CN109843911A - 用于治疗骨相关疾病的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了包含α_vβ₃整联蛋白结合基序的突变体M‑CSF蛋白质和包含其的药物组合物。进一步，提供了治疗或预防与骨吸收增加相关的疾病的组合物的用途。

Description

用于治疗骨相关疾病的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月18日提交的IL专利申请号247369的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明尤其涉及修饰的多肽及其用途，如在骨相关疾病的治疗中的用途。

背景技术

骨质疏松症是50岁以上女性和男性中常见的慢性骨骼疾病，是全世界每年超过890万例骨折的根本原因，由此带来显著的社会和经济成本。最初用于治疗(处理，management)女性骨质疏松症的药物是基于***，但长期给予这些药物与乳腺癌、心血管疾病和痴呆症的风险增加有关。迄今为止，最常开处方的用于骨质疏松症的药物是双膦酸盐，但这些药物也有非特异性的不良副作用，如胃肠道毒性、肾毒性、高钙血症、颌骨坏死等。因此，迫切需要用于治疗骨质疏松症的新的有效且高度特异性的药物。

破骨细胞的过度骨吸收是骨质疏松症发病机制的核心。在刺激两种必需因子——单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和激活NF-κB配体(RANKL)的受体——之后，破骨细胞从单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞中分化。近年来，已经证明靶向M-CSF和RANKL的抗体对于破骨细胞分化的抑制是有效的，并且因此对于骨质疏松症的治疗是有效的，但是这些配体在破骨细胞以外的细胞上的表达已经引起了对其安全性的担忧。

M-CSF及其受体c-FMS在破骨细胞功能中的重要性先前已在一项研究中得到阐明，该研究显示M-CSF-和c-FMS-缺陷小鼠两者均患有延迟的骨骼生长和骨硬化病。同样，α_vβ₃整联蛋白对破骨细胞功能至关重要；α_vβ₃整联蛋白与骨基质的相互作用诱导细胞骨架组织，其将破骨细胞的再吸收机制极化至骨-细胞界面，其中它产生由围绕皱褶缘的肌动蛋白质环组成的隔离的(isolated)再吸收隔室(compartment)。这通过观察到整联蛋白β3敲除小鼠由于破骨细胞的功能缺陷而增加骨量来反映。

有趣的是，除了c-FMS和α_vβ₃整联蛋白在破骨细胞活性中的独特作用外，还已经显示这两种因子在骨吸收中起协同作用。M-CSF信号传导通过其受体c-FMS通过串扰(crosstalk)调节骨吸收，其中信号传导由α_vβ₃整联蛋白激活。c-FMS通过在破骨细胞细胞骨架重排中与α_vβ₃整联蛋白协作而在调节骨吸收中发挥重要作用，因为两种因子刺激相同的c-Src启动的信号传导复合物。最后，c-FMS改变α_vβ₃从低亲和力状态到高亲和力状态的构象，并且它以整联蛋白-3β-依赖性方式激活Rac。重要的是，显示c-FMS和α_vβ₃整联蛋白共同定位于破骨细胞细胞骨架，表明这些受体之间的串扰发生在相同的细胞位点。因此，c-FMS和α_vβ₃整联蛋白在破骨细胞分化和功能中的功能和空间偶联连同这两种受体的排他性表现(专有呈现，exclusive presentation)表明，同时与这两种靶受体结合的拮抗剂可以充当高度特异和有效的抗再吸收药物。

关于单独靶向c-FMS和α_vβ₃整联蛋白用于骨质疏松症治疗的一些工作已经开始，但尚未发展到临床应用。例如，一些利用两种抗c-FMS抗体(命名为AFS98和M279)和最近开发的c-FMS人源化抗c-FMS单克隆抗体(mAb)的研究解决了M-CSF信号传导在癌症病理学中的功能作用，但其在体内抑制破骨细胞活性的功效尚未探索过。另外的——也许是更重要的——问题是，鉴于毒性、耐药性或脱靶效应等因素，靶向c-FMS的低分子量激酶域抑制剂的开发尤其具有挑战性。

最近的研究集中在α_vβ₃整联蛋白的抗体、Arg-Gly-Asp(“RGD”)三肽基序的肽模拟物(peptidomimetics)和小分子α_vβ₃整联蛋白拮抗剂，它们已在骨吸收的体外和体内模型中显示是有效的，指示α_vβ₃整联蛋白的抑制剂将是合适的治疗骨质疏松症的剂。

发明内容

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方式，但下文描述了示例性方法和/或材料。在有冲突的情况下，将以包括定义的专利说明书为准。另外，材料，方法和实例仅是说明性的，并不一定旨在限制。

根据一个方面，提供了包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的氨基酸序列的多肽，所述多肽包含选自以下的至少一个突变：在SEQ ID NO：1第27位处的甲硫氨酸残基的突变、或用RGD基序替代SEQ ID NO：1的氨基酸25-32或氨基酸64-71，所述RGD基序包含SEQID NO：6所示的氨基酸序列。

根据另一个实施方式，所述在SEQ ID NO：1的第27位处的甲硫氨酸残基的突变是替代为选自精氨酸(Arg)、组氨酸(His)或赖氨酸(Lys)的氨基酸。根据另一个实施方式，所述多肽包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。

根据另一个实施方式，所述在SEQ ID NO：1第27位处的甲硫氨酸残基的突变是替代为精氨酸(Arg)。根据另一个实施方式，所述多肽包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

根据另一个实施方式，所述RGD基序包含至少9个氨基酸残基。根据另一个实施方式，所述RGD基序包含SEQ ID NO：7(XXXRGDXXX)中所示的氨基酸序列，其中X独立地是任何氨基酸。根据另一个实施方式，所述RGD基序选自：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)、SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)和SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)。

根据另一个实施方式，所述多肽包含用所述RGD基序替代SEQ ID NO：1的氨基酸25-32。根据另一个实施方式，所述RGD基序选自：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)和SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)。

根据另一个实施方式，所述多肽包含用所述RGD基序替代SEQ ID NO：1的氨基酸64-71。根据另一个实施方式，所述RGD基序包含SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)中所示的氨基酸序列。

根据另一个实施方式，所述多肽不能形成同型二聚体。根据另一个实施方式，所述多肽结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。

根据另一个实施方式，所述多肽包含与式I(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQL KDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKS CFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)中所示氨基酸序列具有至少97％同源性的氨基酸序列，其中b是选自0和1的整数，并且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，并且X₅是P或C，其中多肽不能形成同型二聚体，并且其中所述突变体结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。

根据另一个实施方式，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。

根据另一方面，提供了包含式I中所示氨基酸序列的多肽：(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKS CFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)，其中b是选自0和1的整数，并且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，并且X₅是P或C。

根据另一方面，提供了包含选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。

根据另一方面，提供了编码本发明多肽的分离的核酸分子。根据另一方面，提供了包含本发明核酸的表达载体。根据另一方面，提供了用本发明的表达载体转化或转染的细胞。

根据另一方面，提供了药物组合物，其包含本发明的多肽和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述组合物用于抑制或降低破骨细胞活性。

根据另一方面，提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明多肽和药学上可接受的载体，用于治疗或预防对其有需要的受试者中与不受调控的破骨细胞活性相关的疾病。

根据另一方面，提供了药物组合物在制备用于治疗或预防对其有需要的受试者中与不受调控的破骨细胞活性相关的疾病的药物中的用途，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的多肽和药学上可接受的载体。

根据另一方面，提供了治疗对其有需要的受试者中与骨吸收增加相关的疾病的方法，方法包括给所述受试者施用包含本发明的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物的步骤，由此治疗对其有需要的受试者中与骨吸收增加相关的疾病。

在一些实施方式中，所述疾病与骨吸收增加有关。在一些实施方式中，与骨吸收增加相关的所述疾病是骨质疏松症。

根据下文给出的详细描述，本发明的进一步实施方式和全部适用性范围将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然表明了本发明的优选实施方式，但是仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将从该详细描述中变得显而易见。

附图说明

图1A-1D展示了在亲和力成熟过程后选择的M-CSF、M-CSF_RGD文库和三种M-CSF_RGD变体的氨基酸序列。图1A-1C显示了以下氨基酸序列：(1A)具有由星号标记的二聚化所需的C31的M-CSF，二聚化界面中的两个柔性环用一条线(环AB，残基25-32)和用两条线(环3，残基64-71)加下划线，(1B)M-CSF_RGD文库1，其中残基25-32被在每一侧具有三个随机氨基酸的RGD基序替代，和(1C)M-CSF_RGD文库2，其中残基64-71被在每一侧有三个随机氨基酸的RGD基序替代，且C31被丝氨酸替代，以抑制二硫键连接的同型二聚化；图1D是呈现在四(4.22和4.24)轮和五(5.6)轮亲和力成熟过程后选择的三个M-CSF_RGD克隆的突变环的序列的表；

图2是显示YSD M-CSF_M的结合滴定曲线的图表。

图3A-3D是不同M-CSF构建体及其产生的信号传导事件的示意图：(3A)M-CSF_WT是二硫键连接的同型二聚体，其结合并激活cFMS，(3B)M-CSF单体(命名为M-CSF_M)，在第31位中设计有半胱氨酸替代为丝氨酸以防止通过二硫键二聚化，所述M-CSF单体与c-FMS结合并抑制其介导的信号传导，(3C)单特异性M-CSF，其可结合整联蛋白α_vβ₃(通过RGD基序)但不结合c-FMS(命名为M-CSF_αvβ3)，因为第9位和第15位中的突变阻止M-CSF与其受体结合，和(3D)M-CSF_RGD，其通过将在M-CSF二聚化位点上的两个环之一(AB环或CD环)替代为在每个位点上具有3个随机氨基酸的RGD基序，使得M-CSF_RGD能够结合α_vβ₃整联蛋白以及c-FMS并抑制其介导的信号传导事件；

图4是酵母表面展示(YSD)构建体的示意图。

图5A-5F显示M-CSF_RGD亲和力成熟过程的FACS点图，其中测试酵母展示的突变体库与(5A)200nM c-FMS、(5B)500nMα_vβ₃整联蛋白、(5C)250nMα_vβ₃整联蛋白、(5D)100nMα_vβ₃整联蛋白、(5E)20nMα_vβ₃整联蛋白、和(5F)50nM c-FMS的结合，如每个具有黑色多边形门(blackpolygon shape gates)的图中所示的，收集高靶向结合物(binder)；

图6A-6D是显示各个YSD M-CSF_RGD克隆与α_vβ₃整联蛋白和c-FMS的归一化结合值的柱状图：测试来自分选四(6A)和分选五(6C)的每个的二十五个不同克隆与20nM的α_vβ₃整联蛋白的结合，将结果归一化为最低的结合物，接下来，测试来自分选4(6B)的最佳15种α_vβ₃整联蛋白M-CSF_RGD结合物和来自分选5(6D)的最佳10种α_vβ₃整联蛋白M-CSF_RGD结合物与50nM的c-FMS的结合，这些结果归一化为M-CSF_M，所选克隆(4.22、4.24和5.6)用箭头标记。

图7A-7D描绘了M-CSF_M和M-CSF_RGD变体的蛋白质纯化过程：(7A)是表示在21kDa尺寸下以高分子量标准洗脱的非糖基化M-CSF_RGD克隆4.22的尺寸排阻色谱法(尺寸排阻层析，size exclusion chromatography)的结果的图表，(7B)是显示非糖基化M-CSF_M、非糖基化4.22、非糖基化4.24和非糖基化5.6的CD光谱的图表。(7C)是表示非糖基化5.6的质谱分析光谱(mass spectrometry spectrum)结果的图表。(7D)是所有纯化蛋白质的SDS PAGE照片：糖基化M-CSF_M(泳道1)、非糖基化M-CSF_M(泳道2)、非糖基化4.22(泳道3)、非糖基化4.24(泳道4)和非糖基化的5.6(泳道5)；

图8显示了在与递增浓度的交联剂BS³孵育后，呈现纯化变体(M-CSF_αvβ3(4.22、4.24、5.6)、M-CSF_αvβ3、和M-CFS_M)的单体和二聚体的凝胶的照片；

图9A-9J显示了不同M-CSF纯化蛋白质的SPR传感图：与浓度为12.5nM、25nM、50nM、100nM和200nM的c-FMS(9A-9E)和α_vβ₃整联蛋白(9F-9J)结合的M-CSF_M(9A和9E)，M-CSF_avβ3(9B和9G)、4.22(9C和9H)、4.24(9D和91)和5.6(9E和9J)；

图10A-10E显示了展示M-CSF_RGD变体对RGD结合整联蛋白的结合特异性的图表。将αvβ3(10A)、αvβ5(10B)、α3β1(10C)、α4β7(10D)和α5β1(10E)整联蛋白固定在芯片表面，使三个M-CSF_RGD变体4.22、4.24和5.6以1μM的浓度流过芯片表面。

图11A-11F显示了用流式细胞术展示直接细胞结合测定结果的图表。测试纯化的M-CSF_RGD变体和M-CSF_M蛋白质与鼠原代细胞(图11A、11B和11C)和MDA-231乳腺癌细胞系(图11C、11D和1IF)的结合。黑色直方图表示阴性对照，灰色直方图表示蛋白质结合或受体表达。细胞表达c-FMS(图11A、11C)和α_vβ₃整联蛋白(图11B、11D)。小鼠原代细胞(图11E)和MDA-231细胞(图11F)显示以剂量依赖性方式与1μM、2.5μM和7.5μM M-CSF_M、4.22和5.6各自结合；和

图12A-12D显示了展示不同M-CSF_RGD变体和M-CSF_M对破骨细胞分化的影响的照片(图12)和柱状图(图12B-D)。将原代小鼠骨髓单核细胞在含有重组小鼠M-CSF(20ng/ml)、RANKL(20ng/ml)和不同浓度的抑制剂的α-MEM生长培养基中培养96小时。阳性对照含有α-MEM生长培养基、重组M-CSF和RANKL但不含抑制剂。阴性对照含有α-MEM生长培养基与重组M-CSF并且PBS对照具有含有重组M-CSF和RANKL的10％PBS。(图12A)固定细胞并染色抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)。(图12B-D)检查细胞：(图12B)成熟破骨细胞的数量，(图12C)骨髓单核细胞。将结果归一化为阳性对照。

图13显示了M-CSFM(仅含有C31S突变)和M-CSFM、M27R(含有C31S和M27R两者)对原代鼠细胞向破骨细胞分化的影响。

图14A-14D显示了与M-CSF野生型结构相比的M-CSF_C31S突变体的结构。图14A描绘了二聚体M-CSF_C31S突变体的解析的(solved)X射线结构，以带状图显示，其中S31可视化为棒。图14B描绘了野生型M-CSF结构(PDB ID 3UF2)中C31-C31二硫键的特写(close up)，可视化为球体并以原子着色(colored by atom)。该结构相对于14A中所示的M-CSF_C31S突变体围绕X旋转90°。图14C是M-CSF野生型结构上的M-CSF_C31S突变体结构的叠加(overlay)，其中后者的两个C31残基显示为球体。图14D是M-CSF_C31S突变体二聚体中S31残基的特写，如14B中可见的。

图15A-15C显示M-CSF_C31S残基对跨M-CSF_C31S二聚体界面的相互作用的显著贡献。图15A.M-CSF_C31S残基被计算为显著贡献于跨二聚体界面的相互作用(参见表1)，显示为棒并且通过其能量贡献的类型着色如下：品红色(来自侧链的极性/静电贡献+非极性贡献)、青色(来自主链的极性/静电贡献+非极性贡献)、绿色(仅非极性贡献)。相对的单体显示为着色小麦的表面表示。图15B类似于15A，围绕X旋转180°。图15C示例了Q26和M27的定向，它们有显著的贡献并被认为对二聚体形成是特别有影响的，因此被选择用于进一步诱变，显示为棒(来自两个单体的Q26和M27残基中的一个)和球体(来自相对的单体的M27残基)。

图16A-16D显示了评估M-CSF变体的寡聚状态的生物物理测定。图16A是SDS-PAGE凝胶，描绘了与BS³试剂交联的不同M-CSF变体，单体(20kDa)和二聚体(40kDa)的量可见于SDS-PAGE凝胶上：人M-CSF(左上)、小鼠M-CSF(左下)、M-CSF_C31S(右上)和M-CSF_C31S,M27R(右下)。图16B显示通过DLS测量的M-CSF_WT(实线)、M-CSF_C31S(短划线)和M-CSF_C31S,M27R(点线)的水合半径的分布。呈现了每个变体的计算的水合半径。图16C显示了通过M-CSF_WT及其两种变体(M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R)的内部脚本(in-house script)确定的回转半径。短划线表示使用CRYSOL从晶体结构[PDB ID：3UF2]计算的M-CSF单体和M-CSF二聚体的理论R_g值。图16D是M-CSF_WT及其两种变体(M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R)的小角度X射线散射(SAXS)结构。使用计算机程序GASBOR从SAXS数据重建从头计算模型(Ab initiomodels)，并通过计算机程序DAMAVER对其进行平均。使用PyMOL(http://www.pymol.org)将M-CSF二聚体(蓝色和红色)的晶体结构和单体结构(从M-CSF的晶体结构中提取，红色)与获得的SAXS模型(黄色，M-CSF_WT；绿色，M-CSF_C31S；青色，M-CSF_C31S,M27R)对齐。

图17A-17B描绘了通过SPR检测的M-CSF_WT和M-CSF_C31S,M27R对c-FMS受体的亲和力。M-CSF_WT与c-FMS结合的浓度高达70nM(17A)和M-CSF_C31S,M27R与c-FMS结合的浓度高达20nM的传感图(Sensogram)。N＝3(17B)。值是平均值±SD。

图18A-18B显示响应于M-CSF变体的c-FMS磷酸化的评估。(18A)与0.5nM鼠M-CSF(阳性对照，+)、无M-CSF(阴性对照，-)或0.5nM鼠M-CSF+1μM的M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R孵育后BMM上鼠c-FMS的磷酸化。(18B)与0.5nM人M-CSF(阳性对照，+)、无M-CSF(阴性对照，-)或0.5nM鼠M-CSF+100nM的M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R孵育后，CD14⁺细胞上人c-FMS的磷酸化。在每个实验中将所有信号归一化为β-肌动蛋白、c-FMS表达和阳性对照的信号。使用t检验计算统计学分析，将每个样品与阳性对照进行比较。N＝3。值是平均值±SEM。*，p<0.05；**，p<0.01；***，P<0.005。

图19A-19B。M-CSF_C31S,M27R抑制单核细胞分化为破骨细胞。(19A)在鼠M-CSF+RANKL(阳性对照)，没有RANKL的M-CSF(阴性对照)和M-CSF+RANKL+M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R存在下，在50nM、1μM的浓度下评估骨髓来源的单核细胞(BMM)的分化。使用TRAP染色法对细胞染色并对其拍照(上图)。定量破骨细胞的数量(左下)和破骨细胞中的细胞核的数量(右下)。(19B)在人M-CSF+鼠RANKL(阳性对照)，不含RANKL的M-CSF(阴性对照)和M-CSF+RANKL+M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R存在下，在50nM、250nM和1μM的浓度下评估CD14⁺的分化。使用TRAP染色法对细胞染色，并拍照细胞(上图)。定量破骨细胞的数量(左下)和破骨细胞中的细胞核的数量(右下)。使用t检验进行统计学分析，将每个样品与阳性对照进行比较。N＝3。值是平均值±SEM。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.005。

图20A-20C。M-CSF变体以不同的效力激活c-FMS。(20A)在0.5nM鼠M-CSF(阳性对照)、无M-CSF(阴性对照)、M-CSF_WT(0.5、5和10nM)，M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R(0.5、5、10、50、1000和5000nM)的存在下，在不存在鼠M-CSF的情况下，定量磷酸化的鼠c-FMS。在每个实验中将所有信号归一化为β-肌动蛋白质、c-FMS表达和阳性对照的信号。使用t检验计算统计学分析，将每个样品与阳性对照进行比较。N＝3。值是平均值±SEM。(20B)显示在不同浓度的M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R下c-FMS激活的图示。(20C)M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R在不同寡聚化状态下作为其浓度的函数的假设抑制机制的图示。

图21是显示经M-CSF5.6处理的卵巢切除小鼠的CTX-1血清浓度的点图。每个黑色实心点表示一只动物的CTX-1血清浓度。

图22A-22B是显示M-CSF5.6处理的卵巢切除小鼠的平均CTX-1血清浓度的柱状图，(22A)和(22B)分别显示有或没有溶血样品的平均CTX-1血清浓度。误差条表示样本均值的标准误差。

图23是显示与M-CSFRGD变体一起孵育的成熟破骨细胞中肌动蛋白质环形成的实例图片。允许小鼠BMM在M-CSF和RANKL存在下72小时分化成破骨细胞。然后，将细胞在没有(阳性对照)或用抑制剂(5μM)的情况下再孵育24小时，然后固定并染色F-肌动蛋白和细胞核。细胞能够形成固体肌动蛋白环(白色箭头)，分散的(scattered)肌动蛋白环(白色箭)或无定形肌动蛋白分布(带刺箭头)。图片是每个样品从五个不同孔中获得的35个图像的代表。

具体实施方式

本发明提供了修饰的M-CSF蛋白质和包含其的组合物或试剂盒。本发明还提供使用所述修饰的M-CSF的治疗方法。在一些实施方式中，本发明的一些实施方式的修饰的M-CSF不能经历M-CSF同型二聚化并且对α_vβ₃和c-FMS具有增强的结合亲和力。在一些实施方式中，修饰的M-CSF包含RGD基序。在一些实施方式中，修饰的M-CSF包含SEQ ID NO：1的在第31位处的半胱氨酸(Cys)突变和在第27位处的甲硫氨酸(Met)突变。

有利地，本发明的一些实施方式的修饰的M-CSF蛋白质充当c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的拮抗剂。如本领域所知，c-FMS和α_vβ₃一般在破骨细胞的膜上表达，并且它们的激活是破骨细胞分化所必需的。因此，在一些实施方式中，本发明的修饰的M-CSF蛋白质能够抑制或减少破骨细胞分化。在额外的实施方式中，本发明的修饰的M-CSF蛋白质能够减少骨吸收。在一些实施方式中，本发明的修饰的M-CSF实际上可用于治疗和/或预防骨质疏松症。

本发明部分地基于以下令人惊讶的发现：本文公开的修饰的M-CSF结合α_vβ₃整联蛋白和c-FMS并抑制其活性。本发明进一步部分地基于令人惊讶的发现，即，本文公开的修饰的M-CSF抑制破骨细胞分化。

如以下实例部分中举例说明的，使用修饰的M-CSF实现抑制，所述修饰的M-CSF包括半胱氨酸31的替代和***其环AB或环CD中的RGD基序。如下文实例部分中进一步举例说明的，包含SEQ ID NO：1的第9和15位突变的修饰的M-CSF不能结合c-FMS。

修饰的M-CSF

根据一个方面，本发明提供了包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的氨基酸序列的多肽，所述多肽包括含有如SEQ ID NO：6(RGD)所示氨基酸序列的RGD基序。

在一些实施方式中，多肽包含与SEQ ID NO：1(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSXQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTEPVRGDNINPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)具有至少90％、91％、92％、93％、或94％同源性的氨基酸序列，其中X是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。

本领域技术人员将理解，单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)具有Uniprot登录号P09603且包含AB环(氨基酸25-32)、BC环(氨基酸64-71)和CD环(氨基酸90-103)。

在一些实施方式中，与SEQ ID NO：1的相应AB环或CD环相比，选自AB环和CD环的至少一个环包含3-10个连续氨基酸残基的修饰。在一些实施方式中，修饰选自：氨基酸残基的缺失、替代和添加。

在一些实施方式中，选自AB环和CD环的至少一个环包含RGD基序。在一些实施方式中，AB环包含RGD基序。在一些实施方式中，CD环包含RGD基序。

在一些实施方式中，多肽包含选自以下的一个或多个氨基酸序列：SEQ ID NO：3(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID)、SEQ ID NO：4(ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED)和SEQID NO：5(PNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)。

在一些实施方式中，突变多肽不能形成同型二聚体。在一些实施方式中，多肽结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。

在一些实施方式中，多肽包含式I中所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKS CFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)，其中b是选自0和1的整数，且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，X₅是P或C。

在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDQTPRGDSPSITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)。

在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDTYPRGDMCSITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVK NVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)。

在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSSQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDEPVRGDNINPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)。

在一些实施方式中，多肽包含式II中所示的氨基酸序列：

EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGHERQSEGS，其中b是选自0和1的整数，并且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，且X₅是P或C。

如本文所用，“b”和“1-b”表示包含在前述相邻括号内的序列的重复数。重复数可以在0和1之间变化。对于非限制性实例，当b等于0时，括号内的前述序列不是序列的部分。“1-b”表示导致等于1或0的整数的数学等式。

在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDX₁X₂X₃RGDX₄X₅SITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGHERQSEGS)，其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，且X₅是P或C。

在一些实施方式中，多肽包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSSQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDEPVRGDNINPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQDVVTKPDCNCLYPKAIPSSDPASVSPHQPLAPSMAPVAGLTWEDSEGTEGSSLLPGEQPLHTVDPGSAKQRPPRSTCQSFEPPETPVVKDSTIGGSPQPRPSVGAFNPGMEDILDSAMGTNWVPEEASGEASEIPVPQGTELSPSRPGGGSMQTEPARPSNFLSASSPLPASAKGQQPADVTGTALPRVGPVRPTGQDWNHTPQKTDHPSALLRDPPEPGSPRISSLRPQGLSNPSTLSAQPQLSRSHSSGSVLPLGELEGRRSTRDRRSPAEPEGGPASEGAARPLPRFNSVPLTDTGHERQSEGS)。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”包括天然肽、肽模拟物(一般包括非肽键或其他合成修饰)和肽类似物拟肽和半拟肽或其任何组合。在另一个实施方式中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。

在一个实施方式中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列、或由其衍生的序列，或者由SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17中所示的氨基酸序列、或由其衍生的序列组成。

如本文所用，术语“衍生自”或“对应于”是指使用本领域技术人员已知的任何一种合适手段，基于序列知识构建氨基酸序列，例如根据本领域的标准方案进行化学合成。

本领域技术人员将认识到，改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或少量氨基酸的肽或蛋白质序列的单个替代，缺失或添加是保守修饰的变体，其中改变导致具有相似电荷、尺寸和/或疏水性特性的氨基酸的替代，如，例如谷氨酸(E)替代为天冬氨酸(D)。

在一些实施方式中，本发明的多肽包含具有一个或多个保守替代衍生自SEQ IDNO：11、12、13、14、15、16或17的序列。在一些实施方式中，本发明的突变多肽包含具有至多1、2、3、4、5、6或7个保守取代衍生自SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17的序列。每种可能性代表本发明的单独实施方式。根据本发明的另一个实施方式，本发明的多肽包含与SEQID NO：11、12、13、14、15、16或17同源的序列。根据本发明的另一个实施方式，本发明的多肽包含与SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17具有大于70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，本发明的多肽包含与SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，其中突变体M-CSF不能形成同型二聚体，其中突变体M-CSF结合c-FMS，并且其中突变体M-CSF结合α_vβ₃整联蛋白。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

在一些实施方式中，本发明的多肽包含与选自以下的序列具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列：SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16和17，其中本发明的多肽不能形成同型二聚体，其中本发明的多肽结合c-FMS，并且其中本发明的多肽结合α_vβ₃整联蛋白。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，术语“类似物”包括具有与本文具体显示的序列之一基本上相同的氨基酸序列的任何肽，其中一个或多个残基已被功能上类似的残基保守替代并且展示本文所述的能力。保守替代的实例包括用一种非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替代另一种非极性残基，用一种极性(亲水)残基替代另一种极性残基，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间，用一种碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替代另一种碱性残基，或用一种酸性残基，如天冬氨酸或谷氨酸替代另一种酸性残基。每种可能性代表本发明的单独实施方式。

如本文所用，短语“保守替代”还包括使用化学衍生的残基代替非衍生的残基，条件是该肽显示如本文所述的必备的功能。

在一个实施方式中，多肽是SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16或17的变体。

在另一个实施方式中，术语“变体”是指多肽或核苷酸序列，其分别与另一种多肽或多核苷酸相比包含一个或多个氨基酸或核苷酸的修饰。在一些实施方式中，与另一种多肽或多核苷酸相比，所述修饰分别是一个或多个氨基酸或核苷酸的替代、缺失和/或***。在一些实施方式中，改变可以是次要性质，如保守氨基酸替代或对于核苷酸序列导致不显著影响多肽活性的保守氨基酸替代。在一些实施方式中，改变可以是氨基酸分子的替代，导致糖基化位点的添加，从而增加多肽的糖基化。

一般，本发明包括多肽的衍生物。术语“衍生物”或“化学衍生物”包括具有一个或多个通过侧链或官能团反应而化学衍生的残基的多肽的任何化学衍生物。这种衍生分子包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化以形成N-im-苄基组氨酸。作为化学衍生物还包括那些肽，其含有二十种标准氨基酸残基的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可以替代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以替代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替代组氨酸；高丝氨酸可以替代丝氨酸；和鸟氨酸可以替代赖氨酸。

另外，肽衍生物可以通过化学修饰而不同于本发明的肽的天然序列，所述化学修饰包括但不限于末端-NH2酰化、乙酰化或巯基乙酸酰胺化、以及通过例如，用氨、甲胺等末端-羧酰胺化。肽可以是线性的、环状的或支链的等，这些构象可以使用本领域公知的方法实现。

根据本发明原理的肽衍生物和类似物还可以包括侧链键修饰，包括但不限于CH2-NH-、CH2-S-、-CH2-S＝O、OC-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、S＝C-NH-和-CH＝CH-，和骨架修饰如修饰的肽键。肽内的肽键(-CO-NH-)可以被以下键取代，例如，N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)；酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)H-N)；酮亚甲基键(-CO-CH2-)；α-氮杂键(a-aza bonds)(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基；卡巴键(carba bonds)(-CH2-NH-)；羟基乙烯键(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺键(-CS-NH)；烯烃(olefmic)双键(-CH＝CH-)；和肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是“正常(normal)”侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可以在沿肽链的一个或多个键处发生，甚至在几个(例如2-3个)键处同时发生。

本发明还包括肽衍生物和类似物，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰氨基、苄氧羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基、氯乙酰氨基或甲酰氨基。游离羧基可以衍生化以形成例如盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。组氨酸的咪唑氮可以衍生化以形成N-im-苄基组氨酸。

如本文所用，术语“盐”是指羧基的盐和肽分子的氨基或胍基的酸加成盐。羧基的盐可以通过本领域已知的手段形成，并且包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、三价铁盐或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如与胺(三乙醇胺、哌啶、普鲁卡因等)形成的盐。酸加成盐包括例如与无机酸(如例如乙酸或草酸)的盐。盐在此描述了添加到肽溶液中的离子组分，以增强钙矿物的水凝胶形成和/或矿化。

肽类似物还可含有非天然氨基酸。非天然氨基酸的实例包括但不限于肌氨酸(Sar)、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨酸、异丙基Lys、3-(2'-萘基)-Ala、烟酰基(nicotinyl)Lys、氨基异丁酸和3-(3'-吡啶基-Ala)。

此外，肽类似物可含有其他衍生的氨基酸残基，包括但不限于甲基化氨基酸、N-苄基化氨基酸、O-苄基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、O-乙酰化氨基酸、苄氧羰基取代的氨基酸等。具体实例包括但不限于甲基-Ala(Me Ala)、MeTyr、MeArg、MeGlu、MeVal、MeHis、N-乙酰基-Lys、O-乙酰基-Lys、苄氧羰基-Lys、Tyr-O-苄基、Glu-O-苄基、苄基-His、Arg-苯甲磺酰基、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸等。

本发明还包括肽类似物，其可含有一种或多种氨基酸的D-异构体形式。其中至少一个氨基酸和可能所有氨基酸是D-氨基酸的逆反(逆转，retro-inverso)D-氨基酸肽的产生是本领域公知的。当肽中的所有氨基酸都是D-氨基酸，并且分子的N-和C-末端被反转时，结果是具有相同结构基团的分子处于与L-氨基酸形式的分子中的相同位置。然而，该分子对蛋白质水解降解更稳定，因此可用于本文所述的许多应用中。非对映体肽相比具有相同氨基酸序列的全部L-或全部D-氨基酸肽可能高度有利，因为它们具有更高的水溶性，更低的免疫原性和更低的蛋白质水解降解敏感性。如本文所用的术语“非对映体肽”是指包含L-氨基酸残基和D-氨基酸残基两者的肽。本发明的非对映体肽中D-氨基酸残基的数量和位置可以是可变的，只要该肽能够展示本发明的修饰的M-SCF所公开的功能。

聚乙二醇化

在一些实施方式中，本发明的多肽与聚乙二醇(PEG)缀合。已知PEG与多肽的缀合延长多肽的体内半衰期。PEG是环氧乙烷的无毒聚合物，广泛用于蛋白质药物和其他领域。

RGD基序

在一些实施方式中，RGD基序包含SEQ ID NO：6(RGD)中所示的氨基酸序列Arg-Gly-Asp。在一些实施方式中，RGD基序还包含位于RGD序列的任一侧或两侧侧翼的一个或多个随机化氨基酸残基。在一些实施方式中，整联蛋白结合基序包含SEQ ID NO：7(XXXRGDXXX)中所示的氨基酸序列，其中每个X各自代表任何氨基酸残基(例如，随机化的氨基酸残基)。在一些实施方式中，RGD基序表现出对α_vβ₃的结合特异性。在一些实施方式中，RGD基序对α_vβ₃比对其他整联蛋白(例如，α₄β₇、α₂β_2b、α₅β₁和α_vβ₅)具有显著更高的结合亲和力。

在一些实施方式中，包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的RGD基序具有小于30、20、18、15、12、9、8、7、6、5或4个氨基酸的长度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另一个实施方式中，包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的RGD基序具有衍生自SEQ ID NO：2的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的长度。在另一个实施方式中，包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的RGD基序具有3至6、3至7、3至8、3至9、3至10、3至11、3至12、3至14、3至15、3至16、3至17、3至18、3至19或3至20的长度。每种可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，RGD基序包含至少9个氨基酸残基。在一些实施方式中，RGD基序包含9个氨基酸残基或由9个氨基酸残基组成。在一些实施方式中，RGD基序具有3至20个氨基酸，包含SEQ ID NO：6(RGD)中所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，RGD基序包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)、SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)和SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)。在一些实施方式中，RGD基序选自：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)、SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)。

在一些实施方式中，RGD基序包含SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，RGD基序包含SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)中所示的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，RGD基序包含SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)中所示的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，多肽的AB环包含选自以下的RGD基序：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)、SEQ ID NO：9(TYPRGDMCS)。在一些实施方式中，多肽的CD环包含RGD基序，其包含SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)中所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)中所示的氨基酸序列组成。

合成多肽

根据一个实施方式，本发明的多肽可以通过本领域已知的用于肽合成的任何方法和/或技术合成或制备。根据另一个实施方式，多肽可以通过Merrifield的固相肽合成方法合成(参见J.Am.Chem.Soc,85:2149,1964)。根据另一个实施方式，本发明的多肽可以使用本领域公知的标准溶液方法合成(参见，例，如Bodanszky,M.,Principles of PeptideSynthesis,Springer-Verlag,1984)。

通常，合成方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸顺序添加到与合适树脂结合的生长肽链中。通常地，第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基团保护。然后可以将保护的或衍生的氨基酸附接到惰性固体支持物(树脂)上或通过在形成酰胺键的导电的条件下添加具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中的下一个氨基酸而在溶液中使用。然后从该新添加的氨基酸残基中除去保护基团，并添加下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在所有期望的氨基酸已被以适当的顺序连接后，依次或同时除去任何剩余的保护基团，如果通过固相方法合成，则肽链从固体支持物上切下，得到(afford)最终的肽。

在固相肽合成方法中，氨基酸的α-氨基被酸或碱敏感基团保护。这种保护基团应具有对肽键形成条件稳定的特性，同时易于除去而不破坏生长的肽链。合适的保护基团是叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(Cbz)、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片基氧基羰基、(α,α)-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)等。在固相肽合成方法中，将C-末端氨基酸附接到合适的固体支持物上。适用于上述合成的合适的固体支持物是那些对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性的物质，以及不溶于所用溶剂介质的物质。合适的固体支持物是氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、羟甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等。偶联反应在溶剂，例如乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中完成。连续保护的氨基酸的偶联可以在本领域中公知的自动多肽合成仪中进行。

在另一个实施方式中，可以合成本发明的多肽，使得连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键。在另一个实施方式中，非肽键包括但不限于亚氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮键，其可以通过本领域技术人员公知的反应形成。

本发明还包括含有编码任何本发明多肽的核酸的多核苷酸序列。在另一个实施方式中，编码多肽的核酸序列与编码本发明多肽的核酸序列或其片段的核酸序列至少70％、或者可选地至少80％、或者可选地至少90％、或者可选地至少95％、或者可选地至少99％同源。

在一些实施方式中，本发明提供了编码本发明多肽的多核苷酸。

在一些实施方式中，将本发明的多核苷酸连接到表达载体中，所述表达载体包含顺式调节序列(例如，启动子序列)的转录控制。在一些实施方式中，顺式调节序列适合于指导本发明多肽的组成型表达。在一些实施方式中，顺式调节序列适合于指导本发明多肽的组织特异性表达。在一些实施方式中，顺式调节序列适合于指导本发明多肽的诱导型表达。

术语“多核苷酸”是指核酸(例如DNA或RNA)序列，其包含产生多肽所必需的编码序列。在一个实施方式中，多核苷酸是指单链或双链核酸序列，其以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(例如，以上的组合)的形式分离和提供。

在一个实施方式中，“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶从信使RNA逆转录产生的序列。在一个实施方式中，随后可以使用DNA聚合酶在体内或体外扩增序列。

在一个实施方式中，“基因组多核苷酸序列”是指从染色体衍生(分离)的序列，因此它代表染色体的连续部分。

在一个实施方式中，“复合多核苷酸序列”是指至少部分互补且至少部分基因组的序列。在一个实施方式中，复合序列可包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及介于其间的一些内含子序列。在一个实施方式中，内含子序列可以是任何来源，包括其他基因，并且一般将包括保守的剪接信号序列。在一个实施方式中，内含子序列包括顺式作用表达调控元件。

在一些实施方式中，使用如实施例1中所述的PCR技术或本领域技术人员已知的任何其他方法或程序制备本发明的多核苷酸。在一些实施方式中，该程序涉及两种不同DNA序列的连接(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”,eds.Ausubel etal.,John Wiley&Sons,1992)。

在一个实施方式中，将本发明的多核苷酸***表达载体(即，核酸构建体)中以使重组多肽能够表达。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适于在原核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适于在真核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括穿梭载体，其使得该载体适于在原核生物和真核生物中复制和整合。在一些实施方式中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如，启动子，增强子)和转录和翻译终止子(例如，多腺苷酸化信号)。

在一个实施方式中，多种原核或真核细胞可用作宿主表达***以表达本发明的多肽。在一些实施方式中，这些包括但不限于微生物，如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞***。

在一些实施方式中，使用非细菌表达***(例如哺乳动物表达***)来表达本发明的多肽。在一个实施方式中，表达载体用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸。

在一些实施方式中，在本发明的细菌***中，根据意图用于表达的多肽的用途，可以有利地选择许多表达载体。在一个实施方式中，需要大量多肽。在一个实施方式中，期望指导高水平蛋白质产物表达的载体——可能作为与疏水信号序列的融合，该融合将表达的产物导入细菌的周质或蛋白质产物易于纯化的培养基中。在一个实施方式中，某些融合蛋白质用特异性切割位点改造以帮助回收多肽。在一个实施方式中，适合于这种操作的载体包括但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier et al.,Methods in Enzymol.185:60-89(1990)]。

在一个实施方式中，使用酵母表达***。在一个实施方式中，数个含有组成型或诱导型启动子的载体可用于酵母中，如美国专利号5,932,447公开的。在另一个实施方式中，使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。

在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括额外的多核苷酸序列，其允许例如来自单个mRNA(如内部核糖体进入位点(IRES))的几种蛋白质的翻译。

在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于可从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得地pTRES，及其衍生物。

在一些实施方式中，本发明使用含有来自真核病毒(如逆转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛***瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，以及衍生自爱泼斯坦-巴尔(Epstein Bar)病毒的载体包括pHEBO和p205。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白质启动子、小鼠乳癌病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白质启动子或在真核细胞中显示有效表达的其他启动子的指导下表达蛋白质的任何其他载体。

在一些实施方式中，提供诸如侧向(lateral)感染和靶向特异性优点的重组病毒载体用于体内表达本发明的多肽。在一个实施方式中，侧向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是单个感染细胞通过其产生许多后代病毒粒子的过程，病毒粒子发芽(bud off)并感染相邻细胞。在一个实施方式中，结果是大面积迅速被感染，其中大部分最初未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方式中，产生不能侧向扩散的病毒载体。在一个实施方式中，如果所需目的是仅将特定基因引入局部(localized)数目的靶细胞中，则该特性可能是有用的。

可以使用各种方法以将本发明的表达载体引入细胞中。这些方法总体上描述于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory,New York(1989,1992)、Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989)、Chang等,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)、Vega等,Gene Targeting,CRC Press,Ann ArborMich.(1995)、Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986]中，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，关于阳性-阴性选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992。

本领域技术人员将理解，本发明的多肽还可以使用上文所述的任何合适的施用模式(即，体内基因治疗)从施用于个体的核酸构建体表达。在一个实施方式中，根据需要通过适当的基因递送媒介物(vehicle)/方法(转染、转导、同源重组等)和表达***将核酸构建体引入合适的细胞中，然后将修饰的细胞在培养物中扩增并返回个体(即，离体基因治疗)。

在一个实施方式中，使用细胞因子的体内基因治疗已经在动物模型(如啮齿动物[Bohl et al.,Blood.2000；95:2793-2798]，灵长类动物[Gao et al.,Blood,2004,Volume103,Number9])中尝试并在对患有慢性肾功能衰竭患者的人体临床试验中证明是成功的[Lippin et al Blood 2005,106,Number 7]。

在一个实施方式中，使用植物表达载体。在一个实施方式中，多肽编码序列的表达由数个启动子驱动。在一些实施方式中，使用了病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson et al.,Nature 310:511-514(1984)]、或TMV的外壳蛋白质启动子[Takamatsu et al.,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施方式中，使用植物启动子，如例如RUBISCO的小亚基[Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli etal.,Science224:838-843(1984)]或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley et al.,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔和本领域技术人员公知的其他技术将构建体引入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant MolecularBiology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463(1988)]。本领域中公知的其他表达***如昆虫和哺乳动物宿主细胞***也可用于本发明。

应当理解，除了含有***的编码序列(编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括改造的序列以优化表达多肽的稳定性、产生、纯化、产量或活性。

在一些实施方式中，在有效条件下培养转化细胞，其允许表达大量重组多肽。在一些实施方式中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基是指其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方式中，培养基一般包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐源的水溶液，以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物(如维生素)。在一些实施方式中，本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养皿中培养。在一些实施方式中，培养在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。在一些实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识内。

在一些实施方式中，根据用于生产的载体和宿主***，本发明的所得多肽或者保留在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间中，如大肠杆菌中的周质空间；或者保持在细胞或病毒膜的外表面上。在一个实施方式中，在培养的预定时间后，重组多肽的回收受到影响。

在一个实施方式中，本文使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的完整发酵培养基，并且不需要暗示(imply)额外的分离或纯化步骤。

在一个实施方式中，本发明的多肽利用多种标准蛋白质纯化技术，如但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白质A色谱法、层析聚焦和差异溶解来纯化。

在一个实施方式中，为了促进回收，表达的编码序列可以被改造以编码本发明的多肽且融合可切割部分。在一个实施方式中，可以设计融合蛋白质，使得可以通过亲和色谱法容易地分离多肽；例如，通过固定在对可切割部分特异的柱上。在一个实施方式中，在多肽和可切割部分之间改造切割位点，并且通过用在该位点特异性切割融合蛋白质的适当的酶或剂处理，可以从层析柱释放多肽[例如，参见Booth et al.,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella et al.,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)].

在一个实施方式中，以“基本上纯的”形式收回本发明的多肽，其允许在本文所述的应用中有效使用蛋白质。

如本文所用，术语“基本上纯的”描述肽/多肽或已与其天然污染物分离的其他物质。一般，当至少约60至75％的样品表现出单肽骨架时，单体肽基本上是纯的。次要变体或化学修饰一般共有相同的肽序列。基本上纯的肽可以包含超过约85至90％的肽样品，并且可以超过95％纯、超过97％纯或超过约99％纯。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测量纯度，通过染色确定均匀性。可选地，出于某些目的，可能需要高分辨率，并且可以使用HPLC或类似的纯化手段。对于大多数目的，可以使用简单的色谱柱或聚丙烯酰胺凝胶来确定纯度。

术语“纯化的”不要求材料以呈现绝对纯度，不包括其他化合物的存在的形式存在。相反，它是一个相对的定义。在起始材料或天然材料纯化至少一个数量级，2或3、或4或5个数量级之后，肽处于“纯化”状态。

在一个实施方式中，本发明的多肽基本上不含天然相关的宿主细胞组分。术语“基本上不含天然相关的宿主细胞组分”描述了从以其天然宿主细胞状态与之伴随的天然污染物分离的肽或其他物质。因此，在化学合成或在与来自天然来源的宿主细胞不同的细胞***中合成的肽将不含其天然相关的宿主细胞组分。

在一个实施方式中，还可以使用体外表达***合成本发明的多肽。在一个实施方式中，体外合成方法是本领域公知的，并且该***的组分是可商购的。

药物组合物

根据另一方面，本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的本发明多肽(作为活性成分)和药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物促进化合物向有机体的施用。

在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以以本发明多肽的药学上可接受的盐或其类似物或其衍生物的形式配制。在另一个实施方式中，药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，如衍生自无毒无机或有机酸(如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等)的盐，以及与游离羧基形成的那些盐，如衍生自无毒无机或有机碱(如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)的盐。

如本文所用，术语“载体”是指与治疗化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶剂。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还设想了抗菌剂，如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；用于调节张力的剂，如氯化钠或右旋糖。按本文提供的药物组合物的重量计，载体总共可占约0.1％至约99.99999％。

如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适合施用于受试者，例如人。例如，术语“药学上可接受的”可意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物(更特别是人类)。

在另一个实施方式中，本发明的组合物采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、软膏、泡沫、糊剂、缓释制剂等的形式。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以配制成栓剂，具有传统的结合物和载体，如甘油三酯，微晶纤维素，黄蓍树胶或明胶。口服制剂可包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中，其内容在此通过引入并入本文。这样的组合物将含有治疗有效量的本发明多肽，优选以基本上纯化的形式，以及适量的载体，以为受试者提供适当施用的形式。

根据本发明的一个实施方式，药物组合物含有0.1％-95％的本发明多肽(一种或多种)、其衍生物或类似物。根据本发明的另一个实施方式，药物组合物含有1％-70％的多肽(一种或多种)衍生物或其类似物。根据本发明的另一个实施方式，待施用的组合物或制剂可以含有一定量的多肽(一种或多种)，其衍生物或类似物，根据本发明的实施方式，其量可有效治疗正在接受治疗的受试者的状况或疾病。

本发明的一个实施方式涉及本发明的多肽、其衍生物或类似物，其以单位剂型存在并通过药学领域公知的任何方法制备。在本发明的一个实施方式中，单位剂型是片剂、胶囊、锭剂、薄片、贴剂(patch)、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。另外，可任选地使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量将还取决于施用途径和疾病或病症的性质，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。可从源自体外或体内动物模型测试生物测定或***的剂量-反应曲线外推有效剂量。

根据一个实施方式，本发明的组合物以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含至少一种本发明的活性组分以及药学上可接受的载体或稀释剂。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以以任何常规的口服、肠胃外或透皮剂型单独或一起施用。

如本文所用，术语“给予”，“施用”和类似术语是指在合理的医疗实践中以提供治疗效果的方式向受试者递送含有活性剂的组合物的任何方法。

根据目的组织的位置，本发明的多肽可以以适合于将多肽提供给目的组织内的细胞的任何方式施用。因此，例如，可以将含有本发明多肽的组合物引入例如体循环中，其将肽分布到目的组织。或者，可将组合物局部应用于目的组织(例如，注射、或作为连续输注泵送、或作为组织内的推注、应用于皮肤的全部或部分表面等)。

在一些实施方式中，包含多肽的药物组合物通过口服、直肠、***、局部、鼻、眼、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内施用途径施用。药物组合物的施用途径将取决于待治疗的疾病或状况。合适的施用途径包括但不限于肠胃外注射，例如皮内、静脉内、肌肉内、病灶内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径施用的肽的生物利用率可以低于通过肠胃外注射施用的肽，但是通过使用适当的制剂，可以设想通过透皮、口服、直肠、***、局部、鼻、吸入和眼部治疗方式给予本发明的组合物将是可能的。另外，可能期望通过任何合适的途径引入本发明的药物组合物，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过例如附着于储库(reservoir)的心室内导管来促进。也可以使用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器。

对于局部应用，可以将本发明的肽、其衍生物、类似物或片段与药学上可接受的载体组合，以便基于所期望的活性递送有效剂量。载体可以是，例如但不限于，软膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫或凝胶棒的形式。

对于口服应用，药物组合物可以是片剂或胶囊的形式，其可以含有任何下列成分，或类似性质的化合物：结合物，如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁；或助流剂，胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质外，它还可以含有液体载体如脂肪油。另外，剂量单位形式可含有各种其他改变剂量单位物理形式的物质，例如糖，虫胶或其他肠内吸收药的包衣。本发明的片剂还可以是薄膜包衣的。

出于肠胃外施用的目的，可以使用芝麻油或花生油或丙二醇水溶液的溶液，以及相应水溶性盐的无菌水溶液。如果需要，可以适当地缓冲这种水溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射目的。

根据一些实施方式，本发明的肽，其衍生物或类似物可以在控释***中递送。在另一个实施方式中，输注泵可用于施用肽，如用于例如将胰岛素或化学疗法递送至特定器官或肿瘤的肽。在另一个实施方式中，本发明的肽与可生物降解的、生物相容的聚合物植入物组合施用，其在选定的部位在受控的时间段内释放肽。优选的聚合物材料的实例包括但不限于聚酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物和共混物(参见，Medical applications of controlled release,Langer and Wise(eds.),1974,CRCPres.,Boca Raton,Fla.,其内容通过引用以其整体在此并入)。在又另一个实施方式中，控释***可以放置在治疗靶附近，因此仅需要一小部分全身剂量。

目前描述的肽、其衍生物或其类似物也可以包含在人工产生的结构中，如脂质体、ISCOMS、缓释颗粒和其它增加血清中肽或多肽的半衰期的媒介物。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束，不溶性单层、液晶、磷脂分散体、层状层等。与本文所述肽一起使用的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质总体上包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，如胆固醇。脂质的选择总体上由诸如脂质体尺寸和在血液中的稳定性的考虑因素决定。多种方法可用于制备脂质体，如例如，由Coligan,J.E.et al,Current Protocols in Protein Science,1999,John Wiley&Sons,Inc.,New York所述，并且还参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028、和5,019,369。

该组合物还包括将活性物质掺合到聚合物化合物(如聚乳酸、聚乙二醇酸、水凝胶等)的粉粒制剂中或其上，或掺合到脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、血影或原生质球上。)这些组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

在一个实施方式中，本发明提供组合制剂。在一个实施方式中，“组合制剂”尤其定义“多部分试剂盒(kit of parts)”，其意义在于如上定义的组合配偶体可以独立给药或通过(即同时(simultaneously)、同时(concurrently)、分开或顺序)使用具有显著量(distinguished amounts)的组合配偶体的不同固定组合给药。在一些实施方式中，然后将该多部分试剂盒的部分可以例如同时或按时间顺序交错施用，即对于多部分试剂盒的任何部分在不同时间点并且以相同或不同的时间间隔。在一些实施方式中，组合配偶体的总量的比例可以在组合制剂施用。在一个实施方式中，组合制剂可以变化，例如，以便应对待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其可能是由于特定疾病、疾病的严重性、年龄、性别或体重的不同的需要可以由本领域技术人员容易地做出。

在一个实施方式中，应当理解，与用每种剂本身的治疗相比，本发明的肽可以与另外的活性剂一起提供给个体，以实现改善的治疗效果。在另一个实施方式中，对组合疗法相关的不良副作用采取措施(例如，给药和选择互补剂)。

在一个实施方式中，根据待治疗状况的严重程度和反应性(responsiveness)，给药可以是单次或多次施用，其中治疗过程持续数天至数周或直到产生治愈或实现疾病状态的减轻(diminution)。

在一些实施方式中，肽以治疗安全有效的量施用。如本文所用，术语“安全有效量”是指当以本文所述方式使用时，足以产生所期望的治疗反应而没有与合理的益处/风险比相称的过度不良副作用(例如毒性，刺激或过敏反应)的组分的量的。在另一个实施方式中，多肽的治疗有效量是体内可测量的预期生物效应所必需的多肽的量。施用的实际量，施用的速率和时间过程将取决于所治疗状况的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量，时间(timing)等的决定由全科医师或专科医师负责，并且一般考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送的部位、施用方法和医师已知的其他因素。技术和方案的实例可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,(2005)中找到。在一些实施方式中，最初可以从体外测定估计有效量或剂量的制备。在一个实施方式中，可以在动物模型中配制剂量，并且这种信息可以用于更准确地确定人体中的有用剂量。

在一个实施方式中，本文所述活性成分的毒性和治疗功效可通过体外、细胞培养物或实验动物中的标准药学程序确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。在一个实施方式中，剂量根据使用的剂型和所用的施用途径而变化。在一个实施方式中，确切的制剂、给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况选择。[参见例如，Fingl,et al.,(1975)"The PharmacologicalBasis of Therapeutics",Ch.1p.1]。

含有本文所述多肽作为活性成分的药物组合物可根据常规药物配合技术制备。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.(1990)。还参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21stEd.,Lippincott Williams &Wilkins,Philadelphia,Pa.(2005)。

在一个实施方式中，制备包含在相容的药物载体中配制的本发明制剂的组合物，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指示的状况。

在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装(pack)或分配器装置——如FDA批准的试剂盒中，其含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。在一个实施例中，包装例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施例中，包装或分配器由与容器相关联的通知以由管理药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式容纳，该通知反映了该机构对组合物的形式、或人或兽医管理的批准。在一个实施方式中，这种通知是美国食品和药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration)批准的用于处方药的标签或批准的产品插页的标签。

组合物的用途

根据一些方面，提供了治疗、改善(ameliorating)、减少和/或预防与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的状况的方法，该方法包括以下步骤：给予受试者包含有效量的本发明多肽的药物组合物，从而治疗、改善、减少和/或预防与对其有需要的受试者的骨吸收增加相关的状况。

在一些实施方式中，提供了治疗与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病的方法，该方法包括给予所述受试者包含有效量的氨基酸分子的药物组合物和药学上可接受的载体的步骤，该氨基酸分子包含选自SEQ ID NO：11-17的氨基酸序列，从而在治疗、改善、减少和/或预防与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病。

在另一个实施方式中，本发明的多肽或包含该多肽的组合物用于治疗、改善、减少和/或预防与对其有需要的受试者中骨吸收增加相关的状况。在一些实施方式中，提供了包含有效量多肽的组合物，其用于治疗或预防与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病。在一些实施方式中，提供了包含有效量的氨基酸分子的组合物，所述氨基酸分子包含选自SEQ ID NO：11-17的氨基酸序列，用于治疗或预防与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病。

在一些实施方式中，提供了包含有效量的多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、改善、减少或预防与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病。在一些实施方式中，本发明提供包含有效量的氨基酸分子的组合物在制备药物中的用途，该氨基酸分子包含选自SEQ ID NO：11-17的氨基酸序列，该药物用于治疗与对其有需要的受试者中的骨吸收增加相关的疾病。

在一个实施方式中，将本发明的多肽本身提供给受试者。在一个实施方式中，将本发明的多肽作为药物组合物的一部分提供给受试者，其中将其与药学上可接受的载体混合。

与骨吸收增加相关的疾病的非限制性实例包括佩吉特病，骨质疏松症和肿瘤相关骨吸收疾病。

在一些实施方式中，与骨吸收增加相关的疾病是骨质疏松症。

如本文所用的术语“受试者”是指动物，更具体地是指非人类哺乳动物和人类生物。非人动物受试者还可包括动物的产前形式，如例如胚胎或胎儿。非人动物的非限制性实例包括：马、牛、骆驼、山羊、绵羊、狗、猫、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猪。在一个实施方式中，受试者是人。人类受试者还可包括胎儿。在一个实施方式中，对其有需要的受试者是患有与骨吸收增加相关的状况和/或有患有与骨吸收增加相关的状况的风险的受试者。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”疾病、病症或状况包括减轻(alleviation)其至少一种症状、降低其严重程度或抑制其进展。治疗不需要意味着疾病、病症或状况完全治愈。为了有效治疗，本文的有用的组合物仅需要降低疾病、病症或状况的严重程度，降低与其相关的症状的严重程度，或者为患者或受试者的生活质量提供改善。

如本文所用，术语“预防”疾病、病症或状况包括延迟、预防、遏抑或抑制疾病、病症或状况的发病。如根据本文描述的主题使用的，术语“预防”涉及预防的过程，其中受试者在疾病/病症过程的诱导或发病之前暴露于本文描述的肽。这可以在个体具有遗传谱系的情况下进行，所述遗传谱系指示要防止向疾病/病症发生的倾向。例如，对于其祖先显示出向某些类型(例如，炎性疾病)病症倾向的个体，这可能是真的。术语“遏抑”用于描述其中疾病/病症过程已经开始但尚未实现该状况的明显症状的状况。因此，个体的细胞可能患有疾病/病症，但尚未在临床上认识到疾病/病症的外部体征。在任何一种情况下，术语预防都可以应用于包括预防和遏抑。相反，术语“治疗”是指活性剂的临床应用，以对抗其临床表现已在患者中实现的已存在状况。

如本文所用，术语“状况(病况，condition)”包括与正常的解剖学和生理学偏差，该偏差构成活体动物或其一个部分的正常状态的损害，该损害中断或改变身体机能的表现。

除非另有指示，否则本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比例范围应理解为包括该范围内的任何整数及其分数的浓度、百分比或比率，如整数的十分之一和百分之一。

除非另有指示，否则本文所述的与任何物理特征(例如聚合物亚单元、尺寸或厚度)相关的任何数字范围，应理解为包括所述范围内的任何整数。

如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人。

在讨论中，除非另有说明，否则诸如“基本上”和“约”修饰本发明实施方式的一个特征或多个特征的条件或关系特性的形容词应理解为意味着条件或特性被限定在公差范围内，对于预期的应用的实施方式的操作是可接受的。除非另有指示，否则说明书和权利要求中的词语“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的，并且表示其联合的项目中的至少一个或任何组合。

应当理解，上文和本文其他地方使用的术语“一”和“一个”是指所列举的组件中的“一个或多个”。除非另外特别说明，否则本领域普通技术人员将清楚，单数的使用包括复数。因此，术语“一”，“一个”和“至少一个”在本申请中可互换使用。

为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有指示，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字在所有情况下应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的期望的特性而变化。最低限度地，每个数值参数至少应根据报告的有效数的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。

在本申请的说明书和权利要求中，每个动词“包括”、“包括”和“具有”及其共轭用于指示动词的一个或多个对象不一定是动词的一个主语或多个主语的组件、元件或部件的完整列表。

如本文使用的其他术语意在由它们在本领域中公知的含义来定义。

在检查以下实施例后，本发明的其它目的，优点和新颖特征对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见，这些实施例不意图是限制性的。另外，如上文描述的和如下面的权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到实验支持。

应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供，或者在本发明的任何其他描述的实施方式中适当地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些元件的情况下不起作用。

实施例

通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook等,(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等(eds)"GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法学；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"byFreshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols inImmunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等(eds),"Basic andClinical Immunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell andShiigi(eds),"Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual"CSHL Press(1996)；"Bacteriophage Methods andProtocols",Volume 1:Isolation,Characterization,and Interactions，所有这些都通过引用并入。贯穿本文档提供了其他一般参考文献。

如上所述和如下面的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。

材料和方法

方法设计和构建M-CSF_M、两个M-CSF_RGD文库和M-CSF_αvβ3

使用鼠c-FMS/M-CSF复合物(PDB：3EJJ)的3D结构和人M-CSF(PDB：1HMC)的3D结构，鉴定了复合物的结合界面。M-CSF单体，命名为M-CSF_M，其由158个氨基酸组成，设计有阻止单体的同型二聚化的C31S突变(参见Deng,P.,等,Biochemical and biophysicalresearch communications,1996.228(2):p.557-566)。然后设计两个M-CSF_M变体的文库，使得远离受体结合位点的两个环(根据PDB：3EJJ的残基编号分别为25至32和64至71)各自被RGD基序(侧翼为每一侧三个随机氨基酸，表示为XXXRGDXXX(命名为M-CSF_RGD))替代。为了在每个文库中产生随机氨基酸，将DNA密码子合成为NNS序列，其中N可以是任何密码子，S可以是C或G。M-CSF_M基因和两个M-CSF_RGD文库是由GenScript(Piscataway，NJ，USA)为我们制备，具有pCTCON同源位点和胺末端上的ECORI和NheI限制性位点以及C末端上的AvrII和BamHI限制性位点。用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)通过PCR扩增M-CSF_M基因和M-CSF_RGD文库DNA序列，并使用微脉冲电穿孔仪(Micropulserelectrorator)(Bio-Rad，USA)转化到EBY100酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中，该菌株具有修饰的线性pCTCON质粒[48]，用于同源重组。在色氨酸选择性培养基SDCAA(2％右旋糖、0.67％酵母氮碱、0.5％细菌酪蛋白质氨基酸、1.47％柠檬酸钠、0.429％柠檬酸一水合物，pH4.5)中回收DNA序列。为了评估两个M-CSF_RGD文库的多样性(大小)，将酵母以几种稀释度铺板(plated)在SDCAA平板(0.54％Na₂HPO₄、0.856％Na₂HPO₄·H₂O、18.2％山梨糖醇、1.5％琼脂、2％右旋糖、0.67％酵母氮碱、0.5％细菌酪蛋白质氨基酸)上，并手动计数。文库1由3.6×10⁶个变体组成，文库2由8.3×10⁶个变体组成。将两个文库组合成一个产生1.1×10⁷个变体的文库。为了评估文库的初始可变性，通过GenScript对来自每个文库的20个克隆进行测序。在鉴定c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的最佳结合物后，选择其中一种(4.22)突变成α_vβ₃整联蛋白而不是c-FMS结合物，被称为M-CSF_αvβ3。通过用丙氨酸替代组氨酸，在第9和15位设计了两个单点突变。在pCTCON载体上的M-CSF_αvβ3基因购自Biomatik(Wilmington,DE,USA)。

流式细胞术分选和分析

为了在酵母表面上表达M-CSF_M基因和两个M-CSF_RGD文库，将SDCAA培养基替换为SGCAA培养基(2％半乳糖、0.67％酵母氮碱、0.5％细菌酪蛋白质氨基酸、1.47％柠檬酸钠、0.429％柠檬酸一水合物)，并且酵母在30℃下孵育过夜，直至培养物达到OD₆₀₀＝10.0(每毫升10⁸个细胞)。将等于文库大小十倍的细胞数量添加至1ml含有1％牛血清白蛋白质(PBSA)的PBS中；离心悬浮液，且除去上清液。对于M-CSF_M和M-CSF_RGD文库与c-FMS的结合分析，将酵母细胞与小鼠抗c-myc抗体，9E10(Abcam，Cambridge，MA，USA)以1:50的比例和不同浓度的可溶性Fc缀合的人c-FMS(R&D systems，USA)在室温下一起孵育1小时。在另外的洗涤步骤后，将细胞用二级PE抗小鼠(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)和山羊抗人Fc FITC抗体(Sigma-Aldrich)在4℃下在黑暗中标记30分钟。对于M-CSF_RGD文库与整联蛋白的结合分析，用整联蛋白结合缓冲液(IBB；20mM Tris，pH7.5，2mM CaCl₂、100mM NaCl、1mM MgCl₂和1mMMnCl₂)+1％BSA进行实验。将酵母细胞与鸡抗c-myc和不同浓度的可溶性人α_vβ₃整联蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)一起孵育1小时。在另外的洗涤步骤后，将细胞用二级PE-抗鸡和FITC-抗人β3整联蛋白(BioLegend，San Diego，CA，USA)抗体在黑暗中标记30分钟。用1ml的PBSA或IBB+1％BSA洗涤标记的细胞。共进行了5轮亲和力成熟分选；在每轮分选中，创建对角线形状以富集高蛋白质结合物。在每轮分选中，将0.5％至2％的群体收集到含有SDCC培养基的新管中。第一轮分选是针对500nM c-FMS(分选0)进行的，随后对500nMα_vβ₃整联蛋白(分选1)、250nMα_vβ₃整联蛋白(分选2)、100nMα_vβ₃整联蛋白(分选类)、20nMα_vβ₃整联蛋白(分选4)、和50nM的c-FMS(分选5)进行分选。使用iCyt Synergy FACS仪器(SonyBiotechnology,San Jose,CA,USA)富集高亲和力结合物。

选择和鉴定高亲和力α_vβ₃整联蛋白和c-FMS结合物

为了鉴定高α_vβ₃整联蛋白和c-FMS结合物，测试来自分选4的25个不同克隆和来自分选5的25个不同克隆与20nMα_vβ₃整联蛋白的结合，如流式细胞术分选部分中所述。然后，分析对α_vβ₃整联蛋白具有最高亲和力的来自分选4的10个α_vβ₃整联蛋白结合克隆和来自分选5的10个α_vβ₃整联蛋白结合克隆与50nM的c-FMS的结合。选择对α_vβ₃整联蛋白和c-FMS都具有最高亲和力的克隆，并使用Zymoprep^TMYeast Plasmid Miniprep I(Zymo Research，Irvine，CA，USA)根据制造商的方案从这些克隆中提取DNA。将提取的质粒与大肠杆菌感受态细胞在冰上孵育30min，并转移到0.2-cm间隙比色皿(Bio-Rad，USA)中。将比色皿***微脉冲电穿孔仪(Bio-Rad，USA)中并用2.5kV脉冲。立即向每个比色皿中添加1ml温热的Luria肉汤(Luria Broth)(LB)培养基，并将悬浮液在37℃下孵育1小时。接种细菌并且其在含有1:1000氨苄青霉素的LB琼脂平板上在37℃下生长过夜。菌落被移至含有氨苄青霉素的LB培养基中并生长过夜。根据制造商的方案，用HiYield质粒mini试剂盒(RBC，Bioscience，Taiwan)从细菌培养物中提取质粒。对纯化的质粒进行测序以确认它们含有期望的序列并防止重复。为了确定对其他RGD结合整联蛋白，即α₄β₇、α₂β_2b、α₅β₁和α_vβ₅(BioLegend，USA)的结合特异性，分析了三种选择的M-CSF_RGD变体(4.22、4.24和5.6)与250nM每种整联蛋白的结合。为了检测整联蛋白结合，将M-CSF_RGD变体分别与APC抗人CD49d、APC抗人CD41、FITC抗人CD49e和FITC抗人CD5(BioLegend，USA)一起孵育，并用Accuri C6流式细胞分析仪(BDBiosciences，San Jose，CA，USA)分析。

蛋白质的纯化

将三种M-CSF_RGD变体(4.22、4.24和5.6)、M-CSF_M和M-CSF_αvβ3用ECORI和AvrII(NewEngland Biolabs，USA)消化并用Quick Ligase(New England Biolabs,USA)连接至pPICK9K表达质粒，pPICK9K表达质粒在克隆位点的N末端含有FLAG标签、C末端含有6×His标签。将质粒转化到感受态大肠杆菌中，并如前所述用AOX1正向和反向引物测序。将具有期望序列的质粒用SacI限制酶(New England Biolabs，USA)线性化，并使用多拷贝毕赤酵母属(Pichia)表达试剂盒(Invitrogen，USA)转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115中。转化后，将细胞铺板在RDB平板(18.6％山梨糖醇、2％琼脂、2％右旋糖、1.34％酵母氮碱、4×10^–5％生物素和各5×10^–3％的L-谷氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-异亮氨酸)上，在30℃下保持48小时，收集，并再次铺板在遗传霉素(Geneticin)(G418 4mg/ml)平板上，保持额外48-72小时。将菌落移至5ml的BMGY培养基(2％蛋白质胨、1％酵母提取物、0.2％K₂H(PO₄)、1.1812％KH₂(PO₄)、1.34％酵母氮碱、4×10^–5％生物素、1％甘油)，在30℃下孵育过夜，并转移(transformed)到5ml的BMMY培养基(2％蛋白质胨、1％酵母提取物、0.23％K₂H(PO₄)、1.1812％KH₂(PO₄)、1.34％酵母氮碱、4×10^–5％生物素、0.5％甲醇)，在30℃下保持3天。每天，将甲醇添加BMMY培养基中以维持浓度为0.5％。对于小规模蛋白质表达，将GS115细胞以3800g离心10min，并收集上清液进行蛋白质印迹分析：使用1:1000初级小鼠抗FLAG(Sigma-Aldrich，USA)，然后使用1:5000缀合碱性磷酸酶的抗小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)和2ml的BCIP试剂(Sigma-Aldrich，USA)用于信号显影(signal development)。将表达最高的培养物在50ml的BMGY中在30℃下生长过夜，并转移至500ml的BMMY。每天(持续3天)，将甲醇添加BMMY培养基中以维持浓度为0.5％。然后，将细胞以3800rpm浓缩10分钟，并使用0.22-μm过滤器(stericups)(Millipore，Ecuador)过滤上清液。向滤液中添加NaCl至终浓度为150-300mM，添加咪唑至终浓度为10mM，并将pH调节至8.0。将蛋白质溶液在4℃下孵育1小时，在3800g下离心10分钟，并再次过滤。使用蠕动泵将滤液加载到HisTrap Ni柱(GE Healthcare Life Sciences，UK)上。用结合缓冲液(20mM NaH₂PO₄·H₂O、500mM NaCl和10mM咪唑；pH 8)洗涤柱，并用洗脱缓冲液(20mM NaH₂PO₄·H₂O、500mM NaCl和500mM咪唑；pH 8)洗脱。通过Vivaspin(GEHealthcare Life Sciences,UK)以3,000Da截止值(cutoff)除去洗脱缓冲液，并用PBS替换缓冲液。通过在室温下用内切糖苷酶Endo HF(New England Biolabs，USA)过夜处理除去蛋白质N-糖基化。蛋白质在具有Superdex 200 16/600尺寸排阻柱的纯150FPLC上进一步纯化，并将洗脱时间与蛋白质标准品的洗脱时间进行比较。对纯化的蛋白质样品进行质谱分析(Ilse Katz Institute for Nanoscale Science and Technology,BGU)并用Instant Blue(Expedeon,San Diego,CA,USA)进行SDS-PAGE考马斯蓝染色以评估蛋白质纯度。使用Evolution 260生物分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)基于280nm处的蛋白质吸收和对于M-CSF_M和M-CSF_RGD变体4.22的13,325M^-1cm^-1的消光系数测量蛋白质浓度。M-CSF_αvβ3和M-CSF_RGD变体4.24和5.6的消光系数是14,815M^-1cm^-1。

圆二色(CD)分析

使用具有1-mm路径长度的石英比色皿的J-815CD光谱仪(JASCO，Tokyo，Japan)进行纯化蛋白质的二级结构分析。在室温下获得400μl的PBS中的5μM的纯化蛋白质的光谱。将三个光谱的平均值归一化以获得椭圆率(度×cm²/dmol)并减去PBS背景。二极管电压>1000V的数据点被排除在外。为了确定M-CSF_M熔化温度，如所述测试5μM的M-CSF_M，并且以逐步的方式将样品温度从10℃升高至95℃并获得光谱。对于主要由α-螺旋二级结构组成的蛋白质变性，观察到的波长为209nm。

化学交联

将纯化的M-CSF_M、M-CSF_RGD变体和M-CSF_αvβ3与不同浓度的BS³[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA]交联剂0-2500μM在室温下一起孵育30分钟。然后，添加Tris至终浓度为30mM，并将混合物在室温下孵育15分钟。将样品变性并加载到15％SDS-PAGE上。凝胶用考马斯蓝(InstantBlue，Expedeon，CA，USA)染色，并用MiniBis pro(DNR Bio-Imaging Systems,Jerusalem,Israel)可视化(visualized)。

表面等离振子共振(SPR)

在ProteOn XPR36(Bio-Rad,USA)上进行可溶性纯化蛋白质(M-CSF_M和M-CSF_RGD变体)与c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的结合的确定。通过使用胺偶联剂磺基-NHS(0.1M N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(0.4M 1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，Bio-Rad，USA)将M-CSF_RGD、M-CSF_M和M-CSF_αvβ3蛋白质变体固定在芯片表面上。为了将M-CSF_RGD，M-CSF_M和M-CSF_αvβ3变体共价附接到芯片上，使用pH4.0的10mM乙酸钠缓冲液中的1μg每种蛋白质和3μg的BSA以对于M-CSF_M、M-CSF_αvβ3 4.22、4.24和5.6分别给出474、900、1329、1272和1337响应单位(RU)。未结合的酯在pH8.5下用1M乙醇胺HCl失活，并将温度设定在25℃。然后，旋转芯片，允许人c-FMS可溶性蛋白质(Sino Biological，China)以6种不同浓度(0、12.5、25、50、100和200nM)以50μl/min的流速流过芯片490s，然后在PBS+0.005％吐温(PBST)中解离600秒。为了确定α_vβ₃整联蛋白结合，使用50mM NaOH以100μl/min的流速再生芯片，并再次分析c-FMS结合以确保芯片已经再生。在确保芯片再生后，允许不同浓度的α_vβ₃整联蛋白(0、12.5、25、50、100和200nM)流过芯片。将获得的相互作用归一化为与芯片表面结合的初始蛋白质RU。然后，对于每种浓度，从传感图的平衡结合相获得K_D。为了确定对每个M-CSF_RGD变体的α_vβ₃整联蛋白特异性，新芯片加载有不同的RGD结合整联蛋白，如下：8.5μg的α₃β₁、8.5μg的α₄β₇、6μg的α₅β₁、8.5μg的α_vβ₅和8.5μg的α_vβ₃整联蛋白以及3μg的BSA作为阴性对照。如上所述，用pH4.0的10mM乙酸钠缓冲液将蛋白质共价结合到芯片。然后，允许1μM的M-CSF_RGD变体以50μl/min的速率流过芯片409s，然后用PBS+1％吐温解离600s。将获得的相互作用归一化为与芯片表面结合的初始蛋白质RU。为了达到统计学显著性，我们确保χ²值至少为R_max值的10％或更低。

直接细胞结合测定

将M-CSF_M和两种M-CSF_RGD变体(4.22和5.6)以DyLight^TM488NHS酯(Thermo FisherScientific,USA)和纯化的蛋白质的摩尔比为1:1进行标记。将溶液在室温下孵育1小时，并用Vivaspin(GE Healthcare life sciences,UK)以3,000Da截止值洗涤残留的未结合染料三次。由于蛋白质纯化产率低，未测试M-CSF_RGD变体4.24和M-CSF_αvβ3的直接细胞结合。

MDA-MB-231乳腺癌细胞用于纯化蛋白质的直接细胞结合。将细胞以每孔10⁵的密度铺板在96孔板中，并用1ml的0.1％PBSA洗涤。将细胞以150g离心5min，并除去上清液；这一步重复两次。然后，将标记的M-CSF_RGD蛋白质变体和M-CSF_M单特异性对照在IBB+1％BSA中以不同浓度(1、2.5和7.5μM)添加到细胞中，总体积为100μl，并在4℃下轻轻搅动孵育2小时。对于c-FMS表达，细胞用PE-抗人CD115(BioLegend，USA)以1:50的稀释度染色，而对于α_vβ₃整联蛋白表达，用FITC-抗人β₃整联蛋白(BioLegend，USA)以1:25的稀释度染色，持续30min。然后，如上所述洗涤细胞两次，并用Accuri C6流式细胞术分析仪(BD Biosciences，USA)分析。从其他样品中减去细胞的平均荧光。每个浓度重复实验三次。

鼠骨髓来源的单核细胞(BMM)通过从WT C57BL6小鼠的股骨和胫骨冲洗骨髓获得。将细胞用ACK红色裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific,USA)处理，并在含有重组鼠M-CSF(40ng/ml)(R&D systems，USA)的αMEM生长培养基(Biological Industries,Israel)中的细菌培养皿上铺板。将细胞在37℃下，5％CO₂下孵育3天，以诱导单核细胞附着和增殖。用PBS洗涤平板，使用细胞刮棒分离细胞，并将10⁵个细胞转移到96孔板中的每个孔中。用200μl的0.1％PBSA洗涤细胞两次。如所述确定对标记的M-CSF_M和M-CSF_RGD蛋白质的结合。对于鼠c-FMS表达，抗小鼠CD115(CSF-1R)(BioLegend，USA)以1:50浓度使用并用山羊抗大鼠(PE)抗体(Abcam，USA)检测。对于α_vβ₃整联蛋白表达，如前所述使用Alexa Fluor 488抗小鼠/大鼠CD61(BioLegend，USA)抗体。用Accuri C6流式细胞术分析仪(BD Biosciences，USA)分析样品。每个浓度重复实验三次。

原代细胞分化测定-如在鼠原代细胞部分中所述获得鼠原代细胞。细胞用PBS洗涤并使用细胞刮棒分离，并将20,000个细胞铺板在96孔板的每个孔中。通过在含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素、20ng/μl M-CSF和20ng/μl RANKL(R&D Systems，USA)的α-MEM中培养细胞来诱导破骨细胞分化。为了确定M-CSF_RGD变体和M-CSF_M对破骨细胞的影响，将蛋白质以三种不同浓度(50nM、1μM和5μM)添加至分化培养基(具有M-CSF和RANKL)。72-96小时后，一旦细胞已完全分化，将它们用4％低聚甲醛固定，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(Sigma-Aldrich，USA)根据制造商的方案染色。作为阳性对照，使用PBS代替抑制剂，且阴性对照包括在不含RANKL和抑制剂的分化培养基中孵育的细胞。通过分析每个孔中随机区域的20个图像获得破骨细胞参数；用具有自动化阶段的Olympus×83显微镜观察破骨细胞。以双盲方式对每个图像中的细胞进行计数，并使用ImageJ软件确定破骨细胞中的细胞核数和总破骨细胞表面积。对每种条件进行三次重复，并将每次重复归一化为阳性对照值。

统计学分析-用GraphPad Prism版本5.00(用于Windows***)(La Jolla，CA，USA)分析来自原代细胞分化测定的数据的列统计(column statistics)。数据显示为平均值±SEM。通过列统计和t检验分析确定统计学显著性。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结晶和结构确定-将M-CSF_C31S浓缩至5.5mg/ml。使用Index筛选试剂盒(HamptonResearch)在293K进行初始结晶条件筛选。每滴含有0.3μl的结晶溶液和0.3μl的M-CSF_C31S蛋白质溶液的混合物。晶体生长9天，且从含有以下优化结晶溶液的液滴中收获：0.03Mbis-Tris，pH6.5；0.17M甲酸镁；16.67％PEG 3350；0.07M bis-Tris，pH 5.5。在收集数据之前，将晶体在液氮中急骤冷却(flash-cooled)。在欧洲同步辐射装置(EuropeanSynchrotron Radiation Facility)(ESRF，Grenoble，France)的光束线BM14上收集衍射数据集，最大分辨率为在下对250幅图像测量数据，振荡范围为1°，曝光时间为每幅图像3s，且晶体与探测器之间的距离为181.45mm。使用HKL2000程序套件(Otwinowski,Z.and Minor,W.(1997)276,307–326)进行数据处理。使用CCP4程序套件(Winn,M.D.,Ballard,C.C.,Cowtan,K.D.,Dodson,E.J.,Emsley,P.,Evans,P.R.et al.(2011)Overviewof the CCP 4suite and current developments.Acta Crystallogr.Sect.D 67,235–242)的Phaser(McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.and Read,R.J.(2007)Phaser crystallographicsoftware.J.Appl.Crystallogr.40,658–674)进行相位采集和结构确定。最终模型由Coot(Emsley,P.and Cowtan,K.(2004)Coot:model-building tools for moleculargraphics.Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.60,2126–2132)构建，且使用Phenix(Adams,P.D.,Afonine,P.V.,Bunkóczi,G.,Chen,V.B.,Davis,I.W.,Echols,N.etal.(2010)PHENIX:a comprehensive Python-based system for macromolecularstructure solution.Acta Crystallogr.Sect.D Biol.Crystallogr.66,213–221)改良。

能量计算以鉴定对二聚体形成有显著贡献的M-CSF_C31S残基-分析M-CSF_C31S残基对二聚体形成的每个残基贡献，如Kosloff,M.,等(2011；Nat.Struct.Mol.Biol.18,846–853)所述的。使用有限差分泊松-玻尔兹曼(FDPB)方法用于计算在二聚体界面的内的每个残基的净静电和极性贡献(ΔΔG_elec)。非极性能量贡献(ΔΔG_np)计算为表面积比例项，通过将复合物形成时埋藏的每个残留物表面积[使用surfv计算(Sridharan,S.,Nicholls,A.,Honig,B.,Nicholls,A.and Honig,B.(1992).FASEB J.]乘以的表面张力常数(Sheinerman,F.B.,Al-Lazikani,B.and Honig,B.(2003)Sequence,structure andenergetic determinants of phosphopeptide selectivity ofSH2domains.J.Mol.Biol.334,823–841)。能量上显著的残基定义为对相互作用贡献ΔΔG_elec或ΔΔG_np>1kcal/mol的残基。

蛋白质表达和纯化-三种计算选择的M-CSF变体(即，M-CSF_C31S,Q26R、M-CSF_C31S,M27R和M-CSF_{C31S,Q26R,M27R}，以及M-CSF_C31S和M-CSF_WT)使用如前所述的GS115毕赤酵母酵母菌株(Rosenfeld,L.,Shirian,J.,Zur,Y.,Levaot,N.,Shifman,J.M.and Papo,N.(2015)Combinatorial and computational approaches to identify interactions ofmacrophage colony-stimulating factor(M-CSF)and its receptor c-FMS.J.Biol.Chem.290,26180–26193)纯化。使用Superdex 200 16/600柱(GE Healthcare)最终纯化M-CSF_C31S和M-CSF_WT，同时使用Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare)纯化M-CSF_C31S,M27R、M-CSF_C31S,Q26R和M-CSF_{C31S,Q26R,M27R}。

BS³交联测定-将人(4μg)和鼠M-CSF_WT(1μg)、M-CSF_C31S(1μg)和M-CSF_C31S,M27R(2.5μg)与不同浓度的BS³[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯](ThermoFisher Scientific，MA，USA)交联剂(0、25μM、100μM、250μM、500μM、1000μM和2500μM)一起在室温下孵育30min。然后，添加bis-Tris缓冲液至终浓度为30mM，并将混合物在室温下孵育15min。用样品缓冲液使样品变性，煮沸，并加载到15％SDS-PAGE上用于蛋白质分离。用InstantBlue染色法(Expedeon，CA，USA)将凝胶染色40min，然后是两个用双蒸水洗涤的步骤。将凝胶用MiniBispro(DNR Bio-Imaging Systems,Jerusalem,Israel)可视化。

动态光散射(DLS)-使用DLS确定M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R的流体动力学半径。将浓度为0.5mg/ml的蛋白质过滤以除去聚集物和污染物。在两个不同的实验中，以90°的角度测量光散射三次，导致总共六次测量。以60°的角度进行另一次测量以验证半径不随测量角度改变。对溶液进行分析以验证最丰富的物质的尺寸范围为1-10nm。比较三种不同蛋白质的该物质的峰值，并将每种蛋白质的流体动力学半径确定为峰值的最大值。

小角度X射线散射(SAXS)分析-SAXS数据在SAXLAB GANESHA 300XL***上收集，其拥有带有集成单色仪的Genix 3D Cu源，三个针孔准直和二维Pilatus 300K检测器。以的间隔记录散射强度。测量在25℃下在真空下进行。在浓度为3、5和7mg/ml时测量所有三种M-CSF变体。还测量了缓冲液的散射并从样品的散射中减去。

散射矢量的大小由以下等式描述：

其中2θ是散射角，λ是波长。

旋转半径(R_g)的值来自SAXS曲线的小角度部分(Guinier区域，qR_g<1.0)，在PRIMUS[43]中。在该区域，Guinier近似适用于：

R_g值也是使用内部脚本[44]推导出来的，内部脚本被设计以使用GNOM(Svergun,D.I.(1992).J.Appl.Crystallogr.25,495–503)进行自动搜索最佳拟合参数。使用CRYSOL(Barberato,C.,Barberato,C.and Koch,M.H.J.(1995)J.Appl.Crystallogr.28,768–773)以基于M-CSF_WT晶体结构(PDB ID代码：3UF2)计算理论SAXS光谱。这些光谱用作重建实验SAXS数据的参考。使用GASBOR(Svergun,D.I.,Petoukhov,M.V.and Koch,M.H.J.(2001)Biophys.J.80,2946–2953)以基于由内部脚本获得的最佳GNOM拟合重建分子包膜。对每个样品计算十个模型并使用DAMAVER进行平均(Volkov,V.V.and Svergun,D.I.(2003)J.Appl.Crystallogr.36,860–864)。

表面等离振子共振(SPR)-通过SPR光谱学在ProteOn XPR36(Bio-Rad，CA，USA)上确定M-CSF_WT和M-CSF_C31S,M27R结合c-FMS受体的能力。通过使用胺偶联剂、磺基-NHS(0.1M N-羟基琥珀酰亚胺)和EDC(0.4M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)将M-CSF变体固定在芯片表面上。对于芯片激活，接着在10mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中添加1μg的蛋白质，分别对M-CSF_WT和M-CSF_C31S,M27R给出1063和551响应单位(RU)。将BSA(3μg；3762RU)固定在芯片上作为阴性对照。在pH8.5下用1M乙醇胺HCl使未结合的酯失活。在每次结合测定之前，将温度设定在25℃。然后允许可溶性人c-FMS受体(胞外结构域，残基Met1-Glu512)(SinoBiological,China)以4.375、8.75、17.5、35和70nM的浓度和25μl/min的流速，流过表面结合的M-CSF，持续16min 21s，并且在此期间测量M-CSF和c-FMS之间的相互作用。测量蛋白质的解离，同时允许PBST(磷酸盐缓冲盐水+0.005％吐温)以50μl/min的流速在表面上流过6min和50s。该过程重复三次，在运行之间进行再生步骤。用50mM NaOH以100μl/min的流速进行再生。对于每种蛋白质复合物，从蛋白质-蛋白质相互作用过程中测量的RU减去BSA通道的值产生传感图。解离常数(K_D)由平衡结合相的传感图确定。

磷酸化测定-对两种细胞类型(BMM和人外周血CD14⁺单核细胞)进行如下实验：(i)来自野生型C57BL6小鼠的BMM通过如前所述的从股骨和胫骨冲洗骨髓来纯化(Levaot,N.,Simoncic,P.D.,Dimitriou,I.D.,Scotter,A.,La Rose,J.,Ng,A.H.M.et al.(2011)J.Clin.Invest.121,3244–3257)。用ACK红细胞裂解缓冲液(ThermoFisher Scientific,USA)处理细胞，并在含有10％胎牛血清(FBS)(选择不含LPS以预防巨噬细胞分化)、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺的完全α-MEM生长培养基(Sigma-Aldrich,USA)中生长。以40ng/ml的浓度(Peprotech，Israel)添加重组鼠M-CSF在37℃下保持三天，以诱导单核细胞的粘附和增殖。然后，将7×10⁵个细胞转移到具有完全α-MEM和20ng/ml鼠M-CSF和RANKL(R&DSystems，USA)的6孔板中保持48小时。(ii)CD14⁺单核细胞(Lonza，Switzerland)在人M-CSF(20ng/mL)存在下在完全α-MEM培养基中生长5天。然后，将3.5×10⁵个细胞转移至具有完全α-MEM培养基、20ng/μl人M-CSF(R&D Systems，USA)和20ng/ml鼠RANKL的24孔板中保持72小时。此时，用饥饿培养基(不含FBS的α-MEM)替换培养基4小时。饥饿后，用PBS洗涤细胞，并在含有0.5nM鼠(BMM)或人(CD14⁺)M-CSF和100nM(CD14⁺细胞)或1μM(BMM)的M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R的饥饿培养基中孵育1min。为了在不存在鼠M-CSF_WT的情况下测试磷酸化水平，我们将0.5、5、10、50、1000和5000nM的M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R和0.5、5、10nM的人M-CSF_WT与细胞一起孵育。阳性对照含有0.5nM鼠(BMM)或人(CD14⁺)M-CSF，而阴性对照在不含任何添加蛋白质的饥饿培养基中孵育。将细胞转移至冰，并且添加裂解缓冲液(脱氧胆酸盐0.5％、25nM NaF、10mM NaPO₄、1mM原钒酸钠、5mM EDTA，pH 7.4、5mM EGTA，pH 7.4、100mM NaCl、2％Triton X-100)。将细胞分离，收集，在冰上孵育10min，以14,000g离心30min，且将上清液转移到新管中。对所有样品进行蛋白质印迹，用兔中产生的抗c-FMS、抗磷酸化c-FMS或抗β-肌动蛋白质抗体作为第一抗体(Cell Signaling Technologies,MA,USA)。然后添加二级HRP连接的抗兔抗体，并使用EZ-ECL试剂盒(Biological Industries,Israel)显色信号。用Fusion FX(VilberLourmat,Germany)对化学发光信号进行成像。使用ImageJ量化图像。将每个样品的磷酸化c-FMS的定量强度值除以总的c-FMS强度，然后除以β-肌动蛋白质表达强度。将阳性对照的值设定为1，并根据其对其他样品进行归一化。

分化测定-如上所述获得并生长BMM和CD14+细胞。含有单核细胞的平板用PBS洗涤；针对BMM使用细胞刮棒或针对CD14⁺使用Accutase(Biological industries,Israel)分离细胞；将2×10⁴个BMM或1×10⁴个CD14⁺细胞转移到96孔板中的每个孔中。如‘磷酸化测定’部分中所述诱导破骨细胞分化。为了确定M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R对破骨细胞分化的影响，将蛋白质添加到不同浓度(对于BMM，50nM、1μM和5μM和对于CD14⁺，50nM、250nM和1μM)的分化培养基(含有M-CSF和RANKL)中。为了确定人M-CSF_WT对分化的影响，将其在不添加鼠M-CSF_WT的情况下以不同浓度(50nM、1μM和5μM)添加至细胞。一旦细胞完全分化，将它们用4％低聚甲醛固定，并使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒(Sigma-Aldrich，USA)根据制造商的方案染色。作为阳性对照，将细胞与不含抑制剂的M-CSF和RANKL一起孵育，而阴性对照由在不含RANKL的分化培养基中孵育的细胞组成。通过分析来自每个孔中随机区域的20个图像获得破骨细胞参数；用具有自动化阶段的Olympus×83显微镜观察破骨细胞。以双盲方式计数每个图像中的细胞，并使用ImageJ软件确定破骨细胞中的细胞核数。对于BMM的阳性对照，计算平均为每孔28.33个破骨细胞和135个细胞核。对于CD14⁺阳性对照，每孔的破骨细胞和细胞核的平均数分别为14.5和75。将每个参数的结果归一化为阳性对照值。

使用GraphPad Prism版本5.00(用于Windows***)(La Jolla，CA，USA)分析来自c-FMS磷酸化测定和细胞分化测定的数据的列统计。数据显示为平均值±SEM或平均值±SD。通过列统计和t检验分析确定统计学显著性。P值<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1

改造结合c-FMS的单体M-CSF

如本领域已知的，M-CSF糖蛋白质作为同型二聚体分泌，其在与两种c-FMS受体结合后诱导c-FMS自动磷酸化，然后激活下游信号传导途径。此外，先前公开了M-CSF的第31位半胱氨酸在M-CSF二聚化和c-FMS的激活中起关键作用(参见Deng,P.,et al.,Biochemicaland biophysical research communications,1996.228(2):p.557-566)。

为了产生充当c-FMS拮抗剂的M-CSF，M-CSF二聚化的能力受损。通过用如SEQ IDNO：2(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLIDSQMETSSQITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMEDTMRFRDNTPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSSQGHERQSEGS)所示的丝氨酸残基替代158个氨基酸长的M-CSF(参见SEQ ID NO：18，图1A)的第31位的半胱氨酸，产生具有降低的二聚化能力的突变体M-CSF(命名为M-CSF_M)。

通过将M-CSF_M基因转化为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)并评估蛋白质表达和结合来评估M-CSF_M/c-FMS***与酵母表面展示(YSD)方法的相容性。

为了评估M-CSF_M对c-FMS在YSD***上的结合亲和力，检查了M-CSF_M与不同浓度的可溶性c-FMS的表观结合。将在细胞壁上表达M-CSF_M的细胞与10种不同浓度的c-FMS-Fc(0.5nM至2000nM)一起孵育，并用流式细胞术测试其结合。得到的曲线对于单个位点结合曲线具有好的拟合，并且表观KD为20nM(图2)。得到的K_D值(k_D＝20nM)类似于先前在本领域中公开的K_D值(K_D＝13.6nM，参见Elegheert,J.,et al.,Nat Struct MolBiol,2012.19(9):p.938-47)。

接下来，评估M-CSF_M与c-FMS的结合特异性。为此目的，利用M-CSF_M结合c-kit受体(其为c-FMS结构同源物)的能力。结果表明，即使在200nM的高浓度下，M-CSF_M也不结合c-kit受体(数据未显示)。这些结果证明M-CSF_M表现出对c-FMS的高结合性和高特异性。

实施例2

具有对c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的高亲和力的RGD基序蛋白质的单体M-CSF和M-CSF的改造和选择

先前的研究公开了通过其受体c-FMS的M-CSF信号传导通过与α_vβ₃整联蛋白激活的信号传导的串扰(cross-talk)来调节骨吸收。因此，进行了排除M-CSF_M结合α_vβ₃整联蛋白的能力的实验。结果展示，即使在200nM的高浓度下，M-CSF_M也不结合α_vβ₃整联蛋白。

为了构建可以结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的双特异性M-CSF单体，M-CSF_M(SEQ IDNO：2)支架上的两个环之一被RGD替代，RGD是对α_vβ₃整联蛋白配体结合关键的基序，侧翼为每一侧三个随机氨基酸，即，XXXRGDXXX，其中X代表任何随机氨基酸(命名为M-CSF_RGD)。文库1是构建体文库，其中残基25-32被RGD基序替代(SEQ ID NO：19，图1B)。文库2代表构建体文库，其中残基64-71被RGD基序替代。不同的构建体及其特性在图3A-D中示例。

为了鉴定和分离对c-FMS和α_vβ₃整联蛋白两者具有高亲和力的M-CSF变体，构建了能够通过使用流式细胞术从低亲和力克隆分离高亲和力克隆的YSD复合物。M-CSF_RGD文库与Aga1p和酵母细胞壁共价连接。用c-FMS-Fc重组蛋白质和山羊抗人Fc FITC缀合的二抗确定对c-FMS的结合，并用小鼠抗c-myc一抗和PE抗小鼠二抗测量表达水平。对于α_vβ₃整联蛋白结合，将酵母与重组α_vβ₃整联蛋白和小鼠抗人CD49d FITC二抗一起孵育，并用鸡抗c-myc一抗和PE山羊抗鸡二抗测量表达水平(图4)。

在验证M-CSF_RGD在酵母细胞壁的表面上良好表达并且文库确实结合500nM可溶性c-FMS和500nMα_vβ₃整联蛋白之后，将两个文库合并(在表达方面以1:1的比例)并被认为是由1.1×10⁷个变体组成的单一文库。为了富集高亲和力α_vβ₃整联蛋白结合物群体，将YSD文库与不同浓度的α_vβ₃整联蛋白和特异性抗体(抗c-myc)一起孵育以检测表达。接下来，添加荧光标记的二抗(异硫氰酸荧光素(FITC)抗人β₃)以检测整联蛋白结合和蛋白质复合物表达(藻红蛋白(PE))。随后，通过FACS使用对角线形状将高亲和力结合物分离到新管中，以使蛋白质结合与其表达在酵母细胞壁上的拷贝数归一化。该文库被富集并且该过程总共重复五次。为了富集α_vβ₃整联蛋白和c-FMS结合，第一次分选是用500nM c-FMS进行，以确保文库与c-FMS的结合不会丢失，随后的四次分选用500nM、250nM、100nM和20nMα_vβ₃整联蛋白以分离最好的整联蛋白结合物。在第四次分选之后，观察到α_vβ₃整联蛋白结合的改善和c-FMS结合的减少。随后，为了恢复c-FMS结合，针对50nM的c-FMS进行最后分选(图5A-F)。

为了鉴定将结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白两者的特异性变体，首先确定来自分选4和5的50种不同变体的α_vβ₃整联蛋白结合。接着测试得到的最佳25种α_vβ₃整联蛋白结合物的c-FMS结合(图6A-D)。显示高c-FMS结合和高α_vβ₃整联蛋白结合的三种独特结合物。这些M-CSF_RGD变体被指定为4.22、4.24(均来自分选4)和5.6(来自分选5)(图1D)。三种选择的变体(4.22、4.24和5.6)的序列除了RGD结合环之外没有任何突变。

为了测试这些变体是否仅选择性地结合α_vβ₃整联蛋白，测试了三种M-CSF_RGD变体与α_vβ₃、α₄β₇、α_2β2_b和α₅β₁整联蛋白(250nM)的结合。所有三种变体都显示出对α_vβ₃整联蛋白的高度特异性，因此被认为是对破骨细胞特异性药物开发的良好候选物，因为破骨细胞早在分化的48小时时表达高水平的α_vβ₃整联蛋白。

结果进一步展示变体5.6对c-FMS的亲和力高于对α_vβ₃整联蛋白的亲和力；变体4.24对α_vβ₃整联蛋白的亲和力高于对c-FMS的亲和力；以及变体4.22对c-FMS和α_vβ₃整联蛋白都具有中间结合亲和力。另外，4.22和5.6是来自环1文库的代表，4.24是来自环2文库的代表。使用YSD***，通过显示它们与c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的结合强度各自单独等于同时与两种受体结合的强度(数据未显示)，进一步展示三种M-CSF_RGD变体(4.22、4.24和5.6)可以同时结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。M-CSFRG变体与c-FMS和α_vβ₃整联蛋白的结合强度在结合两者时与结合其中一种相比没有降低的事实表明，一种受体没有在空间上干扰另一种受体的结合，因此，所开发的抑制剂对一个靶的结合将不抑制其与另一个靶的结合。

实施例3

M-CSF_M和M-CSF_RGD变体的产生、纯化和评估

纯化M-CSF_M和M-CSF_RGD变体并以其可溶形式表征。进行实验以证实M-CSF糖基化不影响蛋白质结合和信号传导。M-CSF_M和M-CSF_RGD的糖基化变体(即，在第122位和第140位具有两个糖基化位点)和M-CSF_M和M-CSF_RGD的非糖基化变体(从内切糖苷酶反应获得)在毕赤酵母中表达并通过使用亲和色谱法作为第一步纯化。接下来，将糖基化和非糖基化的M-CSF_M和M-CSF_RGD变体加载到尺寸排阻色谱柱上，并以大约21kDa的预期大小洗脱(图7A)。纯化蛋白质的SDS-PAGE分析显示非糖基化M-CSF_M以～21kDa的预期大小迁移。获得糖基化M-CSF_M的三个条带，21kDa的一个和两个糖基化位点的两个更高的条带。纯化蛋白质的圆二色性(CD)光谱显示出对应于主要由α-螺旋基序组成的蛋白质的相似曲线，这意味着糖基化和RGD环不改变蛋白质二级结构。此外，M-CSF_M中的突变C31S不改变蛋白质二级结构。为了降低可能干扰体外和体内研究的免疫原性，因此M-CSF_RGD蛋白质以非糖基化形式纯化。使用质谱法(MS)确定纯化蛋白质的精确质量：获得M-CSF_M的预期分子量为21.6kDa；M-CSF_RGD变体的分子量为：4.22为21.7kDa、4.24为21.7kDa、以及5.6为22kDa。

实施例4

纯化的M-CSF_M维持部分二聚化并且取消M-CSF_RGD和M-CSF_αvβ3变体二聚化

进行实验以验证纯化的变体不能二聚化。将纯化的变体与交联剂试剂(BS³[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯])一起孵育，以增强和可视化非共价分子间相互作用。孵育后，停止反应并将样品加载于蛋白质凝胶上的变性条件下。如所预期的，即使在2500μM的非常高的BS³浓度下，三种M-CSF_RGD变体(4.22、4.24和5.6)和M-CSF_αvβ3也未显示任何二聚化。相反，M-CSF_M在所有BS³浓度下仍显示出一些二聚化相互作用(图8)。该发现表明M-CSF_M维持一些二聚化能力，因此不适合作为c-FMS抑制剂的开发。其他纯化的蛋白质M-CSF_RGD和M-CSF_αvβ3没有显示任何二聚化，因此具有开发作为c-FMS信号传导的良好拮抗剂的潜力。

实施例5

纯化的蛋白质以不同的亲和力结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白

通常，天然蛋白质受体的良好竞争者应该表现出比其天然配体的结合亲和力更高的结合亲和力(K_D)。M-CSF对c-FMS受体的K_D位于低纳摩尔范围(13.6nM)。α_vβ₃整联蛋白对玻连蛋白(其配体之一)和对抑制剂cRGDfV的结合亲和力分别为40.7nM和157.8nM。为了展示纯化的蛋白质结合其靶并为了确定与其靶(α_vβ₃整联蛋白和c-FMS)的结合亲和力，使用表面等离振子共振(SPR)。首先，为了确定c-FMS结合，将纯化的蛋白质(4.22、4.24、5.6、M-CSF_M和M-CSF_αvβ3)固定在芯片表面上，测试不同浓度的c-FMS在不同浓度(0、12.5、25、50、100和200nM)下的结合(图9A-J)。糖基化和非糖基化的M-CSF_M的K_D值相似，即，分别为42.6nM和31.6nM。如预期，由于RGD环替代，M-CSF_RGD蛋白质与c-FMS的结合亲和力降低，导致4.22的K_D值为152nM，4.24的K_D值为219nM和5.6的K_D值为96nM。如预期，M-CSF_αvβ3没有显示任何与c-FMS的结合。为了确定α_vβ₃整联蛋白结合的解离常数，将纯化的M-CSF_RGD、M-CSF_M和M-CSF_αvβ3固定在芯片的表面上并允许不同浓度的α_vβ₃整联蛋白(200、100、50、25、21.5和0nM)流过芯片表面。如预期，M-CSF_M不结合α_vβ₃整联蛋白。对于M-CSF_RGD蛋白质4.22的结合亲和力为199nM，对于4.24的结合亲和力为108nM，对于5.6的结合亲和力为245nM，并且在231nM下测量M-CSF_αvβ3的K_D。因此，与YSD上观察到的结果类似，三种M-CSF_RGD蛋白质对α_vβ₃整联蛋白和c-FMS表现出不同的亲和力：4.24对α_vβ₃整联蛋白具有高K_D，对于c-FMS具有较低的K_D，5.6是高c-FMS结合物和较低的α_vβ₃整联蛋白结合物，以及4.22具有针对两种受体的中间值。这种结合亲和力的异质性使得能够达到对破骨细胞活性和分化的最敏感的平衡和最佳效果。

实施例6

M-CSF_RGD变体结合可溶性αvβ5整联蛋白和α_vβ₃整联蛋白而非其他RGD结合整联蛋白

为了确定三种M-CSF_RGD变体对整联蛋白α_vβ₃相对于(vis-à-vis)人体中产生的其他整联蛋白的特异性，五种不同的RGD结合整联蛋白(α₃β₁、α₄β₇、α₅β₁、α_vβ₅和α_vβ₃)固定在芯片的表面上，并测试M-CSF_RGD变体在1μM浓度下的整联蛋白结合。整联蛋白α₃β₁、α₄β₇和α₅β₁不结合三种M-CSF_RGD蛋白质(图10C-E)。如前所述，整联蛋白α_vβ₃以高亲和力结合可溶性M-CSF_RGD蛋白质(图10A)。此外，整联蛋白αvβ5同样结合M-CSF_RGD蛋白质(图10B)。尽管αvβ5整联蛋白在破骨细胞上没有严格(solemnly)表达，但它也通过c-FMS信号传导被调节为α_vβ₃整联蛋白。在破骨细胞分化和c-FMS信号传导期间，α_vβ₃整联蛋白的表达水平增加而α_vβ₅整联蛋白减少。与SPRα_vβ₃整联蛋白结合实验相对应，M-CSF_RGD蛋白质与α_vβ₃整联蛋白的结合亲和力与α_vβ₅整联蛋白结合的顺序相同，4.24是最佳α_vβ₅整联蛋白，其次是4.22和5.6。

实施例7

M-CSF_M和M-CSF_RGD变体的直接细胞结合

用流式细胞仪对乳腺癌细胞系MDA-MB-231和鼠原代细胞进行直接细胞结合的测定。使用MDA-MB-231是因为细胞在细胞膜上表达α_vβ₃整联蛋白和c-FMS，一种在达到完全分化和成熟之前模仿破骨细胞状态的蛋白质表达模式。该细胞系显示与1μM、2.5μM和7.5μM的M-CSF_M结合，并与M-CSF_RGD变体4.22和5.6结合(图11F)。M-CSF_RGD变体5.6显示出最佳结合能力，M-CSF_M是最弱的结合物。测试从骨髓获得的鼠原代细胞的结合，而没有任何分化的诱导(t＝0)。这些细胞表达高水平的c-FMS和低水平的α_vβ₃整联蛋白(图11A和11B)，模仿早期破骨细胞分化阶段的状态。对于这些细胞，M-CSF_M显示出比5.6和4.22更强的细胞结合(图6E)，这可能是由于其对c-FMS的更高亲和力，c-FMS是细胞膜上的主要的(dominant)靶。

实施例8

M-CSF_M和M-CSF_RGD变体抑制体外破骨细胞分化

将鼠骨髓单核细胞从8至12周龄小鼠的骨髓中纯化，并在重组M-CSF和RANKL存在下接种用于破骨细胞分化72-96小时。为了评估M-CSF_RGD变体，M-CSF_M和M-CSF_αvβ3抑制破骨细胞分化的能力，将三种不同浓度的抑制剂添加到分化培养基中：50nM、1μM和5μM。在分化期结束时，将破骨细固定胞并染色用于酒石酸抗性酸性磷酸酶活性(TRAP)。在三个参数方面评估破骨细胞的分化和扩散：破骨细胞的数量、破骨细胞中的细胞核的数量和破骨细胞表面积。令人惊讶的是，所有测试的M-CSF_RGD变体以剂量依赖性方式抑制破骨细胞分化，在浓度低至50nM时显示出显著抑制，并且在高于1μM的浓度下完全消除多核细胞的外观。与阳性对照相比，破骨细胞表面积(α_vβ₃整联蛋白活性的良好指标)也明显降低，指示α_vβ₃整联蛋白抑制(图12A-D)。M-CSF_M明显增强破骨细胞分化，这可能指示一些M-CSF_M二聚化发生在高浓度下。这些结果显示，即使在低浓度下，所有M-CSF_RGD变体都抑制破骨细胞分化和扩散，因此它们具有进一步开发的良好前景，包括在体内实验中的测试。

实施例9

使用M-CSF双突变体(M-CSFM，M27R)抑制破骨细胞形成

C31S突变阻止M-CSF在两个M-CSF单体之间形成二硫键，同时仍允许其非共价地二聚化。当M-CSF二聚化时，每个第27位的甲硫氨酸与相对单体中的疏水口袋结合。M27R突变的添加同样抑制非共价二聚化，因为精氨酸太大，并且是阳性的而不适合该口袋。

当M-CSF以其单体形式与c-FMS结合时，它阻止两个c-FMS单体二聚化，从而抑制下游信号传导途径，随后抑制c-FMS磷酸化，包括单核巨噬细胞向破骨细胞的增殖和分化。

图13显示M-CSFM(仅含有C31S突变)和M-CSFM、M27R(含有C31S和M27R)对原代鼠细胞向破骨细胞分化的影响。阳性对照含有具有M-CSF WT和RANKL的分化培养基。阴性对照仅含有RANKL，其尽管不分化但保持细胞存活。将不同(Varying)浓度的M-CSFM和M-CSFM、M27R添加细胞中，使其生长5天。然后将细胞固定并用TRAP染色法染色分化的破骨细胞。

M-CSFM充当破骨细胞分化的诱导物，产生比阳性对照更多的破骨细胞，可能是由于其二聚化能力，而M-CSFM，M27R以剂量依赖性方式抑制破骨细胞形成，导致细胞分化少且差。

实施例10

M-CSF_C31S的结晶和有助于二聚体形成的残基的计算分析

M-CSF_C31S,M27R变体虽然是单特异性的(仅靶向c-FMS而非整联蛋白)，但在体外和基于细胞的针对破骨细胞的测定中都是高效的。该突变使蛋白质成为单体(相对于M-CSF-wt，其是二聚体)，因此在体外是一种非常有效的拮抗剂。

C31S突变阻止M-CSF在两个M-CSF单体之间形成二硫键，同时仍允许其非共价地二聚化。当M-CSF二聚化时，每个第27位的甲硫氨酸与相对单体中的疏水口袋结合。M27R突变的添加同样抑制非共价二聚化，因为精氨酸太大并且是阳性的而不适合于该口袋。当M-CSF以其单体形式与c-FMS结合时，它阻止两个c-FMS单体二聚化，从而抑制下游信号传导途径，随后抑制c-FMS磷酸化，包括单核巨噬细胞向破骨细胞的增殖和分化。

为了产生单体M-CSF变体，首先将在第31位不能形成分子间二硫键的M-CSF_C31S变体结晶。使用座滴蒸气扩散法(sitting drop vapor diffusion method)对纯化的M-CSF_C31S进行几次结晶试验，并在9天后形成晶体。用于结构确定的数据集在欧洲同步辐射装置(European Synchrotron Radiation Facility)(ESRF；Grenoble，France)的BM14光束线处收集。晶体结构通过分子置换解析(solved)到最大分辨率为(图14A，PDB ID：5LXF)，用作搜索模型PDB ID：3UF2。

令人惊讶的是，相对于野生型M-CSF(M-CSF_WT)，M-CSF_C31S仅显示出微小的三级结构差异，并且在四级二聚体结构中基本上没有差异(图14A-D)。在M-CSF野生型中C31-C31二硫键的相同位置(图14B)中在丝氨酸侧链之间观察到S31-S31氢键(图14D)。M-CSF_WT和M-CSF_C31S突变体结构是在结构的整个长度上与的RMSD重叠，并且在整个(across)链上非常相似(图14C)。突变体的二聚体界面与野生型的二聚体界面高度相似，表明M-CSF_C31S突变不足以阻止M-CSF二聚体的形成，并且需要进一步的诱变来消除二聚化。

应用基于能量的方法来鉴定关键位置作为用于诱变的候选物以扰乱二聚体界面。使用M-CSF_C31S二聚体结构作为输入，应用能量计算以鉴定对M-CSF_C31S–M-CSF_C31S二聚体界面有显著贡献的残基。使用有限差分Poisson-Boltzmann(FDPB)方法计算每个M-CSF_C31S残基的净静电和极性贡献(ΔΔG_elec)，其在二聚体界面的内。通过将复合物形成时埋藏的每个残基表面积乘以的表面张力常数，计算非极性能量贡献(ΔΔG_np)作为表面积比例项。能量上显著的残基定义为对相互作用贡献ΔΔG_elec或ΔΔG_np≥1kcal/mol的残基。

该方法鉴定了12个界面M-CSF_C31S残基，其对两个M-CSF分子之间的分子间相互作用产生显著贡献(表1，图15A，B)。这些残基位于M-CSF的两个区段中。主要区段包括D24-I33之间的大部分残基(图15A)。第二个较短的区段包括疏水残基(F67)和三个带电/极性残基——R66、R68和N73(图15B)。

表1：对整个M-CSF二聚体界面的相互作用的每个残基能量贡献

如方法中所述的计算，np＝非极性，sc＝侧链静电贡献，mc＝主链静电贡献。

与其他鉴定的残基相反，残基M27满足以下四个条件：1)对二聚体形成特别强的贡献，2)缺乏参与受体结合，3)可能影响单体稳定性的最小分子间相互作用，和4)在突变时在两个M-CSF单体之间预测引入的强空间干扰。M27残基深入延伸到相对的M-CSF_C31S单体中(图15C)。结果，由于每个M27，大约的表面积被比任何其他M-CSF_C31S残基更多地埋藏在相对的单体内。将该残基突变为精氨酸，目的是将空间位阻和正电荷引入疏水环境中。

实施例11

M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R的二聚化分析

为了验证结构和计算分析并验证M-CSF_C31S,M27R确实是单体，进行了几种生物物理测定。首先，使用不同量的BS³试剂[双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]通过赖氨酸残基交联纯化的鼠和人M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R，并使用SDS-PAGE评估蛋白质大小(图16A)。鼠M-CSF_WT充当阳性对照，因为其在二聚化位点(K68)中具有赖氨酸，其促进二聚体中两个单体的分子间交联。实际上，在添加交联剂时，几乎完全在具有符合二聚体大小(～40kDa)的分子量的条带中观察到鼠M-CSF_WT。相反，在相同位置中具有精氨酸的人M-CSF_WT仅产生对应于二聚体大小的模糊(faint)条带，即使在高浓度的BS³下也是如此。M-CSF_C31S给出(gave)单体和二聚体条带的混合物(～20和～40kDa)。二聚体条带在更高的BS³浓度下变得更加突出。很可能非共价二聚化允许M-CSF_C31S中的其他赖氨酸密切接近并交联。重要的是，即使在高BS³浓度下，M-CSF_C31S,M27R也不产生对应于二聚体的任何条带。这些结果与基于结构的计算重新设计一致。

接下来，在溶液中评估M-CSF变体的大小。将浓度为0.5mg/ml的M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R以90°的角度进行动态光散射(DLS)分析。比较每个样品中最丰富种的峰(图16B)，并从每个峰计算估计的流体动力学半径。对于M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R，发现流体动力学半径分别为3.73±0.19、3.56±0.24和2.94±0.10nm。由于蛋白质不是完全球状的，计算的半径不代表分子的实际大小，但它们确实能够比较蛋白质的大小。确实发现M-CSF_C31S,M27R显著小于其他两种变体，支持前者是单体的假设。为了证实M-CSF_C31S,M27R的寡聚状态不是浓度依赖性的，对所有M-CSF变体进行浓度为3、5和7mg/ml的SAXS测量。由SAXS数据确定的回转半径(R_g)示于图16C中。值得注意的是，R_g值保持在M-CSF_WT和M-CSF_C31S的相似范围内。M-CSF_C31S,M27R的R_g值在较高浓度下略有增加，可能由于颗粒间相互作用增加。仍然，最低M-CSF_C31S,M27R浓度的R_g值显著低于M-CSF_WT和M-CSF_C31S的对应值，并且接近M-CSF单体的理论R_g(图16B，虚线，)。为了说明这三种蛋白质在溶液中的寡聚状态，从SAXS数据重建了低分辨率结构(图16D)。从SAXS谱和相应的SAXS重构结构中提取的R_g值支持M-CSF_WT和M-CSF_C31S在溶液中作为二聚体存在而M-CSF_C31S,M27R是单体的前提。

实施例12

M-CSF_C31S,M27R在体外保持与c-FMS受体的结合

为了测试M-CSF_C31S,M27R是否仍然可以结合c-FMS受体的胞外结构域(残基Met1-Glu512)，M-CSF_WT和M-CSF_C31S,M27R与受体的K_D通过使用SPR光谱学测量。将不同的M-CSF蛋白质附接到芯片上，并测量与溶液中不同浓度的c-FMS的结合(图17A-B)。c-FMS和M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R之间的K_D结合常数分别为：25.1±7.50、31.6±1.11和61.5±12.7nM。观察到的对M-CSF_C31S,M27R的c-FMS亲和力降低是生物活性的指示。

实施例13

M-CSF_C31S,M27R抑制c-FMS磷酸化

为了确定M-CSF_C31S,M27R是否结合并且还拮抗c-FMS，评估了与不同M-CSF变体孵育后受体的磷酸化。首先，使用鼠骨髓来源的单核细胞(BMM)，因为由于两个配体之间的高序列同一性，之前显示鼠c-FMS结合人M-CSF。BMM在含有鼠M-CSF_WT(20ng/ml)和RANKL(20ng/ml)的分化培养基中生长48小时。然后，将细胞饥饿并暴露于鼠M-CSF_WT(0.5nM)和M-CSF_C31S或M-CSF_C31S,M27R(1μM)。裂解细胞，并使用蛋白质印迹评估c-FMS的表达和磷酸化水平。定量并归一化C-FMS磷酸化水平。与暴露于用作对照的M-CSF_WT的细胞相比，暴露于M-CSF_C31S的细胞表现出增加的磷酸化水平。该发现指示M-CSF_C31S变体仍然是受体的激动剂(图18A)。相反，发现与M-CSF_C31S,M27R一起孵育的细胞具有较低水平的磷酸化c-FMS，即，M-CSF_C31S,M27R充当受体的拮抗剂(图18A)。

用人外周血CD14⁺单核细胞进行另一个实验以确定M-CSF_C31S,M27R是否对人c-FMS具有相同的影响。CD14⁺细胞在含有人M-CSF_WT和鼠RANKL的分化培养基中生长72小时，并且在饥饿后暴露于人M-CSF_WT(0.5nM)与CSF_C31S,M27R或M-CSF_C31S的组合(100nM)。再次，M-CSF_C31S,M27R的存在导致c-FMS的磷酸化降低(图18B)，而M-CSF_C31S充当激动剂，诱导磷酸化(图18B)。不同M-CSF变体对c-FMS磷酸化的影响可能由于它们的二聚化趋势导致。虽然M-CSF_C31S是二聚体并且允许c-FMS二聚化和磷酸化，但是单体M-CSF_C31S,M27R可能不会促进c-FMS二聚化，因此其随后的磷酸化降低。

实施例14

M-CSF_C31S,M27R损害单核细胞向破骨细胞的分化

鉴于上述磷酸化的降低，假设M-CSF_C31S,M27R与分化的单核细胞的孵育将导致破骨细胞的形成减少。为了测试该前提，在BMM为50和1000和5000nM的浓度和CD14⁺细胞为50、250、1000nM的浓度下，将BMM或CD14⁺细胞分别与鼠或人M-CSF_WT(20ng/ml)、和鼠RANKL(20ng/ml)连同M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R一起孵育。允许细胞分化96小时或直至它们达到完全分化。在与M-CSF_C31S一起孵育的BMM中，破骨细胞迅速形成，因此它们仅分化72小时。然后，用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒染色细胞(图19A，B)。观察到破骨细胞形成在M-CSF_C31S存在下，在两种较低浓度下高度加速，而在M-CSF_C31S,M27R存在下以剂量依赖性方式被显著抑制。将每个样品的破骨细胞数和细胞核数定量——暴露于CSF_C31S,M27R导致两个参数均以剂量依赖性方式降低，而M-CSF_C31S对于50和1000nM浓度产生相反的结果(图19A，B)。令人惊讶的是，浓度为5000nM的M-CSF_C31S显示破骨细胞和细胞核数均减少，表明其激动活性仅在一定浓度范围内发生。对于M-CSF_WT也观察到这种对分化行为的抑制。这些结果与磷酸化测定一致，即，M-CSF_C31S,M27R与c-FMS的结合阻止了c-FMS二聚化和磷酸化，这转而又阻止了单核细胞分化为破骨细胞。

为了检查M-CSF_C31S是否以与人M-CSF_WT相同的方式激动c-FMS，在存在50、1000和5000nM人M-CSF_WT而不存在鼠M-CSF_WT的情况下进行另一种BMM分化测定。在该浓度范围内，人M-CSF_WT以剂量依赖性方式抑制破骨细胞及其细胞核的数量。有趣的是，在所有测试浓度中，人M-CSF_WT比M-CSF_C31S在抑制细胞分化方面更有活性，这表明后者是更好的c-FMS激动剂。

实施例15

M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R显示不同的c-FMS激活/抑制效力

为了阐明每种M-CSF变体的潜在机制和剂量反应性质，使用不同浓度的M-CSF蛋白质进行磷酸化测定。将M-CSF_WT、M-CSF_C31S和M-CSF_C31S,M27R与BMM一起在不含鼠M-CSF的情况下孵育1分钟。选择M-CSF_WT和M-CSF_C31S的浓度(分别为0.5-10nM和0.5-5000nM)以允许钟形曲线激活，如分化测定所见。正如预期，M-CSF_WT的钟形曲线出现的浓度低于分别在5nM和10nM达到峰值的M-CSF_C31S。有趣的是，在峰浓度下，与M-CSF_WT相比，M-CSF_C31S导致10倍增加的磷酸化，与阳性对照相比40倍增加的磷酸化。相反，M-CSF_C31S,M27R在除5μM以外的任何浓度下显示非常有限的c-FMS磷酸化。在该浓度下，M-CSF_C31S,M27R可能开始二聚化，从而允许c-FMS激活(图20A)。

为了揭晓每种M-CSF变体的激动/拮抗特性，我们已经使用广的浓度范围的这些蛋白质进行了磷酸化实验。选择我们使用的浓度范围以允许形成M-CSF/c-FMS激活和抑制的典型钟形曲线。如预期的，M-CSF_WT和M-CSF_C31S在不同蛋白质浓度下显示出相似的曲线，其中在较低浓度下M-CSF_WT磷酸化c-FMS。出乎意料的是，M-CSF_C31S促使磷酸化水平比M-CSF_WT高得多，在10nM时磷酸化的c-FMS具有10倍增加。M-CSF_C31S,M27R在低于5μM的浓度下没有表现出磷酸化能力(图20A，B)。

考虑到这一点，假设引起该c-FMS激活曲线的机制基于M-CSF配体二聚化趋势和配体占据的c-FMS分子的组合。因此，这些不同变体的c-FMS激活模型(图20C)被提议。例如，假定在M-CSF_WT在浓度高于5nM的情况下，许多c-FMS分子与共价二聚体配体结合，阻止两个c-FMS受体紧密接近(coming in close proximity)，从而消除受体的二聚化和磷酸化。另一方面，在CSF_C31S处于相同浓度的情况下，c-FMS分子与单体M-CSF_C31S结合，从而增加局部浓度和对M-CSF二聚化和c-FMS磷酸化的驱动力。在高M-CSF_C31S浓度存在下，其变成非共价二聚体，因此导致与高M-CSF_WT浓度相同的效果。

本研究可以更好地理解M-CSF-M-CSF相互作用及其对M-CSF/c-FMS功能的影响。这些见解的应用导致了M-CSF突变体的合理改造，该突变体表现出进一步开发为治疗剂的希望。因此，我们可以具有我们所支配的用于研究与M-CSF/c-FMS配体/受体相互作用相关的分子机制和细胞信号传导途径，或许更重要的是，同样类似的生物过程的新工具。

实施例16

评估M-CSF5.6变体对骨吸收的影响

为了评估M-CSF变体对骨吸收的影响，将10周龄的C57Rcc小鼠切除卵巢，导致***分泌减少，类似于骨质疏松症中发生的。手术后两周，用M-CSF5.6变体以三种浓度(0.1mg/kg、0.5mg/kg和15mg/kg)处理小鼠，以测试对骨吸收的影响并找到最佳剂量。在4天的时间内，0.1和0.5mg/kg M-CSF5.6处理的小鼠每天两次接受皮下注射，而15mg/kg M-CSF5.6处理的小鼠每天接受皮下注射。最后一次注射后18-24小时处死小鼠。使用CTX-1(羧基末端胶原交联)ELISA测量血液中I型胶原片段的量。

结果显示在下表2和图21中。

表2.M-CSF5.6处理的卵巢切除的小鼠的CTX-1血清浓度。

将动物随机分成2个对照组(假手术(SHAM)、PBS)和4个处理组(0.1、0.5和15mg/kgM-CSF5.6以及0.1mg/kg阿仑膦酸盐作为阳性对照)。除假手术组外，所有动物均切除卵巢。*、^、+分别代表溶血-血清样品、不成功的卵巢切除术(如尸体检验确定的)和异常值。从分析中排除卵巢切除不成功的小鼠的CTX-I血清浓度值。

结果支持M-CSF 5.6能够在体内减少CTX-I的观点。与PBS处理的动物相比，用15mg/kg M-CSF 5.6处理的小鼠显示出～2倍的CTX-I水平降低(图22A)。在溶血样品中效果更为突出(图15B)。由于卵巢切除术没有引起CTX-I水平的显著改变(图22A，B)预期在真正的病理状态下，M-CSF 5.6的作用将更加突出和显著。

重要的是，与PBS处理的动物相比，独立于样品的溶血状态，观察到接受0.1mg/kg阿仑膦酸盐的动物的CTX-I水平显著降低(图22A，B)。由于已知阿仑膦酸盐处理可降低CTX-I水平，因此预期该结果。另外，当溶血样品包括在分析中时(图22A)，有清楚的剂量反应效果，其显示较低剂量的M-CSF 5.6(0.1和0.5mg/kg)无效。考虑到CTX-I水平不受卵巢切除手术的影响(图22A，B)。

实施例17

M-CSF_RGD抑制成熟破骨细胞中肌动蛋白质环的形成

对于成熟的破骨细胞适当地再吸收骨，必须形成称为“密封区”的独特结构；这种结构由肌动蛋白质环组成，肌动蛋白质环由通过称为胞足体的粘附复合物连接的致密肌动蛋白质网制成。肌动蛋白质环的形成涉及几个阶段：开始时，胞足体以分散的方式在整个细胞中形成，然后胞足体组形成称为带的小肌动蛋白质结构，并且在破骨细胞成熟时，带移动到细胞周边，群集，并形成肌动蛋白质环。胞足体含有高水平的α_vβ₃整联蛋白，这对于形成具有致密胞足体网络的适当肌动蛋白质环是必需的。为了测试双特异性M-CSF_RGD变体对α_vβ₃整联蛋白的抑制是否影响肌动蛋白质环的形成，允许小鼠BMM分化成成熟的破骨细胞，以至于(to the point that)形成多核细胞并表现出肌动蛋白质环结构。此时，添加抑制剂，将细胞额外孵育24小时，然后固定并染色。在不用任何抑制剂(即阳性对照)的情况下，仅用M-CSF和RANKL孵育的细胞形成致密的连续肌动蛋白质环结构。单特异性M-CSF_C-FMS的添加没有大幅抑制肌动蛋白质环形成，并且观察到呈现致密连续肌动蛋白质环的破骨细胞；尽管如此，与阳性对照相比，呈现未成熟环的分散的胞足体更丰富。添加环状RGD肽，得到确认的(well-established)α_vβ₃整联蛋白抑制剂，或单特异性M-CSF_αvβ3降低了胞足体的浓度和密度，并且肌动蛋白质环看起来不那么明显(pronounced)，更宽并可扩散有高分布的分散的胞足体。对α_vβ₃整联蛋白表现出最低亲和力的双特异性M-CSF_RGD变体5.6显示出与cRGD和M-CSF_αvβ3相同的表型。引人注目的是，当添加双特异性M-CSF_RGD变体4.22和4.24时，破骨细胞不形成任何肌动蛋白质环或甚至分散的胞足体，而肌动蛋白质形成可扩散的结构，其在整个细胞表面周围随机扩散(图23)。

尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。

序列表

<110> 国家生物技术研究所公司

<110> 本-古里安大学B.G.内盖夫技术和应用公司

<120> 用于治疗骨相关疾病的组合物和方法

<130> NIBN-P-016

<150> IL247369

<151> 2016-08-18

<160> 19

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工的（Aritficial）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> X是除了半胱氨酸之外的任何氨基酸

<400> 1

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1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Xaa Gln

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<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工的

<400> 2

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1 5 10 15

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Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

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<212> PRT

<213> 人工的（Aritficial）

<400> 4

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1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu

1 5 10 15

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<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

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1

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(3)

<223> X是任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(9)

<223> X是任何氨基酸

<400> 7

Xaa Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Gln Thr Ser Arg Gly Asp Ser Pro Ser

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成肽

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<210> 11

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> X是Arg、His或Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> X是除了半胱氨酸之外的任何氨基酸

<400> 11

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

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<210> 12

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

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<210> 13

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Pro Arg Gly Asp Met Cys

20 25 30

Ser Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val

35 40 45

Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp

50 55 60

Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln

65 70 75 80

Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr

85 90 95

Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe

130 135 140

Ala Glu Cys Ser Ser

145

<210> 14

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Ser Gln

20 25 30

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

35 40 45

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Glu

50 55 60

Pro Val Arg Gly Asp Asn Ile Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln

65 70 75 80

Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr

85 90 95

Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe

130 135 140

Ala Glu Cys Ser Ser

145

<210> 15

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Arg Glu Thr Ser Ser Gln

20 25 30

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

35 40 45

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr

50 55 60

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Glu Pro Val Arg Gly Asp Asn Ile Asn

65 70 75 80

Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu

85 90 95

Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val

100 105 110

Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn

115 120 125

Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe

130 135 140

Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala Glu Cys Ser Ser

145 150 155

<210> 16

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (25)..(25)

<223> X是Gln或Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (26)..(26)

<223> X是Thr或Tyr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (27)..(27)

<223> X是Ser或Pro

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (31)..(31)

<223> X是Seq或Met

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (32)..(32)

<223> X是Pro或Cys

<400> 16

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Xaa Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Xaa

20 25 30

Ser Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val

35 40 45

Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp

50 55 60

Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln

65 70 75 80

Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr

85 90 95

Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe

130 135 140

Ala Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys

145 150 155 160

Leu Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro

165 170 175

His Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp

180 185 190

Glu Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln

195 200 205

Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg

210 215 220

Ser Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp

225 230 235 240

Ser Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe

245 250 255

Asn Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp

260 265 270

Val Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln

275 280 285

Gly Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr

290 295 300

Glu Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu

325 330 335

Pro Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr

340 345 350

Pro Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu

355 360 365

Pro Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn

370 375 380

Pro Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser

385 390 395 400

Gly Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg

405 410 415

Asp Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly

420 425 430

Ala Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr

435 440 445

Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser

450 455

<210> 17

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Ser Gln

20 25 30

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

35 40 45

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Glu

50 55 60

Pro Val Arg Gly Asp Asn Ile Asn Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln

65 70 75 80

Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr

85 90 95

Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe

130 135 140

Ala Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys

145 150 155 160

Leu Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro

165 170 175

His Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp

180 185 190

Glu Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln

195 200 205

Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg

210 215 220

Ser Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp

225 230 235 240

Ser Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe

245 250 255

Asn Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp

260 265 270

Val Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln

275 280 285

Gly Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr

290 295 300

Glu Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro

305 310 315 320

Ala Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu

325 330 335

Pro Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr

340 345 350

Pro Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu

355 360 365

Pro Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn

370 375 380

Pro Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser

385 390 395 400

Gly Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg

405 410 415

Asp Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly

420 425 430

Ala Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr

435 440 445

Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser

450 455

<210> 18

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln

20 25 30

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

35 40 45

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr

50 55 60

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu

65 70 75 80

Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu

85 90 95

Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln

100 105 110

Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu

115 120 125

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala

130 135 140

Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser

145 150 155

<210> 19

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(27)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(33)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 19

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

1 5 10 15

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Xaa Xaa Xaa Arg Gly Asp Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val

35 40 45

Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp

50 55 60

Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln

65 70 75 80

Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr

85 90 95

Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu

100 105 110

Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu

115 120 125

Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe

130 135 140

Ala Glu Cys Ser Ser Gln Gly His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser

145 150 155

Claims (27)

1.包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的氨基酸序列的多肽，所述多肽包含选自以下的至少一个突变：SEQ ID NO：1的第27位的甲硫氨酸残基的突变、或用RGD基序替代SEQID NO：1的氨基酸25-32或氨基酸64-71，所述RGD基序包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO：1的第27位的甲硫氨酸残基的所述突变是替代为选自Arg、His和Lys的氨基酸。

3.权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO：1的第27位的甲硫氨酸残基的所述突变是替代为Arg。

4.权利要求1所述的多肽，其中所述RGD基序包含至少9个氨基酸残基。

5.权利要求4所述的多肽，其中所述RGD基序包含SEQ ID NO：7(XXXRGDXXX)所示的氨基酸序列，其中X独立地是任何氨基酸。

6.权利要求5所述的多肽，其中所述RGD基序选自：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)、SEQ IDNO：9(TYPRGDMCS)和SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)。

7.权利要求3所述的多肽，其包括用所述RGD基序替代SEQ ID NO：1的氨基酸25-32。

8.权利要求7所述的多肽，其中所述RGD基序选自：SEQ ID NO：8(QTSRGDSPS)和SEQ IDNO：9(TYPRGDMCS)。

9.权利要求3所述的多肽，其包括用所述RGD基序替代SEQ ID NO：1的氨基酸64-71。

10.权利要求9所述的多肽，其中所述RGD基序包含SEQ ID NO：10(EPVRGDNIN)所示的氨基酸序列。

11.权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述多肽不能形成同型二聚体。

12.权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。

13.权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含与式I所示氨基酸序列具有至少97％同源性的氨基酸序列：(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)，其中b是选自0和1的整数，并且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，并且X₅是P或C，其中所述多肽不能形成同型二聚体，并且其中所述突变体结合c-FMS和α_vβ₃整联蛋白。

14.权利要求13所述的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。

15.包含如式I中所示氨基酸序列的多肽：(EEVSEYCSHMIGSGHLQSLQRLID(SQMETSSQ)_b(X₁X₂X₃RGDX₄X₅S)_(1-b)ITFEFVDQEQLKDPVCYLKKAFLLVQDIMED(TMRFRDNT)_(1-b)(EPVRGDNIN)_bPNAIAIVQLQELSLRLKSCFTKDYEEHDKACVRTFYETPLQLLEKVKNVFNETKNLLDKDWNIFSKNCNNSFAECSS)，其中b是选自0和1的整数，并且其中：X₁是Q或T，X₂是T或Y，X₃是S或P，X₄是S或M，并且X₅是P或C。

16.权利要求1-15中任一项所述的多肽，其包含选自SEQ ID NO：11-17的氨基酸序列。

17.分离的核酸分子，其编码权利要求13-16中任一项所述的多肽。

18.表达载体，其包含权利要求17所述的核酸。

19.用权利要求18所述的表达载体转化或转染的细胞。

20.药物组合物，包含权利要求1-16中任一项的多肽和药学上可接受的载体。

21.权利要求20所述的药物组合物，其用于抑制或降低破骨细胞活性。

22.药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-16中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体，用于治疗或预防对其有需要的受试者中与不受调控的破骨细胞活性相关的疾病。

23.包含有效量的权利要求1-16中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗对其有需要的受试者中与不受调控的破骨细胞活性相关的疾病的药物中的用途。

24.权利要求22或23所述的药物组合物，其中所述疾病与骨吸收增加相关。

25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述疾病是骨质疏松症。

26.用于治疗与对其有需要的受试者中的不受调控的破骨细胞活性或骨吸收增加相关的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含权利要求1-16中任一项所述的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物的步骤，从而治疗对其有需要的受试者中与骨吸收增加相关的疾病。

27.权利要求26所述的方法，其中所述与骨吸收增加相关的疾病是骨质疏松症。