CN109825636A - 一种用于鉴定苹果新品种“赤霞”指纹图谱的ssr分子标记及其应用 - Google Patents
一种用于鉴定苹果新品种“赤霞”指纹图谱的ssr分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属植物分子遗传学和苹果种质创新技术领域，提供一种用于鉴定苹果新品种‘赤霞’指纹图谱的SSR分子标记及其应用。所述分子标记为14对SSR共显性标记，分别为：SSR标记CH01d08，SSR标记CH01f02，SSR标记CH01f07a，SSR标记CH02b10，SSR标记CH02d08，SSR标记CH02c02a，SSR标记CH05e03，SSR标记Hi03a10，SSR标记Hi04a05，SSR标记Hi23d06，SSR标记GD 12，SSR标记GD 142，SSR标记GD 147，SSR标记NH009b；对苹果新品种‘赤霞’进行快速、准确的鉴定。对新品种保护与种质资源收集提供依据。
Description
技术领域
本发明属于植物分子遗传学和苹果种质创新技术领域，具体涉及一种用于鉴定苹果新品种‘赤霞’指纹图谱的SSR分子标记及其应用，涉及苹果新品种的鉴定及其指纹图谱构建的方法。
背景技术
苹果属（Malus Mill.）种质资源丰富，品种类型多样。随着果树种质资源的创新和苹果新品种的选育，苹果品种、品系混杂，同名异种，同种异名现象日趋严重，因此保护品种的真实性、维护育种家和生产者的权益显得尤为重要。
SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记是用特异性引物进行PCR扩增的一种标记技术，具有稳定性、多态性高等特点，是鉴定苹果品种的一种理想的分子标记。利用该技术构建苹果品种的SSR指纹图谱，具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，能够反映生物个体或种群间基因组差异，是鉴别苹果品种的有效方法，可以为苹果品种保护提供更加可靠的科学依据。
苹果新品种‘赤霞’是山西省农业科学院生物技术研究中心曹秋芬研究员课题组自主培育的苹果新品种，该品种是‘千秋’和‘津轻’的杂交后代中选育而来的。该苹果品种属中熟品种，成熟期在9月上旬；果实比普通‘嘎拉’稍大；果实颜色浓红，果肉脆，有香味，采摘期可以延长至10月上旬，不落果，果实保持紧脆，延迟采摘香味和色泽更浓；耐贮藏性好，贮后不绵；果实易着色，不用套袋能全果面浓红，可作为中熟品种大量发展。
结合以PCR为基础的SSR分析技术对苹果新品种‘赤霞’进行指纹图谱技术构建，实现苹果新品种‘赤霞’的快速鉴定，同时为我国苹果种质资源收集和保护以及鉴定评价提供依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于鉴定苹果新品种‘赤霞’指纹图谱的SSR分子标记及其应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记，所述分子标记为如下所示的14对SSR标记，分别为：SSR标记CH01d08，SSR标记CH01f02，SSR标记CH01f07a，SSR标记CH02b10，SSR标记CH02d08，SSR标记CH02c02a，SSR标记CH05e03，SSR标记Hi03a10，SSR标记Hi04a05，SSR标记Hi23d06，SSR标记GD 12，SSR标记GD 142，SSR标记GD 147，SSR标记NH009b；用于扩增上述标记的引物分别为：
SSR标记CH01d08核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示；
SSR标记CH01f02核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示；
SSR标记CH01f07a核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示；
SSR标记CH02b10核苷酸序列如SEQ ID No.7、8所示；
SSR标记CH02d08核苷酸序列如SEQ ID No.9、10所示；
SSR标记CH02c02a核苷酸序列如SEQ ID No.11、12所示；
SSR标记CH05e03核苷酸序列如SEQ ID No.13、14所示；
SSR标记Hi03a10核苷酸序列如SEQ ID No.15、16所示；
SSR标记Hi04a05核苷酸序列如SEQ ID No.17、18所示；
SSR标记Hi23d06核苷酸序列如SEQ ID No.19、20所示；
SSR标记GD 12核苷酸序列如SEQ ID No.21、22所示；
SSR标记GD 142核苷酸序列如SEQ ID No.23、24所示；
SSR标记GD 147核苷酸序列如SEQ ID No.25、26所示；
SSR标记NH009b核苷酸序列如SEQ ID No.27、28所示。
利用所述的鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记构建指纹图谱，具体方法为：以苹果新品种‘赤霞’基因组DNA为PCR扩增模板，分别以所述SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外观测仪上观察电泳结果；用QIAxcelAdvanced全自动实时毛细管电泳***进行分析检测，并读取相应数据，获得指纹图谱。
PCR扩增反应体系为20 μL，其中含10 × PCR Buffer 2.0 μL、2.5 mM 的dNTPsmixture 1.6 μL、10 ng/μL 的Primers F 0.15 μL、10 ng/μL 的Primers R 0.15 μL、5U/μL 的Taq 聚合酶0.2 μL、100ng/μL 的DNA模板2.0 μL，去离子水补足至13.9 μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性2 min 30 s，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40s，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存备用。
琼脂糖凝胶电泳缓冲液为1×TBE缓冲液，恒定电压150 V条件下电泳约0.5 h，关闭电源，停止电泳，取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
结果显示，苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH01d08的扩增产物为239bp的特异条带；在SSR位点CH01f02的扩增产物为179bp和183bp的特异条带；在SSR位点CH01f07a的扩增产物为175bp和 191bp的特异条带；在SSR位点CH02b10的扩增产物为119bp和123bp的特异条带；在SSR位点CH02d08的扩增产物为210bp和224bp的特异条带；在SSR位点CH05e03的扩增产物为177bp和183bp的特异条带；在SSR位点GD12的扩增产物为150bp的特异条带；在SSR位点GD142的扩增产物为135bp和142bp的特异条带；在SSR位点GD 147的扩增产物为135bp的特异条带；在SSR位点NH009b的扩增产物为141bp和145bp的特异条带；在SSR位点CH02c02a的扩增产物为186bp的特异条带；在SSR位点Hi03a10的扩增产物为259bp的特异条带；在SSR位点Hi04a05的扩增产物为191bp和197bp的特异条带；在SSR位点Hi23d06的扩增产物为169bp的特异条带。
本发明具有以下优点：将自主研发的苹果品种用SSR分子标记进行了鉴定，并对其构建指纹图谱。本发明所述的14对SSR分子标记是共显性标记，可以对苹果新品种‘赤霞’进行快速、准确的鉴定。本发明通过对苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记鉴定，不仅可以对其进行准确鉴定，同时对其进行了指纹图谱构建，这在很大程度上对新品种保护与种质资源收集提供依据。
附图说明
图1为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH01d08的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图2为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH01f02的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图3为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH01f07a的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图4为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH02b10的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图5为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH02d08的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图6为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH05e03的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图7为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点GD12的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图8为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点GD142的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图9为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点GD147的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图10为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点NH009b的毛细管电泳指纹图谱（美国ABI3730测序仪上获得）；图11为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH02c02a的毛细管电泳指纹图谱（凯杰全自动核酸蛋白分析仪QIAxcel Advanced上获得）；图12为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点Hi03a10的毛细管电泳指纹图谱（凯杰全自动核酸蛋白分析仪QIAxcel Advanced上获得）；图13为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点Hi04a05的毛细管电泳指纹图谱（凯杰全自动核酸蛋白分析仪QIAxcel Advanced上获得）；图14为苹果新品种‘赤霞’在SSR位点Hi23d06的毛细管电泳指纹图谱（凯杰全自动核酸蛋白分析仪QIAxcel Advanced上获得）。
具体实施方式
果树栽培历史悠久，种间杂交、无性繁殖容易，因此果树具有种质资源丰富、品种多样的特点。对苹果种质的准确鉴定是对其进行知识产权保护、保存和育种的重要基础。品种鉴定对于保护新育成品种及育种工作者的权益具有重要意义。用传统的形态和同工酶分析，误差大、效率低，难以鉴定性状相似的品种，分类标准也难以统一。DNA分子标记对品种的鉴定实质上是对基因型的鉴定，使果树品种鉴定直接从DNA分子水平上进行，准确度高，效率高且信息量大。SSR标记为共显性标记，该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点，所得的的结果重复性高。
具体实施步骤如下：
一、DNA的提取
采用CTAB法（曹秋芬等，2003）提取苹果新品种‘赤霞’嫩叶基因组DNA。筛选到苹果种质的准确鉴定是对其进行知识产权保护、保存的14对SSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
所述分子标记为如下所示的14对SSR标记，分别为：SSR标记CH01d08，SSR标记CH01f02，SSR标记CH01f07a，SSR标记CH02b10，SSR标记CH02d08，SSR标记CH02c02a，SSR标记CH05e03，SSR标记Hi03a10，SSR标记Hi04a05，SSR标记Hi23d06，SSR标记GD 12，SSR标记GD142，SSR标记GD 147，SSR标记NH009b；用于扩增上述标记的引物分别为：
SSR标记CH01d08核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示；
SSR标记CH01f02核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示；
SSR标记CH01f07a核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示；
SSR标记CH02b10核苷酸序列如SEQ ID No.7、8所示；
SSR标记CH02d08核苷酸序列如SEQ ID No.9、10所示；
SSR标记CH02c02a核苷酸序列如SEQ ID No.11、12所示；
SSR标记CH05e03核苷酸序列如SEQ ID No.13、14所示；
SSR标记Hi03a10核苷酸序列如SEQ ID No.15、16所示；
SSR标记Hi04a05核苷酸序列如SEQ ID No.17、18所示；
SSR标记Hi23d06核苷酸序列如SEQ ID No.19、20所示；
SSR标记GD 12核苷酸序列如SEQ ID No.21、22所示；
SSR标记GD 142核苷酸序列如SEQ ID No.23、24所示；
SSR标记GD 147核苷酸序列如SEQ ID No.25、26所示；
SSR标记NH009b核苷酸序列如SEQ ID No.27、28所示。
二、扩增体系
以苹果新品种‘赤霞’嫩叶基因组DNA为PCR扩增模板，分别以所述SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增，PCR反应体系总体积为15μL，由其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mMdNTPs 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去离子水补足至15μL；扩增程序为：94℃预变性2 min 30s，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环，72℃10 min，4℃保存备用。
三、PCR产物检测
PCR产物在美国ABI3730测序仪和凯杰全自动核酸蛋白分析仪QIAxcel Advanced上进行检测，收集原始数据。
四、数据分析
实验结果如表1所示，苹果新品种‘赤霞’在SSR位点CH01d08的扩增产物为239bp的特异条带；在SSR位点CH01f02的扩增产物为179bp和183bp的特异条带；在SSR位点CH01f07a的扩增产物为175bp和 191bp的特异条带；在SSR位点CH02b10的扩增产物为119bp和123bp的特异条带；在SSR位点CH02d08的扩增产物为210bp和224bp的特异条带；在SSR位点CH05e03的扩增产物为177bp和183bp的特异条带；在SSR位点GD12的扩增产物为150bp的特异条带；在SSR位点GD142的扩增产物为135bp和142bp的特异条带；在SSR位点GD 147的扩增产物为135bp的特异条带；在SSR位点NH009b的扩增产物为141bp和145bp的特异条带；在SSR位点CH02c02a的扩增产物为186bp的特异条带；在SSR位点Hi03a10的扩增产物为259bp的特异条带；在SSR位点Hi04a05的扩增产物为191bp和197bp的特异条带；在SSR位点Hi23d06的扩增产物为169bp的特异条带。
表1为苹果新品种‘赤霞’指纹数据
序列表
<110> 山西省农业科学院生物技术研究中心；山西省农业科学院果树研究所
<120> 一种用于鉴定苹果新品种‘赤霞’指纹图谱的SSR分子标记及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccgagcacta ccattga 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgtctgttta ccgcttct 18
Claims (4)
1.一种鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记，其特征在于：所述分子标记为如下所示的14对SSR标记，分别为：SSR标记CH01d08，SSR标记CH01f02，SSR标记CH01f07a，SSR标记CH02b10，SSR标记CH02d08，SSR标记CH02c02a，SSR标记CH05e03，SSR标记Hi03a10，SSR标记Hi04a05，SSR标记Hi23d06，SSR标记GD 12，SSR标记GD 142，SSR标记GD 147，SSR标记NH009b；用于扩增上述标记的引物分别为：
SSR标记CH01d08核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示；
SSR标记CH01f02核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示；
SSR标记CH01f07a核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示；
SSR标记CH02b10核苷酸序列如SEQ ID No.7、8所示；
SSR标记CH02d08核苷酸序列如SEQ ID No.9、10所示；
SSR标记CH02c02a核苷酸序列如SEQ ID No.11、12所示；
SSR标记CH05e03核苷酸序列如SEQ ID No.13、14所示；
SSR标记Hi03a10核苷酸序列如SEQ ID No.15、16所示；
SSR标记Hi04a05核苷酸序列如SEQ ID No.17、18所示；
SSR标记Hi23d06核苷酸序列如SEQ ID No.19、20所示；
SSR标记GD 12核苷酸序列如SEQ ID No.21、22所示；
SSR标记GD 142核苷酸序列如SEQ ID No.23、24所示；
SSR标记GD 147核苷酸序列如SEQ ID No.25、26所示；
SSR标记NH009b核苷酸序列如SEQ ID No.27、28所示。
2.利用权利要求1所述的鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记构建指纹图谱，其特征在于：具体方法为：以苹果新品种‘赤霞’基因组DNA为PCR扩增模板，分别以所述SSR分子标记为引物对，进行PCR扩增，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在紫外观测仪上观察电泳结果；用QIAxcel Advanced全自动实时毛细管电泳***进行分析检测，并读取相应数据，获得指纹图谱。
3.根据权利要求2所述的利用鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记构建指纹图谱，其特征在于：PCR扩增反应体系为20 μL，其中含10 × PCR Buffer 2.0 μL、2.5 mM 的dNTPsmixture 1.6 μL、10 ng/μL 的Primers F 0.15 μL、10 ng/μL 的Primers R 0.15 μL、5U/μL 的Taq 聚合酶0.2 μL、100ng/μL 的DNA模板2.0 μL，去离子水补足至13.9 μL；
PCR扩增程序为：94℃预变性2 min 30 s，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40s，35个循环，72℃ 10 min，4℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的利用鉴定苹果新品种‘赤霞’的SSR分子标记构建指纹图谱，其特征在于： 琼脂糖凝胶电泳缓冲液为1×TBE缓冲液，恒定电压150 V条件下电泳约0.5 h，关闭电源，停止电泳，取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。
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| CN201910270157.9A CN109825636A (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 一种用于鉴定苹果新品种“赤霞”指纹图谱的ssr分子标记及其应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111218522A (zh) * | 2020-02-20 | 2020-06-02 | 山西省农业科学院生物技术研究中心 | 一种用荧光ssr分子标记构建苹果新品种‘赤霞’分子身份证的方法及应用 |
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