CN109836502B

CN109836502B - 一种双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN109836502B
Application number: CN201811339728.1A
Authority: CN
Inventors: 刘文慧; 赵文彬; 陈枢青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2018-11-12
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2038-11-12
Also published as: CN109836502A

Abstract

本发明公开了一种双特异性抗体，通过将两种抗体的Fab结构域分别偶联第一连接臂和第二连接臂后，再通过两个连接臂之间的叠氮基接头与炔基接头发生叠氮‑炔基环加成反应，从而两种抗体的Fab偶联获得双特异性抗体。本发明双特异性抗体的制备方法较传统的双特异性抗体的制备方法有着表达水平高，偶联效率高，组装正确率高的优点，该形式的双特异性抗体具有更高的亲和性和特异性，在体内外均能有效激活淋巴细胞并产生对CD20阳性的肿瘤细胞的特异性杀伤，而且由于缺乏抗体的Fc段，不仅更易于穿透实体瘤，而且能够避免Fc造成的非特异性杀伤的毒副作用具有更高的特异性。

Description

一种双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种双特异性抗体及其应用。

背景技术

癌症是21世纪人类健康面临的最大挑战之一。抗体药物在癌症的治疗中发挥着重要作用，随着临床数据的不断反馈，人们发现传统的单抗药物由于单一的表位容易造成耐药或者由于抗体药效不佳容易造成复发等限制了单抗药物在临床的应用上。双特异性抗体可以同时识别和结合两种不同的抗原表位，根据发挥作用的途径一般可分为两种，一种是通过协同作用同时阻断两种不同的信号通路而发挥作用，另一种是通过激活效应细胞(T细胞，NK细胞等)来发挥药效。首先针对多表位的双特异性抗体可以解决单抗单一表位造成的耐药；此外近些年来免疫治疗在肿瘤治疗中获得了巨大的成功，有研究者提出利用人体自身的免疫***是是***最为有效方式，效应细胞依赖的双特异性抗体可以利用人体自身的免疫细胞高效的杀伤肿瘤细胞。因此双特异性抗体以其独特的优势，在肿瘤的治疗中占据着举足轻重的地位。

目前研究最为广泛的为T细胞依赖的双特异性抗体，该抗体一条臂可以结合肿瘤相关抗原，同时另一条臂可以和效应T细胞表面的CD3分子结合，形成免疫突触从而激活T细胞，激活的T细胞可以释放穿孔素和颗粒酶通过裂解或者凋亡作用杀伤肿瘤细胞。

双特异性抗体早期主要的制备方法包括双杂交瘤细胞法和化学偶联方法。双杂交瘤细胞法产生的双特异性抗体一般为鼠源性抗体，具有较强的免疫原性，在临床上应用有限。化学偶联方法反应条件不佳且容易对抗体活性产生影响，因此应用范围不广。随着基因工程技术的发展，越来越多的研究者尝试用基因工程的方法制备双特异性抗体，例如目前应用最为广泛的基因泰克开发的knob into hole技术以及在其基础上罗氏开发的Crossmab技术，虽然这些方法显著的改善了早期方法的缺陷，但是两组抗体之间仍然存在着一定的错配概率以及抗体的表达水平较低的缺陷。

传统的双特异性抗体形式为IgG型，具有较大的分子结构，难以透过血管内皮质及细胞间隙从而到达实体瘤深部的肿瘤细胞，因此在实体瘤的治疗效果不如血液瘤。因此研究者尝试利用基因工程技术表达小型化的双特异性抗体，其中应用最为广泛的BiTE(双特异性T细胞衔接器)，安进公司的blinatumomab(CD19×CD3)是FDA第一个批准上市用于费城染色体阴性的复发性难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病(Gerhard Zugmaier,Molecular Immunology,Clinical overview of anti-CD19

and ex vivo datafrom anti-CD33

as examples for retargeting T cells in hematologicmalignancies,2015,(67)58-66)。BiTE主要由两条单链抗体(scFv)组成，分子量约50kDa，较传统的IgG型双特异性抗体有着易于穿透肿瘤组织的优点，但是由于较小的分子量和缺乏Fc段造成抗体的半衰期很短(约2h)，在临床使用时需要配置连续输液装置。因此临床上急需具有适宜药动学性质的小型化的双特异性抗体，目前研究比较多的抗体形式包括2F(ab’)，taFv-Fc，(scFv)₂-HSA等。

目前处于临床或者临床前研究的CD20×CD3双特异性抗多数是以利妥昔为靶抗体的IgG型，如由Trion pharma公司开发的处于临床Ⅱ期的FBTA-05，Genentech公司开发的处于临床Ⅰ期的CD20-TDB等。此外Lu等人尝试将IgG-CD20通过一段柔性连接结构与scFv-CD3抗体进行融合表达(Chia-Yen Lu,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications,Tetravalent anti-CD20/CD3bispecific antibody for the treatmentof B cell lymphoma,2016,(473)808-813)，制备得到的抗体分子量约200kDa。目前尚无以Ofatumumab抗体作为靶向CD20的双特异性抗体的研究，而且目前没有关于小型化的CD20×CD3双特异性抗体形式被报道，所以一种有适宜药动学性质的小型化的CD20×CD3双特异性抗体有待开发。此外对于T细胞依赖的双特异性抗体，肿瘤细胞激活T细胞后产生的较强的免疫级联反应，脱靶效应是造成其毒性的关键因素。2F(ab’)形式的双特异性抗由于缺乏Fc段，不仅避免了Fc片段与体内表达FcRn细胞相互作用带来的毒副反应，也可避免由于Fc段引起的全身性的免疫副作用，进一步保证了抗体的特异性。此2F(ab’)形式的双特异性抗体保留了BiTE形式易于穿透肿瘤的性质，且有着较好的药动学性质，是双特异性抗体表达形式的首选。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种以CD20为靶抗原，以T细胞为效应细胞的基于抗体的抗原结合片段为基础的Bi-2F(ab’)形式的双特异性抗体的制备方法和应用。

一种双特异性抗体，制备方法包括以下步骤：

(1)分别提供抗CD20和抗CD3的单克隆抗体的Fab结构域，且两者Fab结构域的C端带有LPXTG序列，分别命名为Fab-CD20和Fab-CD3，

(2)分别提供第一连接臂和第二连接臂，所述第一连接臂的两端分别具有寡甘氨酸接头和炔基接头，所述第二连接臂的两端分别具有寡甘氨酸接头和叠氮基接头，

(3)在Sortase A酶催化下，LPXTG序列与寡甘氨酸接头发生转肽反应，使Fab-CD20连接第一连接臂、Fab-CD3连接第二连接臂，或者Fab-CD20连接第二连接臂、Fab-CD3连接第一连接臂，

(4)所述叠氮基接头与炔基接头发生环加成反应，使第一连接臂与第二连接臂相连，从而将Fab-CD20和Fab-CD3相连，获得所述双特异性抗体。

寡甘氨酸接头一般为1～5个甘氨酸残基，寡甘氨酸残基与LPXTG序列在Sortase A酶催化下偶联。两种抗体的Fab结构域分别偶联第一连接臂和第二连接臂后，再通过两个连接臂之间的叠氮基接头与炔基接头发生叠氮-炔基环加成反应(strain-promoted alkyne-azide cycloadditions，SPAAC)，从而两种抗体的Fab偶联获得双特异性抗体。SPAAC反应属于点击化学(click chemistry)中最经典的反应。该反应在水溶液中就可以进行，且操作简单，不需要外源的催化剂，反应条件温和，反应速率快。最突出的优点就是反应收率高，节省成本投入，同时在生产过程中减少了易产生危险的有毒废物，为实现工业上大规模的生产创造了可能。

优选的，两者Fab结构域仅在重链C端带有LPXTG序列。

所述Fab-CD20的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

所述Fab-CD3的重链氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。

所述LPXTG序列为LPETG，Fab-CD20及Fab-CD3与LPXTG序列之间具有柔性接头，所述柔性接头由若干甘氨酸残基和/或丝氨酸残基组成。

优选的，所述柔性接头为GGGGS、(GGGGS)₂或(GGGGS)₃。

步骤(1)提供的Fab-CD20和Fab-CD3的LPXTG序列末端还连接有用于蛋白纯化的组氨酸标签。组氨酸标签用于对表达得到的抗体进行纯化，且该组氨酸标签在第一步与连接臂偶联时会被去除，不影响后续双特异性抗体的结构。

所述第一连接臂为GGG-(PEG)_m-DBCO，第二连接臂为GGG-(PEG)_n-N₃，其中m≤4，n≤4。PEG为聚乙二醇，DBCO为二苯基环辛炔接头。

本发明还提供了所述的双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，肿瘤类型为CD20阳性的B淋巴瘤。

本发明双特异性抗体的制备方法较传统的双特异性抗体的制备方法有着表达水平高，偶联效率高，组装正确率高的优点，该形式的双特异性抗体具有更高的亲和性和特异性，在体内外均能有效激活淋巴细胞并产生对CD20阳性的肿瘤细胞的特异性杀伤，而且由于缺乏抗体的Fc段，不仅更易于穿透实体瘤，而且能够避免Fc造成的非特异性杀伤的毒副作用具有更高的特异性。

附图说明

图1为连接臂小分子GGG-(PEG)₃-N₃和GGG-(PEG)₄-DBCO的化学结构式示意图。

图2为酶促-化学偶联制备Bi-2F(ab’)-CD20-CD3双特异性抗体的原理图。

图3为分子筛纯化点击化学反应产物Bi-2F(ab’)-CD20-CD3的结果图。

图4为SDS-PAGE分析分子筛纯化偶联产物Bi-2F(ab’)-CD20-CD3的结果图，其中，泳道1和2为还原状态结果，泳道3和4位非还原状态结果，泳道1和3为偶联产物2F(ab’)-CD20-CD3样品，泳道2和4为未偶联产物Fab-CD20-N₃和Fab-CD3-DBCO混合样品。

图5为HPLC分析偶联产物Bi-2F(ab’)-CD20-CD3结果图。

图6为Ramos细胞检测Bi-2F(ab’)-CD20-CD3亲和力检测结果图，其中图A～E加入抗体情况分别为：阴性对照、Fab-CD20 1μg/ml、Fab-CD20 5μg/ml、Bi-2F(ab’)-CD20-CD3 1μg/ml、Bi-2F(ab’)-CD20-CD3 5μg/ml。

图7为PBMC细胞检测Bi-2F(ab’)-CD20-CD3亲和力检测结果图，其中图A～E加入抗体情况分别为：阴性对照、Fab-CD3 1μg/ml、Fab-CD3 5μg/ml、Bi-2F(ab’)-CD20-CD3 1μg/ml、Bi-2F(ab’)-CD20-CD3 5μg/ml。

图8为Bi-2F(ab’)-CD20-CD3体外杀伤实验结果图。

图9为Bi-2F(ab’)-CD20-CD3和IgG-CD20-CD3特异性验证结果图。

图10为流式分析Bi-2F(ab’)-CD20-CD3对PBMC的特异性早期激活标志CD69流式图，其中，图A为阴性对照、图B为2000ng/ml的CD3抗体、图C～G分别为浓度为16、80、400、2000、10000ng/ml的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体。

图11为流式分析Bi-2F(ab’)-CD20-CD3对PBMC的特异性晚期激活标志CD25流式图，其中，图A为阴性对照、图B为2000ng/ml的CD3抗体、图C～G分别是浓度梯度依次为16、80、400、2000、10000ng/ml的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体。

图12为流式分析Bi-2F(ab’)-CD20-CD3对PBMC与CD20阴性细胞K562共孵育后T细胞增殖图。

图13为流式分析Bi-2F(ab’)-CD20-CD3对PBMC与CD20阳性细胞Ramos共孵育后T细胞增殖图，其中A～H分别是PBMC空白、PBMC-CFSE空白、0、16、80、400、2000、10000ng/ml Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体。

图14为Bi-2F(ab’)-CD20-CD3体外抗肿瘤活性实验结果图。

具体实施方式

志愿者新鲜外周血样本：与浙江大学校医院合作获得，经浙江大学药学院医学伦理委员会审批通过，编号：(2018)伦研批第(003)号。

实施例1

Fab-CD20或Fab-CD3的制备。

Fab表示抗原结合片段，包括一条重链(H)和一条轻链(L)，Fab-CD20重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，重链编码基因序列如SEQ IDNo.3所示，轻链编码基因序列如SEQ ID No.4所示。Fab-CD3重链氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，重链编码基因序列如SEQ ID No.7所示，轻链编码基因序列如SEQ ID No.8所示。在本发明中，Fab-CD20还在原OFA单抗的抗原结合片段的基础上做了改造，用于与药物进行偶联，Fab-CD3还在原OKT3单抗的抗原结合片段的基础上做了改造，用于与药物进行偶联，改造方式为在重链的CH1末端(C端)带有(GGGGS)₃-LPETGGHHHHHH的多肽序列，(GGGGS)₃为柔性连接肽，LPETG为SortaseA酶识别序列，6×His标签用于蛋白纯化。

OFA单抗和OKT3单抗的抗原结合片段的轻链和重链编码基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成，然后用PCR方法完成上述改造。然后分别连接pMH3表达载体并瞬转至人胚肾细胞(293F)中，并用His Trap HP亲和柱对抗体进行纯化，并获得Fab-CD20或Fab-CD3单抗。

实施例2

双特异性抗体Bi-2F(ab’)-CD20-CD3的制备，制备流程如图2所示。

1、Fab-CD20-N₃，Fab-CD3-DBCO偶联物的制备

(1)在10ml反应体系中，分别加入6μM Fab单抗(溶于50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)，用缓冲液(50mM tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)溶解的150μM GGG-PEG₄-DBCO/GGG-PEG₃-N₃(图1，由南京联宁生物技术有限公司合成)，50mΜsortase A，5mM的CaCl₂，于37℃水浴反应12h。

(2)用protein L(1ml，GE)柱用来纯化反应液，洗脱液洗脱得到抗体偶联物，用1MTris调pH至7.0左右，10kDa millipore超滤管超滤浓缩并用PBS缓冲液置换，-20℃保存备用。Fab-CD20与GGG-PEG₃-N₃反应获得Fab-CD20-N₃，Fab-CD3与GGG-PEG₄-DBCO反应获得Fab-CD3-DBCO。

2、Fab-CD20-N₃，Fab-CD3-DBCO点击化学偶联反应及纯化

(1)在1ml的反应体系中(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)，Fab-CD20-N₃和Fab-CD3-DBCO按照摩尔比1∶1在4℃震荡反应过夜。

(2)用分子筛(Superdex 200Increase 10/300GL，GE)柱来纯化反应液，收集流出的第一个峰的的流出液如图3所示，为两者偶联后的产物，命名为Bi-2F(ab’)-CD20-CD3，第二个峰为未偶联的Fab-CD20-N₃和Fab-CD3-DBCO(两者分子量接近)，根据投料量(3mg Fab-CD20-N₃和3mg Fab-CD20-N₃)和回收到蛋白量(～2.7mg)可以计算得到回收率约为45％。由于蛋白分子之间空间位阻较大，使得偶联效率未能到达100％。目的产物用30kDamillipore超滤管超滤浓缩并用PBS缓冲液置换，-20℃保存备用。

(3)SDS-PAGE分析纯化产物如图4所示，在还原条件下有一条约50kDa的条带(两条重链点击化学连在一起)和一条25kDa的轻链的条带(两条轻链大小相近难以分开)；在非还原条件下有一条约100kDa的条带与理论值相符。

(4)HPLC分析纯化产物的纯度(非还原条件下)，如图5所示，蛋白纯度可以达到95％左右。

实施例3

流式亲和力测定。

(1)收集1×10⁶个Ramos细胞分别Fab-CD20、Bi-2F(ab’)-CD20-CD3(1μg/ml和5μg/ml)在4℃共孵育30min；同样的收集1×10⁶个PBMC分别和Fab-CD3和Bi-2F(ab’)-CD20-CD3(1μg/ml和5μg/ml)在4℃共孵育30min；

(2)PBS洗涤三次后，每管加入抗人的鼠单抗Fab(1∶1500稀释)200μl，并于4℃孵育30min；

(3)PBS洗涤三次后，每管加入FITC标记的山羊抗鼠的IgG(H+L)(1∶250稀释)200μl，4℃孵育30min后，PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测。

(4)流式细胞仪检测抗体与CD20阳性/CD3阳性的细胞的亲和力主要通过二抗标记后的FITC的平均荧光强度来表示。

(5)如图6和7所示酶促-化学偶联产物Bi-2F(ab’)-CD20-CD3的亲和力明显高于单独的Fab-CD20和Fab-CD3，说明二价的2F(ab’)双特异性抗体亲和力和稳定性高于单价的Fab抗体。

实施例4

体外活性测定

(1)收集CD20阳性的Ramos，Daudi，Raji细胞和CD20阴性的K562细胞，计数后用RPMI-1640(10％FBS)培养基重悬成细胞密度为1×10⁶细胞悬液，分别以100μl/孔铺于12孔板中；

(2)抽取志愿者新鲜外周血，用人淋巴细胞分离液分离出其中的淋巴细胞PBMC后，PBS缓冲液洗两遍并计数后，用PBS重悬成1×10⁷细胞悬液，并加入适量的CFSE至5μM的终浓度。在37℃避光水浴15min后，PBS洗两遍并计数后用RPMI-1640(10％FBS)培养基重悬成细胞密度为1.25×10⁶细胞悬液，分别以400μl/孔铺于(1)中的12孔板中；

(3)加入不同浓度(10000、2000、400、200、80、16、8ng/ml)的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体，共孵育48h，收集细胞用PBS洗涤后，用100μl含有5μl Annexin V、5μl PI重悬，室温孵育15min，补加400μl的结合液，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比；

(4)从图8中的结果可以看出，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体对CD20阴性的K562细胞没有明显的杀伤作用，而对CD20阳性的肿瘤细胞Ramos、Daudi和Raji有浓度梯度依赖的特异性杀伤作用，且在8ng/ml的浓度就可以对细胞产生杀伤，体外杀伤肿瘤效果非常显著。

实施例5

体外特异性验证实验

(1)选择表达FcRn受体的K562细胞作为研究对象，收集细胞后计数，用RPMI-1640(10％FBS)培养基重悬成细胞密度为1×10⁶细胞悬液，分别以100μl/孔铺于12孔板中；

(3)分别加入不同浓度(10000、100、10ng/ml)的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体和对照抗体IgG型的IgG-CD20-CD3(由申请人根据knob into hole和crossmab技术构建得到的IgG形式的抗体，该抗体的一条臂为抗CD20抗体，另一条臂为抗CD3抗体)，共孵育48h，收集细胞用PBS洗涤后，用100μl含有5μl Annexin V、5μl PI重悬，室温孵育15min，补加400μl的结合液，流式细胞仪检测细胞凋亡百分比；

(4)结果如图9所示，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体在三个浓度下对表达FcRn的K562没有明显的杀伤作用，而IgG-CD20-CD3在1000ng/ml的浓度下对表达FcRn的K562有着明显的杀伤作用，说明缺乏Fc段的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体特异性更好。

实施例6

PBMC特异性激活检测

(1)收集CD20阳性的Ramos细胞，计数后用RPMI-1640(10％FBS)培养基重悬成细胞密度为1×10⁶细胞悬液，分别以100μl/孔铺于12孔板中；

(2)抽取志愿者新鲜外周血，用人淋巴细胞分离液分离出其中的淋巴细胞PBMC后，PBS缓冲液洗两遍并计数后，用RPMI-1640(10％FBS)培养基重悬成细胞密度为1.25×10⁶细胞悬液，分别以400μl/孔铺于(1)中的12孔板中；

(3)加入不同浓度(10000、2000、400、80、16ng/ml)的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体，选择2000ng/ml的CD3抗体作为对照组共孵育48h，收集细胞用PBS洗涤后，加入适当浓度的抗CD4-FITC，CD8-FITC，CD69-PE，CD25-APC抗体(抗体购自美国BD公司)4℃孵育30min。PBS洗涤两遍重悬后进行流式检测。

(4)结果如图10和11所示，CD25和CD69是T细胞激活的表面标志，单独的Fab-CD3抗体在2000ng/ml的浓度下对T(CD4⁺CD8⁺)细胞有微弱的激活作用(较低的CD4⁺CD8⁺CD69⁺或者CD4⁺CD8⁺CD25⁺阳性比例)，但是明显低于同浓度下的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体激活T细胞的能力。说明Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体能够特异性的激活T细胞，且激活比例与给药浓度呈正相关。

实施例7

PBMC特异性增殖检测

(3)加入不同浓度(10000、2000、400、200、80、16、8ng/ml)的Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体，共孵育48h，收集细胞用PBS洗涤并重悬后，流式细胞仪检细胞增殖；

(4)结果如图12和13所示，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3抗体与CD20阴性细胞系K562的共孵育时不能引起PBMC的增殖，但是CD20阳性的Ramos细胞共孵育可以特异性的引起PBMC的增殖，且增殖的比例与给药浓度成正比。

实施例8

体内抗肿瘤活性实验

(1)抽取志愿者新鲜外周血，用人淋巴细胞分离液分离出其中的淋巴细胞PBMC后，PBS缓冲液洗两遍并计数后，用PBS重悬成2×10⁸细胞悬液；

(2)体外培养CD20阳性细胞Ramos，离心收集，并用PBS洗涤两次，计数后用一定体积的PBS重悬配置成5×10⁷cell/ml的细胞悬液；

(3)效应细胞PBMC悬液与靶细胞Ramos悬液按照1∶1(v/v)的比例混合(Effect：Target 4∶1)，接种于SCID Beige小鼠的右侧腋下。并将小鼠随机分为四组：saline对照组，CD3抗体对照组(3mg/kg)，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3低剂量组(1mg/kg)，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3高剂量组(3mg/kg)。接瘤24h后，开始给药每隔两天给药一次，共给药五次。

(4)结果如图14所示，Saline对照组和和CD3抗体对照组中小鼠的肿瘤在逐渐长大，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3高剂量给药组(3mg/kg)肿瘤全部消失，Bi-2F(ab’)-CD20-CD3低剂量给药组(1mg/kg)中有三只肿瘤全部消失，只有一只在缓慢生长。实验结果说明Bi-2F(ab’)-CD20-CD3在低浓度的给药剂量下便能很好的抑制肿瘤的生长，具有较强的抗肿瘤活性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种双特异性抗体及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His

245 250 255

His

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaact attagttgga atagtggttc cataggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatata 300

cagtacggca actactacta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca ggcggtggag gctctggagg cgggggttcc 720

ggtggcggag gttcactgcc ggagactggt ggtcatcacc accatcacca ttaa 774

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cttcggccaa 300

gggacacgac tggagattaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 5

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Leu Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His

245 250

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180

aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300

gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac aggcggtgga ggctctggag gcgggggttc cggtggcgga 720

ggttcactgc cggagactgg tggtcatcac caccatcacc attaa 765

<210> 8

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcac 180

ttcaggggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcggcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt cggctcgggg 300

acaaagttgg aaataaaccg gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Leu Pro Glu Thr Gly

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Gly

1

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Pro Glu Thr Gly Gly His His His His His His

20 25

Claims

1.一种双特异性抗体，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

(4)所述叠氮基接头与炔基接头发生环加成反应，使第一连接臂与第二连接臂相连，从而将Fab-CD20和Fab-CD3相连，获得所述双特异性抗体，

两者Fab结构域仅在重链C端带有LPXTG序列，

所述Fab-CD20的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，

所述Fab-CD3的重链氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述LPXTG序列为LPETG，Fab-CD20及Fab-CD3与LPXTG序列之间具有柔性接头，所述柔性接头由若干甘氨酸残基和/或丝氨酸残基组成。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述柔性接头为GGGGS、(GGGGS)₂或(GGGGS)₃。

4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，步骤(1)提供的Fab-CD20和Fab-CD3的LPXTG序列末端还连接有用于蛋白纯化的组氨酸标签。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一连接臂为GGG-(PEG)_m-DBCO，第二连接臂为GGG-(PEG)_n-N₃，其中m≤4，n≤4。

6.如权利要求1～5所述的双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，肿瘤类型为CD20阳性的B淋巴瘤。