CN109828120A - 基于靶标激发金纳米粒子表面dna循环的蛋白质荧光分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法。该分析方法的检测溶液包括修饰发卡DNA1的金纳米粒子Au‑DNA1、双链DNA识别探针DNA2/DNA3、单链DNA识别探针DNA4和核酸外切酶Nt.BbvCI。DNA1上标记有荧光染料，此荧光染料的荧光被金纳米粒子猝灭。当靶标蛋白存在时，可被识别探针夹心识别，基于邻位效应，DNA4取代DNA2与DNA3杂交，释放的DNA2与Au‑DNA1杂交，激活酶切位点，引发Nt.BbvCI对DNA1的酶切，使得荧光染料远离金纳米粒子表面恢复荧光，此酶切反应可在金纳米粒子表面循环进行，从而放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。该分析方法操作简单、灵敏、普适性高，具有一定的临床应用价值。
Description
一、技术领域
本发明为一种基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法，用于对蛋白质分子的简单、灵敏检测。通过蛋白-适配体识别模式，利用夹心识别反应产生邻位效应，诱导核酸杂交、链取代、金纳米粒子表面DNA酶切循环放大，使得大量荧光染料释放，放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。
二、背景技术
细胞分泌物的表达异常与包括恶性肿瘤在内的多种疾病相关，因此具有重要的分析检测意义。常规细胞分泌物检测方法主要包括基于抗原抗体识别的免疫分析和基于蛋白-适配体识别的分析方法。免疫分析方法主要为酶联免疫法(ELISA)，该方法虽具有较高的检测灵敏度，但其存在操作复杂、耗时长、成本高等缺点。不同于蛋白抗体，适配体是一条能特异性识别目标蛋白的短链核酸序列，因其具有稳定性强、易合成和功能化、成本低廉、操作简单、循环方式多样等优点，已被广泛用于蛋白质的检测。然而目前基于蛋白-适配体识别所建立的细胞分泌物(例如PDGF-BB)的检测方法，主要依赖适配体与目标蛋白识别后其结构的改变直接产生信号进行检测。这些方法由于缺乏可靠的信号放大步骤，检测灵敏度不高。因此，迫切需要发展简单、快速、灵敏的细胞分泌物检测方法。
邻位诱导效应通过夹心识别反应使一对含有DNA的亲和探针(如抗体-DNA复合物，DNA-适配体序列)与靶标蛋白结合形成邻位复合物，使得亲和探针上的DNA产生邻位杂交，进而触发级联DNA循环反应，产生检测信号。该策略将对蛋白质的检测转化为对DNA的检测，由于DNA放大技术成熟并多样，通过与各种DNA信号放大技术偶联，可实现对蛋白质的灵敏检测。
3维DNA分子机器构建于纳米或微米颗粒表面，主要包括驱动核酸链和DNA运动轨道。其中，运动轨道由纳微米颗粒表面高密度修饰的核酸链构成。这种高密度的修饰极大的提高了核酸的局域浓度，使得杂交反应能高效率的循环进行。驱动核酸链存在时可通过DNA杂交反应在熵驱动或酶驱动模式下在运动轨道上行走，实现信号放大。现今已发展了多种3维DNA分子机器，并用于发展高灵敏的生物分析方法。
本发明结合蛋白-适配体夹心识别反应、邻位诱导效应、3维DNA分子机器放大技术，设计了一个基于靶标蛋白激发金纳米粒子表面DNA循环放大的蛋白质荧光分析方法，并用于对细胞分泌物的灵敏检测。该方法简单、灵敏、通用，在临床分析中有较大的应用前景。
三、发明内容
本发明的内容是：制备高密度修饰发卡DNA1的金纳米粒子Au-DNA1，结合邻位效应、DNA链取代反应、酶切循环放大技术，发展了一种靶标蛋白激发金纳米粒子表面DNA循环放大的蛋白质荧光分析方法，实现了靶标蛋白的简单、快速、灵敏检测。
本发明通过以下技术方案来实现：
通过Au-S键合，将荧光染料分子标记的发卡DNA1高密度修饰到金纳米粒子表面，制备Au-DNA1。将待测样品和含有Au-DNA1、DNA2/DNA3、DNA4和核酸外切酶Nt.BbvCI的检测溶液混合，通过蛋白-适配体识别方式，样品中的靶标蛋白被DNA2/DNA3和DNA4夹心识别，形成DNA2/DNA3-靶标蛋白-DNA4复合物，基于邻位效应，DNA4取代DNA2与DNA3杂交，释放的DNA2与Au-DNA1杂交，激活酶切位点，引发Nt.BbvCI对DNA1的酶切，使得标记在DNA1上的荧光染料分子远离金纳米粒子表面恢复荧光(如图1)，基于DNA2与DNA1杂交引发的酶切反应可在金纳米粒子表面循环进行，从而放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。
上述的荧光染料分子在接近金纳米粒子表面时荧光处于猝灭状态。
上述的DNA1上含有失活的酶切位点，DNA2与DNA1的杂交可激活酶切位点，并使得DNA1被Nt.BbvCI酶切。
上述的DNA3和DNA4都含有能特异性识别靶标蛋白的适配体片段和能进行邻位杂交的核酸片段，如图2所示。
本分析方法测定靶标蛋白的原理：
本发明设计的基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法，原理如图1所示：将含有靶标蛋白的样品溶液与含有Au-DNA1、识别探针DNA2/DNA3、识别探针DNA4和核酸外切酶Nt.BbvCI的检测溶液混合并于37℃下温育1个小时。在温育过程中，靶标蛋白同时与两个识别探针结合，产生夹心复合物，从而进行邻位杂交，释放DNA2与DNA1杂交并激活Nt.BbvCI的酶切位点，进而发生酶切反应，使得修饰在DNA1上的荧光染料分子脱离金纳米粒子表面，恢复荧光。由于酶切反应，DNA2被再次释放，并引发第二轮酶切，如此循环，获得放大的荧光信号。用荧光光谱仪测得反应溶液的荧光强度，将荧光信号强度对靶标蛋白浓度的对数作图，获得标准曲线，通过标准曲线求得样品溶液中靶标蛋白的浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下特点：
本发明结合蛋白-适配体识别、邻位诱导效应、3维DNA分子机器技术，设计了一种简单、灵敏、通用的蛋白质荧光分析方法，用于对细胞分泌物的检测。相比于现有的蛋白质检测方法，具有以下特点：
(1)本方法为一步分析方法，蛋白质的检测可由样品溶液直接与检测溶液混合温育实现，无需传统ELISA中的多步清洗、分离步骤，操作简单，成本低廉；
(2)基于3维DNA分子机器技术，设计金纳米粒子表面DNA循环放大策略，实现对检测信号的高效放大，提高靶标蛋白的检测灵敏度，检测限可达到亚pM级；
(3)该方法通过设计含有适配体片段的识别探针来对靶标蛋白进行识别，所以通过更换适配体的序列，该方法可应用于多种靶标蛋白的检测，具有良好的普适性。
四、附图说明
图1.基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法示意图
图2.双链DNA识别探针DNA2/DNA3和单链DNA识别探针DNA4的结构示意图
五、具体实施方式
实施例1：结合附图1，说明所发明的基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法对细胞分泌物thrombin的检测：
(1)温育过程：将20μL不同浓度的thrombin标准溶液或者样品溶液与60μL含10nMDNA2/DNA3、10nM DNA4、0.75nM Au-DNA1和0.19U/μL Nt.BbvCI的缓冲溶液混合，37℃温育1个小时；
(2)荧光分析：用荧光光谱仪检测反应后的溶液，用485nm的激光激发，采集其515nm处的荧光强度值，由此获得标准曲线并计算样品溶液中靶标蛋白的浓度。
Claims (6)
1.本发明涉及一种基于靶标激发金纳米粒子表面DNA循环的蛋白质荧光分析方法，其特征在于该分析方法以含有修饰发卡DNA1的金纳米粒子Au-DNA1、双链DNA识别探针DNA2/DNA3、单链DNA识别探针DNA4和核酸外切酶Nt.BbvCI的溶液为检测溶液，当靶标蛋白存在时，通过蛋白-适配体识别方式，被DNA2/DNA3和DNA4夹心识别，基于邻位效应，DNA4取代DNA2与DNA3杂交，释放的DNA2与Au-DNA1杂交，激活酶切位点，引发Nt.BbvCI对DNA1的酶切，使得标记在DNA1上的荧光染料远离金纳米粒子表面恢复荧光，同时，DNA2被再次释放并引发第二轮酶切，如此循环，放大荧光信号，实现对靶标蛋白的灵敏定量分析。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的DNA1上标记有荧光染料，由于DNA1的发卡结构，荧光染料接近金纳米粒子表面，荧光处于猝灭状态。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的DNA3含有两个功能片段，分别是能特异性识别靶标蛋白的适配体片段和能与DNA2杂交的核酸片段。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的DNA4含有两个功能片段，分别是能特异性识别靶标蛋白的适配体片段和能邻位取代DNA2与DNA3杂交的核酸片段。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于所述的DNA2能与DNA1杂交形成能被Nt.BbvCI酶切的DNA2/DNA1双链。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于如下检测步骤：
(1)将样品和检测溶液混合，37℃温育60分钟，用荧光光谱仪测荧光强度；
(2)利用标准曲线法，求出样品中靶标蛋白的浓度。
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