CN109843972B - 分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物 - Google Patents

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Abstract

一种分支型异单分散聚乙二醇，如式(1)所示(X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同，n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数，E是具有对于L2的键价数为2价且对于L3的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点，L1和L2各自独立地表示单键或二价有机基团，并且L3表示单键、‑L4‑(CH2)m1‑或‑L4‑(CH2)m2‑L5‑(CH2)m3‑，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数)。

Description

分支型异单分散聚乙二醇及其制造方法和其缀合物
技术领域
本发明涉及分支型异单分散聚乙二醇、用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体及其制造方法，以及分支型异单分散聚乙二醇缀合物。更具体地，本发明涉及分支型异单分散聚乙二醇，其用于生物功能聚合物、药物递送***中的药物或药物载体、诊断用材料或仪器等的修饰，并且特别地，其能够作为用于抗体-药物缀合物的连接物使用。
背景技术
近年来，抗体-药物缀合物(Antibody-Drug Conjugate：ADC)在实践中使用并且在药物领域中引起了高度关注(Toxins,2011,3,p.848-883(非专利文献1)，J.Med.Chem.,2011,54,p.3606-3623(非专利文献2))，在抗体-药物缀合物中药物通过连接物缀合至抗体，并且能够将药物主动运送至抗原呈递细胞。
由于许多药物通常是疏水性的，当其作为ADC使用时，经常发生聚集(aggregation)。因此，一种已被研究的连接物是异(hetero)型单分散聚乙二醇，其为亲水性连接物。
异型单分散聚乙二醇是指这样的化合物：其为了在各个末端单独缀合药物和抗体而在两末端具有互不相同的官能团(异型)，并且为了简化药物申请和ADC的制造、纯化和分析而包含90％以上的具有特定乙二醇链长的化合物。
在上述ADC中，由于抗体和药物单独地缀合至上述作为连接物的异型单分散聚乙二醇的各个末端，当在上述异型单分散聚乙二醇中存在作为杂质的在两个末端具有相同官能团的化合物(同型聚乙二醇等)时，会生成具有两个缀合的抗体的化合物或者具有两个缀合的药物的化合物。由于没有缀合药物，具有两个缀合的抗体的化合物不能展现ADC的效果。由于没有缀合抗体，具有两个缀合的药物的化合物被运送至抗原呈递细胞以外的位置，从而引起副作用。此外，在存在作为杂质的具有不同于具有期望的官能团的异型聚乙二醇的官能团组合的其他异型化合物的情况下，由于生成了不具有期望的抗体或期望的药物的化合物，所以也会产生与上述相同的问题。因此，从药物的使用和效果的观点来说重要的是，上述异型单分散聚乙二醇包含高纯度的在其两个末端具有互不相同的官能团的异型聚乙二醇，即官能团纯度高。
此外，近年来，出于提高上述ADC中药物的运送效率的目的，希望的是使用多个药物缀合至一个抗体的ADC，并且作为一种方式，已经尝试了使用具有分支型结构的连接物的方法。
例如，在专利文献1(US20130052130A1)中，公开了一种分支型异单分散聚乙二醇，其中通过将单分散聚乙二醇缀合至由三羟基甲胺(Tris)或例如赖氨酸的氨基酸组成的分支位点，引入了三个或四个上述乙二醇链。
此外，在专利文献2(CN104530415A)中，公开了一种分支型异单分散聚乙二醇，其中通过将单分散聚乙二醇缀合至由甘油或硫代甘油组成的分支位点，引入了三个上述乙二醇链。
在专利文献1和专利文献2中共同的是，单分散聚乙二醇缀合至分支位点的全部缀合点，并且可缀合至抗体或药物的官能团缀合至聚乙二醇的末端。这能够示意性地如下所示：
(X-PEG1-)n-B-PEG2-Y
(式中，X和Y各自表示互不相同的官能团，并且n表示为2或3的整数。B表示分支骨架。PEG1和PEG2各自表示直链型单分散聚乙二醇。)
在专利文献1和专利文献2中，作为获得上述分支型异单分散聚乙二醇的方法，描述了一种方法，其中制备了两种具有互不相同的末端官能团的直链型单分散聚乙二醇(X-PEG1和PEG2-Y)，并且首先使X-PEG1和分支位点反应然后使PEG2-Y反应，或者首先使PEG2-Y和分支位点反应然后使X-PEG1反应。在下式中示出首先使PEG2-Y和分支位点反应然后使X-PEG1反应的情况的实例。
第一步
B+PEG2-Y→B-PEG2-Y
第二步
X-PEG1+B-PEG2-Y→(X-PEG1-)n-B-PEG2-Y
(式中，X和Y各自表示互不相同的官能团，并且n表示为2或3的整数。B表示分支位点。PEG1和PEG2各自表示直链型单分散聚乙二醇。)
在上述分支型异单分散聚乙二醇的制造中，在第一步分支位点B与PEG2-Y的反应中存在残留PEG2-Y的可能，如下式所示。这一化合物仅在一个末端具有与期望的分支型异单分散聚乙二醇相同的官能团。因此，当包含过量加入的单分散聚乙二醇的分支型异单分散聚乙二醇用于ADC的制造时，由于官能团纯度低，所以生成了缺失期望的抗体或期望的药物的化合物，从而导致药物的有效性下降。
B+PEG2-Y→B-PEG2-Y+PEG2-Y
此外，存在在第二步与X-PEG1的反应中过量加入的X-PEG1残留的可能，如下式所示。这一化合物仅在一个末端具有与期望的分支型异单分散聚乙二醇相同的官能团。因此，当包含过量加入的单分散聚乙二醇的分支型异单分散聚乙二醇用于ADC的制造时，由于官能团纯度低，生成了缺失期望的抗体或期望的药物的化合物，从而导致药物的有效性下降。
X-PEG1+B-PEG2-Y→(X-PEG1-)n-B-PEG2-Y+X-PEG1
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US20130052130A1
专利文献2：CN104530415A
非专利文献
非专利文献1：Toxins,2011,3,p.848-883
非专利文献2：J.Med.Chem.,2011,54,p.3606-3623
发明内容
本发明解决的问题
如上文所述，因为在专利文献1和专利文献2描述的分支型异单分散聚乙二醇中，需要在两步中反应两种具有不同末端官能团的直链型单分散聚乙二醇，由于过量加入的直链型单分散聚乙二醇的残留，期望的分支型异单分散聚乙二醇的纯度下降，并且存在药物的使用和效果出现问题的可能性。
此外，作为分支型异单分散聚乙二醇的纯化方法，例示了重结晶、柱纯化等。在专利文献1和专利文献2中，过量加入的单分散聚乙二醇(PEG2-Y和X-PEG1)通过柱色谱去除。但是，由于具有相同末端官能团的单分散聚乙二醇即使链长不同也具有相似的物理性质，所以柱纯化困难，从而导致产率下降。
本发明的目的是获得高纯度的在两个末端具有互不相同的官能团的分支型异单分散聚乙二醇，用于制造上述分支型异单分散聚乙二醇的中间体，分支型异单分散聚乙二醇缀合至生物功能分子的异型单分散聚乙二醇缀合物，以及用于制造上述分支型异单分散聚乙二醇的中间体。
解决问题的手段
为了实现上述目的进行了大量研究，作为结果，发明人已经发现，能够获得如式(1)所示的高纯度的在两个末端具有互不相同的官能团的分支型异单分散聚乙二醇，并且其中单分散聚乙二醇不缀合至分支位点的三个缀合点中的一个。此外，发明人已经发现，通过在末端使用特定官能团合成用于制造上述分支型异单分散聚乙二醇的中间体，能够仅利用简单的分离萃取而不使用例如柱色谱的纯化方法获得高纯度的在两个末端具有互不相同的官能团的分支型异单分散聚乙二醇，从而完成本发明。
因此，本发明提供了下列(1)至(11)。
(1)一种分支型异单分散聚乙二醇，如式(1)所示：
Figure BDA0002020071390000051
(在式(1)中，
X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同，
n是6至30的整数，
E是具有对于L2的键价数为2价且对于L3的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点，
L1和L2各自独立地表示单键或二价有机基团，并且
L3表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数)。
(2)如(1)所述的分支型异单分散聚乙二醇，其中L3表示-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
(3)如(1)或(2)所述的分支型异单分散聚乙二醇，其中式(1)中的L2是醚键。
(4)如(1)或(2)所述的分支型异单分散聚乙二醇，如式(2)所示：
Figure BDA0002020071390000061
(在式(2)中，
X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同，
n是6至30的整数，
L1表示单键或二价有机基团，并且
L3表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数)。
(5)一种用于制造如(4)所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体，如式(3)所示：
Figure BDA0002020071390000062
(在式(3)中，
n表示6至30的整数，并且
Y2表示-NH2或-O-(CH2)m4-NH2，并且m4表示1至5的整数)。
(6)一种制造如(5)所述的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的方法，以如下所述的顺序包含：
步骤(1)，使用在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂，进行如下式(4)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(5)所示的化合物的偶联，以获得如下式(6)所示的化合物，
A-(OCH2CH2)n-B…(4)
(在式(4)中，
A表示羟基的保护基团，
B表示离去基团，并且
n表示6至30的整数)，
Figure BDA0002020071390000071
(在式(5)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数)，
Figure BDA0002020071390000072
(在式(6)中，
A表示羟基的保护基团，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数)；
步骤(2)，如式(6)所示的化合物的保护基团A的去保护，以获得如下式(7)所示的化合物，
Figure BDA0002020071390000081
(在式(7)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数)；
步骤(3)，对如式(7)所示的化合物进行分离纯化；以及
步骤(4)，对如式(7)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体。
(7)如(6)所述的方法，其中碱性催化剂是氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种。
(8)一种分支型异单分散聚乙二醇缀合物，其中生物功能分子缀合至如(1)至(4)的任意一项所述的分支型异单分散聚乙二醇。
(9)一种用于制造如(4)所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体，如式(40)所示：
Figure BDA0002020071390000082
(在式(40)中，
n表示6至30的整数，并且
Y2表示-NH2或-O-(CH2)m4-NH2，并且m4表示1至5的整数)。
(10)一种制造如(9)所述的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的方法，以如下所述的顺序包含：
步骤(1')，使用在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂，进行如下式(41)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(42)所示的化合物的偶联，以获得如下式(43)所示的化合物，
2-CH2CH2-(OCH2CH2)n-1-B
…(41)
(在式(41)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，
B表示离去基团，并且
n表示6至30的整数)，
Figure BDA0002020071390000091
(在式(42)中，
A表示羟基的保护基团)，
Figure BDA0002020071390000092
(在式(43)中，
A表示羟基的保护基团，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数)；
步骤(2')，如式(43)所示的化合物的保护基团A的去保护，以获得如下式(44)所示的化合物，
(在式(44)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数)；
步骤(3')，对如式(44)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如式(40)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体；以及
步骤(4')，对如式(40)所示的化合物进行分离纯化。
(11)如(10)所述的方法，其中碱性催化剂是氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种。
发明的效果
由于本发明的如上述式(1)或上述式(2)所示的化合物以高纯度在两个末端具有互不相同的官能团，当其用作ADC时，抑制了缺失期望的抗体或期望的药物的化合物的生成，从而期ADC效果的提高。
此外，在本发明的制造如上述式(1)或上述式(2)所示的化合物的方法中，由于单分散聚乙二醇不缀合至分支位点的三个缀合点中的一个，所以能够容易地获得以高纯度在两个末端具有互不相同的官能团的如上述式(1)或上述式(2)所示的化合物。
另外，在本发明的制造如上述式(3)所示的化合物的方法中，由于在上述步骤(1)中通过使用特定的碱性催化剂抑制了副反应，并且通过以上述步骤(1)至步骤(4)的顺序进行，能够仅利用分离纯化去除源自步骤(1)中过量加入的如上述式(4)所示的化合物的杂质，所以能够容易地获得具有高链长纯度和高官能团纯度的如上述式(3)所示的化合物。
进一步地，由于在上述步骤(1')中通过使用特定的碱性催化剂抑制了副反应，并且通过以上述步骤(1')至步骤(4')的顺序进行，能够仅利用分离纯化去除源自步骤(1')中过量加入的如上述式(41)所示的化合物的杂质，所以能够容易地获得具有高链长纯度和高官能团纯度的如上述式(40)所示的化合物。
具体实施方式
下文中将详细描述本发明的优选实施方式。
根据本发明的分支型异单分散聚乙二醇是高纯度的在两个末端具有两种官能团并且单分散聚乙二醇不缀合至分支位点的三个缀合点中的一个的化合物。此外，末端官能团的高纯度意指具有官能团的特定组合的化合物的纯度(在下文中，称为官能团纯度)为95％以上。另外，单分散聚乙二醇意指具有特定乙二醇链长的化合物的纯度(在下文中，称为链长纯度)为90％以上。
分支型异单分散聚乙二醇如式(1)所示。
Figure BDA0002020071390000111
在式(1)中，X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同。n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数。E是对于L1的键价数为2价且对于L3的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点，L1和L2各自独立地表示单键或二价有机基团。L3表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
在上述式(1)中，X1和Y1是互不相同的官能团，并且官能团没有特别限定，只要是能够与作为被分支型异单分散聚乙二醇所修饰的目标的生物功能分子(蛋白质药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包括寡核酸等的核酸化合物、核酸药物、抗癌药物、以及其他药物例如低分子量药物)中存在的官能团反应以形成共价键的官能团即可。其中，X1和Y1各自独立地优选为能够在温和条件下以高反应效率与由蛋白质所代表的生物功能分子中天然存在的基团(例如氨基、巯基、醛基或羧基)、或者能够被人工引入生物功能分子的基团(例如马来酰亚胺基、酮基、叠氮及或炔基)反应的官能团。更具体地，优选的是醛基、马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基、氨基、氨氧基、巯基、烯丙基、乙烯基、炔基或叠氮基。此外，考虑到反应效率等，X1和Y1各自更优选为马来酰亚胺基、活性酯基、活性碳酸酯基、炔基、叠氮基、碘乙酰胺基或溴乙酰胺基。
此外，X1和Y1各自独立地，在目标生物功能分子中存在的官能团为氨基的情况下，优选为醛基、活性酯基、活性碳酸酯基、羧基或酮基；在目标生物功能分子中存在的官能团为巯基的情况下，优选为马来酰亚胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、炔基或乙烯基；在目标生物功能分子中存在的官能团为醛基或酮基的情况下，优选为氨基；在目标生物功能分子中存在的官能团为羧基的情况下，优选为氨基、氨氧基或巯基；在目标生物功能分子中存在的官能团为马来酰亚胺基的情况下，优选为巯基；在目标生物功能分子中存在的官能团为叠氮基的情况下，优选为炔基；在目标生物功能分子中存在的官能团为炔基的情况下，优选为叠氮基。
关于X1和Y1的优选组合，例如，当X1是活性酯基时，Y1优选为马来酰亚胺基、叠氮基、炔基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、乙烯砜基、氧代氨基、巯基、烯丙基或乙烯基；当X1是活性碳酸酯基时，Y1优选为马来酰亚胺基、叠氮基、炔基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、乙烯砜基、氧代氨基、巯基、烯丙基或乙烯基；当X1是马来酰亚胺基时，Y1优选为活性酯基、活性碳酸酯基、叠氮基、炔基、醛基、羧基、氨基、氧代氨基或酮基；当X1是叠氮基时，Y1优选为活性酯基、活性碳酸酯基、马来酰亚胺基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、醛基、乙烯砜基、羧基、氨基、氧代氨基、巯基、烯丙基、乙烯基或酮基；当X1是炔基时，Y1优选为活性酯基、活性碳酸酯基、马来酰亚胺基、碘乙酰胺基、溴乙酰胺基、醛基、乙烯砜基、羧基、氨基、氧代氨基、巯基、烯丙基、乙烯基或酮基。
在上述式(1)中，L1是负责聚乙二醇链和X1之间的缀合的连接物，没有特别限定，只要其是构成共价键的位点即可，并且优选为单键、二价饱和烃基、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、碳酸酯键、或包含氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键或碳酸酯键的二价饱和烃基。上述饱和烃基优选地包含10个以下的碳原子，并且包括例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚丙基、异亚丙基、四亚甲基、亚丁基、异亚丁基、五亚甲基和六亚甲基。
在式(1)中，L3是负责Y1和分支位点E之间的缀合的连接物，并且表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-。L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
在本发明中，当L4为醚键并且L5为酰胺键时，L3的优选实例如下式任一所示：
-O-(CH2)m2-C(O)NH-(CH2)m3- (8)
-O-(CH2)m2-NHC(O)-(CH2)m3- (9)
在本发明中，马来酰亚胺基是如包括L1或L3的下式所示的基团，并且是与例如巯基的亲核基团反应的基团。
Figure BDA0002020071390000131
在上述式(10)中，R1优选为氢原子或甲基基团，并且更优选为氢原子。
在本发明中，在X1或Y1是马来酰亚胺基的情况下，-L1-X1或-L3-Y1的优选实例如下式所示：
Figure BDA0002020071390000141
在上述式(11)中，a表示1至5的整数，并且R1具有与上述式(10)中的R1相同的含义。
在本发明中，活性酯基是如包括L1或L3的下式所示的基团，并且与例如氨基的亲核基团反应。
Figure BDA0002020071390000142
在上述式(12)中，R2优选为苯基、3-吡啶基、琥珀酰亚胺基、2-苯并噻唑基或1-苯并***基，更优选为琥珀酰亚胺基或1-苯并***基，最优选为琥珀酰亚胺基。
在本发明中，在X1或Y1是活性酯基的情况下，-L1-X1或-L3-Y1的优选实例如下式所示：
Figure BDA0002020071390000143
在上述式(13)中，b表示1至5的整数，并且R2具有与上述式(12)中的R2相同的含义。
在本发明中，活性碳酸酯基是如包括L1或L3的下式所示的基团，并且与例如氨基的亲核基团反应。
Figure BDA0002020071390000151
在上述式(14)中，R3优选为苯基、3-吡啶基、琥珀酰亚胺基、4-硝基苯基、2-苯并噻唑基或1-苯并***基，更优选为琥珀酰亚胺基或1-苯并***基，最优选为琥珀酰亚胺基。
在本发明中，在X1或Y1是活性碳酸酯基的情况下，-L1-X1或-L3-Y1的优选实例如下式所示：
Figure BDA0002020071390000152
在上述式(15)中，R3具有与上述式(14)中的R3相同的含义。
在本发明中，炔基是如包括L1或L2的下式中的任意一个所示的基团，并且与叠氮基反应。
-L1(or L3)-C≡C-R4…(16)
Figure BDA0002020071390000153
在上述式中，R4优选为具有8个以下的碳原子的饱和烃基或氢原子，并且更优选为氢原子。
在本发明中，在X1或Y1是炔基的情况下，-L1-X1或-L3-Y1的优选实例如下式所示：
Figure BDA0002020071390000161
在上述式(20)中，c表示2至5的整数，并且R4具有与上述式(21)中的R4相同的含义。此外，在上述式(22)中，d表示1至6的整数。
在本发明中，在X1或Y1是碘乙酰胺基或溴乙酰胺基的情况下，X1或Y1是如包括L1或L3的下式所示的基团，并且与巯基反应。
Figure BDA0002020071390000162
n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数。从用作ADC的连接物的观点，n优选为6至24的整数。
E是具有对于L2的键价数为2价且对于L3的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点。
在本发明中，甘油位点是如包括L2和L3的下式的任一者所示的基团，并且从原材料纯度的观点，优选为具有如式(25)所示的结构。
Figure BDA0002020071390000171
L2是负责聚乙二醇链和分支位点E之间的缀合的连接物，没有特别限定，只要其是构成共价键的位点即可，并且包括例如单键、二价饱和烃基、氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键、碳酸酯键、以及包含氨基甲酸酯键、酰胺键、醚键或碳酸酯键的二价饱和烃基。L2优选为氨基甲酸酯键、酰胺键和醚键的任意一个，并且从原材料纯度的观点，优选为醚键。上述饱和烃基优选地包含10个以下的碳原子，并且包括例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚丙基、异亚丙基、四亚甲基、亚丁基、异亚丁基、五亚甲基和六亚甲基。
如上述式(1)所示的分支型异单分散聚乙二醇的优选实例包括如下式(28)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000181
在本发明中，用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体如下式(29)所示。
Figure BDA0002020071390000182
在上述式(29)中，n表示6至30的整数。X2和Y2是互不相同的官能团，并且X2表示氢原子或者包含二价饱和烃基的氨基和羧基的任意一种。Y2表示-NH2、-O-(CH2)m4-NH2、-COOH和-O-(CH2)m6-COOH的任意一种。m4和m6各自表示1至5的整数。L2表示二价有机基团。E是具有对于L2的键价数为2价且对于Y2的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点。
在上述式(29)中，n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数。从用作ADC的连接物的观点，n优选为6至24的整数。
在上述式(29)中，X2没有特别限定，只要是能够被转化为式(1)中的X1的官能团即可，并且优选为氢原子或者包含二价饱和烃基的氨基和羧基的任意一种，更优选为氢原子。上述饱和烃基优选地包含10个以下的碳原子，并且包括例如亚甲基、亚乙基、三亚甲基、亚丙基、异亚丙基、四亚甲基、亚丁基、异亚丁基、五亚甲基和六亚甲基。
在上述式(29)中，Y2没有特别限定，只要是能够被转化为式(1)中的Y1的官能团即可，并且优选为-NH2、-O-(CH2)m4-NH2、-COOH和-O-(CH2)m6-COOH的任意一种，并且从容易合成的观点，更优选为-NH2或-O-(CH2)m4-NH2。m4和m6各自表示1至5的整数。
从合成如上述式(1)所示的分支型异单分散聚乙二醇的观点，上述式(29)中的X2和Y2优选为互不相同的官能团。关于X2和Y2的优选组合，例如，当Y2是-COOH或-O-(CH2)m6-COOH时，X2优选为氢原子或包含二价饱和烃基的氨基，并且当Y2是-NH2或-O-(CH2)m4-NH2时，X2优选为氢原子或包含二价饱和烃基的羧基。
在上述式(29)中，L2是负责聚乙二醇链和分支位点E之间的缀合的连接物，并且具有与上述式(1)中的L2相同的含义。从原材料纯度的观点，上述式(29)中的L2优选为醚键。
E是具有对于L2的键价数为2价且对于Y2的键价数为1价的分支位点，并且表示如上述式(25)或上述式(26)所示的甘油位点。从原材料纯度的观点，E优选为如上述式(25)所示的甘油位点。
如上述式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的优选实例包括如上述式(3)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000191
在使用如上述式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体获得如上述式(1)所示的分支型异单分散聚乙二醇的方法中，能够恰当地使用通过已知合成方法获得的化合物。例如，引入马来酰亚胺基的方法包括：3-马来酰亚胺基丙酸或马来酰亚胺基丁酸与例如1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩合剂反应，然后与如式(29)所示的本发明的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基反应的方法；以及，在例如三乙胺的碱的存在下，3-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯与如式(29)所示的本发明的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基反应的方法。
此外，例如，引入活性酯基的方法包括：在例如1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩合剂的存在下，N-羟基琥珀酰亚胺与如式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的羧基反应的方法；以及，在例如三乙胺的碱的存在下，二琥珀酰亚胺基碳酸酯与如式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的羟基反应的方法。
另外，例如，引入碘乙酰胺基的方法包括：在例如三乙胺的碱的存在下，二(碘乙酸)酐等与如式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基反应的方法。
进一步地，例如，引入炔基的方法包括：在例如三乙胺的碱的存在下，炔丙基氯甲酸酯、(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯或二苯并环辛炔-N-羟基马来酰亚胺基酯等与如式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基反应的方法。
使用如上述式(29)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体获得如上述式(1)所示的分支型异单分散聚乙二醇的方法的典型实例包括下列步骤。
(a)末端具有活性碳酸酯基和马来酰亚胺基的化合物的合成
Figure BDA0002020071390000201
在氯仿溶剂中、在三乙胺的存在下，如上述式(30)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基与3-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯反应，以获得如下式(31)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000211
在二氯甲烷溶剂中、在三乙胺的存在下，如上述式(31)所示的化合物的羟基与二琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，以获得如下式(32)所示的分支型异单分散聚乙二醇。如式(32)所示的化合物与其中X1是活性酯基并且Y1是马来酰亚胺基的如式(1)所示的化合物相同。
Figure BDA0002020071390000212
(b)末端具有活性酯基和碘乙酰胺基的化合物的合成
Figure BDA0002020071390000213
在氯仿溶剂中、在三乙胺的存在下，如上述式(33)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基与二(碘乙酸)酐反应，以获得如下式(34)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000214
在二氯甲烷溶剂中、在1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的存在下，如上述式(34)所示的化合物的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以获得如下式(35)所示的分支型异单分散聚乙二醇。如式(35)所示的化合物与其中X1是活性酯基并且Y1是碘乙酰胺基的如式(1)所示的化合物相同。
Figure BDA0002020071390000221
(c)末端具有炔基和活性酯基的化合物的合成
Figure BDA0002020071390000222
在氯仿溶剂中、在三乙胺的存在下，如上述式(36)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的氨基与(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯反应，以获得如下式(37)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000223
在二氯甲烷溶剂中、在1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的存在下，如上述式(37)所示的化合物的羧基与N-羟基琥珀酰亚胺反应，以获得如下式(38)所示的分支型异单分散聚乙二醇。如式(38)所示的化合物与其中X1是炔基并且Y1是活性酯基的如式(1)所示的化合物相同。
此外，在本发明中，一种用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体如下式(40)所示。
Figure BDA0002020071390000231
(在式(40)中，n表示6至30的整数。Y2表示-NH2或-O-(CH2)m4-NH2，并且m4表示1至5的整数。)
[链长纯度的测定]
作为如上述式(1)所示的化合物的链长纯度，使用通过反相色谱法测定的如上述式(3)所示的化合物的链长纯度。这是因为当如上述式(1)所示的化合物的是在X1或Y1具有活性酯基或活性碳酸酯基的化合物时，其在测定时发生分解，所以不能通过反相色谱法进行链长纯度的准确测量。另外，由于从如上述式(3)所示的化合物获得如上述式(1)所示的化合物的反应是酸性氯化物与酸酐之间的缩合反应，所以不影响链长纯度。
[官能团纯度的测定]
如上述式(1)所示的化合物的官能团纯度是基于如上述式(3)所示的化合物的官能团纯度的1H-NMR测定而确定的。与前文相似，这是因为不能通过反相色谱法进行如上述式(1)所示的化合物的官能团纯度的准确测量。关于上述测定方法，首先，通过对如上述式(3)所示的化合物的反相色谱分析，测定如上述式(3)所示的化合物的官能团纯度。接下来，进行如上述式(1)所示的化合物和如上述式(3)所示的化合物的1H-NMR测定，以确定官能团X1和Y1的引入率，并且根据下式(F1)计算官能团纯度：
如式(1)所示的化合物的官能团纯度＝如式(3)所示的化合物的官能团纯度×(X1的引入率)×(Y1的引入率) (F1)
在上述反相色谱测定中，通过使用质谱仪作为检测器识别各个峰，然后从通过使用差示折光计作为检测器计算的各个峰的面积值而测定纯度。关于测定条件没有特别限定，只要分别检测各个峰即可，但是当使用质谱仪作为检测器时，例如，测定在下列条件下进行。
检测器：Waters Corp.制造的Quattro micro串联质谱仪
色谱柱：Tosoh Corp.制造的TSKgel ODS-80Ts(粒径：5μm，柱尺寸：4.6mm×25cm)
展开溶剂：5mM乙酸铵，甲醇/蒸馏水＝j/k
j和k表示甲醇和蒸馏水的体积比。取决于待测定化合物的单分散聚乙二醇的重复单元n的数量和末端官能团的类型而恰当地选择j和k。
当使用差示折光计作为检测器时，例如，测定在下列条件下进行。
检测器：Tosoh Corp.制造的RI-8020
色谱柱：Tosoh Corp.制造的TSKgel ODS-80Ts(粒径：5μm，柱尺寸：4.6mm×25cm)
展开溶剂：5mM乙酸铵，甲醇/蒸馏水＝j/k
j和k表示甲醇和蒸馏水的体积比，并且具有与使用质谱仪作为检测器的情况下的测定条件中使用的j和k相同的含义。
在上述1H-NMR测定中，官能团X1和Y1的引入率是通过使用在从如上述式(3)所示的化合物获得如上述式(1)所示的化合物的反应中不受影响的峰的积分值作为基准，从源自官能团X1和Y1的峰的积分值而计算的。取决于官能团X1和Y1的种类，恰当地选择用作基准的峰。
<用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的制造方法>
满足上述具体条件的本发明的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体能够通过本发明的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的制造方法而获得。如上述式(3)所示的本发明的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的制造方法，其特征在于至少按照顺序包含下列步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)。
[步骤(1)]
根据本发明的步骤(1)是使用氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种作为碱性催化剂，进行如下式(4)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(5)所示的化合物的偶联，以获得如下式(6)所示的化合物的步骤：
A-(OCH2CH2)n-B
…(4)
Figure BDA0002020071390000251
关于如上述式(4)所示的单分散聚乙二醇衍生物，能够采用已知方法，并且在Polym.Chem.,2016,7,2389-2394中描述的方法是有效的。
A是羟基的保护基团，没有特别限定，只要是对在上述偶联反应中使用的碱性催化剂稳定的保护基团即可，并且包括例如甲氧基甲基、苄氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、四氢吡喃基、烯丙基、苄基、4-甲氧基苄基、三甲基苄基、三苯基甲基、三乙基硅基、三异丙基硅基、叔丁基二甲基硅基和叔丁基二苯基硅基。从容易合成的观点，A优选为苄氧基甲基、四氢吡喃基、苄基、三甲基苄基或三苯基甲基，并且更优选为苄基或三苯基甲基。
B是离去基团，没有特别限定，只要是在上述偶联反应中具有反应性的离去基团即可，并且包括例如氯基、溴基、碘基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、氯代甲磺酸酯基和三氟甲磺酸酯基。从容易合成的观点，B优选为溴基、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基及或氯代甲磺酸酯基，并且更优选为甲磺酸酯基。
n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数。从用作ADC的连接物的观点，n优选为6至24的整数。
如上述式(5)所示的化合物能够通过恰当地采用已知方法，从可商购的2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇而合成。
在如上述式(5)所示的化合物中，Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1。m5表示1至5的整数。从容易合成的观点，Z优选为-Z1、-O-(CH2)2-Z1、-O-(CH2)3-Z1和-O-(CH2)5-Z1的任意一种。Z1没有特别限定，只要是对在上述偶联反应中使用的碱性催化剂稳定的官能团即可。从制造如上述式(4)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的观点，Z1优选为包含能够被转化为氨基的氮原子的原子团，并且优选为例如氨基的被保护的形式、叠氮基或氰基。
此外，氨基的被保护的形式意指氨基与保护基团的缀合物。保护基团没有特别限定，只要是对在上述偶联反应中使用的碱性催化剂稳定的保护基即可，并且包括例如9-芴甲基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基和二苄基，优选为叔丁氧基羰基、苄氧基羰基和二苄基。
上述式(4)中的保护基团A和上述式(5)中的Z1的组合没有特别限定，只要Z1对于步骤(2)中保护基团A的去保护条件稳定即可。在步骤(2)中的去保护是酸性条件下的水解反应的情况下，Z1优选为氨基被9-芴甲基羰基保护的形式、氨基被叔丁氧基羰基保护的形式、氨基被苄氧基羰基保护的形式、氨基被二苄基保护的形式、叠氮基或氰基。在步骤(2)中的去保护是催化氢化的情况下，Z1优选为氨基被9-芴甲基羰基保护的形式或氨基被叔丁氧基羰基保护的形式。
在上述偶联反应中使用的碱性催化剂没有特别限定，只要是使反应进行的碱性催化剂即可。优选为在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂，并且包括例如氢氧化钾(pKa＝15.7)、氢氧化钠(pKa＝15.7)、叔丁醇钾(pKa＝19)、叔丁醇钠(pKa＝15.7)、甲醇钠(pKa＝15.5)和乙醇钠(pKa＝16)。更优选地，包括氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠。在使用在水溶液中的pKa超过20的碱性催化剂，例如氢化钠等的情况下，如上述式(5)所示的分支位点被与碱性催化剂的反应分解，使得偶联的产率和纯度下降。另一方面，在使用在水溶液中的pKa小于15的碱性催化剂，例如三甲胺等的情况下，上述偶联的进展趋向于缓慢。此外，上述碱性催化剂的使用量只要能使反应进行就没有问题，并且相对于如上述式(5)所示的化合物的摩尔比通常为2.0至10倍，优选为2.1至5倍。在上述碱性催化剂的使用量小于上述下限的情况下，反应不能完全进行并且如上述式(5)所示的化合物的羟基趋向于残留而不能将单分散聚乙二醇链引入到羟基。另一方面，在使用量超过上述上限的情况下，由于过量的碱，倾向于发生副反应。
关于上述偶联，反应能够在溶剂中进行。上述溶剂没有特别限定，只要不与如上述式(4)所示的化合物和如上述式(5)所示的化合物反应即可，并且包括例如非质子极性溶剂，例如四氢呋喃、乙腈、DMF、二氯甲烷或氯仿及其混合物。上述溶剂的使用量相对于如上述式(4)所示的化合物的质量比通常为1至100倍，优选为2至50倍，最优选为3至30倍。在上述溶剂的使用量超过上述上限的情况下，上述偶联的进展趋向于缓慢。
上述偶联的反应温度取决于使用的溶剂等而变化，并且通常为0至100℃。在上述反应温度小于上述下限的情况下，反应的进展倾向于缓慢。另一方面，在反应温度超过上述上限的情况下，由于过高的温度，倾向于发生副反应。此外，上述偶联的反应时间取决于例如上述反应温度等的条件而变化，并且通常优选为大约1至48小时。
在上述偶联中如上述式(4)所示的化合物的使用量相对于如上述式(5)所示的化合物的摩尔比通常为2.0至10倍，优选为2.1至4倍。在如上述式(4)所示的化合物的使用量小于上述下限的情况下，反应不能完全进行并且如上述式(5)所示的化合物的羟基趋向于残留而不能将单分散聚乙二醇链引入到羟基。另一方面，在使用量超过上限的情况下，过量的如上述式(4)所示的化合物没有用处，并且不仅增加制造成本，还使产率下降，因为难以从作为反应产物的如上述式(6)所示的化合物中分离过量的如上述式(4)所示的化合物。
在步骤(1)中，能够通过上述偶联获得如上述式(6)所示的化合物。上述化合物可以不经纯化而在下个步骤(2)中原样使用，或者可以在使用硅胶柱色谱的纯化或吸附剂处理等之后使用。然而，在本发明中，能够不进行使用硅胶柱色谱的纯化而获得高纯度的本发明的异型单分散聚乙二醇。
[步骤(2)]
根据本发明的步骤(2)是使如上述式(6)所示的化合物的保护基团A去保护以获得如下式(7)所示的化合物的步骤。
Figure BDA0002020071390000281
在上述式(7)中，Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，并且Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种。m5表示1至5的整数。n表示6至30的整数。上述氨基的被保护的形式源自如上述式(6)所示的化合物中的Z1，并且与上述式(6)中的Z1具有相同的含义。
用于使如上述式(6)所示的化合物的保护基团A去保护的方法取决于保护基团的种类而变化，并且包括采用已知方法进行去保护的方法。例如，在A是醚系保护基团，例如甲氧基甲基、四氢吡喃基或三苯甲基的情况下，去保护包括通过在酸性条件下水解的方法。此外，例如，在A是包含苄基的保护基团，例如苄基或三苯甲基的情况下，去保护包括通过在催化剂的存在下催化氢化的方法。另外，例如，在A是硅烷系保护基团，例如三乙基硅基的情况下，去保护包括通过例如四丁基氟化铵的氟离子的去硅基反应。
在上述去保护是水解的情况下，所述水解能够在溶剂中进行。上述溶剂包括例如质子极性溶剂，例如水、甲醇或乙醇及其混合物。此外，溶剂可以包含与水与任意比例混溶的有机溶剂，例如四氢呋喃、乙腈或DMF。上述溶剂的使用量相对于如上述式(6)所示的化合物的质量比通常为1至100倍，优选为2至50倍，最优选为3至30倍。在上述溶剂的使用量超过上述上限的情况下，上述水解的进展趋向于缓慢。关于上述水解，通过使用酸性催化剂进行反应。上述酸性催化剂包括：例如，例如盐酸、硫酸或磷酸的无机酸；例如一水合对甲苯磺酸或甲磺酸的有机酸；以及例如大孔树脂(Amberlyst)的阳离子交换树脂。上述酸性催化剂的当量相对于如上述式(6)所示的化合物的摩尔比通常为0.1至2倍，优选为0.2至1倍。上述水解的反应温度取决于使用的溶剂等而变化，并且通常为0至100℃。在上述反应温度小于上述下限的情况下，反应的进展倾向于缓慢。另一方面，在反应温度超过上述上限的情况下，由于过高的温度，倾向于发生副反应。此外，上述水解的反应时间取决于例如上述反应温度等的条件而变化，并且通常优选为大约1至48小时。
在上述去保护是催化氢化的情况下，反应能够在催化剂的存在下进行。上述催化剂包括例如钯炭或氢氧化钯炭。上述催化剂的当量相对于如上述式(6)所示的化合物的重量比通常为0.01至1倍，优选为0.05至0.2倍。关于上述催化氢化，反应能够在溶剂中进行。上述溶剂包括例如水、甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、DMF及其混合物。上述溶剂的使用量相对于如上述式(6)所示的化合物的质量比通常为1至100倍，优选为2至50倍，最优选为3至30倍。在上述溶剂的使用量超过上述上限的情况下，上述催化氢化的进展趋向于缓慢。上述催化氢化的反应温度取决于使用的溶剂等而变化，并且通常为0至100℃。在上述反应温度小于上述下限的情况下，反应的进展倾向于缓慢。另一方面，在反应温度超过上述上限的情况下，由于过高的温度，倾向于发生副反应。此外，上述水解的反应时间取决于例如上述反应温度等的条件而变化，并且通常优选为大约1至48小时。
在上述去保护是去硅基反应的情况下，其包括通过酸性水解去保护和通过氟离子去保护。通过酸性水解去保护能够通过与上述醚系保护基团的水解去保护相同的方法进行。通过氟离子去保护是通过使用例如四丁基氟化铵或氟化氢的具有氟离子的试剂进行的。上述具有氟离子的试剂的当量相对于如上述式(6)所示的化合物的摩尔比通常为1.0至2倍，优选为1.1至1.5倍。关于上述通过氟离子去保护，反应能够在溶剂中进行。上述溶剂包括例如水、甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、DMF及其混合物。上述溶剂的使用量相对于如上述式(6)所示的化合物的质量比通常为1至100倍，优选为2至50倍，最优选为3至30倍。在上述溶剂的使用量超过上述上限的情况下，上述催化氢化的进展趋向于缓慢。上述通过氟离子去保护的反应温度取决于使用的溶剂等而变化，并且通常为0至100℃。在上述反应温度小于上述下限的情况下，反应的进展倾向于缓慢。另一方面，在反应温度超过上述上限的情况下，由于过高的温度，倾向于发生副反应。此外，上述催化氢化的反应时间取决于例如上述反应温度等的条件而变化，并且通常优选为大约1至48小时。
在步骤(2)中，能够通过上述去保护获得如上述式(7)所示的化合物。上述化合物可以不经纯化而在下个步骤(3)中原样使用，或者可以在使用硅胶柱色谱的纯化或吸附剂处理等之后使用。然而，在本发明中，能够不进行使用硅胶柱色谱的纯化而获得高纯度的本发明的异型单分散聚乙二醇。
[步骤(3)]
根据本发明的步骤(3)是对包含如上述式(7)所示的化合物的反应产物进行分离纯化的步骤。
例如，在上述步骤(1)中过量加入的如上述式(4)所示的化合物残留在作为反应产物的如上述式(6)所示的化合物中。与如上述式(6)所示的化合物相同地在步骤(2)中对如上述式(4)所示的化合物的保护基团A去保护，形成如下式(39)所示的化合物。
H-(OCH2CH2)n-B…(39)
在上述式(39)中，B是离去基团，n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且是6至30的整数。上述离去基团源自如上述式(4)所示的化合物中的B，并且与上述式(4)中的B具有相同的含义。
上述步骤(3)是用水溶液分离洗脱有机溶剂中溶解的如上述式(7)所示的期望化合物中包含的如上述式(39)所示的化合物的步骤。
在上述步骤(3)中使用的有机溶剂包括例如乙酸乙酯、甲苯、氯仿或二氯甲烷，并且从期望化合物的溶解度的观点，优选为氯仿或二氯甲烷。上述有机溶剂的使用量相对于包含如上述式(7)所示的化合物和如上述式(39)所示的化合物的反应产物的质量比通常为2至30倍，优选为3至20倍。在上述有机溶剂的使用量小于上述下限的情况下，如上述式(7)所示的化合物倾向于溶解于水溶液中。另一方面，在使用量超过上述上限的情况下，如上述式(39)所示的化合物的洗脱效率趋向于下降。
上述步骤(3)中使用的水溶液没有特别限定，只要能够溶解如上述式(39)所示的化合物即可，并且包括例如离子交换水和含有低盐浓度的氯化钠或氯化钾等的水溶液。上述水溶液的使用量相对于包含如上述式(7)所示的化合物和如上述式(39)所示的化合物的反应产物的质量比通常为2至30倍，优选为3至20倍。在上述水溶液的使用量小于上述下限的情况下，如上述式(39)所示的化合物的洗脱效率趋向于下降。另一方面，在使用量超过上述上限的情况下，如上述式(7)所示的化合物倾向于溶解于水相中。
在上述步骤(3)中，上述有机溶剂与上述水溶液的比率，作为有机溶剂/水溶液值的重量比，通常为0.2至3.0，优选为0.5至2.0。
上述步骤C的温度取决于n而变化。在n为6至10的情况下，上述温度优选为1至25℃，更优选为5至20℃。在n为11至30的情况下，上述温度优选为1至15℃，更优选为5至10℃。在上述温度超过上述上限的情况下，由于如上述式(39)所示的化合物溶解于有机相所以其不能被去除。此外，进行上述分离洗脱的次数没有特别限定，并且优选为在通过TLC或MS测定等确认有机溶剂中包含的如上述式(39)所示的化合物的情况下进行若干次。
[步骤(4)]
根据本发明的步骤(4)是对如上述式(7)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的步骤。
上述步骤(4)中使用的处理取决于如上述式(39)所示的化合物中的Z1的种类而变化，并且取决于Z1种类能够通过已知方法恰当地进行。例如，在Z1是氨基的被保护的形式的情况下，上述步骤(4)中使用的处理是去保护处理。上述去保护处理取决于上述氨基的被保护的形式的保护基团的种类而变化，并且在保护基团是9-芴甲基羰基的情况下，去保护包括使用例如哌啶或吡咯烷的二级胺的反应。在保护基团是叔丁氧基羰基的情况下，去保护包括使用三氟乙酸或4N盐酸等的反应。在保护基团是苄氧基羰基的情况下，去保护包括在钯炭催化剂的存在下的催化氢化。例如，在Z1是叠氮基或氰基的情况下，上述步骤(4)中使用的处理是还原处理。上述还原处理取决于Z1的种类而变化，并且在Z1是叠氮基的情况下，还原包括使用三苯基膦作为还原剂的施陶丁格(Staudinger)还原以及在钯炭催化剂的存在下的催化氢化。在Z1是氰基的情况下，还原包括在钯炭催化剂或镍催化剂等的存在下的催化氢化。
在上述反应产物中，由于能够通过上述步骤(3)中的分离纯化处理去除杂质，所以不需要使用硅胶柱色谱等的纯化。另外，获得的包含如上述式(3)所示的化合物的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体能够在上述本发明的分支型异单分散聚乙二醇的制造中原样使用，但是也可以在通过例如结晶、吸附处理或硅胶柱色谱的处理纯化之后使用。
根据上述制造方法，能够获得如上述式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体。因为本发明的如上述式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体具有高链长纯度和高官能团纯度，能够不通过例如硅胶柱色谱的处理进行纯化而以高链长纯度和高官能团纯度获得如上述式(1)或上述式(2)所示的分支型异单分散聚乙二醇。
如上述式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的链长纯度和官能团纯度能够通过反相色谱测定而确定。
在如式(1)所示的化合物中的L3为单键的情况下，该化合物能够在二氯甲烷溶剂中、在三乙胺的存在下通过使二琥珀酰亚胺基碳酸酯与如式(40)所示的化合物的羟基反应而获得。
如上述式(40)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的制造方法，其特征在于按照顺序至少包含下列步骤(1')至步骤(4')。
[步骤(1')]
步骤(1')包括通过使用在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂进行如下式(41)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(42)所示的化合物的偶联，以获得如下式(43)所示的化合物。
Z-CH2CH2-(OCH2CH2)n-1-B
…(41)
(在式(41)中，Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，m5表示1至5的整数，B表示离去基团，并且n表示6至30的整数)，
Figure BDA0002020071390000341
(在式(42)中，A表示羟基的保护基团)，
Figure BDA0002020071390000342
(在式(43)中，A表示羟基的保护基团，Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，m5表示1至5的整数，并且n表示6至30的整数)。
[步骤(2')]
步骤(2')包括如上述式(43)所示的化合物的保护基团A的去保护，以获得如下式(44)所示的化合物。
Figure BDA0002020071390000351
(在式(44)中，Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，m5表示1至5的整数，并且n表示6至30的整数。)
[步骤(3')]
步骤(3')包括对如上述式(44)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如上述式(40)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体。
[步骤(4')]
步骤(4')包括对如上述式(40)所示的化合物进行分离纯化。
上述碱性催化剂优选为氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种。
如上述式(40)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体的链长纯度和官能团纯度能够通过反相色谱测定而确定。
<分支型异单分散聚乙二醇缀合物>
通过使用本发明的如上述式(1)或式(2)所示的分支型异单分散聚乙二醇，能够获得其中化合物(异型聚乙二醇)与生物功能分子缀合的异型单分散聚乙二醇缀合物。
上述生物功能分子包括蛋白质药物、多肽、酶、抗体、抗体药物、基因、包括寡核酸等的核酸化合物、核酸药物、抗癌药物、以及其他药物，例如低分子量药物。
获得上述异型单分散聚乙二醇缀合物的方法包括例如下列方法：其中首先将例如抗癌药物或蛋白质药物的药物引入至如上述式(1)或式(2)所示的化合物的X1，然后将抗体缀合至另一个末端Y1。由于如上述式(1)或上述式(2)所示的化合物以高纯度在两个末端具有互不相同的官能团，当其用作ADC时，抑制了缺失期望的抗体或期望的药物的化合物的生成，从而期待ADC效果的提高。
实施例
将通过参考实施例，进一步具体地描述本发明，但是本发明不被解释为局限于这些实施例。
在各个合成实施例中，使用JEOL Ltd.制造的JMTC-400用于核磁共振(1H-NMR)测定，使用Waters Corp.制造的Quattro micro串联质谱仪用于质谱(ESI-MS)的测定。
(实施例1-1)
其中Z1为叠氮基的如式(5)所示的化合物4的合成
Figure BDA0002020071390000361
(在式中，Ms表示甲磺酰基)。
向茄形烧瓶中投入化合物1(20.0g，0.151mol)和甲苯(200mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(18.4g，0.182mol)。在0℃下向其中逐滴加入甲磺酰氯(19.1g，0.167mol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物1消失，向其中加入150mL 1M盐酸使液体分层。有机相用150mL 1M盐酸清洗一次，用150mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用150mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物2。
Figure BDA0002020071390000371
(在式中，Ms表示甲磺酰基。)
向茄形烧瓶中投入化合物2(20.8g，0.099mol)和N,N'-二甲基甲酰胺(100mL)，向其中加入叠氮化钠(7.72g，0.119mol)，在100℃下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过1H-NMR测定确认化合物2消失，用150mL乙酸乙酯稀释混合物。所得溶液用100mL饱和氯化钠水溶液清洗一次，并且用60mL饱和氯化钠水溶液清洗两次。然后，向第一次使用的饱和氯化钠水溶液中加入100mL乙酸乙酯以萃取，并且有机相用50mL饱和氯化钠水溶液清洗两次。合并两个有机相，向其中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物3。
产量：15.3g
Figure BDA0002020071390000372
向茄形烧瓶中投入化合物3(13.3g，mol)、四氢呋喃(5mL)和1M盐酸(10mL)，在室温下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物3消失，反应溶液在减压下浓缩(仅四氢呋喃)。向残留物中加入乙酸乙酯(50mL)使液体分层，有机相用30mL饱和氯化钠水溶液清洗三次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物4。
产量：2.01g
MS(ESI+)：化合物4 118.1[M+H]+
1H-NMR(CDCl3,400MHz)：3.89(m,1H),3.71(dd,1H),3.61(dd,1H),3.41(m,2H)
(实施例1-2)
其中Y2为-NH2并且n为12的如式(3)所示的化合物9的合成
Figure BDA0002020071390000381
(在式中，Trt表示三苯甲基。)
向茄形烧瓶中投入通过Polym.Chem.,2016,7,2389-2394中描述的方法获得的化合物5(50.0g，63.4mmol)和甲苯(250mL)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(10.5mL，76.1mmol)。在0℃下向其中逐滴加入甲磺酰氯(5.4mL，69.8mol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物5消失，向其中加入100mL 1M盐酸使液体分层。有机相用100mL 1M盐酸清洗一次，用100mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用100mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物6。
产量：52.0g
[步骤(1)]
Figure BDA0002020071390000391
(在式中，Trt表示三苯甲基。)
向茄形烧瓶中投入化合物4(1.64g，14.0mmol)和化合物6(36.4g，42.0mmol)，并且对其进行甲苯共沸(30mL×2)。向其中加入四氢呋喃(270mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入氢氧化钾(粉末，2.36g，42mmol)，在加热回流下将混合物搅拌7小时。7小时后，通过ESI-MS测定确认化合物4消失，向其中加入10mL饱和氯化铵水溶液终止反应。溶液在减压下浓缩(仅四氢呋喃)，残留物在150mL甲苯中溶解。溶液用100mL 1M离子交换水清洗两次，用100mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，并且用100mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物7。
产量：35.5g
[步骤(2)至(3)]
Figure BDA0002020071390000392
(在式中，Trt表示三苯甲基。)
向茄形烧瓶中投入化合物7(35.5g)和甲醇(180mL)。向其中加入对甲苯磺酸一水合物(3.99g，21.0mmol)和己烷(150mL)，在室温下将混合物搅拌30分钟。30分钟后，去除己烷层，然后向其中加入己烷(150mL)，并且在室温下将混合物搅拌30分钟。在相同的操作进行四次后，通过ESI-MS测定确认化合物7消失，并且向其中加入120mL碳酸氢钠饱和水溶液。混合溶液用150mL己烷清洗两次。产物的溶液在减压下浓缩，向残留物中加入180mL二氯甲烷，混合物用180mL离子交换水清洗三次，并且用180mL饱和氯化钠水溶液清洗一次(10℃)。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为褐色固体的化合物8。
产量：11.5g
[步骤(4)]
Figure BDA0002020071390000401
向茄形烧瓶中投入化合物8(11.5g)和甲醇(60mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入钯炭(1.2g)，茄形烧瓶内用氢气吹扫，并且在室温下搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物8消失，过滤反应溶液(玻璃纤维滤纸)。滤液在减压下浓缩，残留物在60mL二氯甲烷中溶解。溶液用60mL 1M盐酸萃取一次，并且用60mL二氯甲烷清洗两次。向水相中加入氯化钠至饱和，并且用60mL二氯甲烷萃取三次。合并有机相，向其中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为51.0％。结果总结在表1中。
产量：9.6g
MS(ESI+)：化合物9 1148.2[M+H]+
1H-NMR(CDCl3,400MHz)：3.62(m,99H),3.16(dd,1H),3.04(dd,1H)
(实施例1-3)
其中X1为活性碳酸酯基、Y1为马来酰亚胺基、L2为醚键、L3为-NHC(O)-(CH2)2-并且n为12的如式(1)所示的化合物11的合成
Figure BDA0002020071390000411
向茄形烧瓶中投入3-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯(301mg，1.1mmol)、二丁基羟基甲苯(4mg，0.018mmol)和氯仿(30mL)。将化合物9(1.0g，0.87mmol)和三乙胺(0.17mL，1.2mmol)溶解于氯仿(20mL)，将该溶液在室温下逐滴加入烧瓶。在室温下搅拌4小时后，通过ESI-MS测定确认化合物9消失，向其中加入50mL饱和氯化钠水溶液(pH＝2.0)使液体分层。有机相用50mL饱和氯化钠水溶液(pH＝2.0)清洗，并且在减压下浓缩。向残留物加入50mL柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)，并且混合物用50mL甲苯-氯仿(10:3w/w)清洗三次。水相用50mL氯仿萃取三次。合并有机相，向其中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物10。
产量：928mg
Figure BDA0002020071390000412
向茄形烧瓶中投入化合物10(928mg，0.71mmol)、三乙胺(0.32mL，2.3mmol)、二丁基羟基甲苯(3mg，0.014mmol)和二氯甲烷(45mL)。向其中加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(538mg，2.1mmol)，在室温下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物10消失，向其中加入45mL氯化钠水溶液(pH＝2.0)使液体分层。有机相用45mL氯化钠水溶液(pH＝2.0)清洗，并且在减压下浓缩。向残留物加入45mL 1M盐酸，混合物用45mL乙酸乙酯清洗两次，水相用45mL二氯甲烷萃取两次。合并有机相，用45mL 20％氯化钠水溶液清洗两次，然后合并有机相，向其中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物11。
产量：994mg
MS(ESI+)：化合物11 1598.7[M+NH4]+
1H-NMR(CD3OD,400MHz)：6.83(s,2H),4.47(m,4H),3.62(m,97H),3.38(dd,1H),3.18(dd,1H),2.83(s,8H),2.49(t,2H)
(实施例2-1)
其中Z1为氨基的被保护的形式并且m为3的如式(5)所示的化合物15的合成
Figure BDA0002020071390000421
向双颈茄形烧瓶中投入3-Boc-氨基-1-丙醇12(5.0g，28.5mmol)和甲苯(25mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(5.14mL，37.1mol)。在0℃下向其中逐滴加入甲磺酰氯(2.43mL，31.4mmol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物12消失，向其中加入25mL 1M盐酸使液体分层。有机相用25mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，并且用25mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入3g硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物13。
产量：6.9g
Figure BDA0002020071390000431
(在式中，Ms表示甲磺酰基。)
向四颈茄形烧瓶中投入氢化钠(1.5g)，随后用氮气吹扫。用10mL己烷的清洗进行两次，向其中加入30mL N,N'-二甲基甲酰胺，并且将混合物冷却至0℃。将20mL N,N'-二甲基甲酰胺与化合物1(5.31g，40.2mmol)混合，并且将混合物投入滴液漏斗，在30分钟内逐滴加入。在逐滴加入完成之后，将20mL N,N'-二甲基甲酰胺与化合物13(6.87g，28.7mmol)混合，并且将混合物投入同一个滴液漏斗，在15分钟内逐滴加入。在逐滴加入完成之后，将反应混合物的温度升高到40℃，随后搅拌3小时。3小时后，通过ESI-MS测定确认化合物13消失，使反应混合物冷却至室温。向反应混合物中加入150mL乙酸乙酯，用100mL饱和氯化铵水溶液清洗一次，并且用100mL饱和氯化钠水溶液清洗两次。向有机相中加入15g硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物14。
产量：6.9g
Figure BDA0002020071390000432
向茄形烧瓶中投入化合物14(6.90g，23.8mmol)、四氢呋喃(20mL)和1M盐酸(20mL)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物14消失，并且向反应混合物中加入50mL乙酸乙酯。混合溶液用50mL饱和氯化钠水溶液清洗两次。向有机相中加入5g硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物15。
产量：1.7g
MS(ESI+)：化合物15 250.2[M+H]+
1H-NMR(CDCl3,400MHz)：4.83(s,1H),3.85(m,1H),3.70(dd,1H),3.64(dd,1H),3.51(m,4H),3.25(m,2H),1.74(m,2H),1.44(s,9H)
(实施例2-2)
其中Y1为-O-(CH2)3-NH2并且n为24的如式(3)所示的化合物23的合成
Figure BDA0002020071390000441
(在式中，Bn表示苄基，并且Trt表示三苯甲基。)
向1L的四颈茄形烧瓶中投入氢化钠(1.83g)，随后用氮气吹扫。用无水己烷(20mL)的清洗进行两次，向其中加入80mL乙腈，并且将混合物冷却至0℃。将40mL乙腈与已经与20mL甲苯进行了三次共沸脱水的化合物5(30.0g，38.0mmol)混合，将混合物投入滴液漏斗，在30分钟内逐滴加入。在逐滴加入完成之后，将反应混合物的温度升高到40℃，随后搅拌30分钟。将苄基氯(4.15mL，36.1mmol)投入同一个滴液漏斗，在15分钟内逐滴加入。在逐滴加入完成之后，将反应混合物的温度升高到40℃，随后搅拌2小时。2小时后，通过使用薄层色谱法(己烷:乙酸乙酯＝4:1体积比)测定确认苄基氯消失，使反应混合物冷却至室温。向反应混合物加入20mL饱和氯化铵水溶液之后，混合物在减压下浓缩，向残留物加入100mL甲苯。甲苯溶液用100mL饱和氯化铵水溶液清洗两次，并且用100mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入10g硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物16。
产量：30.9g
Figure BDA0002020071390000451
(在式中，Bn表示苄基，并且Trt表示三苯甲基。)
向1L的茄形烧瓶中投入化合物16(30.9g，35.1mmol)和甲醇(240mL)，然后向其中加入对甲苯磺酸一水合物(3.3g，17.6mmol)，在室温下将混合物搅拌30分钟。30分钟后，去除上层的己烷层，然后向其中加入己烷(90mL)，随后在室温下搅拌30分钟。在相同的操作进行六次后，通过ESI-MS测定确认化合物16消失，并且在0℃下向其中加入100mL碳酸氢钠饱和水溶液。混合溶液用90mL己烷清洗两次。产物的溶液在减压下浓缩，残留物在100mL离子交换水中溶解，并且用100mL甲苯清洗两次。在向下层的水溶液中加入30g氯化钠以达到饱和浓度之后，用100mL二氯甲烷进行两次萃取。向萃取的有机相中加入20g硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物17。
产量：15.6g
Figure BDA0002020071390000452
(在式中，Trt表示三苯甲基，并且Bn表示苄基。)
向双颈茄形烧瓶中投入氢化钠(219g，50.2mmol)，随后用氮气吹扫。用无水己烷(25mL×两次)的清洗进行两次，向其中加入50mL乙腈，并且将混合物冷却至0℃。化合物17(22.8g，35.8mmol)与15mL甲苯进行三次共沸脱水，然后与25mL乙腈混合，将混合物投入滴液漏斗，在30分钟内逐滴加入。将30mL乙腈与已经与50mL甲苯进行了三次共沸脱水的化合物6(52.8g，60.9mmol)混合，将混合物投入同一个滴液漏斗，在15分钟内逐滴加入。在逐滴加入完成之后，将反应混合物的温度升高到80℃，随后搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物16消失，向其中加入甲醇钠的甲醇溶液(3.5mL)，随后搅拌30分钟。30分钟后，通过ESI-MS测定确认化合物16消失，使反应混合物冷却至室温。反应混合物在减压下浓缩，向残留物加入350mL甲苯。甲苯溶液用350mL饱和氯化铵水溶液清洗两次，并且用350mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物18。
产量：55.8g
Figure BDA0002020071390000461
(在式中，Trt表示三苯甲基，并且Bn表示苄基。)
向茄形烧瓶中投入化合物18(55.8g)和甲醇(300mL)。向其中加入对甲苯磺酸一水合物(3.76g，19.8mmol)和己烷(320mL)，在室温下将混合物搅拌30分钟。30分钟后，去除己烷层，然后向其中加入己烷(200mL)，并且在室温下将混合物搅拌30分钟。在相同的操作进行六次后，通过ESI-MS测定确认化合物18消失，向其中加入300mL碳酸氢钠饱和水溶液。混合溶液用200mL己烷清洗两次。产物的溶液在减压下浓缩，向残留物中加入400mL二氯甲烷，混合物用400mL离子交换水清洗三次，并且用400mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物19。
产量：39.3g
Figure BDA0002020071390000471
(在式中，Bn表示苄基，并且Ms表示甲磺酰基。)
向茄形烧瓶中投入化合物19(14.7g，12.6mmol)和甲苯(70mL)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(2.1mL，15.1mmol)。在0℃下逐滴加入甲磺酰氯(1.1mL，13.9mmol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物19消失，向其中加入70mL 1M盐酸使液体分层。有机相用70mL 1M盐酸清洗一次，用70mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用70mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物20。
产量：12.7g
Figure BDA0002020071390000472
向茄形烧瓶中投入化合物15(0.82g，3.29mmol)和化合物20(12.7g，10.2mmol)，并且对其进行甲苯共沸(15mL×2)。向其中加入四氢呋喃(60mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入氢氧化钠(408mg，10.2mmol)，在加热回流下将混合物搅拌7小时。7小时后，通过ESI-MS测定确认化合物15消失，向其中加入20mL饱和氯化铵水溶液终止反应。溶液在减压下浓缩(仅四氢呋喃)，残留物在60mL甲苯中溶解。溶液用60mL饱和氯化铵水溶液清洗一次，并且用60mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物21。
产量：8.5g
Figure BDA0002020071390000481
向茄形烧瓶中投入化合物21(8.5g)和甲醇(40mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入钯炭(900mg)，茄形烧瓶内用氢气吹扫，并且在室温下搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物21消失，过滤反应溶液(玻璃纤维滤纸)。滤液在减压下浓缩，残留物在40mL二氯甲烷中溶解。溶液用40mL离子交换水清洗三次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物22。
产量：3.9g
Figure BDA0002020071390000482
向茄形烧瓶中投入化合物22(3.9g，1.6mmol)和二氯甲烷(20mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。在0℃下向其中加入三氟乙酸(0.15mL，1.9mmol)，在室温下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物22消失，向其中加入三乙胺(0.31mL，2.2mmol)终止反应。溶液用20mL 1M盐酸萃取三次。合并水相，用20mL二氯甲烷萃取三次。合并有机相，向其中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物23。
产量：3.4g
(实施例2-3)
其中X1为叠氮基、Y1为溴乙酰胺基、L1为-(CH2)2-、L2为醚键、L3为-O-(CH2)3-并且n 为23的如式(1)所示的化合物25的合成
Figure BDA0002020071390000491
向茄形烧瓶中投入化合物23(1.0g，0.44mmol)、5-叠氮基戊酸(68.7g，0.48mmol)和氯仿(5mL)。向其中加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(104mg，0.53mmol)，在室温下将混合物搅拌4小时。4小时后，通过ESI-MS测定确认化合物23消失，过滤反应溶液。滤液用5mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗三次，并且用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向其中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物24。
产量：1.0g
Figure BDA0002020071390000492
向茄形烧瓶中投入化合物24(1.0g，0.42mmol)、三乙胺(0.32mL，1.0mmol)、二丁基羟基甲苯(3mg，0.014mmol)和二氯甲烷(50mL)。向其中加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(237mg，0.92mmol)，在室温下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物24消失，向其中加入和50mL氯化钠水溶液(pH＝2.0)使液体分层。有机相用50mL氯化钠水溶液(pH＝2.0)清洗，并且在减压下浓缩。向残留物加入50mL 1M盐酸，混合物用50mL乙酸乙酯清洗两次，水相用50mL二氯甲烷萃取两次。合并有机相，用50mL 20％氯化钠水溶液清洗两次，然后合并有机相，向其中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物25。
产量：1.0g
MS(ESI+)：化合物25 1352.6[M+2NH4]2+
1H-NMR(CD3OD,400MHz)：4.43(m,4H),3.64(m,195H),3.41(m,2H),3.22(m,2H),2.80(s,8H),2.71(t,2H),1.74(m,2H),1.46(m,4H)
(实施例3-1)
其中X1为活性碳酸酯基、Y1为溴乙酰胺基、L2为醚键并且n为12的如式(1)所示的化 合物27的合成
Figure BDA0002020071390000501
向茄形烧瓶中投入实施例1-2中获得的化合物9(1.0g，0.87mmol)和甲苯(5mL)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(0.145mL，1.04mmol)。在0℃下向其中逐滴加入溴乙酰溴(0.083mL，0.95mmol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物9消失，向其中加入5mL 1M盐酸使液体分层。有机相用5mL 1M盐酸清洗一次，用5mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物26。
产量：1.03g
Figure BDA0002020071390000511
向茄形烧瓶中投入化合物26(1.03g，0.81mmol)和甲苯(5mL)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(0.27mL，1.94mmol)。在0℃下向其中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(359mg，1.78mmol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物26消失，向其中加入5mL 1M盐酸使液体分层。有机相用5mL 1M盐酸清洗一次，并且用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物27。
产量：1.20g
MS(ESI+)：化合物27 816.8[M+2NH4]2+
1H-NMR(CD3OD,400MHz)：8.37(d,2H),7.44(d,2H),4.31(m,4H),4.10(s,2H),3.64(m,95H),3.41(m,2H)
(实施例4-1)
其中X1为活性酯基、Y1为炔基、L1为-(CH2)2-、L2为醚键、L3为-NHC(O)-(CH2)2-并且n 为12的如式(1)所示的化合物31的合成
Figure BDA0002020071390000512
向茄形烧瓶中投入二苯并环辛炔-N-羟基马来酰亚胺基酯(198mg，0.48mmol)和氯仿(2mL)。将实施例1-2中获得的化合物9(500mg，0.44mmol)和三乙胺(0.072mL，0.52mmol)溶解于氯仿(1mL)，将该溶液在室温下逐滴加入烧瓶。在室温下搅拌4小时后，通过ESI-MS测定确认二苯并环辛炔-N-羟基马来酰亚胺基酯消失，向其中加入5mL 1M盐酸使液体分层。有机相用5mL 1M盐酸清洗一次，并用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次，并且在减压下浓缩。向有机相中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物28。
产量：613mg
Figure BDA0002020071390000521
向茄形烧瓶中投入化合物28(613mg，0.43mmol)和二氯甲烷(12mL)。在0℃下向其中加入氢氧化钾(粉末，24mg，0.43mmol)，向其中逐滴加入丙烯酸叔丁酯(0.38mL，2.58mmol)，在0℃下将混合物搅拌1.5小时。1.5小时后，通过ESI-MS测定确认反应进程，并且在2小时后，加入5mL饱和氯化铵水溶液。对混合溶液进行分液，有机相用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物29。
产量：715mg
Figure BDA0002020071390000522
向茄形烧瓶中投入化合物29(715mg，0.42mmol)和1M盐酸(3mL)，在60℃下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物29消失，将混合物冷却至室温。向反应溶液中加入5mL二氯甲烷使液体分层。有机相用5mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，并且用饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物30。
产量：641mg
Figure BDA0002020071390000531
向茄形烧瓶中投入化合物30(641mg，0.41mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(112g，0.97mmol)和氯仿(5mL)。向其中加入1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(202mg，1.05mmol)，在室温下将混合物搅拌4小时。4小时后，通过ESI-MS测定确认化合物30消失，过滤反应溶液。滤液用5mL柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)清洗三次，并且用5mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向其中加入硫酸镁干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为白色固体的化合物31。
产量：633mg
MS(ESI+)：化合物31 904.3[M+2NH4]2+
1H-NMR(CD3OD,400MHz)：7.48(m,8H),5.13(d,1H),3.64(m,104H),3.40(m,2H),2.98(m,4H),2.83(s,8H),2.66(t,4H)
<如式(1)所示的分支型异单分散聚乙二醇的链长纯度和官能团纯度>
(实施例5-1)
[链长纯度的测定]
关于实施例1-3合成的化合物11的链长纯度，使用实施例1-2合成的化合物9的链长纯度。
作为化合物9的反相色谱测定的结果，发现包含93.4％的n为12的分支型单分散聚乙二醇以及总计6.6％的n为除了12之外的化合物，其中n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，所以链长纯度为93.4％。结果总结在表1中。
另外，在反相色谱测定中，通过使用质谱仪作为检测器识别各个峰，然后从通过使用差示折光计作为检测器计算的各个峰的面积值测定纯度。在使用质谱仪作为检测器的情况下，通过分别使用Waters Corp.制造的Alliance 2695作为机器、Waters Corp.制造的Quattro micro串联质谱仪作为检测器(质谱仪)、Tosoh Corp.制造的TSKgel ODS-80Ts(粒径：5μm，柱尺寸：4.6mm×25cm)作为色谱柱、以及5mM乙酸铵的甲醇/蒸馏水＝45/55的溶液作为展开溶剂，在0.6mL/min的流速、45℃的柱温、0.01mg/g的样品浓度以及5μL的进样量的条件下进行测定。在使用差示折光计作为检测器的情况下，通过分别使用Tosoh Corp.制造的构建GPC***(build GPC system)HLC-8220作为机器、Tosoh Corp.制造的RI-8020作为检测器(差示折光计)、Tosoh Corp.制造的TSKgel ODS-80Ts(粒径：5μm，柱尺寸：4.6mm×25cm)作为色谱柱、以及5mM乙酸铵的甲醇/蒸馏水＝45/55的溶液作为展开溶剂，在0.6mL/min的流速、45℃的柱温、0.2mg/mL的样品浓度以及40μL的进样量的条件下进行测定。
[官能团纯度的测定]
实施例1-3合成的化合物11的官能团纯度是基于化合物9的官能团纯度通过1H-NMR测定确定的。
具体地，作为化合物9的反相色谱测定的结果，发现包含99.9％的在末端具有两个羟基和一个氨基的化合物，以及0.1％的具有末端官能团的其他组合的化合物，所以官能团纯度为99.9％。另外，在从化合物9获得化合物10的反应中，源自化合物9的氨基的α位的亚甲基的峰(3.16、3.04ppm，2H)消失，并且在3.38和3.18ppm观察到新的峰。当采用在反应中积分值的不变化的峰(3.62ppm，97H)作为基准时，新的峰的积分值总计为1.997，所以马来酰亚胺基的引入率为99.9％(＝1.997÷2×100)。
接下来，当采用源自化合物11的1H-NMR谱图中的马来酰亚胺基的峰(6.83ppm，2H)的积分值作为基准(2.0)时，源自活性碳酸酯基的峰(4.47ppm，4H)的积分值为3.840，所以活性碳酸酯基的引入率为96.0％(＝3.840÷4)。因此，化合物11的官能团纯度为95.8％(＝99.9×0.999×0.96)。结果总结在表1中。
(实施例5-2)
[链长纯度的测定]
关于实施例2-3合成的化合物25的链长纯度，使用实施例2-2合成的化合物23的链长纯度。
作为化合物23的反相色谱测定的结果，发现包含91.6％的n为24的分支型单分散聚乙二醇以及总计8.4％的n为除24以外的化合物，其中n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且，所以链长纯度为91.6％。结果总结在表1中。除了使用5mM乙酸铵的甲醇/蒸馏水＝55/45的溶液作为展开溶剂之外，通过与实施例5-1相同的方法进行反相色谱测定。
[官能团纯度的测定]
实施例2-3合成的化合物25的官能团纯度以与实施例7-1中相同的方式通过1H-NMR测定确定。
关于化合物23的反相色谱测定的结果，官能团纯度为99.9％。另外，在从化合物23获得化合物24的反应中，源自化合物23的氨基的α位的亚甲基的峰(3.10ppm，2H)消失，并且在3.41ppm观察到新的峰。当采用在反应中积分值不变化的峰(3.64ppm，195H)作为基准时，新的峰的积分值总计为1.990，所以叠氮基的引入率为99.5％(＝1.990÷2×100)。接下来，当采用源自化合物25的1H-NMR谱图中的叠氮基的峰(3.22ppm，2H)的积分值作为基准(2.0)时，源自活性碳酸酯基的峰(4.43ppm，4H)的积分值为3.905，所以活性碳酸酯基的引入率为97.6％(＝3.905÷4)。因此，化合物25的官能团纯度为97.0％(＝99.9×0.995×0.976)。结果总结在表1中。
(实施例5-3)
[链长纯度的测定]
实施例3-1合成的化合物27的链长纯度以与实施例5-1中相同的方法确定。链长纯度为93.4％。结果总结在表1中。
[官能团纯度的测定]
实施例3-1合成的化合物27的官能团纯度以与实施例5-1中的相同的方式通过1H-NMR测定确定。
关于化合物9的反相色谱测定的结果，官能团纯度为99.9％。另外，在从化合物9获得化合物26的反应中，源自化合物9的氨基的α位的亚甲基的峰(3.16、3.04ppm，2H)消失，并且在3.41ppm观察到新的峰。当采用在反应中积分值不变化的峰(3.62ppm，97H)作为基准时，新的峰的积分值为1.992，所以溴乙酰胺基的引入率为99.6％(＝1.992÷2×100)。接下来，当采用源自化合物27的1H-NMR谱图中的溴乙酰胺基的峰(4.13ppm，2H)的积分值作为基准(2.0)时，源自活性碳酸酯基的峰(4.31ppm，4H)的积分值为3.896。所以活性碳酸酯基的引入率为97.4％(＝3.896÷4)。因此，化合物27的官能团纯度为96.9％(＝99.9×0.996×0.974)。结果总结在表1中。
(实施例5-4)
[链长纯度的测定]
实施例4-1合成的化合物31的链长纯度以与实施例5-1中相同的方法确定。链长纯度为93.4％。
[官能团纯度的测定]
实施例4-1合成的化合物31的官能团纯度通过1H-NMR测定确定。
关于化合物30的反相色谱测定的结果，官能团纯度为99.9％。另外，在从化合物9获得化合物28的反应中，源自化合物9的氨基的α位的亚甲基的峰(3.16、3.04ppm，2H)消失，并且在3.40ppm观察到新的峰。当采用在反应中积分值不变化的峰(3.62ppm，97H)作为基准时，新的峰的积分值为1.998，所以炔基的引入率为99.9％(＝1.998÷2×100)。接下来，当采用源自化合物31的1H-NMR谱图中的炔基的峰(2.98ppm，4H)的积分值作为基准(4.0)时，源自活性酯基的峰(2.83ppm，8H)的积分值为7.624。所以活性酯基的引入率为95.3％(＝7.624÷8)。因此，化合物31的官能团纯度为95.1％(＝99.9×0.999×0.953)。结果总结在表1中。
表1
Figure BDA0002020071390000571
<用于制造如式(3)所示的分支型异单分散聚乙二醇的中间体的链长纯度和官能团纯度>
(实施例6-1)
除了在化合物4与化合物6之间的反应中使用氢氧化钠代替氢氧化钾作为碱性催化剂之外，以与实施例1-2相同的方式获得化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为48.3％。结果总结在表2中。
(实施例6-2)
除了在化合物4与化合物6之间的反应中使用叔丁醇钾代替氢氧化钾作为碱性催化剂之外，以与实施例1-2相同的方式获得化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为50.1％。结果总结在表2中。
(实施例7-1)
实施例1-2合成的化合物9的纯度通过反相色谱测定而确定。
测定条件与实施例5-1相同。作为结果，包含93.4％的n为12的分支型单分散聚乙二醇以及总计6.6％的n为除12以外的化合物，其中n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，所以链长纯度为93.4％。另外，包含99.9％的在末端具有两个羟基和一个氨基的化合物以及0.1％的具有末端官能团的其他组合的化合物，所以官能团纯度为99.9％。结果总结在表2中。
(实施例7-2)
实施例6-1合成的化合物9的纯度是通过与实施例5-1相同的方法确定的。链长纯度为91.8％，并且官能团纯度为99.9％。结果总结在表2中。
(实施例7-3)
实施例6-2合成的化合物9的链长纯度是以与实施例5-1中相同的方法确定的。链长纯度为92.6％，并且官能团纯度为99.7％。结果总结在表2中。
(比较例1-1：步骤(1)中的碱性催化剂改变的情况)
除了在化合物4与化合物6之间的反应中使用氢化钠代替氢氧化钾作为碱性催化剂之外，以与实施例1-2相同的方式获得化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为23.2％。结果总结在表2中。
(比较例1-2：步骤(3)中的分液温度改变的情况)
除了在步骤(3)将分离清洗时的温度改变为25℃之外，以与实施例1-2相同的方式获得化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为52.8％。结果总结在表2中。
(比较例1-3：权利要求5中描述的保护基团A和保护基团Z的组合不是优选组合的情况)
除了使用化合物35代替化合物6之外，以与实施例1-2相同的方式获得化合物9。基于化合物4，三个步骤的摩尔产率为36.2％。结果总结在表2中。
Figure BDA0002020071390000591
(在式中，Bn表示苄基，并且Ms表示甲磺酰基。)
向茄形烧瓶中投入化合物17(15.6g，24.5mmol)和甲苯(80mL)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入三乙胺(4.1mL，29.4mmol)。在0℃下向其中逐滴加入甲磺酰氯(2.1mL，27.0mol)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过ESI-MS测定确认化合物17消失，向其中加入80mL 1M盐酸使液体分层。有机相用80mL 1M盐酸清洗一次，用80mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗两次，并且用80mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物32。
产量：16.7g
Figure BDA0002020071390000601
(在式中，Bn表示苄基)
向茄形烧瓶中投入化合物4(1.64g，14.0mmol)和化合物32(30.0g，42.0mmol)，并且对其进行甲苯共沸(30mL×2)。向其中加入四氢呋喃(270mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入氢氧化钾(粉末，2.36g，42mmol)，在加热回流下将混合物搅拌7小时。7小时后，通过ESI-MS测定确认化合物4消失，向其中加入10mL饱和氯化铵水溶液终止反应。溶液在减压下浓缩(仅四氢呋喃)，残留物在150mL甲苯中溶解。溶液用100mL 1M离子交换水清洗两次，用100mL饱和碳酸氢钠水溶液清洗一次，并且用100mL饱和氯化钠水溶液清洗一次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物33。
产量：30.2g
Figure BDA0002020071390000602
(在式中，Bn表示苄基)
向茄形烧瓶中投入化合物33(30.2g)和甲醇(150mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入钯炭(3.0g)，茄形烧瓶内用氢气吹扫，并且在室温下搅拌5小时。5小时后，通过ESI-MS测定确认化合物33消失，过滤反应溶液(玻璃纤维滤纸)。滤液在减压下浓缩，残留物在150mL二氯甲烷中溶解。溶液用150mL离子交换水清洗五次。向有机相中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为淡黄色透明液体的化合物9。基于化合物4，两个步骤的摩尔产率为36.2％。结果总结在表2中。
产量：5.8g
(比较例2-1)
比较例1-1合成的化合物9的纯度通过与实施例9-1相同的方法确定。链长纯度为64.9％，并且官能团纯度为70.4％。结果总结在表2中。
(比较例2-2)
比较例1-2合成的化合物9的纯度通过与实施例9-1相同的方法确定。链长纯度为86.1％，并且官能团纯度为92.2％。结果总结在表2中。
(比较例2-3)
比较例1-3合成的化合物9的纯度通过与实施例9-1相同的方法确定。链长纯度为92.7％，并且官能团纯度为99.3％。结果总结在表2中。
表2
Figure BDA0002020071390000611
从上述结果确认了，实施例1-2、实施例6-1或实施例6-2获得的化合物9，n为12的的化合物的纯度(链长纯度)为90％以上，其中n表示单分散聚乙二醇的重复单元的个数，并且在末端具有两个羟基和一个氨基的化合物的纯度(官能团纯度)为95％以上。
另外，关于比较例1-1获得的化合物9，因为在步骤(1)的偶联中使用氢化钠作为碱性催化剂，由于分支位点的分解或副反应，生成了具有未知结构的多种杂质，所以摩尔产率、链长纯度和官能团纯度下降。在使用比较例1-1获得的化合物9合成如上述式(1)所示的化合物的情况下，获得了具有低链长纯度和低官能团纯度的化合物，并且在为了提高纯度而进行通过柱色谱的纯化时，摩尔产率进一步下降。
此外，关于比较例1-2获得的化合物9，因为在步骤(3)的分离纯化时的高温，上述式(39)所示的单分散聚乙二醇未被分离。因为杂质为直链型并且末端官能团为羟基和甲磺酸酯基的组合，所以化合物9的链长纯度和官能团纯度下降。
在例如以与实施例1-3相同的方式，使用比较例1-2获得的化合物9获得化合物11的情况下，因为上述杂质形成为直链型并且在末端具有活性碳酸酯基和甲磺酸酯基的化合物，所以化合物11的链长纯度和官能团纯度下降。在为了提高纯度而进行通过柱色谱的纯化时，摩尔产率进一步下降。
另外，关于比较例1-3获得的化合物9，因为在步骤(2)中同时进行如上述式(6)所示的化合物的保护基团A(苄基)的去保护和官能团Z1(叠氮基)的还原处理，在步骤(3)的分离纯化中，如上述式(3)所示的化合物与如上述式(39)所示的单分散聚乙二醇一起溶解于水相，所以摩尔产率下降。在使用比较例1-3获得的化合物9合成如上述式(1)所示的化合物的情况下，低链长纯度为90％以上并且官能团纯度为95％以上，但是摩尔产率低。
(实施例8-1)
其中Y2为-NH2并且n为12的如式(40)所示的化合物45的合成
Figure BDA0002020071390000631
(在式中，Trt表示三苯甲基。)
向茄形烧瓶中投入化合物15(15g，19.0mmol)和二氯甲烷(71mL)使之溶解。茄形烧瓶内用氮气吹扫，并且向其中加入苯邻二甲酰亚胺(3.92g，26.6mmol)和三苯基膦(6.98g，26.6mmol)。在20至30℃下向其中逐滴加入熔接在二氯甲烷(15mL)中的偶氮二甲酸二异丙酯(4.61g，22.8mmol)，在25℃下将混合物搅拌1小时。1小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物5消失，向其中加入甲醇(0.73mL，22.8mmol)终止反应。反应溶液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物46。
NH2-CH2CH2-(OCH2CH2)n-1-O-Trt
…(47)
(在式中，Trt表示三苯甲基。)
向茄形烧瓶中投入上述化合物46的总量、甲醇(59.4mL)和乙二胺一水合物(22.28g，285mmol)，随后在氮气吹扫下溶解。混合物在35至45℃下搅拌1小时。1小时后，通过NMR测定确认化合物46消失。加入甲苯(75mL)和20％氯化钠水溶液(75mL)清洗三次，并且将有机相在减压下浓缩。然后，残留物在离子交换水(45mL)中溶解，并且向其中加入5％磷酸二氢钠水溶液(120mL)将pH调整至6。溶液用乙酸乙酯(190mL)清洗三次以获得化合物47的水溶液。
NH2-CH2CH2-(OCH2CH2)n-1-OH
…(48)
在茄形烧瓶中，向上述化合物47的水溶液的总体积中加入少量6N盐酸将pH调整至1，将混合物搅拌5小时。5小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物47消失，过滤去除沉积的固体。用少量400g/L氢氧化钠水溶液将pH调整至7.5，向其中加入氯仿(200mL)清洗一次。向所得水溶液中加入氯化钠以形成饱和氯化钠水溶液，向其中加入氯仿(45mL)和异丙醇(15mL)以将期望的化合物萃取至有机相，将有机相在减压下浓缩，在氯仿(75mL)中再次溶解，向其中加入无水硫酸钠(10g)脱水。过滤溶液以去除无水硫酸钠，并且加入甲苯(35mL)的同时在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物48。
产量：6.51g
Figure BDA0002020071390000641
向茄形烧瓶中投入化合物48(5.93g，10.9mmol)、水(30mL)和四氢呋喃(33mL)使之溶解。茄形烧瓶内用氮气吹扫，向其中加入碳酸氢钠(2.66g，31.6mmol)和二甲酸二叔丁酯(3.46g，15.8mmol)，混合物在20至30℃下搅拌6小时。6小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物48消失。加入己烷(45mL)清洗水相四次，然后向其中加入二氯甲烷(22.4mL)以将期望的化合物萃取至有机相。向有机相加入无水硫酸钠(6g)脱水，过滤溶液以去除无水硫酸钠。然后，溶液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物49。
产量：6.31g
Figure BDA0002020071390000642
(在式中，Ms表示甲磺酰基。)
向茄形烧瓶中投入化合物49(6.2g，9.6mmol)和甲苯(36mL)使之溶解。茄形烧瓶内用氮气吹扫，向其中加入三乙胺(1.33g，13.1mmol)和甲磺酰氯(1.29g，11.3mmol)，混合物在20至30℃下搅拌4小时。4小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物49消失。向其中加入25％氨水溶液(30mL)清洗有机相三次，然后向其中加入饱和氯化钠水溶液(30mL)清洗有机相一次。向有机相加入无水硫酸钠(6g)脱水，过滤溶液以去除无水硫酸钠。然后，溶液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物50。
产量：5.87g
[步骤(1')]
Figure BDA0002020071390000651
向茄形烧瓶中投入化合物50(4.0g，5.5mmol)、化合物51(0.47g，2.6mmol)和无水四氢呋喃(6.0mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫，使之溶解。向其中加入氢氧化钾(粉末，0.15g)，在20至30℃下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过NMR测定确定残留的化合物50，向其中加入氢氧化钾(粉末，0.15g)，在20至30℃下将混合物搅拌2小时。随后，向其中加入乙二胺一水合物(10.78g，138mmol)终止反应，然后向其中加入甲苯(46mL)稀释。向其中加入25％氨水溶液(20mL)清洗有机相四次，向有机相中加入无水硫酸钠(4g)干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物52。
产量：3.2g
[步骤(2')]
Figure BDA0002020071390000661
向茄形烧瓶中投入化合物52(3.0g，2.1mmol)、甲醇(120mL)和5％Pd/C(1.5g)。茄形烧瓶内用氮气吹扫，向其中加入环己烷(4.1g)，混合物在50至60℃下搅拌4小时。在冷却至30℃后，向其中加入氯仿(300mL)，过滤去除Pd/C，将滤液在加入甲苯(100mL)的同时在减压下干燥从而最终用甲苯(40mL)代替溶剂。向有机相中加入无水硫酸钠(3g)干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物53。
产量：2.2g
[步骤(3')至(4')]
Figure BDA0002020071390000662
向茄形烧瓶中投入化合物53(2.0g，1.48mmol)和二氯甲烷(16mL)，茄形烧瓶内用氮气吹扫。向其中加入三氟乙酸(3g)，在室温下将混合物搅拌2小时。2小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物53消失，加入水(40mL)以将期望的化合物萃取至水相。向水溶液中加入少量400g/L氢氧化钠水溶液将pH调整至7.5，向其中加入氯化钠以形成饱和氯化钠水溶液。随后，向其中加入氯仿(9mL)和异丙醇(3mL)以将期望的化合物萃取至有机相，并且有机相按顺序用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和饱和氯化钠水溶液(20mL)清洗。有机相在减压下浓缩，在氯仿(20mL)中再次溶解，向其中加入硫酸钠干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物45。基于化合物50，三个步骤的摩尔产率为51.8％。链长纯度为94.8％，并且官能团纯度为98.2％。
产量：1.4g
(实施例8-2)
其中X1为马来酰亚胺基、Y1为活性碳酸酯基并且L3为单键的如式(1)所示的化合物 54的合成
Figure BDA0002020071390000671
向茄形烧瓶中投入3-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯(667mg，2.5mmol)、二丁基羟基甲苯(1mg)和二氯甲烷(130mL)。将化合物45(1.2g，1.05mmol)和三乙胺(0.38mL，2.7mmol)溶解于二氯甲烷(8mL)，将该溶液在室温下逐滴加入烧瓶。在室温下搅拌4小时后，通过薄层色谱法(TLC)测定确认化合物45消失，有机相用含15％溶解的氯化钠的柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)(50mL)清洗三次，并且在减压下浓缩。向残留物中加入柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)(50mL)，混合物用甲苯-二氯甲烷(10:3w/w)(50mL)清洗三次。水相用50mL二氯甲烷萃取三次。合并有机相，向其中加入无水硫酸镁(1g)干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物55。
产量：890mg
向茄形烧瓶中投入化合物55(780mg，0.54mmol)、三乙胺(0.12mL，0.86mmol)、二丁基羟基甲苯(1mg)和二氯甲烷(15mL)。向其中加入二琥珀酰亚胺基碳酸酯(208mg，0.81mmol)，在室温下将混合物搅拌5小时。5小时后，通过NMR测定确定化合物55消失，加入含15％溶解的氯化钠的柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)(25mL)清洗三次。合并有机相，向其中加入无水硫酸钠(1g)干燥，随后过滤。滤液在减压下浓缩，以获得为透明液体的化合物54。链长纯度为93.2％，并且官能团纯度为95.8％。
产量：705mg

Claims (11)

1.一种分支型异单分散聚乙二醇，其特征在于，如式(1)所示：
Figure FDA0003026374660000011
并且所述分支型异单分散聚乙二醇的链长纯度为90％以上，其中，
在式(1)中，
X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同，
n是6至30的整数，
E是具有对于L2的键价数为2价且对于L3的键价数为1价的分支位点，并且表示甘油位点，
L1和L2各自独立地表示单键或二价有机基团，并且
L3表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
2.根据权利要求1所述的分支型异单分散聚乙二醇，其特征在于，L3表示-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
3.根据权利要求1或2所述的分支型异单分散聚乙二醇，其特征在于，式(1)中所含的L2是醚键。
4.根据权利要求1或2所述的分支型异单分散聚乙二醇，其如式(2)所示：
Figure FDA0003026374660000021
在式(2)中，
X1和Y1各自表示包含至少一个能够与生物功能分子中存在的官能团反应以形成共价键的官能团的原子团，条件是原子团X1包含的官能团与原子团Y1包含的官能团互不相同，
n是6至30的整数，
L1表示单键或二价有机基团，并且
L3表示单键、-L4-(CH2)m1-或-L4-(CH2)m2-L5-(CH2)m3-，L4表示醚键、酰胺键和氨基甲酸酯键的任意一种，L5表示酰胺键或氨基甲酸酯键，并且m1、m2和m3各自独立地表示1至5的整数。
5.一种用于制造根据权利要求4所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体，如式(3)所示：
Figure FDA0003026374660000022
在式(3)中，
n表示6至30的整数，并且
Y2表示-NH2或-O-(CH2)m4-NH2，并且m4表示1至5的整数。
6.一种制造根据权利要求5所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体的方法，其特征在于，以如下所述的顺序包含：
步骤(1)，使用在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂，进行如下式(4)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(5)所示的化合物的偶联，以获得如下式(6)所示的化合物，
A-(OCH2CH2)n-B ···(4)
在式(4)中，
A表示羟基的保护基团，
B表示离去基团，并且
n表示6至30的整数，
Figure FDA0003026374660000031
在式(5)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，
Figure FDA0003026374660000032
在式(6)中，
A表示羟基的保护基团，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数；
步骤(2)，如所述式(6)所示的化合物的保护基团A的去保护，以获得如下式(7)所示的化合物，
Figure FDA0003026374660000033
在式(7)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数；
步骤(3)，对如所述式(7)所示的化合物进行分离纯化；以及
步骤(4)，对如所述式(7)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如式(3)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述碱性催化剂是氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种。
8.一种分支型异单分散聚乙二醇缀合物，其特征在于，生物功能分子缀合至根据权利要求1至4的任意一项所述的分支型异单分散聚乙二醇。
9.一种用于制造根据权利要求4所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体，如式(40)所示：
Figure FDA0003026374660000041
在式(40)中，
n表示6至30的整数，并且
Y2表示-NH2或-O-(CH2)m4-NH2，并且m4表示1至5的整数。
10.一种制造根据权利要求9所述的分支型异单分散聚乙二醇的中间体的方法，其特征在于，以如下所述的顺序包含：
步骤(1')，使用在水溶液中的pKa为15至20的碱性催化剂，进行如下式(41)所示的单分散聚乙二醇衍生物与如下式(42)所示的化合物的偶联，以获得如下式(43)所示的化合物，
Z-CH2CH2-(OCH2CH2)n-1-B
··(41)
在式(41)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，
B表示离去基团，并且
n表示6至30的整数，
Figure FDA0003026374660000051
在式(42)中，
A表示羟基的保护基团，
Figure FDA0003026374660000052
在式(43)中，
A表示羟基的保护基团，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数；
步骤(2')，如所述式(43)所示的化合物的保护基团A的去保护，以获得如下式(44)所示的化合物，
Figure FDA0003026374660000053
在式(44)中，
Z表示-Z1或-O-(CH2)m5-Z1，Z1表示氨基的被保护的形式、叠氮基和氰基的任意一种，并且m5表示1至5的整数，并且
n表示6至30的整数；
步骤(3')，对如所述式(44)所示的化合物进行去保护处理或还原处理，以获得如式(40)所示的用于制造分支型异单分散聚乙二醇的中间体；以及
步骤(4')，对如所述式(40)所示的化合物进行分离纯化。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述碱性催化剂是氢氧化钾、氢氧化钠、叔丁醇钾和叔丁醇钠的任意一种。
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