。与突变校正后的间充质干细胞(GC-MSCs)相比，基因突变的间充质干细胞(CS-MSCs)出现增殖能力降低，生长阻滞的表型(图4中A)。细胞衰老β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-beta-Gal(senescence-associated beta-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。此外与突变校正后的间充质干细胞(GC-MSCs)相比，基因突变的间充质干细胞(CS-MSCs)还呈现出高水平的β-半乳糖苷酶染色活性(图4中B)。

具体步骤如下：分别以CS-MSCs细胞和GC-MSCs细胞为供试细胞(分别设置早代(第1代)和晚代(第5代)实验组)，吸去6孔板中培养的供试细胞的细胞培养液，用PBS洗涤1次，再加入染色固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15分钟。弃去固定液，用PBS洗涤1次，每孔加入1ml染色工作液。以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况，并进一步对两组细胞中的SA-beta-Gal染色阳性细胞比率进行定量统计分析。

UV照射后，DNA主要以两种损伤形式存在，分别为环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutanepyrimidine dimers，CPD)和6-4光产物(6-4pyrimidine photoproducts，6-4 PPs)。这两种形式完全依赖于细胞内核苷酸剪切修复通路来修复，因此CPD的含量可用来指示细胞核苷酸剪切修复的能力。本实施例采用一定剂量的UV分别照射实施例3，4制备的携带CS病人特异基因突变及突变校正后的间充质干细胞和神经干细胞，并检测其对UV敏感性：包括细胞内CPD的含量及细胞凋亡水平。

1、UV处理后检测成体干细胞的CPD的含量及细胞凋亡水平

将实施例3中获得的CS-MSCs及GC-MSCs以1.5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板，第二天用10J/m²UV进行照射。照射后培养24小时，免疫荧光检测细胞内环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的含量。具体实验步骤参照实施例1中的免疫荧光步骤。一抗及稀释比例如下：抗人CPD抗体(Cosmo Bio公司,货号TMD-2，1：100)。

结果如图4中C所示，发现携带基因突变的间充质干细胞在修复CPD的能力上存在一定程度的缺陷。

将实施例4中获得的CS-NSCs及GC-NSCs以1.5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板，第二天用5J/m²UV进行照射。照射后培养24小时，免疫荧光检测细胞内环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的含量。具体实验步骤参照实施例1的免疫荧光步骤。一抗及稀释比例如下：抗人CPD抗体(Cosmo Bio公司,货号TMD-2，1：100)。

结果如图4中D所示，发现携带基因突变的神经干细胞在修复CPD的能力上存在一定程度的缺陷。

2、UV处理后检测成体干细胞的凋亡情况

利用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测携带CS病人特异基因突变及突变校正后的间充质干细胞和神经干细胞在UV处理后的凋亡情况。间充质干细胞用10J/m²UV进行照射，24小时后收集细胞，然后用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行检测。结果如图4中E所示，与突变校正后的间充质干细胞相比，ERCC6基因突变的间充质干细胞在经过UV照射后细胞凋亡比例增加。此外，神经干细胞用5J/m²UV进行照射，24小时后收集细胞，然后用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行检测。图4中F结果显示，与突变校正后的神经干细胞相比，ERCC6基因突变的神经干细胞在经过UV照射后细胞凋亡比例也显著增加。不进行UV照射的间充质干细胞和神经干细胞分别作为对照也同时进行凋亡水平的检测。

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法

<130> GNCLN190096

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggatcacgcc agtctggagt agg 23

<210> 2

<211> 127

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ctaaagagac accctccact gactacaggc atcaggcatc aattcaagaa cacagagaaa 60

ctgctcctag catcctcacc tgcatcctct tccagactgg cgtgatctag ttcaattttc 120

acctctg 127

Claims (10)

1.一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：

(A1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；

(A2)将所述CS-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。

2.一种经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法，包括如下步骤：

(B1)对离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞进行重编程，得到诱导多能干细胞，记为CS-iPSC；

(B2)对所述CS-iPSC进行基因编辑，特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变，得到能表达全长ERCC6蛋白的诱导多能干细胞，记为GC-iPSC；

(B3)将所述GC-iPSC定向诱导分化为成体干细胞，即得所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：权利要求1的步骤(A1)和权利要求2的步骤(B1)中，所述重编程均为将OCT3/4基因、SOX2基因、KLF4基因、L-Myc基因和LIN28基因共同导入所述离体的携带科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变的科凯恩氏综合征病人来源的成纤维细胞中，并培养至获得所述CS-iPSC；

和/或

所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变为c.643G>T和/或c.3776C>A；

和/或

权利要求2的步骤(B2)中，所述“特异性消除所述科凯恩氏综合征特异性ERCC6基因突变”为将所述c.643G>T矫正为c.643G>G，和/或将所述c.3776C>A矫正为c.3776C>C。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞为皮肤成纤维细胞；

和/或

所述成体干细胞为间充质干细胞或神经干细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：当所述成体干细胞为间充质干细胞时，权利要求1的步骤(A2)和权利要求2的步骤(B3)中，是按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为间充质干细胞的：

(a1)将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行拟胚体分化，获得拟胚体；

(a2)为如下(a2-1)或(a2-2)：

(a2-1)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞；

(a2-2)将所述拟胚体接种于玻璃粘连蛋白包被的培养板中进行培养，得到纤维状细胞，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即得所述间充质干细胞；

当所述成体干细胞为神经干细胞时，权利要求1的步骤(A2)和权利要求2的步骤(B3)中，是按照包括如下步骤的方法将所述CS-iPSC或所述GC-iPSC定向诱导分化为神经干细胞的：

(b1)在人类诱导多能干细胞培养基中对所述CS-iPSC或所述GC-iPSC进行诱导培养，得到诱导培养后细胞；

(b2)在神经干细胞诱导培养基1中对所述诱导培养后细胞进行第一次分化培养，得到第一次分化培养后细胞；

(b3)在神经干细胞诱导培养基2中对所述第一次分化培养后细胞进行第二次分化培养，得到所述神经干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在(a2-1)中，所述培养是在间充质干细胞培养基1中进行的；所述间充质干细胞培养基1为在αMEM培养基中加入胎牛血清、青霉素/链霉素、重组人成纤维细胞生长因子FGF2和TGFβ后得到的培养基；其中，所述胎牛血清在所述间充质干细胞培养基1中的体积百分含量为10％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000Units/ml，链霉素在所述间充质干细胞培养基1中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述间充质干细胞培养基1中的含量为10ng/ml；所述TGFβ在所述间充质干细胞培养基1中的含量为5ng/ml；

和/或

在(a2-2)中，所述培养是在间充质干细胞培养基2中进行的；所述间充质干细胞培养基2为在MSC基础培养基中加入血清替代物、TGFβ、重组人成纤维细胞生长因子FGF2、EGF、PDGF、青霉素/链霉素后得到的培养基；其中，所述血清替代物在所述间充质干细胞培养基2中的体积百分含量为5％；所述青霉素在所述间充质干细胞培养基2中的终浓度为10000Units/ml，链霉素在所述间充质干细胞培养基2中的终浓度为10000μg/ml；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述间充质干细胞培养基2中的含量为6ng/ml；所述TGFβ在所述间充质干细胞培养基2中的含量为5ng/ml；所述EGF在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml；所述PDGF在所述间充质干细胞培养基2中的含量为10ng/ml；

和/或

所述神经干细胞诱导培养基2由Advanced DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N2、B27、GlutaMAX、人白血病抑制因子hLIF、CHIR99021、SB431542和Compound E混合而成；所述Advanced DMEM/F12培养基在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为48.5％；所述Neurobasal培养基在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为48.5％；所述N2在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为1％；所述B27在所述神经干细胞诱导培养基2中的体积分数为2％；所述GlutaMAX在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为2mM；所述CHIR99021在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为4μM；所述SB431542在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为3μM；所述人白血病抑制因子hLIF在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为10ng/ml；所述Compound E在所述神经干细胞诱导培养基2中的浓度为0.1μM；

和/或

所述神经干细胞诱导培养基1由Advanced DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N2、B27、GlutaMAX、人白血病抑制因子hLIF、CHIR99021、SB431542、Compound E和Dorsomorphin混合而成；所述Advanced DMEM/F12培养基在所述神经干细胞诱导培养基1中的体积分数为48.5％；所述Neurobasal培养基在所述神经干细胞诱导培养基1中的体积分数为48.5％；所述N2在所述神经干细胞诱导培养基1中的体积分数为1％；所述B27在所述神经干细胞诱导培养基1中的体积分数为2％；所述GlutaMAX在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为2mM；所述CHIR99021在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为4μM；所述SB431542在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为3μM；所述人白血病抑制因子hLIF在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为10ng/ml；所述Compound E在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为0.1μM；所述Dorsomorphin在所述神经干细胞诱导培养基1中的浓度为2μM；

和/或

所述神经干细胞基础诱导培养基由Advanced DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、N2、B27、GlutaMAX、人白血病抑制因子hLIF、CHIR99021和SB431542混合而成；所述AdvancedDMEM/F12培养基在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为48.5％；所述Neurobasal培养基在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为48.5％；所述N2在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为1％；所述B27在所述神经干细胞基础诱导培养基中的体积分数为2％；所述GlutaMAX在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为2mM；所述CHIR99021在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为3μM；所述SB431542在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为2μM；所述人白血病抑制因子hLIF在所述神经干细胞基础诱导培养基中的浓度为10ng/ml；

和/或

所述人类诱导多能干细胞培养基为在基础培养基中添加Knockout血清替代物、非必需氨基酸、GlutaMAX、青霉素/链霉素、β-巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子FGF2得到的培养基；所述Knockout血清替代物在所述人类诱导多能干细胞培养基中的体积分数为20％；所述非必需氨基酸在所述诱导多能干细胞培养基中的浓度为0.1mM；所述GlutaMAX在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为1mM；所述青霉素终浓度为10000Units/ml，链霉素的终浓度为10000μg/ml；所述β-巯基乙醇在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为55μM；所述重组人成纤维细胞生长因子FGF2在所述人类诱导多能干细胞培养基中的浓度为10ng/ml。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：在步骤(b3)中，还包括如下步骤：将所述第二次分化培养得到的细胞在神经干细胞基础诱导培养基中传代培养，得到所述神经干细胞；

和/或

在步骤(b1)中，所述诱导培养的时间为1-3天；

和/或

在步骤(b2)中，所述第一次分化培养的时间为1-3天；

和/或

在步骤(b3)中，所述第二次分化培养的时间为4-6天。

8.由权利要求1-7中任一所述方法制备得到的所述人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或者所述经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞；

或

方法I：一种制备权利要求1-7任一中所述CS-iPSC的方法，包括权利要求1-7任一中的步骤(A1)；

或

由所述方法I制备得到的所述CS-iPSC；

或

方法II：一种制备权利要求1-7任一中所述GC-iPSC的方法，包括权利要求1-7任一中的步骤(B1)-(B2)；

或

由所述方法II制备得到的所述GC-iPSC。

9.用于制备权利要求1-7任一中所述的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的试剂盒，含有权利要求6中所述人类诱导多能干细胞培养基、所述间充质干细胞培养基1、所述间充质干细胞培养基2、所述神经干细胞基础诱导培养基、所述神经干细胞诱导培养基1和所述神经干细胞诱导培养基2中的至少一种。

10.权利要求1-7中任一所述的方法或权利要求8所述的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的经遗传修饰的人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞或所述的方法I或所述的方法II或权利要求9所述的试剂盒在如下任一中的应用：

(A)制备用于筛选和/或鉴定用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品；或用于筛选和/或鉴定用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物；

(B)制备用于研究科凯恩氏综合征发病机制的产品；

(C)制备用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征的产品；或用于治疗和/或预防科凯恩氏综合征；

(D)制备科凯恩氏综合征的细胞模型。